Summary
Målet med detta protokoll är att injicera Rhodamine-konjugerat klotformigt aktin i Drosophila embryon och bild intranuclear actin rod montering efter värmestress.
Abstract
Syftet med detta protokoll är att visualisera intranukleära aktinstavar som monteras i levande Drosophila melanogaster-embryon efter värmestress. Actin stavar är ett kännetecken för en bevarad, inducerbar Actin Stress Response (ASR) som åtföljer mänskliga patologier, inklusive neurodegenerativ sjukdom. Tidigare visade vi att ASR bidrar till morphogenesis misslyckanden och minskad livskraft att utveckla embryon. Detta protokoll möjliggör fortsatt studier av mekanismer som ligger till grund för actin rod assembly och ASR i ett modellsystem som är mycket mottagligt för avbildning, genetik och biokemi. Embryon samlas in och monteras på ett täckglas för att förbereda dem för injektion. Rhodaminkonjugerat klotformigt aktin (G-aktinrött) späds ut och lastas i en mikroneedel. En enda injektion görs till mitten av varje embryo. Efter injektionen inkuberas embryon vid förhöjd temperatur och intranukleära aktinstavar visualiseras sedan genom konfokal mikroskopi. Fluorescensåterhämtning efter försök med fotoblekning (FRAP) kan utföras på aktinstavarna. och andra aktinrika strukturer i cytoplasman kan också avbildas. Vi finner att G-aktinRöd polymeriserar som endogent G-aktin och inte på egen hand stör normal embryoutveckling. En begränsning av detta protokoll är att försiktighet måste vidtas under injektionen för att undvika allvarlig skada på embryot. Men med övning, injicera G-aktinRöd i Drosophila embryon är ett snabbt och tillförlitligt sätt att visualisera aktin stavar och kan lätt användas med flugor av någon genotyp eller med införandet av andra cellulära påfrestningar, inklusive hypoxi och oxidativ stress.
Introduction
Detta protokoll beskriver hur man injicerar G-aktinRöd för att visualisera monteringen av intranukleära aktinstavar i värmestressade embryon som genomgår ett inducerbart Actin Stress Response (ASR)1. Vi utvecklade detta protokoll för att hjälpa studier av ASR, som i embryon leder till störd morfogenes och minskad livskraft, och hos vuxna mänskliga celltyper är associerad med patologier inklusive njursvikt2,muskel myopatier3, och Alzheimers och Huntingtons sjukdom4,5,6,7,8. Denna ASR framkallas av många cellulära påfrestningar, inklusivevärmechock 9,10,11,oxidativ stress4,6,minskad ATP-syntes12, och onormal Huntingtin eller β-amyloid oligomerization4,5,6,7,9,13,14,15,16. Ett kännetecken för ASR är monteringen av avvikande aktinstavar i antingen cytoplasman eller kärnan i drabbade celler, som drivs av stressinducerad hyperaktivering av ett aktin interagerande protein, Cofilin1,5,6,10. Tyvärr kvarstår viktiga kunskapsluckor när det gäller ASR. Till exempel är funktionen hos aktinstavarna inte känd. Vi förstår inte varför stavar bildas i cytoplasman hos vissa celltyper, men andras kärna. Det är inte heller klart om ASR är skyddande eller maladaptivt för celler eller embryon som genomgår stress. Slutligen känner vi fortfarande inte till de detaljerade mekanismerna bakom Cofilin hyperaktivering eller actin stång montering. Således ger detta protokoll en snabb och mångsidig analys för att undersöka ASR genom att visualisera aktinstångsbildning och dynamik i det mycket lätthanterliga experimentella systemet hos det levande fruktflugaembryon.
Protokollet för att mikroinjektera G-aktinrött i levande Drosophila-embryon utvecklades ursprungligen för att studera dynamiken i normala cytoplasmaiska aktinstrukturer 17 under vävnadsuppbyggnadshändelser. I dessa studier fann vi att G-aktinRöd injektion inte negativt påverkade tidiga utvecklingsprocesser i embryot, inklusive cytokines eller gastrulation17,18. Vi ändrade sedan protokollet, anpassning av embryohanteringen och G-aktinRöd injektion för att möjliggöra avbildning av aktinstavar i värmestressade embryon som genomgår ASR1. Andra metoder förutom G-aktinRöd injektion kan användas för att visualisera aktin i embryon. Dessa metoder är beroende av att uttrycka fluorescerande proteiner (FPs) märkta för att fungera eller till domäner av aktinbindande proteiner, såsom Utrophin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP och Moesin-GFP (granskas19). Att använda dessa FP-sonder kräver dock försiktighet eftersom de kan stabilisera eller störa vissa aktinstrukturer, inte lika märka alla aktinstrukturer20, och när det gäller actin-GFP, är mycket överuttryckta - problematiska för analysen av stångenheten som inte bara är stressberoende utan också aktinkoncentrationsberoende1. Således är G-aktinRöd den föredragna sonden för stavstudier i flugembryon, och embryots stora storlek möjliggör sin enkla injektion.
Arbetsflödet för detta protokoll liknar andra väletablerade mikroinjektionstekniker som har använts för att injicera proteiner, nukleinsyror, droger och fluorescerande indikatorer i Drosophila-embryon 21,22,23,24,25,26,27. Men efter mikroinjektionen av G-aktinRöd här utsätts embryon för mild värmestress för att inducera ASR och intranukleär aktinstångsuppsättning. För laboratorier med tillgång till flugor och en injektionsrigg bör denna metod vara lätt genomförbar och anpassningsbar för specifika studielinjer med avseende på ASR, inklusive induktion av olika påfrestningar eller modulering i distinkt genetisk bakgrund.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbered embryosamlingskoppar och äppeljuiceagarplattor
- Fem dagar före injektionsexperimentet,konstruera 28 eller skaffa minst två små embryosamlingskoppar. Gör färska 60 mm äppeljuice agarplattor som ska användas med små uppsamlingskoppar28. Förvara tallrikar i plastlådor täckta med fuktiga pappershanddukar vid 4 °C.
OBS: Små embryosamlingskoppar, befolkade med flugnummer enligt beskrivningen i steg 1.3, kommer att ge tillräckligt antal embryon per experiment, samtidigt som embryohantering och embryoinjektion kan göras på kort tid för att möjliggöra avbildning av tidiga utvecklingsstadier. - Värm äppeljuiceplattor till 18 °C och tillsätt en klick jästpasta i mitten av plattan. Jästpasta är en enkel pasta av aktiv jäst och destillerat vatten.
- För att främja den mest generösa äggläggningen, sätt upp samlingskoppar med flugor 2 dagar före experimentet. Tillsätt minst 100 honor och 50 hanflugor till samlingskopparna och toppa med en beredd äppeljuiceplatta (Bild 1, steg 1). Dagarna före injektionsexperimentet ändras äppeljuiceplattorna minst två gånger varje dag, en gång på morgonen och en gång på kvällen.
OBS: Bästa injektions- och bildbehandlingsresultat erhålls när embryosamlingskoppar hålls vid 18 °C med en 12 h ljus på/ljusavstramningscykel.
2. Förbered en arbetslagerlösning av G-aktinRöd för mikroinjektion
OBS: Denna beredning gör endast 2 μL av ett 5 mg/ ml arbetslager av G-aktinRöd, så om användare inte är vana vid mikroinjektionstekniken är det fördelaktigt att hoppa till steg 3 och öva mikroinjektionerna med en neutral pH-buffert för att bevara värdefullt arbetslager. 10 μg-lagret av G-aktinRött från säljaren kan förvaras i originalförpackningen i en 16 oz skruvkryp burk med ~500 g torkmedel vid 4 °C i upp till 6 månader.
- Förbered en G-buffertlagerlösning i förväg: 5 mM Tris-HCl, 0,2 mM CaCl2, pH 8,0. Filtrera och förvara i rumstemperatur.
- På injektionsdagen bered 1 ml av en G-buffertarbetslösning i ett nytt snäpplocksmikrocentrifugrör på is med G-buffertlagret från steg 2.1, kompletterat med följande vid de angivna slutliga koncentrationerna: 1 mM dithiothreitol (DTT) och 0,2 mM ATP, pH 8.0.
OBS: 1 ml G-buffertarbetslösning är mer än vad som behövs för ett experiment men förenklar beredningen. Överskott kan ignoreras efter experimentet eller användare kan skala ner enligt deras önskemål.- Håll 10 μg G-aktinrött lager på is, tillsätt först 1 μL filtrerat, destillerat vatten till toppen av den rosa droppen av G-aktinRöd inuti röret.
- Tillsätt sedan 1 μL av den kalla, nyberedda G-buffertarbetslösningen från steg 2.2. Rör upp och ner ~20 gånger för att blanda väl med pipettvolymen inställd på 1 μL. G-actinRed-aktien kommer nu att vara vid den slutliga utspädningen på 5 mg/ml.
- Inkubera den beredda G-aktinröd i 30 min på is ostört.
- Centrifugera den beredda G-aktinröda vid 16 000 x g i 20 min vid 4 °C i en mikrocentrifug för att avlägsna eventuella fällningar.
- Rör försiktigt 1,5 μL av supernatanten i ett nytt snaplock mikrocentrifugrör på is, vilket undviker den mörkrosa pelleten.
- Förvara den beredda G-aktin Red-supernatanten på is i upp till 6 timmar tills den är klar att lastas i en mikroneedle.
OBS: Mikroneedles kan dras från kapillärrör i förväg på en mikropipettedragare och sedan lagras vid rumstemperatur på en remsa av modelleringslera i en 100 x 20 mm Petri-skål. Föreslagna parametrar för mikroneedledragning finns i Pipette Cookbook29.
3. Samla embryon och montera för injektion
- Låt flugor lägga embryon i 30 minuter på äppeljuiceplattor med jästpasta vid 18 °C.
- Medan flugor ligger, förvärm en äppeljuice agar tallrik utan jästpasta till rumstemperatur, skär ut en 4 cm x 1 cm rektangulär kil av äppeljuice agar med ett rakblad och placera på en 25 mm x 75 mm glasrutschbana.
- Skördeplatta från 30 minuters insamling och dekahorionatembryon genom att hälla färskt blekmedel, utspädd 1:1 med destillerat vatten, på tallriken och virvla plattan i 1 min, enligtbeskrivningen i 28 (figur 1,steg 2).
OBS: Olika märken av blekmedel säljs i olika koncentrationer. Blekmedlet som används här är 6% natriumhypoklorit från flaskan och späds till en slutlig koncentration av 3% natriumhypoklorit. Andra blekmedelsmärken vid något lägre koncentrationer kommer att fungera lika bra. - Häll blekmedlet och dekhorionerade embryon i en uppsamlingskorg (en 70 μm cellsil) och skölj tallriken två gånger med destillerat vatten från en sprutaflaska och tillsätt dessa tvättar i uppsamlingskorgen.
- Skölj kraftigt de dechorionerade embryona i uppsamlingskorgen med destillerat vatten tills inga jästklumpar är synliga och korgen lämnar inga rosa märken från överskott av blekmedel när de blottas på en pappershandduk.
- Skördeplatta från 30 minuters insamling och dekahorionatembryon genom att hälla färskt blekmedel, utspädd 1:1 med destillerat vatten, på tallriken och virvla plattan i 1 min, enligtbeskrivningen i 28 (figur 1,steg 2).
- Använd en pensel med borst fuktat med destillerat vatten, överför dekhorionerade och tvättade embryon från uppsamlingskorgen på den beredda äppeljuiceagarkilen på glasrutschbanan.
- Använd ett par pincett med fin spets eller en dissekerande nål för att ordna tio embryon i en rak linje längs den rektangulära agarkilens långa axel (figur 1, steg 3). Ordna embryona från huvud till svans, så att deras främre pol är vänd åt höger och den dorsala sidan är vänd mot forskaren (Figur 1,steg 3, förstorad).
- Skär av 0,5 cm av änden av en P200 pipettspets med ett rakblad och doppa i "embryolimmet" (beskrivsi 28). Täck generöst en region 5 mm i bredd(bild 1,steg 4) längs långsidan av ett rektangulärt locklip på 24 mm x 50 mm och låt torka, lim sida upp. Torkning tar ~ 30 s och är klar när hela den limbelagda regionen verkar matt snarare än våt eller glänsande.
OBS: Förbered "embryolim" minst 48 timmar i förväg. Tillsätt n-Heptane till remsor av dubbelsidig tejp i en scintillationsflaska enligt beskrivningen i28. - När "embryolimmet" har torkat, placera försiktigt täckglasets limsida ovanpå raden med justerade embryon på agaren och lämna 2-3 mm utrymme mellan överdragslockets kant och embryoraden.
OBS: Om embryona fastnar för nära överdragslockets kan det leda till att embryona torkar ut för mycket under försökets gång. - Vänd täcket så att embryona nu är vända uppåt. De bör fastna i en linje längs en lång kant av täckglaset och deras ventrala region vänd mot täckglasets närmaste kant(figur 1,steg 4, förstorad).
- Torka embryona genom att placera täcket med embryon försiktigt ovanpå 150 g färskt blått torkmedel lagrat i en 16 oz skruv toppburk. Skruva fast locket ordentligt och inkubera i 8-10 min (Bild 1, steg 5).
- Efter uttorkning, ta bort täckglaset från torkmedelsburken och tejpa varje kortsida av täckglaset till en mikroskopbild, embryosidan uppåt, med två 4 cm2 bitar dubbelsidig tejp så att embryolocket passar på injektionsstadiet (Figur 1, steg 6).
- Tillsätt 2-3 droppar Halocarbon 27-olja med en Pasteur-pipett för att täcka de justerade embryona och skydda dem från ytterligare uttorkning (figur 1,steg 6).
4. Injicera och värma stressembryon för att främja bildandet av aktinstavar
OBS: Alla injektioner görs i ett temperaturkontrollerat rum vid 18 °C.
- Förbered fuktiga inkubationskammare från en petriskål i glas som är minst 100 mm x 20 mm stor och fodra kammaren med vridningar av labbvävnadstorkare fuktade med destillerat vatten (figur 1,steg 8). Förvärm inkubationskamrarna vid 32 °C eller önskad inkubationstemperatur innan embryon injiceras.
- Öppna luftflödesventilen för mikroinjektorn och slå på mikroinjektorn (tryckluft eller husluft med ett tryck på minst 90 psi är lämplig).
- Medan embryon är uttorkande, ladda tillbaka det tidigare beredda G-aktinRöda supernatanten i mikroneedeln med hjälp av en mikrolastarspets. Ställ in pipetten så att den drar upp 1-1,5 μL.
OBS: På grund av aktins viskositet kanske belastningsvolymerna inte är korrekta och det kan finnas tillräckligt med aktin kvar för att ladda minst en till två mikroneedlar till. Upp till 60 embryon kan injiceras per laddad mikroneedle om mikroneedeln kalibreras korrekt och inte blir igensatt under försökets gång. - Fäst mikroneedeln på nålhållaren och dra åt skruven. Anslut luftröret till mikroinjektorn och se till att återflödestrycket på mikroneedlejämvikten till 30 hPa.
- Kalibrera mikroinjektorinställningarna för att driva ut en 100 μm diameter bubbla av G-aktinRöd (~ 500 pL) på en glidmikrometer. Vrid tryckknappen (500-1500 hPa) och injektionspulsens tidsratt (0,1-0,5 s) på mikroinjektorn för att få rätt bubbelstorlek. Justera dessa inställningar varje gång en ny mikroneedle laddas för att ta hänsyn till variation i aktinviskositet och mikroneedlespetsstorlek.
OBS: Det beredda G-aktinröttetär trögflytande och det kan finnas luft i spetsen på mikroneedeln som ska utvisas innan embryon injiceras. Om G-aktinRöd inte lätt avvisar från mikroneedelns spets, bryt försiktigt mikroneedlespetsen mot kanten av glidmikrometern. - Placera diabilden med monterade embryon på mikroskopstadiet.
OBS: Varje injektion som sätts upp kommer att vara annorlunda, så forskare måste justera sin injektionsmetod i enlighet därmed. Här flyttas embryona med avseende på en stationär mikroneedle, injicerar varje embryo genom att köra embryot i mikroneedeln. - Justera mikromanipulatorstadiet och fokus för 10x-målet på ljusmikroskopet så att embryona är synliga. Embryona är i rätt fokalplan när konturerna av vitelinmembranet är skarpast och embryot verkar störst. Välj embryon att injicera som befinner sig i rätt utvecklingsstadium, så att när inkubationen efter injektionen är klar når större delen av kopplingen önskat utvecklingsstadium (t.ex. injicera embryon på Bownes stadium 2-330 för att observera stavar vid cellulärisering efter värmestress vid 32 °C).
- Använd mikroneedlekontrollerna för att föra in nålen i samma fokalplan som embryona.
OBS: Om mikroneedeln fastnar på täckglaset medan du flyttar scenen eller mikroneedeln, är mikroneedeln för nära bilden och är inte i rätt brännplan. Mikroneedeln ska vara parallell med täckglaset och inte i en signifikant vinkel(figur 1,steg 7). - Sätt in mikroneedeln i embryot så att den träffar embryot i mitten av sin ventrala region, vid embryot "ekvator". Avtryckarinjektion med fotpedalen eller knappen "injicera" när mikroneedlespetsen är synlig inuti embryots mitt (bild 1, steg 7).
- Injicera G-aktinRöd en gång och ta långsamt bort mikroneedeln. Flytta scenen och upprepa för varje embryo i lämpligt utvecklingsstadium.
OBS: Embryots expansion är normal eftersom G-aktinrött injiceras och lite cytoplasma kan läcka ut ur embryot. - När alla embryon har injicerats, placera diabilden med embryona i den beredda fuktiga inkubationskammaren och stäng locket(figur 1,steg 8). Om man försöker få embryon som når cellulärisering, stressa värmen embryona vid 32 °C i 60-75 min i den fuktiga inkubationskammaren.
OBS: Inkubationstider noteras som möjliggör visualisering av stavar i cellulärt värmestressade embryon. Inkubationstiden blir längre för embryon som inte är värmestresskontroll eftersom utvecklingen kommer att vara långsammare vid en lägre temperatur31. Dessa kontrollembryon kan inkuberas i fuktiga kamrar vid temperaturer som 18 °C eller 25 °C, beroende på utformningen av det specifika experimentet och den fråga som ska ställas. Den minsta inkubationstid som krävs för att G-aktinrött ska kunna spridas i hela embryot är 30 min.
5. Bildaktinstavar i värmestressade embryon genom konfokal mikroskopi
- Medan embryona värmestressas, slå på det konfokala mikroskopet och välj 561 nm laserkanal.
- Flytta objektivet (25x, 40x eller 63x rekommenderas) till arbetspositionen.
- Om avbildning värme stressade embryon, ställ sedan in den uppvärmda sceninkubatorn för att uppnå en inre temperatur på 32 °C. En punkt-och-skjut- eller infraröd termometer kan användas för att kontrollera temperaturen vid eller nära målet.
- Ta bort diabilden med injicerade embryon från den fuktiga inkubationskammaren efter att inkubationen är klar (bild 1, steg 9).
- Arbeta snabbt, bänd försiktigt av de dubbelsidiga tejpbitarna som användes för att fästa täcket med monterade embryon på bilden (Bild 1, steg 9).
VARNING: Var försiktig under dessa steg eftersom täcken lätt kan splittras om för mycket kraft appliceras. - Stick ihop två 2,5 cm långa bitar dubbelsidig tejp och skär tejpen halvt på längden för att göra två remsor, 2,5 x 0,5 cm långa (Bild 1, steg 10).
- Fäst två tredjedelar av längden på varje tejpremsa på det första täcket och flankera varje sida av embryona i Halocarbon 27-olja(figur 1,steg 10, orange),och lämna en tredjedel av tejpremsorna hängande från kanten på det första täcket där embryona sitter fast. Använd handskhänder och var försiktig så att du inte rör embryona under detta steg.
- Placera försiktigt ett andra rektangulärt täckglas ovanpå tejpremsorna för att smöra embryona mellan täckena(figur 1,steg 10, blå). Rikta in de 25 mm kanterna men håll de 50 mm kanterna förskjutna från varandra med 1 cm i bredd.
OBS: Detta andra omslagslips fulla yta kommer att bli den nya bildytan som kommer att möta objektivet, så var försiktig så att du inte får fingeravtryck eller Halocarbon 27-olja på denna andra täckyta. Förskjutningen är nödvändig så att extra Halocarbon 27-olja kan tillsättas för att jämnt fördjupa embryona. Tillsätt vid behov Halocarbon 27-olja i sömmen där de två täckena möts högst upp på smörgåsen och det kommer att täcka embryona med kapillärverkan (se streckade linjer i figur 1, steg 10). - Knacka försiktigt ner på de områden på täckglaset som är direkt ovanpå tejpremsorna med den trubbiga sidan av en rakblad för att få täckglaset att hålla fast vid tejpen.
- Vänd täckglassmörgåsen och placera på en labbvävnadstorkare för att hålla avbildningsytan ren och bära till det konfokala mikroskopet(figur 1,steg 11). Se till att tejpen sitter fast helt på båda täckena innan du avbildar.
- Kontrollera att det uppvärmda stadiet är vid temperatur och om du använder ett inverterat mikroskop, tillsätt nedsänkningsvätska på den valda objektivet.
- Placera täckglassmörgåsen på scenen noggrant för att säkerställa att den nya bildytan(2:a täcket) är den som vidrör nedsänkningsvätskan(figur 1,steg 11).
OBS: Vid behov, fäst täckslipsmörgåsen på scenen med två små bitar dubbelsidig tejp för att förhindra onödig rörelse under avbildning om täckglasen inte passar bra i det uppvärmda stadiet. - Fokusera på ett embryo som är i cellulärisering (Bownes steg 4a30) eller önskat utvecklingsstadium med antingen överfört ljus eller fluorescens.
- När ett embryo har kommit i fokus, byt till laserförvärvsläget på det konfokala mikroskopet och justera laserkraft och förstärkning, ramstorlek, plattsättning och projektionsinställningar efter önskemål.
- Ta ytbilder genom fokalplanerna i embryots atomkärnor för att hitta intranukleära aktinstavar. Stavar ska förekomma i flera riktningar som ljusa streck eller punkter inuti de jämförelsevis mörka kärnorna (figur 2A, 2C).
6. Alternativa bildexperiment
- Utför FRAP för att undersöka aktinomsättning längs längden på intranukleära aktinstavar eller i cytoplasmiska aktinstrukturer, såsom plasmamembranets spetsar under celluläriseringen.
- I bildframställningsprogramvaran väljer du ett rektangulärt område runt fårspetsar eller aktinstavar för att förvärva experimentet.
- Välj en liten kvadratisk region i mitten av en aktinstav inom den rektangulära förvärvsregionen för att bleka. Se till att stångens spetsar är synliga och inte bleks under experimentet för att möjliggöra noggrann spårning av stången inuti kärnan.
- Ställ in bleklasern på iterera 50x och ställ in blekmedelslasereffekten på maximalt.
- Välj en tidskurs för att hämta bilder varje sekund för totalt upp till 120 s med maximal pixelhastighet och ställ in lasern på blekmedel efter de första två sekunderna av bildförvärvet.
- Kvantifiera uppgifterna för att bestämma halvtidsåterhämtningen av fluorescens1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett schematiskt arbetsflöde för embryohantering avbildas i figur 1, och en tidsplan för ett typiskt experiment presenteras i tabell 1. En uppskattning för ett bra experimentellt resultat är att för varje 10 embryon som injiceras kommer minst hälften av de embryon som ses att vara i rätt utvecklingsstadium, oskadade och uppvisa en robust ASR med värmestress vid 32 °C. Denna ASR kommer att bevisas genom montering av intranukleära aktinstavar som visas i den representativa ytvybilden av ett embryo i figur 2A (höger panel). Aktinstavar kommer att visas i flera riktningar (parallella eller vinkelräta mot bildplanet) inuti kärnorna och kan avbildas genom flera fokalplan. Som jämförelse kommer kontrollembryon som inkuberas vid 18 °C inte att visa aktinstavar(figur 2A, vänster panel). De procentkärna som innehåller stavar kan kvantifieras, vilket visas i figur 2B. Dessutom får FRAP-experiment utföras på stavar(figur 2C). En föreslagen kvantifieringsmetod för FRAP-datarefereras i 1 och ett exempel på ett fluorescensåterställningsdiagram för en blekt kontra oblekt region i en aktinstav visas i figur 2D.
Om ett embryo skadas allvarligt av injektionen eller blir för torrt under experimentet kan mitotisk asynkron observeras och cellulärisering kommer att störas. Ibland kanske stavar inte är synliga på grund av att man inte får tillräckligt med aktin injicerat i embryot. Om detta händer, se till att mängden G-aktinrött injicerat är 500 pL (mätt med en mikrometer i steg 4.5) och bekräfta att denna mängd förblir konsekvent mellan embryon genom att göra en testinjektion i den omgivande oljan för att kontrollera storleken på G-aktinRöd bubbla mellan varje embryomikroinjektion. För att säkerställa stångvisualisering, arbeta snabbt för att lägga till täckglaset och flytta embryona till det uppvärmda mikroskopstadiet när de tas från den fuktiga kammaren i steg 5.4, eftersom stavuppsättningen ärvändbar 1 och stavarna kan demonteras om embryona hålls vid en temperatur som är mindre än 32 °C i mer än 30 min.
Figur 1: Schematisk översikt över embryohantering under försöket. (1) Vuxna flugor i embryosamlingskoppar lägger embryon på äppeljuiceagarplattor. (2)Embryon dekanteras med 1:1 blekmedel: destillerat vatten, hälls i en uppsamlingskorg och tvättas noggrant med destillerat vatten för att avlägsna blekmedel och skräp. (3) Embryon överförs med en pensel till en rektangulär äppeljuiceagarkil på en rutschkana och placeras på sidorna, från huvud till svans, med dorsala region vänd mot kanten av agar. (4)Ett 5 x 50 mm stort område av ett glaslock (orange) är belagt med "embryolim" och pressas försiktigt ner på den rad embryon som är ordnade på agaren för att fästa dem på täckglaset. (5) Täckglaset med embryon är inverterat så att embryona är vända uppåt. Embryona är uttorkade i en skruvburk. (6) Omedelbart efter uttorkning tejpas täcket fast på en rutschkana, embryon uppåt och embryon är täckta med Halocarbon 27-olja. (7) En mikroneedle som tidigare laddats med beredd G-aktinRöd används för att göra en enda injektion i mitten av ventrala regionen i varje embryo, med nålen placerad parallellt med täckglaset. (8) Efter injektionen inkuberas embryon inuti en petriskål fuktad med fuktiga vävnadstorkare vid kontrolltemperaturen (18 °C) eller med värmespänning (32 °C). (9) Efter inkubation avlägsnas täckglaset med embryona på från diabilden. (10) Två bitar dubbelsidig tejp läggs ovanpå varandra, skivas i halv längd och placeras på vardera sidan av oljan som omger embryona på det första täcket. Ett andra täckskydd (blått) placeras ovanpå det första för att skapa en ny bildyta, förskjutning så att det lämnar en lucka för mer olja som ska tillsättas för att täcka embryona vid behov. (11) Om avbildningen på ett inverterat konfokalt mikroskop inverteras täckklämman så att det andra täckglaset står inför målet. Avbildning görs i en inkuberad kammare, och aktinstavar visualiseras över flera fokala plan i varje embryos kärnor. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Representativa resultat av aktinstavar i värmestressade embryon. A)Aktinstavar ses inte i ett embryo som inkuberades vid kontrolltemperaturen 18 °C (vänster panel), utan ses i kärnan hos ett embryo som var värmestressat vid 32 °C (höger panel). B)Kvantifiering av procentandelen kärnor med aktinstavar från ett representativt experiment. Varje punkt representerar ett embryo där stavar och atomkärnor räknades i hela den bildade regionen (n = 22 embryon vid 18 °C; n = 23 embryon vid 32 °C; felstänger visar standardavvikelse). En students t-test, med ojämn varians antagen, användes för att beräkna p-värdet. C)En representativ tidsserie visar FRAP på en aktinstång. Den del av stången som blekts indikeras av en vit pilspets. Förblekning är 2 s före blekningssteget. Tid = 0 s är blekningssteget, och fluorescens återhämtning spårades fram till 60 s post blekmedel. D)Ett område visar återhämtningsdynamik för aktinfluorescens i en blekt region i en stång, jämfört med en oblekt region i samma stång. Stavar är anmärkningsvärt stabila och aktin inom dem omsättning. Således ses ingen återhämtning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Tabell 1: Experimentellt arbetsflöde med föreslagen tidsplan. Den här tidsplanen sammanfattar den förväntade tid det tar att slutföra varje steg i protokollet.
| Ordning | Steg | Erforderliga tid för varje steg | Beskrivning |
| 1 | 1.1 | 5 dagar i förväg | Gör embryosamlingsburar. Häll äppeljuice agar tallrikar. |
| 2 | 1.2-1.3 | 2 dagar i förväg | Sätt upp uppsamlingsburar med vuxna han- och honflugor. |
| 3 | 2.6 Notera | 1 dag i förväg | Dra kapillärrör för att göra mikroneedles. |
| 4 | 2.1-2.6 | 1 h | Förbered G-aktin. |
| 5 | 3.1 | 30 min | Låt flugor lägga ägg. |
| 6 | 3.2-3.10 | 15-30 min | Samla, montera, desiccate embryon. Täck embryon med olja. |
| 7 | 4.1 | 30 min i förväg | Förbered fuktiga inkubationskammare. |
| 8 | 4.2-4.4 | 1 min | Ladda mikroneedle. |
| 9 | 4.5-4.10 | 10-20 min | Kalibrera G-aktinbubblans storlek och injicera embryon. |
| 10 | 4.11 | 30 min-1+ h | Inkubera/värma stressembryon. |
| 11 | 5.1-5.3 | 1 h i förväg | Slå på mikroskop och inkubationssteg. |
| 12 | 5.4-5.10 | 5 min | Smörgåsembryon mellan täckglas för avbildning. |
| 13 | 5.11-6.6 | 15 min-1+ h | Bild intranuclear aktin stavar i embryon. |
Tabell 2: Felsökningsförslag. Den här tabellen innehåller förslag på felsökning för att underlätta slutförandet av protokollet.
| Potentiellt problem | Förslag |
| Flugor lägger inte tillräckligt med embryon. | Ställ in koppen minst 5 dagar i förväg (se steg 1.1-1.3). Byt tallrikar 3x per dag som leder fram till experimentet för att uppmuntra äggläggning. Låt flugor lägga embryon i 1 h istället för 30 min. Ställ in koppar med unga vuxna flugor. |
| Inget G-aktin utvisas från mikroneedeln. | Öka tryck- och tidsinställningarna på mikroinjektor. Bryt mikroneedlespetsen ytterligare (se steg 4.5 Obs). Eftersom stora träskor kanske inte rensar, ladda en ny nål. |
| Svårt att kalibrera en tillräckligt liten bubbelstorlek. | Justera tryck- och tidsinställningarna (se steg 4.5). Eftersom mikroneedlespetsöppningen kan vara för stor, ladda en ny nål. |
| Embryon frigörs från limet på täckglaset under injektionen. | Justera "embryolim"-konsistensen för framtida täcken genom att tillsätta mer dubbelsidig tejp till heptanlösningen (se steg 3.5 Obs). |
| Embryon torkar ut under temperaturinkubation. | Se till att bilden är jämn i inkubationskammaren (se steg 4.11) och att oljan inte vidrör något som kan transportera bort den. Tillsätt extra droppar olja till embryona. Minska uttorkningstiden före injektion (se steg 3. 8). |
| Oljan täcker inte embryona helt mellan det första och det andra täcket. | Tillsätt extra olja via kapillärverkan till det lilla gapet mellan täckglasen (se steg 5.8 Obs). |
| Intranukleära aktinstavar är inte synliga i värmestressade embryon. | Injicera en större volym G-aktin (se steg 4.5). Kontrollera att temperaturen på både inkubationen efter injektionen (se steg 4.11) och bildkammaren är 32 °C (se steg 5.3). |
| Stora bubblor av G-aktin är synliga runt injektionsstället av embryon. | Injicera en mindre volym G-aktin (se steg 4.5). Öka embryots uttorkningstid för att främja bättre retention av det injicerade aktinet inuti embryot (se steg 3. 8). |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Betydelsen av denna metod är att den använder det väletablerade protokollet för mikroinjektion i Drosophila-embryon 21,22,23,24,25,26,27 för att möjliggöra ny forskning om ASR och medföljande aktinstångsmontering. En stor fördel med att injicera G-aktinRött i levande embryon är att ASR kan studeras i olika sammanhang. För framtida studier kan dessa sammanhang omfatta injektion av embryon av andra genotyper som en del av en mutantskärm eller utsätta injicerade embryon för olika stressförhållanden, såsom oxidativ stress4,32. Även om det inte beskrivs i detalj här, kan denna injektionsteknik också modifieras för att injicera nukleinsyror, andra proteiner, droger och indikatorfärger (för exempel,se 21,22,23,24,32) för att studera ASR. Denna metod presenterar således ett antal metoder för att identifiera de olika påfrestningar som inducerar ASR, ytterligare karakterisera cellulära svar under ASR (t.ex. förändringar i mitokondriell aktivitet) och avslöja nya molekyler och mekanismer som ligger till grund för intranukleär aktinstångsuppsättning.
Några kritiska steg i protokollet inkluderar följande: I steg 3.8 måste embryon vara ordentligt uttorkade för att säkerställa framgångsrik injektion och bästa embryohälsa. Uttorkningstiden beror på laboratoriets omgivningstemperatur och fuktighet, så det rekommenderas att öva montering, uttorkning och injektioner med en neutral pH-buffert först för att fastställa denna parameter för hantering av embryona. I steg 4.5 måste mikroneedle- och injektionsinställningarna finjusteras så att tillräckligt med G-aktinrött kan injektionas i embryon. Om för lite G-aktinRöd injiceras i embryot, kan aktinstavar inte lätt visualiseras, eftersom bildandet av aktinstavar är beroende av koncentrationen av fri aktin1. Dessutom blir det svårt att få konsekventa resultat från FRAP-experiment om det inte finns tillräckligt med G-aktinrött injicerat, eftersom fluorescensintensiteten inte kommer att vara tillräckligt hög för att övervinna bakgrundsfluorescens. Därför är det viktigt att kalibrera bubbelstorleken varje gång en ny nål laddas och används. G-aktinRöd är trögflytande och tenderar att täppa till inuti mikroneedeln. Ibland kan detta leda till att man injicerar varierande mängder G-aktin i embryona. Om mikroneedeln är igensatt och röjningen av mikroneedeln med högt tryck misslyckas, kan det vara nödvändigt att försöka bryta mikroneedelns spets ytterligare eller till och med ladda en ny mikroneedle och injicera en ny uppsättning embryon. Slutligen, i steg 4.11, måste embryon inkuberas vid förhöjd temperatur och för att tillräckligt med tid för asr ska induceras och stavar bildas1. Temperaturen hos alla inkubatorer bör övervakas kontinuerligt, tiden för överföring av embryon från inkubator till inkubator måste begränsas och en timer bör användas för alla inkubationer. Andra möjliga problem listas i tabell 2 med medföljande felsökningstips.
En viktig begränsning av detta protokoll är att exceptionell försiktighet måste vidtas för att bevara embryonas hälsa under injektioner, inkubationer och avbildningar. Protokollet har utformats för att maximera embryohälsan, och med betydande praxis kan en forskare slutföra alla steg i protokollet med embryoutveckling som fortskrider i de takt som förväntas per temperatur31. En andra begränsning av protokollet är behovet av en mikroinjektionsrigg, som kan vara ganska dyr och inte är vanlig utrustning för varje fluglabb. Men om ett angränsande labb är utrustat för att injicera andra embryon (t.ex. Xenopus,Zebrafish och Caenorhabditis elegans) ellervidhäftande celler, är injektionsriggen som används sannolikt lämplig för Drosophila-injektioner. I så fall behöver endast nålens form anpassas för Drosophila-embryon enligt riktlinjerna i Pipette Cookbook29. Alternativt finns det några billigare micoinjector-alternativ på marknaden (t.ex. analoga mikroinjektorer), vilket avsevärt kan minska kostnaden för att montera en injektionsrigg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter har förklarats.
Acknowledgments
Författarna erkänner tacksamt Liuliu Zjengs och Zenghui Xues arbete, som hjälpte till att bana väg för denna teknik i Sokac-labbet, liksom Hasan Seede som hjälpte till med analysen. Arbetet med denna studie finansieras genom ett bidrag från NIH (R01 GM115111).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore-Sigma | A23835G | Component of G buffer |
| Apple juice, Mott's, 64 fl oz | Mott's | 014800000344 | Component of apple juice plates |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Component of apple juice plates |
| Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite | KIK International | 059647210020 | For dechorionating embryos |
| Calcium chloride | Millipore-Sigma | C1016500G | Component of G buffer |
| Cell strainer, 70 μm | Falcon | 352350 | For collecting dechorionated embryos |
| Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan | Zeiss | 0000001994956 | For imaging intranuclear actin rods |
| Desiccant | Drierite | 24001 | For desiccating embryos |
| Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom | Zeiss | 4350649000000 | For arranging embryos on agar wedge |
| Dissecting needle, 5 in | Fisher Scientific | 08965A | For arranging embryos on agar wedge |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP1725 | Component of G buffer |
| Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in | 3M | 021200010323 | For making embryo glue |
| Embryo collection cage | Genessee Scientific | 59100 | For housing adult flies and collecting embryos |
| Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72701D | For arranging embryos on agar wedge |
| Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm | World Precision Instruments, Inc. | TW1004 | For microneedles |
| Halocarbon oil 27 | Millipore-Sigma | H8773100ML | For hydration of embryos |
| Heated stage incubator | Zeiss | 4118579020000, 4118609020000, 4118609010000 | For confocal imaging |
| Lab Tissue Wipers, KimWipes | Kimberly-Clark | 34155 | Lab tissue wipers |
| Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished | Zeiss | Discontinued | Injection microscope |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Millipore-Sigma | H36471KG | Component of apple juice plates |
| Microinjector, FemtoJet4x | Eppendorf | 5253000025 | Microinjector |
| Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 μL | Eppendorf | 5242956003 | For loading microneedles |
| Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment | Bernard Instruments, Inc (Houston, TX) | Custom | For performing microinjections |
| Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown | Sutter Instruments | P97 | For pulling capillary tubes to make microneedles |
| Microscope cover glass 24x50-1.5 | Fisher Scientific | 12544E | For mounting embryos |
| Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm | Fisher Scientific | 22037081 | For mounting embryos for injection |
| n-Heptane | Fisher Scientific | H3601 | Component of embryo glue |
| Objective, 10x | Zeiss | Discontinued | 10x objective for injection microscope |
| Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS | Zeiss | 4217679971711 | 40x water objective for confocal |
| Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm) | Zeiss | 4208529871000 | 25x mixed immersion objective for confocal |
| Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA | Zeiss | 4207829900799 | 63x oil objective for confocal |
| Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2 | Daler-Rowney | 038372016954 | For transferring embryos |
| Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white | Kimberly-Clark | 884266344845 | For blotting cell strainer |
| Pasteur pipette, 5 3/4 in | Fisher Scientific | 1367820A | For covering embryos with oil |
| Petri dish, glass, 100 x 20 mm | Corning | 3160102 | For humid incubation chamber |
| Petri dish, plastic, 60 x 15 mm | VWR | 25384092 | For apple juice plates |
| Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 μL | Eppendorf | 2231000604 | For loading the microneedle |
| Pipette tip, xTIP4 250 μL | Biotix | 63300006 | For adding embryo glue to coverslip |
| Razor blade | VWR | 55411050 | For cutting agar wedge, tape, pipette tips |
| Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4x10 μg) | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | G-actin^Red |
| Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps | Fisher Scientific | 033377 | For making embryo glue |
| Screw top jar, 16 oz | Nalgene | 000194414195 | For desiccating embryos |
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 602104PG | For calibrating volume of G-actin injection |
| Sucrose | Millipore-Sigma | 840971KG | Component of apple juice plates |
| Trizma base | Millipore-Sigma | T15031KG | Component of G buffer |
| Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz | Lesaffre Yeast Corporation | 117929157002 | Component of yeast paste |
References
- Figard, L., et al. Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos. Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).
- Ashworth, S. L., et al. ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion. American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).
- Vandebrouck, A., et al. In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).
- Bamburg, J. R., et al.
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).
- Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress. Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).
- Iida, K., Iida, H., Yahara, I. Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells. Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).
- Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).
- Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin. Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).
- Minamide, L. S., et al. Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods. Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).
- Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons. The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).
- Feldman, M. L., Peters, A. Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus. Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).
- Nishida, E., et al. Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells. Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).
- Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).
- Xue, Z., Sokac, A. M. Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage. The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).
- Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization. Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 393 (2), 209-226 (2014).
- Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. Formins filter modified actin subunits during processive elongation. Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (50), 2477 (2011).
- Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 81, 50750 (2013).
- Carreira-Rosario, A., et al. Recombineering homologous recombination constructs in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (77), 50346 (2013).
- Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microinjection techniques for studying mitosis in the Drosophila melanogaster syncytial embryo. Journal of Visualized Experiments. (31), 1382 (2009).
- Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. Visualizing and tracking endogenous mRNAs in live Drosophila melanogaster egg chambers. Journal of Visualized Experiments. (148), 58545 (2019).
- Wessel, A. D., Gumalla, M., Grosshans, J., Schmidt, C. F. The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology. Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).
- Mollinari, C., González, Microinjection and transgenesis. Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols. Cid-Arregui, A., García-Carrancá, A. , Springer. Berlin. 587-603 (1998).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (49), 2503 (2011).
- Oesterle, A. Pipette Cookbook 2018: P-97 and P-1000 Micropipette Pullers. , Sutter Instruments. Novato, CA. (2018).
- Bownes, M. A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 33 (3), 789-801 (1975).
- Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).
- Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing. Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).
