Summary
Målet med denne protokol er at injicere Rhodamin-konjugerede kugleformede actin i Drosophila embryoner og billede intranuklear actin stang forsamling efter varme stress.
Abstract
Formålet med denne protokol er at visualisere intranukleare actin stænger, der samles i levende Drosophila melanogaster embryoner efter varme stress. Actin stænger er kendetegnende for en bevaret, inducible Actin Stress Response (ASR), der ledsager menneskelige patologier, herunder neurodegenerativ sygdom. Tidligere viste vi, at ASR bidrager til morfogenese fiaskoer og reduceret levedygtigheden af at udvikle embryoner. Denne protokol gør det muligt at fortsætte undersøgelsen af mekanismer, der ligger til grund for actin stang samling og ASR i et modelsystem, der er meget modtagelige for billeddannelse, genetik og biokemi. Embryoner indsamles og monteres på en coverlip for at forberede dem til injektion. Rhodaminkonjugeret globular actin (G-actinRed)fortyndes og indlæses i en mikronædel. En enkelt injektion er lavet i midten af hvert foster. Efter injektion inkuberes embryoner ved forhøjet temperatur, og intranukleare actinstænger visualiseres derefter ved konfokal mikroskopi. Fluorescensgenvinding efter fotobleachingforsøg (FRAP) kan udføres på actinstængerne; og andre actin-rige strukturer i cytoplasmaet kan også afbildes. Vi finder ud af, at G-actinRed polymeriserer som endogen G-actin og ikke i sig selv forstyrrer normal embryoudvikling. En begrænsning af denne protokol er, at der skal udvises forsigtighed under injektionen for at undgå alvorlig skade på embryoet. Men med praksis, injicere G-actinRød i Drosophila embryoner er en hurtig og pålidelig måde at visualisere actin stænger og kan nemt bruges med fluer af enhver genotype eller med indførelsen af andre cellulære belastninger, herunder hypoxi og oxidativ stress.
Introduction
Denne protokol beskriver, hvordan man injicerer G-actinRed for at visualisere samlingen af intranukleare actin stænger i varmestressede embryoner, der gennemgår en indukbel Actin Stress Response (ASR)1. Vi udviklede denne protokol til at støtte undersøgelser af ASR, som i embryoner fører til forstyrret morfogenese og reduceret levedygtighed, og i voksne menneskelige celletyper er forbundet med patologier, herunder nyresvigt2, muskelmyopatier3, og Alzheimers og Huntingtons Sygdom4,5,6,7,8. Denne ASR er fremkaldt af talrige cellulære belastninger, herunder varmechok9,10,11, oxidativ stress4,6, reduceret ATP syntese12, og unormal Huntingtin eller β-amyloid oligomerization4,5,6,7,9,13,14,15,16. Et kendetegn ved ASR er samlingen af afvigende actin stænger i enten cytoplasma eller kernen af berørte celler, som er drevet af stress-induceret hyperaktivering af en actin interagerende protein, Cofilin1,5,6,10. Desværre er der stadig huller i den centrale viden om automatiseret udvikling. For eksempel kendes actinstængernes funktion ikke. Vi forstår ikke, hvorfor stænger dannes i cytoplasmaet af nogle celletyper, men andres kerne. Det er heller ikke klart, om asr er beskyttende eller maladaptive for celler eller embryoner under stress. Endelig kender vi stadig ikke de detaljerede mekanismer, der ligger til grund for Cofilin hyperaktivering eller actin stang samling. Således giver denne protokol en hurtig og alsidig analyse for at sonde ASR ved at visualisere actin stang dannelse og dynamik i den meget tractable eksperimentelle system af levende frugt flyve embryo.
Protokollen til microinject G-actinRed i levende Drosophila embryoner blev oprindeligt udviklet til at studere dynamikken i normale cytoplasmiske actin strukturer17 under væv bygning begivenheder. I disse undersøgelser fandt vi, at G-actinRød injektion ikke påvirkede tidlige udviklingsprocesser i embryoet negativt, herunder cytokinesis eller gastrulation17,18. Vi ændrede derefter protokollen og tilpassede embryohåndteringen og G-actinRed-injektionen for at muliggøre billeddannelse af actinstænger i varme stressede embryoner, der gennemgår ASR1. Andre metoder udover G-actinRød injektion kan bruges til at visualisere actin i embryoner. Disse metoder er afhængige af at udtrykke fluorescerende proteiner (FPs) mærket til at actin eller til domæner af actin bindende proteiner, såsom Utrophin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP, og Moesin-GFP (revideret i19). Men ved hjælp af disse FP sonder kræver forsigtighed, fordi de kan stabilisere eller forstyrre nogle actin strukturer, ikke lige mærke alle actin strukturer20, og i tilfælde af actin-GFP, er meget overekspresseret - problematisk for analysen af stang samling, som ikke kun stress afhængig, men også actin koncentration afhængige1. Således er G-actinRed den foretrukne sonde til stangundersøgelser i flyveembryoner, og embryoets store størrelse tillader sin nemme injektion.
Arbejdsgangen i denne protokol svarer til andre veletablerede mikroinjection teknikker, der er blevet brugt til injektion af proteiner, nukleinsyrer, narkotika, og fluorescerende indikatorer i Drosophila embryoner21,22,23,24,25,26,27. Men efter mikroinjektion af G-actinRed her, embryoner er udsat for mild varme stress for at fremkalde ASR og intranuklear actin stang samling. For laboratorier med adgang til fluer og en injektionsplatform bør denne metode let kunne implementeres og kunne tilpasses specifikke studielinjer med hensyn til ASR, herunder induktion af den ved forskellige belastninger eller graduering i forskellige genetiske baggrunde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbered embryo indsamling kopper og æblejuice agar plader
- Fem dage før injektionseksperimentet konstrueres28, eller der indkøbes mindst to små kopper til indsamling af embryoner. Lav friske 60 mm æblejuice agarplader, der skal bruges med små opsamlingsbægre28. Opbevar plader i plastkasser dækket med fugtige papirhåndklæder ved 4 °C.
BEMÆRK: Små embryonopsamlingskopper, der er befolket med fluenumre som beskrevet i trin 1.3, vil give tilstrækkelige embryonnumre pr. forsøg, samtidig med at det sikres, at håndtering og injektion af embryoner kan udføres på kort tid til, at der kan foretages billeddannelse af tidlige udviklingsstadier. - Varme æblesaftplader til 18 °C og tilsæt en dab gærpasta til midten af pladen. Gærpasta er en simpel pasta af aktiv gær og destilleret vand.
- For at fremme den mest generøse æglægning skal du oprette opsamlingskopper med fluer 2 dage før eksperimentet. Tilsæt mindst 100 hunner og 50 mandlige fluer til opsamlingskopperne, og top med en forberedt æblejuiceplade(Figur 1, trin 1). På dagene op til injektionseksperimentet ændres æblesaftpladerne mindst to gange om dagen, en gang om morgenen og en gang om aftenen.
BEMÆRK: De bedste injektions- og billeddannelsesresultater opnås, når embryonopsamlingskopper holdes ved 18 °C med en lys-/lyscyklus på 12 timer.
2. Forbered en arbejdslageropløsning af G-actinRed til mikroinjection
BEMÆRK: Dette præparat gør kun 2 μL af en 5 mg / mL arbejdslager af G-actinRød, så hvis brugerne er uvante med mikroinjection teknik, er det en fordel at springe til trin 3 og praksis mikroinjections med en neutral pH buffer for at bevare dyrebare arbejdslager. Den 10 μg bestand af G-actinRød fra sælgeren kan opbevares i sin oprindelige emballage i en 16 ounce skrue top krukke med ~ 500 g desiccant ved 4 °C i op til 6 måneder.
- Forbered en G-buffer lagerløsning på forhånd: 5 mM Tris-HCl, 0,2 mM CaCl2, pH 8,0. Filtrer og opbevar ved stuetemperatur.
- På injektionsdagen fremstilles 1 ml G-bufferarbejdsopløsning i et friskt snap cap-mikrocentrifugerør på is ved hjælp af G-bufferlageret fra trin 2.1 suppleret med følgende ved de angivne endelige koncentrationer: 1 mM dithiothreitol (DTT) og 0,2 mM ATP, pH 8,0.
BEMÆRK: Den 1 ml store mængde G-bufferarbejdsløsning er mere end det, der er nødvendigt for et eksperiment, men forenkler præparatet. Overskydende kan kasseres efter eksperimentet, eller brugerne kan skalere ned efter deres præference.- Den rødebestand på 10 μg G-actin tilsættes først 1 μL filtreret, destilleret vand til toppen af den lyserøde dråbe G-actinRed inde i røret.
- Dernæst tilsættes 1 μL af den kolde, frisklavede G-buffer arbejdsopløsning fra trin 2.2. Pipet op og ned ~20 gange for at blande godt med pipettevolumen indstillet til 1 μL. G-actinRød bestand vil nu være på den endelige fortynding af 5 mg / mL.
- Inkuber den forberedte G-actinRed i 30 minutter på is uforstyrret.
- Centrifuge den forberedte G-actinRød ved 16.000 x g i 20 min ved 4 °C i en mikrocentrifuge for at fjerne udfældet.
- Rør forsigtigt 1,5 μL af supernatanten ind i et frisk snap cap mikrocentrifugerør på is, så man undgår den mørke lyserøde pellet.
- Opbevar den forberedte G-actinRed supernatant på is i op til 6 timer, indtil den er klar til at blive lastet i en mikronædel.
BEMÆRK: Mikronåle kan trækkes fra kapillærrør på forhånd på en micropipette-aftrækker og opbevares derefter ved stuetemperatur på en strimmel modellering af ler i en 100 x 20 mm petriskål. Foreslåede parametre for microneedle trække kan findes i Pipette Kogebog29.
3. Indsamle embryoner og montere til injektion
- Lad fluer lægge embryoner i 30 minutter på æblesaftplader med gærpasta ved 18 °C.
- Mens fluer lægger, forvarme en æblejuice agar plade uden gær pasta til stuetemperatur, skåret ud en 4 cm x 1 cm rektangulær kile af æblejuice agar med et barberblad, og sted på en 25 mm x 75 mm glas dias.
- Høstplade fra 30 minutters indsamling og dechorionate embryoner ved at hælde frisk blegemiddel, fortyndet 1:1 med destilleret vand, på pladen og hvirvlende pladen i 1 min, som beskrevet i28 (Figur 1, trin 2).
BEMÆRK: Forskellige mærker af blegemiddel sælges i forskellige koncentrationer. Blegemidlet, der anvendes her, er 6% natriumhypochlorit fra flasken og fortyndes til en endelig koncentration på 3% natriumhypochlorit. Andre blegemiddel mærker på lidt lavere koncentrationer vil fungere lige så godt. - Blegemiddel og dechorionerede embryoner hældes i en opsamlingskurv (en 70 μm cellesien) og pladen skylles to gange med destilleret vand fra en sprøjteflaske, og disse vaskes til opsamlingskurven.
- Skyl kraftigt de dechorionerede embryoner i opsamlingskurven med destilleret vand, indtil der ikke er synlige gærklumper, og kurven efterlader ingen lyserøde mærker fra overskydende blegemiddel, når de slettes på et køkkenrulle.
- Høstplade fra 30 minutters indsamling og dechorionate embryoner ved at hælde frisk blegemiddel, fortyndet 1:1 med destilleret vand, på pladen og hvirvlende pladen i 1 min, som beskrevet i28 (Figur 1, trin 2).
- Ved hjælp af en pensel med børster fugtet med destilleret vand overføres dechorionerede og vaskede embryoner fra opsamlingskurven på den forberedte æblesaft agar kile på glasrutsjebanen.
- Brug et par fin spids pincet eller en dissekering nål til at arrangere ti embryoner i en lige linje langs den lange akse af rektangulære agar kile (Figur 1, trin 3). Arranger embryonerne head-to-tail, således at deres forreste stang vender mod højre og dorsale side står over for forskeren (Figur 1, trin 3, forstørret).
- Skær 0,5 cm af enden af en P200 pipettespids af med et barberblad, og dyp ned i "embryolimen" (beskrevet i28). Der beklædes generøst et område med en bredde på 5 mm (figur 1, trin 4) langs den lange kant af en rektangulær overtræk på 24 mm x 50 mm, og limsiden op. Tørring vil tage ~ 30 s og er færdig, når hele lim-belagt region synes mat i stedet for våd eller skinnende.
BEMÆRK: Forbered "embryolim" mindst 48 timer i forvejen. Der tilsættes n-Heptane til strimler af dobbeltsidet tape i et scintillationsglas som beskrevet i28. - Når "embryolimen" er tørret, skal du forsigtigt placere coverliplimsiden ned på toppen af rækken af justerede embryoner på agaren, hvilket efterlader 2-3 mm plads mellem kanten af dækslet og rækken af embryoner.
BEMÆRK: Hvis embryonerne sættes for tæt på kanten af dækslet, kan det føre til, at embryonerne tørrer for meget ud i løbet af forsøget. - Vend coverlip over, så embryonerne nu vender op. De skal sidde fast i en linje langs en lang kant af coverlip, og deres ventrale region vender den nærmeste kant af coverlip(Figur 1, trin 4, forstørret).
- Afsiccate embryonerne ved at placere coverlip med embryoner forsigtigt på toppen af 150 g frisk blå desiccant opbevares i en 16 ounce skrue top krukke. Skru tæt på låget og inkubat i 8-10 min (Figur 1, trin 5).
- Efter udtørring fjernes coverlip'en fra den udtørringskrukke og tape hver kort side af coverlip'en til et mikroskopdias, embryonsiden op, med to 4 cm2 stykker dobbeltsidet tape, så embryoets coverlip passer på injektionsstadiet (Figur 1, trin 6).
- Tilsæt 2-3 dråber Halocarbon 27 olie med en Pasteur pipette til at dække de justerede embryoner og beskytte dem mod yderligere dehydrering (Figur 1, trin 6).
4. Injicere og varme stress embryoner til at fremme actin stang dannelse
BEMÆRK: Alle injektioner foretages i et temperaturreguleret rum ved 18 °C.
- Forbered fugtige inkubationskamre fra en glas petriskål mindst 100 mm x 20 mm i størrelse og line kammeret med drejninger af lab væv vinduesviskere fugtet med destilleret vand(Figur 1, trin 8). Forvarm inkubationskamrene ved 32 °C eller den ønskede inkubationstemperatur inden injektion af embryoner.
- Åbn luftstrømsventilen for mikroinjektoren, og tænd for mikroinjektoren (trykluft eller husluft med et tryk på mindst 90 psi er egnet).
- Mens embryoner er udtørrende, backload den tidligere forberedte G-actinRød supernatant i microneedle ved hjælp af en mikro loader tip. Sæt pipetten til at trække 1-1,5 μL.
BEMÆRK: På grund af actinens viskositet er lastemængderne muligvis ikke nøjagtige, og der kan være nok actin tilbage til at indlæse mindst en til to mikronødder mere. Op til 60 embryoner kan injiceres pr. lastet mikronød, hvis mikronædlen er kalibreret korrekt og ikke bliver tilstoppet i løbet af forsøget. - Fastgør mikronålen til nåleholderen, og stram skruen. Tilslut luftrøret til mikroinjektoren, og sørg for, at tilbagestrømningstrykket på mikronædel ekvilibraterne til 30 hPa.
- Mikroinjektorindstillingerne kalibreres til at udvise en boble med en diameter på 100 μm af G-actinRed (~500 pL) på et diasmikrometer. Drej trykknappen (500-1500 hPa) og indsprøjtningspulstidsknappen (0,1-0,5 s) på mikroinjektoren for at få den rigtige boblestørrelse. Juster disse indstillinger, hver gang en ny mikronødder indlæses for at tage højde for variabilitet i actin viskositet og microneedle tip størrelse.
BEMÆRK: Den forberedte G-actinRed er tyktflydende, og der kan være luft i spidsen af mikronædlen, der skal udvises, før embryoner injiceres. Hvis G-actinRed ikke umiddelbart udviser fra spidsen af mikronædlen, forsigtigt bryde microneedle spidsen mod kanten af dias mikrometer. - Placer rutsjebanen med monterede embryoner på mikroskopstadiet.
BEMÆRK: Hver injektion, der er oprettet, vil være anderledes, så forskerne bliver nødt til at justere deres injektionsmetode i overensstemmelse hermed. Her flyttes embryonerne med hensyn til en stationær mikronædel, der injicerer hvert foster ved at køre embryoet ind i mikronødder. - Juster mikromanipulatorstadiet og fokus på 10x-målet på lysmikroskopet, så embryonerne er synlige. Embryonerne er i det rigtige brændplan, når konturerne af vitellinmembranen er skarpeste, og embryoet fremstår størst. Vælg embryoner, der skal injiceres, og som er i det rette udviklingsstadium, således at det meste af koblingen på det tidspunkt, hvor inkubationen efter injektionen er afsluttet, når det ønskede udviklingsstadium (f.eks. injicere embryoner på Bownes' stadium 2-330 for at observere stænger ved cellulering efter varmebelastning ved 32 °C).
- Brug microneedle kontrol til at bringe nålen ind i samme brændplan som embryoner.
BEMÆRK: Hvis mikronædlen fanger på dækslet, mens scenen eller mikronædret flyttes, er mikronælen for tæt på rutsjebanen og er ikke i det rigtige brændplan. Mikronædlen skal være parallel med dækslet og ikke i en væsentlig vinkel (figur 1, trin 7). - Indsæt mikronæblet i embryoet, så det rammer embryoet midt i dets ventrale region ved embryoet "ækvator". Udløse injektion med fodpedalen eller "injicere"-knappen, når mikronædelspidsen er synlig inde i midten af embryoet (Figur 1, trin 7).
- Indsprøjt G-actinRed én gang og langsomt fjerne microneedle. Flyt scenen og gentag for hvert foster i den relevante udviklingsfase.
BEMÆRK: Udvidelse af embryoet er normalt, da G-actinRed injiceres, og en smule cytoplasma kan lække ud af embryoet. - Når alle embryonerne er injiceret, skal du placere rutsjebanen med embryonerne i det forberedte fugtige inkubationskammer og lukke låget (Figur 1, trin 8). Hvis du forsøger at få embryoner, der når cellulering, opvarmes embryonerne ved 32 °C i 60-75 minutter i det fugtige inkubationskammer.
BEMÆRK: Inkubationstider bemærkes, der tillader visualisering af stænger i cellulerende varme stressede embryoner. Inkubationstiden vil være længere for ikke-varmestresskontrolfostre, fordi udviklingen vil være langsommere ved en lavere temperatur31. Disse kontrolembryoner kan inkuberes i fugtige kamre ved temperaturer som 18 °C eller 25 °C, afhængigt af det specifikke forsøgs udformning og det spørgsmål, der skal stilles. Den minimale inkubationstid, der er nødvendig for, at G-actinRed kan diffundere hele embryoet, er 30 min.
5. Billede actin stænger i varme stressede embryoner ved konfokal mikroskopi
- Mens embryonerne opvarmes, skal du tænde for konfokalt mikroskop og vælge 561 nm laserkanalen.
- Flyt den objektive linse (25x, 40x eller 63x anbefales) til arbejdsstillingen.
- Hvis billeddiagnostiske varme stressede embryoner, skal du indstille den opvarmede sceneinkubator til at opnå en indre temperatur på 32 °C. Et peg-og-skyd eller infrarødt termometer kan bruges til at kontrollere temperaturen ved eller i nærheden af målet.
- Fjern diaset med injicerede embryoner fra det fugtige inkubationskammer, når inkubationen er afsluttet (Figur 1, trin 9).
- Arbejd hurtigt, lirke forsigtigt de dobbeltsidede båndstykker, der blev brugt til at klæbe coverlip med monterede embryoner til diaset (Figur 1, trin 9).
ADVARSEL: Vær forsigtig under disse trin, da coverlips let kan splintres, hvis der påføres for meget kraft. - Sæt to 2,5 cm lange stykker dobbeltsidet tape sammen og skær båndet halvt i længderetningen for at lave to strimler, 2,5 x 0,5 cm lange (Figur 1, trin 10).
- Sæt to tredjedele af længden af hver båndstrimmel på den første coverlip, flankerende hver side af embryonerne i Halocarbon 27 olie (Figur 1, trin 10, orange), forlader en tredjedel af båndstrimler hængende ud over kanten af den første coverlip, hvor embryonerne sidder fast. Brug behandskede hænder og pas på ikke at røre embryonerne i dette trin.
- Placer forsigtigt en anden rektangulær coverlip oven på båndstrimlerne for at smøre embryonerne mellem coverlips(Figur 1, trin 10, blå). Juster 25 mm kanterne, men hold 50 mm kanterne forskudt fra hinanden med 1 cm i bredden.
BEMÆRK: Denne anden coverslip fulde overflade vil blive den nye billedbehandling overflade, der vil stå over for den objektive linse, så pas på ikke at få fingeraftryk eller Halocarbon 27 olie på denne anden coverlip overflade. Forskydningen er nødvendig, så der kan tilsættes ekstra Halocarbon 27-olie for at nedsænke embryonerne jævnt. Hvis det er nødvendigt, tilsæt Halocarbon 27 olie i sømmen, hvor de to coverslips mødes øverst på sandwichen, og det vil belægge embryonerne ved kapillær handling (se stiplede linjer i figur 1, trin 10). - Bank forsigtigt ned på de områder af coverlip, der er direkte på toppen af båndstrimlerne med den stumpe side af et barberblad for at få coverlipet til at klæbe til båndet.
- Vend coverslip sandwich over og sted på et laboratorium væv visker til at holde billedbehandling overfladen ren og bære til confocal mikroskop(Figur 1,trin 11). Sørg for, at båndet sidder helt fast på begge coverlips før billedbehandling.
- Bekræft, at den opvarmede fase er ved temperatur, og hvis du bruger et omvendt mikroskop, tilsættes nedsænkningsvæske på den valgte objektive linse.
- Læg dæksandwichen forsigtigt på scenen for at sikre, at den nye billedflade(2 nd coverslip) er den, der berører nedsænkningsvæsken (Figur 1, trin 11).
BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt, skal du holde coverslip sandwich til scenen med to små stykker dobbeltsidet tape for at forhindre unødvendig bevægelse under billeddannelse, hvis coverlips ikke passer godt i den opvarmede fase. - Fokus på et foster, der er i cellulering (Bownes fase 4a30)eller ønskede udviklingsstadium ved hjælp af enten transmitteret lys eller fluorescens.
- Når et foster er blevet bragt i fokus, skal du skifte til laseropsamlingstilstanden på det konfokale mikroskop og justere laserkraft og forstærkning, rammestørrelse, fliser og projektionsindstillinger efter behov.
- Tag overflade-view billeder gennem brændplanerne af embryoets kerner for at finde intranukleare actin stænger. Stænger skal vises i flere retninger som lyse striber eller prikker inde i de forholdsvis mørke kerner (Figur 2A, 2C).
6. Alternative billeddiagnostiske eksperimenter
- Udfør FRAP for at undersøge actin omsætning langs længden af intranukleare actin stænger eller i cytoplasmiske actin strukturer, såsom spidsen af plasmamembran furer under cellulering.
- I billedbehandlingssoftwaren skal du vælge et rektangulært område omkring furespidser eller actinstænger, hvor du kan erhverve eksperimentet.
- Vælg en lille firkantet region i midten af en actin stang inden for rektangulære erhvervelse region til blegemiddel. Sørg for, at spidsen af actin stangen er synlige og ikke bliver bleget i løbet af eksperimentet for at give mulighed for nøjagtig sporing af stangen inde i kernen.
- Indstil blegemiddel laser til at gentage 50x og indstille blegemiddel laser magt til maksimum.
- Vælg et tidskursus for at erhverve billeder hvert sekund for i alt op til 120 s ved maksimal pixel dvæle hastighed og indstille laseren til blegemiddel efter de første to sekunder af billedet erhvervelse.
- Kvantificere dataene for at bestemme halv tid for fluorescensgenvinding1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skematisk arbejdsgang for håndtering af embryoner er beskrevet i figur 1, og en tidsplan for et typisk eksperiment fremgår af tabel 1. Et skøn over et godt eksperimentelt resultat er, at for hver 10 embryoner, der injiceres, vil mindst halvdelen af de viste embryoner befinde sig i det korrekte udviklingsstadium, ubeskadigede, og udvise en robust ASR med varmebelastning ved 32 °C. Denne asr vil blive dokumenteret ved samling af intranukleare actin stænger som vist i den repræsentative overfladevisning billede af et foster i figur 2A (højre panel). Actin stænger vises i flere retninger (parallelt eller vinkelret på billedplanet) inde i kernerne og kan afbildes gennem flere brændplaner. Til sammenligning vil kontrolembryoner, der inkuberes ved 18 °C, ikke vise actinstænger(figur 2A, venstre panel). De procentvise kerner, der indeholder stænger, kan kvantificeres, som det fremgår af figur 2B. Derudover kan FRAP-eksperimenter udføres på stænger (Figur 2C). Der henvises til en foreslået kvantificeringsmetode for FRAP-data i1 , og et eksempel på et fluorescensgenvindingsområde for en bleget versus ubleget region af en actin stang er vist i figur 2D.
Hvis et foster er alvorligt beskadiget ved injektion eller bliver for tørt under forsøget, mitotisk asynkron kan observeres og cellularization vil blive forstyrret. Nogle gange er stænger måske ikke synlige på grund af manglende evne til at få nok actin injiceret i embryoet. Hvis dette sker, skal du sikre dig, at mængden af G-actinRød injiceret er 500 pL (målt med et mikrometer i trin 4.5) og bekræfte, at dette beløb forbliver konsistent mellem embryoner ved at foretage en testinjektion i den omgivende olie for at kontrollere størrelsen af den G-actinRøde boble mellem hvert embryonmikroinjektion. For at sikre stangvisualisering skal du arbejde hurtigt for at tilføje coverlip og flytte embryonerne til det opvarmede mikroskoptrin, når de er taget fra det fugtige kammer i trin 5.4, da stangsamlingen er reversibel1, og stænger kan adskilles, hvis embryonerne holdes ved en temperatur under 32 ° C i mere end 30 minutter.
Figur 1: Skematisk oversigt over håndtering af embryoner under forsøget. (1) Voksne fluer i embryonopsamlingskopper lægger embryoner på æblesaftplader. (2) Embryoner dechorioneres med 1:1 blegemiddel:destilleret vand hældes i en opsamlingskurv og vaskes grundigt med destilleret vand for at fjerne blegemiddel og snavs. (3) Embryoner overføres med en pensel til en rektangulær æblejuice agar kile på et dias og arrangeres på deres sider, head-to-tail, med dorsal region ud mod kanten af agar. (4) En 5 x 50 mm region af et glas coverlip (orange) er belagt med "embryo lim" og presses forsigtigt ned på rækken af embryoner arrangeret på agar at overholde dem til coverlip. (5) Dækslet med embryoner inverteres, således at embryonerne vender op og op. Embryonerne er udtørret i en skrue top krukke. (6) Umiddelbart efter udtørringen tapes coverlipet til et dias, embryoner vender mod, og embryoner er dækket af Halocarbon 27-olie. (7) En mikronål, der tidligere var fyldt med forberedt G-actinRed, anvendes til at foretage en enkelt injektion i midten af det ventrale område af hvert foster, med nålen placeret parallelt med coverlip. (8) Efter injektion inkuberes embryoner i en petriskål, der er befugtet med fugtige laboratorievævsviskere ved kontroltemperaturen (18 °C) eller med varmebelastning (32 °C). (9) Efter inkubation fjernes overtræksbilledet med embryonerne på det fra rutsjebanen. (10) To stykker dobbeltsidet tape er lagdelt oven på hinanden, skåret i halve på langs, og placeres på hver side af olien omkring embryoner på den første coverlip. En anden coverlip (blå) er placeret oven på den første til at skabe en ny billeddannelse overflade, offset, så det efterlader et hul for mere olie, der skal tilsættes til at dække embryoner efter behov. (11) Hvis billeddiagnostik på et omvendt konfokalt mikroskop vendes, vendes coverslipsandwichen, så den anden coverlip vender mod målet. Imaging sker i et inkuberet kammer, og actin stænger visualiseres over flere brændplaner af hver embryoner 'kerner. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative resultater af actinstænger i varme stressede embryoner. (A) Actin-stænger ses ikke i et foster, der blev inkuberet ved kontroltemperaturen på 18 °C (venstre panel), men ses i kernen af et foster, der var varmespændt ved 32 °C (højre panel). (B) Kvantificering af procentdelen af kerner med aktinstænger fra et repræsentativt forsøg. Hver prik repræsenterer et foster, hvor stænger og kerner blev talt i hele det afbildede område (n = 22 embryoner ved 18 °C; n = 23 embryoner ved 32 °C; fejllinjer viser standardafvigelse). En student's t-test, med ulige varians antaget, blev brugt til at beregne p-værdien. (C) En repræsentativ tidsserie viser FRAP på en actin stang. Den del af stangen, der blev bleget, er angivet med en hvid pilespids. Pre-blegemiddel er 2 s forud for blegemiddel trin. Tid = 0 s er blegemiddel skridt, og fluorescens opsving blev sporet indtil 60 s post blegemiddel. (D) Et observationsområde viser genvindingsdynamik for fluorescens i et bleget område af en stang sammenlignet med et ubleget område i samme stang. Stænger er bemærkelsesværdigt stabile og actin inden for dem ikke omsætning. Således er der ingen opsving ses. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: Eksperimentel arbejdsgang med foreslået tidsplan. Denne tidsplan opsummerer den forventede tid, det vil tage at afslutte hvert trin i protokollen.
| Rækkefølge | Trin | Krævet tid for hvert trin | Beskrivelse |
| 1 | 1.1 | 5 dage i forvejen | Lav embryonindsamlingsbure. Hæld æblejuice agar plader. |
| 2 | 1.2-1.3 | 2 dage i forvejen | Opsæt opsamlingsbure med voksne mandlige og kvindelige fluer. |
| 3 | 2.6 Bemærkning | 1 dag i forvejen | Træk kapillærrør for at lave mikronødder. |
| 4 | 2.1-2.6 | 1 time | Gør G-aktin klar. |
| 5 | 3.1 | 30 min. | Tillad fluer at lægge æg. |
| 6 | 3.2-3.10 | 15-30 min. | Indsamle, montere, udtørre embryoner. Dæk embryoner med olie. |
| 7 | 4.1 | 30 minutter i forvejen | Forbered fugtige inkubationskamre. |
| 8 | 4.2-4.4 | 1 min. | Lad microneedle. |
| 9 | 4.5-4.10 | 10-20 min. | Kalibrere G-actin boble størrelse og injicere embryoner. |
| 10 | 4.11 | 30 min-1+ h | Inkubere/opvarme stressembryoner. |
| 11 | 5.1-5.3 | 1 time i forvejen | Tænd mikroskop og inkubationsfase. |
| 12 | 5.4-5.10 | 5 min. | Sandwich embryoner mellem coverslips til billeddannelse. |
| 13 | 5.11-6.6 | 15 min-1+ h | Billede intranuklear actin stænger i embryoner. |
Tabel 2: Fejlfinding i forbindelse med forslag. Denne tabel indeholder forslag til fejlfinding for at gøre det lettere at fuldføre protokollen.
| Potentielt problem | Forslag |
| Fluer lægger ikke nok embryoner. | Opsæt koppen mindst 5 dage i forvejen (se trin 1.1-1.3). Skift plader 3x om dagen op til eksperimentet for at tilskynde æglægning. Lad fluer lægge embryoner i 1 time i stedet for 30 min. Opsæt kopper med unge voksne fluer. |
| Ingen G-actin bortvises fra mikronødder. | Øg tryk- og tidsindstillingerne på mikroinjektoren. Bryd mikronædelspidsen yderligere (se trin 4.5 Bemærk). Da større træsko måske ikke er klare, skal du indlæse en ny nål. |
| Svært at kalibrere en lille nok boble størrelse. | Juster indstillingerne for tryk og tid (se trin 4.5). Da åbningen af mikronålespidsen kan være for stor, skal du indlæse en ny nål. |
| Embryoner frigives fra limen på coverlip under injektion. | Juster "embryolim" konsistensen for fremtidige coverlips ved at tilføje mere dobbeltsidet tape til heptanopløsningen (se trin 3.5 Note). |
| Embryoner tørrer ud under temperaturinkubation. | Sørg for, at diaset er i niveau i inkubationskammeret (se trin 4.11), og at olien ikke rører ved noget, der kan væge det væk. Tilsæt ekstra dråber olie til embryonerne. Formindsk udtørringstiden før injektionen (se trin 3.8). |
| Olie dækker ikke helt embryonerne mellem første og andet coverlips. | Tilsæt ekstra olie via kapillær handling til det lille mellemrum mellem coverlips (se trin 5.8 Bemærk). |
| Intranukleare actin stænger er ikke synlige i varme stressede embryoner. | Der indsprøjtes en større mængde G-actin (se trin 4.5). Det bekræftes, at temperaturen i både inkubationen efter injektionen (se trin 4.11) og billedkammeret er 32 °C (se trin 5.3). |
| Store bobler af G-actin er synlige omkring injektionsstedet for embryoner. | Der indsprøjt en mindre mængde G-actin (se trin 4.5). Øge embryoets udtørringstid for at fremme en bedre tilbageholdelse af den injicerede actin inde i embryoet (se trin 3.8). |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Betydningen af denne metode er, at den udnytter den veletablerede protokol for mikroinjektion i Drosophila embryoner21,22,23,24,25,26,27 for at muliggøre ny forskning vedrørende ASR og ledsagende actin stang samling. En stor fordel ved at injicere G-actinRed i levende embryoner er, at ASR kan studeres under en række forskellige sammenhænge. Til fremtidige undersøgelser kan disse sammenhænge omfatte injektion af embryoner af andre genotyper som en del af en mutant skærm eller udsætte injicerede embryoner for forskellige stressforhold, såsom oxidativ stress4,32. Selvom denne injektionsteknik ikke er beskrevet detaljeret her, kan den også ændres til injektion af nukleinsyrer, andre proteiner, lægemidler og indikatorfarver (for eksempel se21,22,23,24,32) for at studere ASR. Således præsenterer denne metode en række tilgange til at identificere den række af belastninger, der fremkalder ASR, yderligere karakteriserer cellulære reaktioner under ASR (f.eks. ændringer i mitokondrieaktivitet) og afdækker nye molekyler og mekanismer, der ligger til grund for intranuklear actin stangmontering.
Nogle kritiske trin i protokollen omfatter følgende: I trin 3.8 skal embryoner udtørres korrekt for at sikre en vellykket injektion og den bedste embryosundhed. Udtørringstiden afhænger af laboratoriets omgivelsestemperatur og fugtighed, så det anbefales at øve montering, udtørring og injektioner med en neutral pH-buffer først for at etablere denne parameter til håndtering af embryonerne. I trin 4.5 skal mikronæd- og injektionsindstillingerne finjusteres, så der kan sprøjtes nok G-actinRed ind i embryoner. Hvis for lidt G-actinRød injiceres i embryoet, kan actin stænger ikke let visualiseres, da dannelsen af actin stænger er afhængig af koncentrationen af fri actin1. Derudover vil det være vanskeligt at få ensartede resultater fra FRAP-eksperimenter, hvis der ikke er nok G-actinRød injiceret, da fluorescensintensiteten ikke vil være høj nok til at overvinde baggrundsfluorescens. Derfor er det vigtigt at kalibrere boblestørrelsen, hver gang en ny nål indlæses og bruges. G-actinRød er tyktflydende og har tendens til at tilstoppe inde i mikronænderet. Nogle gange kan dette føre til injektion af variable mængder af G-actin i embryonerne. Hvis mikronædlen er tilstoppet, og rydningen af mikronædlen med højt tryk svigter, kan det være nødvendigt at forsøge at bryde spidsen af mikronøddelen yderligere eller endda indlæse en ny mikronædel og injicere et nyt sæt embryoner. Endelig skal embryoner i trin 4.11 inkuberes ved forhøjet temperatur og i tilstrækkelig tid til, at ASR kan induceres, og stængerne kandannes 1. Temperaturen på alle inkubatorer skal overvåges konstant, tiden til overførsel af embryoner fra inkubator til inkubator skal begrænses, og der skal anvendes en timer til alle inkubationer. Andre mulige problemer er angivet i tabel 2 med tilhørende fejlfindingstips.
En væsentlig begrænsning af denne protokol er, at der skal udvises ekstraordinær omhu for at bevare embryonernes sundhed under injektioner, inkubationer og billeddannelse. Protokollen er designet til at maksimere embryoets sundhed, og med betydelig praksis kan en forsker fuldføre alle trin i protokollen med embryoudvikling, der skrider frem med de forventede satser pr. Temperatur31. En anden begrænsning af protokollen er nødvendigheden af en mikroinjection rig, som kan være temmelig dyrt og er ikke almindeligt udstyr til hver flyve lab. Men hvis et tilstødende laboratorium er udstyret til at injicere andre embryoner (f.eks. Xenopus, Zebrafisk og Caenorhabditis elegans) eller vedhængende celler, er den anvendte injektionsplatform sandsynligvis egnet til Drosophila-injektioner. I så fald er det kun nålens form, der skal tilpasses Drosophila-embryoner i henhold til retningslinjerne i Pipette Cookbook29. Alternativt er der nogle billigere micoinjector muligheder på markedet (f.eks analoge mikroinjektorer), som kan reducere omkostningerne ved at samle en injektion rig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne taknemmeligt anerkende arbejdet i Liuliu Zheng og Zenghui Xue, der hjalp pioner denne teknik i Sokac lab, samt Hasan Seede, der hjalp med analysen. Arbejdet med denne undersøgelse er finansieret af et tilskud fra NIH (R01 GM115111).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore-Sigma | A23835G | Component of G buffer |
| Apple juice, Mott's, 64 fl oz | Mott's | 014800000344 | Component of apple juice plates |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Component of apple juice plates |
| Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite | KIK International | 059647210020 | For dechorionating embryos |
| Calcium chloride | Millipore-Sigma | C1016500G | Component of G buffer |
| Cell strainer, 70 μm | Falcon | 352350 | For collecting dechorionated embryos |
| Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan | Zeiss | 0000001994956 | For imaging intranuclear actin rods |
| Desiccant | Drierite | 24001 | For desiccating embryos |
| Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom | Zeiss | 4350649000000 | For arranging embryos on agar wedge |
| Dissecting needle, 5 in | Fisher Scientific | 08965A | For arranging embryos on agar wedge |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP1725 | Component of G buffer |
| Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in | 3M | 021200010323 | For making embryo glue |
| Embryo collection cage | Genessee Scientific | 59100 | For housing adult flies and collecting embryos |
| Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72701D | For arranging embryos on agar wedge |
| Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm | World Precision Instruments, Inc. | TW1004 | For microneedles |
| Halocarbon oil 27 | Millipore-Sigma | H8773100ML | For hydration of embryos |
| Heated stage incubator | Zeiss | 4118579020000, 4118609020000, 4118609010000 | For confocal imaging |
| Lab Tissue Wipers, KimWipes | Kimberly-Clark | 34155 | Lab tissue wipers |
| Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished | Zeiss | Discontinued | Injection microscope |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Millipore-Sigma | H36471KG | Component of apple juice plates |
| Microinjector, FemtoJet4x | Eppendorf | 5253000025 | Microinjector |
| Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 μL | Eppendorf | 5242956003 | For loading microneedles |
| Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment | Bernard Instruments, Inc (Houston, TX) | Custom | For performing microinjections |
| Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown | Sutter Instruments | P97 | For pulling capillary tubes to make microneedles |
| Microscope cover glass 24x50-1.5 | Fisher Scientific | 12544E | For mounting embryos |
| Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm | Fisher Scientific | 22037081 | For mounting embryos for injection |
| n-Heptane | Fisher Scientific | H3601 | Component of embryo glue |
| Objective, 10x | Zeiss | Discontinued | 10x objective for injection microscope |
| Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS | Zeiss | 4217679971711 | 40x water objective for confocal |
| Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm) | Zeiss | 4208529871000 | 25x mixed immersion objective for confocal |
| Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA | Zeiss | 4207829900799 | 63x oil objective for confocal |
| Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2 | Daler-Rowney | 038372016954 | For transferring embryos |
| Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white | Kimberly-Clark | 884266344845 | For blotting cell strainer |
| Pasteur pipette, 5 3/4 in | Fisher Scientific | 1367820A | For covering embryos with oil |
| Petri dish, glass, 100 x 20 mm | Corning | 3160102 | For humid incubation chamber |
| Petri dish, plastic, 60 x 15 mm | VWR | 25384092 | For apple juice plates |
| Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 μL | Eppendorf | 2231000604 | For loading the microneedle |
| Pipette tip, xTIP4 250 μL | Biotix | 63300006 | For adding embryo glue to coverslip |
| Razor blade | VWR | 55411050 | For cutting agar wedge, tape, pipette tips |
| Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4x10 μg) | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | G-actin^Red |
| Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps | Fisher Scientific | 033377 | For making embryo glue |
| Screw top jar, 16 oz | Nalgene | 000194414195 | For desiccating embryos |
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 602104PG | For calibrating volume of G-actin injection |
| Sucrose | Millipore-Sigma | 840971KG | Component of apple juice plates |
| Trizma base | Millipore-Sigma | T15031KG | Component of G buffer |
| Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz | Lesaffre Yeast Corporation | 117929157002 | Component of yeast paste |
References
- Figard, L., et al. Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos. Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).
- Ashworth, S. L., et al. ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion. American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).
- Vandebrouck, A., et al. In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).
- Bamburg, J. R., et al.
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).
- Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress. Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).
- Iida, K., Iida, H., Yahara, I. Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells. Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).
- Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).
- Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin. Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).
- Minamide, L. S., et al. Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods. Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).
- Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons. The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).
- Feldman, M. L., Peters, A. Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus. Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).
- Nishida, E., et al. Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells. Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).
- Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).
- Xue, Z., Sokac, A. M. Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage. The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).
- Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization. Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 393 (2), 209-226 (2014).
- Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. Formins filter modified actin subunits during processive elongation. Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (50), 2477 (2011).
- Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 81, 50750 (2013).
- Carreira-Rosario, A., et al. Recombineering homologous recombination constructs in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (77), 50346 (2013).
- Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microinjection techniques for studying mitosis in the Drosophila melanogaster syncytial embryo. Journal of Visualized Experiments. (31), 1382 (2009).
- Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. Visualizing and tracking endogenous mRNAs in live Drosophila melanogaster egg chambers. Journal of Visualized Experiments. (148), 58545 (2019).
- Wessel, A. D., Gumalla, M., Grosshans, J., Schmidt, C. F. The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology. Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).
- Mollinari, C., González, Microinjection and transgenesis. Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols. Cid-Arregui, A., García-Carrancá, A. , Springer. Berlin. 587-603 (1998).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (49), 2503 (2011).
- Oesterle, A. Pipette Cookbook 2018: P-97 and P-1000 Micropipette Pullers. , Sutter Instruments. Novato, CA. (2018).
- Bownes, M. A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 33 (3), 789-801 (1975).
- Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).
- Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing. Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).
