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Developmental Biology

Imagerie Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos Imaging Intra

Published: May 15, 2020 doi: 10.3791/61297
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2,3
1Integrative Molecular and Biomedical Sciences, Baylor College of Medicine, 2Department of Cell and Molecular Biology, School of Molecular and Cellular Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

Summary

Le but de ce protocole est d’injecter de la globulaire conjuguée à la rhodamine dans les embryons de Drosophila et l’assemblage intranucléaire de tige d’actine d’image suivant le stress thermique.

Abstract

Le but de ce protocole est de visualiser les tiges intranucléaires d’actine qui se réunissent dans les embryons vivants de Drosophila melanogaster suivant le stress thermique. Les tiges d’actine sont la marque d’une réponse de stress actin (ASR) conservée et inductible qui accompagne les pathologies humaines, y compris les maladies neurodégénératives. Précédemment, nous avons montré que l’ASR contribue aux échecs de morphogenèse et à la viabilité réduite des embryons en développement. Ce protocole permet d’étudier en continu les mécanismes sous-jacents à l’assemblage des tiges d’actine et à l’ASR dans un système modèle très sensible à l’imagerie, à la génétique et à la biochimie. Les embryons sont recueillis et montés sur un coverslip pour les préparer à l’injection. L’actine globulaire conjuguée à la rhodamine (G-actinRed)est diluée et chargée dans un microneedle. Une seule injection est effectuée au centre de chaque embryon. Après injection, les embryons sont incubés à haute température et les tiges d’actine intranucléaire sont ensuite visualisées par microscopie confoccale. La récupération de la fluorescence après des expériences de photobleaching (FRAP) peut être effectuée sur les tiges d’actine; et d’autres structures riches en actine dans le cytoplasme peuvent également être photographiées. Nous constatons que G-actinRed polymérise comme la G-actine endogène et n’interfère pas, à lui seul, avec le développement normal de l’embryon. Une limitation de ce protocole est que le soin doit être pris pendant l’injection pour éviter des dommages graves à l’embryon. Cependant, avec la pratique, l’injection de G-actinRouge dans les embryons de Drosophila est un moyen rapide et fiable de visualiser les tiges d’actine et peut facilement être utilisé avec des mouches de n’importe quel génotype ou avec l’introduction d’autres contraintes cellulaires, y compris l’hypoxie et le stress oxydatif.

Introduction

Ce protocole décrit comment injecter G-actinRed pour visualiser l’assemblage de tiges d’actine intranucléaires dans les embryons stressés par la chaleur qui subissent une réponse inductible au stress actin (ASR)1. Nous avons développé ce protocole pour faciliter les études de l’ASR, qui dans les embryons conduit à une morphogenèse perturbée et une viabilité réduite, et dans les types de cellules humaines adultes est associée à des pathologies, y compris l’insuffisancerénale 2, myopathies musculaires3, et la maladie d’Alzheimer et de Huntington4,5,6,7,8. Cet ASR est induit par de nombreuses contraintes cellulaires, y compris le chocthermique 9,10,11, stress oxydatif4,6, réduction de la synthèse ATP12, et anormal Huntingtin ou oligomérisation β-amyloïde4,5,6,7,9,13,14,15,16. Une caractéristique de l’ASR est l’assemblage de tiges d’actine aberrantes dans le cytoplasme ou le noyau des cellules affectées, qui est entraînée par l’hyperactivation induite par le stress d’une protéine actin interagissant, Cofilin1,5,6,10. Malheureusement, des lacunes importantes subsistent en matière de connaissances concernant le RSE. Par exemple, la fonction des tiges d’actine n’est pas connue. Nous ne comprenons pas pourquoi les tiges se forment dans le cytoplasme de certains types de cellules, mais le noyau d’autres. Il n’est pas clair non plus si l’ASR est protecteur ou inadapté pour les cellules ou les embryons soumis à un stress. Enfin, nous ne connaissons toujours pas les mécanismes détaillés sous-jacents à l’hyperactivation cofiline ou à l’assemblage de tiges d’actine. Ainsi, ce protocole fournit un essai rapide et polyvalent pour sonder l’ASR en visualisant la formation et la dynamique de tige d’actine dans le système expérimental hautement tractable de l’embryon vivant de mouche de fruit.

Le protocole de microinject G-actinRouge dans les embryons vivants de Drosophila a été initialement développé pour étudier la dynamique des structures normales d’actine cytoplasmique17 pendant des événements de construction de tissu. Dans ces études, nous avons constaté que l’injection rouge de G-actin n’a pas affecté défavorablement des processus développementaux tôt dans l’embryon, y compris la cytokinésie ou la gastrulation17,18. Nous avons ensuite modifié le protocole, en adaptant la manipulation de l’embryon etl’injection rouge de G-actine pour permettre l’imagerie des tiges d’actine dans les embryons stressés par la chaleur subissant l’ASR1. D’autres méthodes que l’injection de G-actin Red peuvent être utilisées pour visualiser l’actine chez les embryons. Ces méthodes reposent sur l’expression de protéines fluorescentes (FPs) étiquetées à l’actine ou à des domaines de protéines liant l’actine, telles que utrophine-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP, et Moesin-GFP (examinédans 19). Toutefois, l’utilisation de ces sondes FP exige de la prudence parce qu’elles peuvent stabiliser ou perturber certaines structures d’actine, ne pas étiqueter également toutes les structures d’actine20, et dans le cas de l’actin-GFP, sont fortement surexprimées – problématiques pour l’analyse de l’assemblage de tiges qui dépend non seulement du stress, mais aussi de la concentration d’actinedépendante 1. Ainsi, G-actinRed est la sonde préférée pour les études de tige dans les embryons de mouche, et la grande taille de l’embryon permet son injection facile.

Le flux de travail de ce protocole est similaire à d’autres techniques bien établies de microinjection qui ont été utilisées pour injecter des protéines, des acides nucléiques, des médicaments et des indicateurs fluorescents dans les embryons de Drosophile 21,22,23,24,25,26,27. Cependant, à la suite de la microinjection de G-actinRouge ici, les embryons sont exposés à un léger stress thermique pour induire l’ASR et l’assemblage intranucléaire de tige d’actine. Pour les laboratoires ayant accès aux mouches et une plate-forme d’injection, cette méthode devrait être facilement implémentable et adaptable pour des lignes d’étude spécifiques en ce qui concerne l’ASR, y compris son induction par différents stress ou modulation dans des milieux génétiques distincts.

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Protocol

1. Préparer des tasses de collecte d’embryons et des assiettes d’agar de jus de pomme

  1. Cinq jours avant l’expérience d’injection, construisez28 ou procurez-vous au moins deux petites tasses de collecte d’embryons. Faire des assiettes fraîches de 60 mm de jus de pomme agar à utiliser avec de petites tasses de collecte28. Conserver les assiettes dans des boîtes en plastique recouvertes de serviettes en papier humide à 4 °C.
    REMARQUE : Les petites tasses de collecte d’embryons, peuplées de nombres de mouches décrites à l’étape 1.3, fourniront un nombre suffisant d’embryons par expérience, tout en veillant à ce que la manipulation et l’injection d’embryons puissent être effectuées en assez peu de temps pour permettre l’imagerie des premiers stades du développement.
  2. Chauffer les assiettes de jus de pomme à 18 °C et ajouter une touche de pâte de levure au centre de l’assiette. La pâte de levure est une pâte simple de levure active et d’eau distillée.
  3. Pour promouvoir la ponte la plus généreuse, installez des tasses de collecte avec des mouches 2 jours avant l’expérience. Ajouter au moins 100 femelles et 50 mouches mâles aux tasses de collecte, et garnir d’une assiette préparée de jus de pomme (figure 1, étape 1). Les jours précédant l’expérience d’injection, changez les assiettes de jus de pomme au moins deux fois par jour, une fois le matin et une fois le soir.
    REMARQUE : Les meilleurs résultats d’injection et d’imagerie sont obtenus lorsque les tasses de collecte d’embryons sont conservées à 18 °C avec une lumière de 12 h sur/lumière hors cycle.

2. Préparer une solution de stock de travail de G-actinRed pour la microinjection

REMARQUE : Cette préparation ne fait que 2 μL d’un stock de travail de 5 mg/mL de G-actinRed,donc si les utilisateurs ne sont pas habitués à la technique de microinjection, il est avantageux de passer à l’étape 3 et de pratiquer les microinjections avec un tampon de pH neutre pour conserver le précieux stock de travail. Le stock de 10 μg de G-actinRed du vendeur peut être stocké dans son emballage d’origine dans un bocal de 16 oz vissé avec ~500 g de desiccant à 4 °C pendant un temps jusqu’à 6 mois.

  1. Préparez une solution de stock g-buffer à l’avance : 5 mM Tris-HCl, 0,2 mM CaCl2, pH 8,0. Filtrer et conserver à température ambiante.
  2. Le jour des injections, préparez 1 mL d’une solution de travail g-tampon dans un tube de microcentrifugeuse à bouchons cassés frais sur la glace à l’aide du stock tampon G de l’étape 2.1, complété par ce qui suit aux concentrations finales indiquées : 1 mM dithiothreitol (DTT) et 0,2 mM ATP, pH 8.0.
    REMARQUE : Le volume de 1 mL de solution de travail G-buffer est supérieur à ce qui est nécessaire pour une expérience, mais simplifie la préparation. L’excès peut être jeté après l’expérience ou les utilisateurs peuvent réduire en fonction de leur préférence.
    1. Garder lebouillon rouge de 10 μg de G-actine sur la glace, ajouter d’abord 1 μL d’eau filtrée distillée au sommet de la gouttelette rose de G-actinRed à l’intérieur du tube.
    2. Ensuite, ajoutez 1 μL de la solution de travail g-tampon fraîchement préparée à partir de l’étape 2.2. Pipet de haut en bas ~ 20 fois pour bien mélanger avec le volume pipette mis à 1 μL. Le stock rouge de G-actin sera maintenant à la dilution finale de 5 mg/mL.
  3. Incuber le G-actinRed préparé pendant 30 min sur la glace intacte.
  4. Centrifugeuse la G-actinerouge préparée à 16.000 x g pendant 20 min à 4 °C dans une microcentrifugeuse pour enlever tout précipité.
  5. Égouttez soigneusement 1,5 μL du supernatant dans un tube de microcentrifugeuse à bouchons cassés frais sur la glace, en évitant la pastille rose foncé.
  6. Conserver le supernatant rouge G-actin préparé sur la glace jusqu’à 6 h jusqu’à ce qu’il soit prêt à être chargé dans un microneedle.
    REMARQUE : Les micronédules peuvent être tirés des tubes capillaires à l’avance sur un puller de micropipette, puis stockés à température ambiante sur une bande d’argile de modélisation dans une boîte de Petri de 100 x 20 mm. Les paramètres suggérés pour la traction des micronouilles peuvent être trouvés dans le livre de cuisine Pipette29.

3. Recueillir des embryons et monter pour injection

  1. Laisser les mouches pondre des embryons pendant 30 min sur des assiettes de jus de pomme avec de la pâte de levure à 18 °C.
  2. Pendant que les mouches sont couchées, préchauffer une plaque d’agar de jus de pomme sans pâte de levure à température ambiante, découper un coin rectangulaire de 4 cm x 1 cm d’agar de jus de pomme avec une lame de rasoir, et placer sur une lame de verre de 25 mm x 75 mm.
    1. Plaque de récolte de la collection de 30 minutes et embryons de déchorionate en versant de l’eau de Javel fraîche, diluée 1:1 avec de l’eau distillée, sur l’assiette et tourbillonnant la plaque pendant 1 min, tel que décritdans 28 (Figure 1, étape 2).
      REMARQUE : Différentes marques d’eau de Javel sont vendues à différentes concentrations. L’eau de Javel utilisée ici est 6% hypochlorite de sodium de la bouteille et est dilué à une concentration finale de 3% d’hypochlorite de sodium. D’autres marques d’eau de Javel à des concentrations légèrement inférieures fonctionneront tout aussi bien.
    2. Verser l’eau de Javel et les embryons déchorionés dans un panier de collecte (une passoire cellulaire de 70 μm) et rincer l’assiette deux fois à l’eau distillée d’une bouteille de gicler, en ajoutant ces lavages au panier de collecte.
    3. Rincer vigoureusement les embryons déchorionés dans le panier de collecte avec de l’eau distillée jusqu’à ce qu’aucune touffe de levure ne soit visible et que le panier ne laisse aucune marque rose de l’excès d’eau de Javel lorsqu’il est effacé sur une serviette en papier.
  3. À l’aide d’un pinceau avec des poils amortis à l’eau distillée, transférer les embryons déchorionés et lavés du panier de collecte sur le coin d’agar de jus de pomme préparé sur la glissière en verre.
  4. Utilisez une paire de pinces à pointe fine ou une aiguille disséquante pour disposer dix embryons en ligne droite le long du long axe du coin rectangulaire de l’agar (figure 1, étape 3). Disposer les embryons tête à queue, de sorte que leur pôle antérieur soit orienté vers la droite et que le côté dorsal soit face au chercheur (figure 1, étape 3, agrandie).
  5. Couper 0,5 cm de l’extrémité d’une pointe de pipette P200 à l’aide d’une lame de rasoir et plonger dans la « colle embryonnaire »(décrite dans 28). Enduire généreusement une région de 5 mm de largeur (figure 1, étape 4) le long du long bord d’un coverslip rectangulaire de 24 mm x 50 mm, et laisser sécher, côté colle vers le haut. Le séchage prendra ~30 s et est complet une fois que toute la région recouverte de colle semble mat plutôt que humide ou brillant.
    REMARQUE : Préparez de la « colle embryonnaire » au moins 48 h à l’avance. Ajouter n-Heptane à des bandes de ruban adhésif à double face dans un flacon de scintillation tel que décritdans 28.
  6. Une fois que la « colle embryonnaire » a séché, placez doucement le côté colle coverslip vers le bas sur le dessus de la rangée d’embryons alignés sur l’agar, laissant 2-3 mm d’espace entre le bord de la couverture et la rangée d’embryons.
    REMARQUE : Coller les embryons trop près du bord du coverslip peut conduire les embryons à sécher trop au cours de l’expérience.
  7. Retournez le coverslip de sorte que les embryons sont maintenant face vers le haut. Ils doivent être coincés dans une ligne le long d’un long bord de la couverture, et leur région ventrale face au bord le plus proche de la couverture (Figure 1, étape 4, magnifié).
  8. Desiccate les embryons en plaçant le coverslip avec des embryons doucement sur le dessus de 150 g de desiccant bleu frais stocké dans un pot de 16 oz vis dessus. Visser hermétiquement sur le couvercle et incuber pendant 8-10 min (Figure 1, étape 5).
  9. Après la dessiccation, retirez le coverslip du bocal desiccant et collez chaque côté court du coverslip à une glissière de microscope, côté embryon vers le haut,avec deux morceauxde 4 cm 2 de ruban adhésif à double face de sorte que le coverslip embryonnaire s’adaptera au stade d’injection ( figure1, étape 6).
  10. Ajouter 2 à 3 gouttes d’huile d’halocarbone 27 avec une pipette Pasteur pour couvrir les embryons alignés et les protéger contre la déshydratation (figure 1, étape 6).

4. Injecter et chauffer les embryons de stress pour favoriser la formation de tiges d’actine

REMARQUE : Toutes les injections se font dans une pièce à température contrôlée à 18 °C.

  1. Préparer des chambres d’incubation humides à partir d’une boîte de Pétri en verre d’au moins 100 mm x 20 mm de taille et tapisser la chambre de torsions d’essuie-glaces de tissu de laboratoire amortis avec de l’eau distillée (figure 1, étape 8). Préchauffer les chambres d’incubation à 32 °C ou la température d’incubation désirée avant l’injection d’embryons.
  2. Ouvrez la valve de flux d’air pour le microinjecteur et allumez le microinjecteur (l’air comprimé ou l’air de la maison avec une pression d’au moins 90 psi est approprié).
  3. Pendant que les embryons se dessèquent, rechargez le supernatant rouge G-actin précédemment préparé dans le microneedle à l’aide d’une pointe de micro chargeuse. Réglez la pipette pour dessiner 1-1.5 μL.
    REMARQUE : En raison de la viscosité de l’actine, les volumes de chargement peuvent ne pas être exacts et il peut rester suffisamment d’actine pour charger au moins un à deux micronèdès de plus. Jusqu’à 60 embryons peuvent être injectés par microneedle chargé si le microneedle est calibré correctement et ne s’obstrue pas au cours de l’expérience.
  4. Fixez le microneedle au porte-aiguille et serrez la vis. Connectez le tube d’air au microinjecteur et assurez-vous que la pression de retour sur les équilibres de micronèdre à 30 hPa.
  5. Calibrer les paramètres du microinjecteur pour expulser une bulle de 100 μm de diamètre de G-actineRouge (~500 pL) sur un micromètre de diapositives. Faites pivoter le bouton de pression (500-1500 hPa) et le bouton de temps d’impulsion d’injection (0,1-0,5 s) sur le microinjecteur pour obtenir la bonne taille de bulle. Ajustez ces paramètres chaque fois qu’un nouveau microneedle est chargé pour tenir compte de la variabilité de la viscosité de l’actine et de la taille de la pointe du microneedle.
    REMARQUE : Le rouge G-actin préparéest visqueux et il peut y avoir de l’air dans le bout du microneedle qui devrait être expulsé avant d’injecter des embryons. Si le rouge G-actine n’expulse pas facilement de l’extrémité du microneedle, casser doucement la pointe du microneedle contre le bord du micromètre de glissière.
  6. Placez la lame avec des embryons montés sur le stade du microscope.
    REMARQUE : Chaque injection mise en place sera différente, de sorte que les chercheurs devront ajuster leur méthode d’injection en conséquence. Ici, les embryons sont déplacés à l’égard d’un microneedle stationnaire, injectant chaque embryon en exécutant l’embryon dans le micronèdle.
  7. Ajustez le stade du micromanipulateur et concentrez l’objectif 10x sur le microscope léger afin que les embryons soient visibles. Les embryons sont dans le plan focal correct lorsque les contours de la membrane vitelline sont les plus pointus et l’embryon apparaît le plus grand. Choisissez des embryons à injecter qui en sont au bon stade de développement, de sorte qu’au moment où l’incubation post-injection est terminée, la majeure partie de l’embrayage atteint le stade de développement souhaité (p. ex., injecter des embryons au stade 2-330 de Bownes afin d’observer les tiges à la cellularisation après un stress thermique à 32 °C).
  8. Utilisez les commandes de micronèdre pour amener l’aiguille dans le même plan focal que les embryons.
    REMARQUE : Si le microneedle attrape sur le coverslip tout en déplaçant la scène ou le microneedle, alors le microneedle est trop près de la glissière et n’est pas dans le plan focal correct. Le microneedle doit être parallèle au coverslip, et non pas à un angle significatif (Figure 1, étape 7).
  9. Insérer le micronèdre dans l’embryon afin qu’il frappe l’embryon au milieu de sa région ventrale, à l’embryon « équateur ». Déclenchez l’injection avec la pédale ou le bouton « injecter » lorsque la pointe du microneedle est visible à l’intérieur du milieu de l’embryon (figure 1, étape 7).
  10. Injecter le G-actinRouge une fois et retirer lentement le microneedle. Déplacez le stade et répétez pour chaque embryon de l’étape de développement appropriée.
    REMARQUE : L’expansion de l’embryon est normale car le rouge G-actine est injecté et un peu de cytoplasme peut s’échapper de l’embryon.
  11. Une fois que tous les embryons ont été injectés, placez la lame avec les embryons dans la chambre d’incubation humide préparée et fermez le couvercle (figure 1, étape 8). Si vous essayez d’obtenir des embryons qui atteignent la cellularisation, la chaleur stresse les embryons à 32 °C pendant 60-75 min dans la chambre d’incubation humide.
    REMARQUE : Les temps d’incubation sont notés qui permettent la visualisation des tiges dans la cellularisation des embryons stressés par la chaleur. Le temps d’incubation sera plus long pour les embryons non anti-stress thermique parce que le développement sera plus lent à une température inférieure31. Ces embryons de contrôle peuvent être incubés dans des chambres humides à des températures telles que 18 °C ou 25 °C, selon la conception de l’expérience spécifique et la question à poser. Le temps d’incubation minimum nécessaire à la diffusion du rouge G-actine dans tout l’embryon est de 30 min.

5. Tiges d’actine d’image dans les embryons stressés par la chaleur par microscopie confoccale

  1. Pendant que les embryons sont stressés par la chaleur, allumez le microscope confocal et sélectionnez le canal laser de 561 nm.
  2. Déplacez l’objectif (25x, 40x ou 63x recommandé) vers la position de travail.
  3. Si la chaleur d’imagerie stressait les embryons, puis réglez l’incubateur de stade chauffé pour atteindre une température interne de 32 °C. Un thermomètre point-and-shoot ou infrarouge peut être utilisé pour vérifier la température à ou près de l’objectif.
  4. Retirer la lame avec des embryons injectés de la chambre d’incubation humide une fois l’incubationterminée ( figure 1, étape 9).
  5. En travaillant rapidement, retirez doucement les morceaux de ruban adhésif à double face qui ont été utilisés pour adhérer à la couverture avec des embryons montés à la diapositive (figure 1, étape 9).
    ATTENTION : Soyez doux pendant ces étapes car les coverslips peuvent facilement se briser si trop de force est appliquée.
  6. Coller deux morceaux de ruban adhésif à double face de 2,5 cm de long ensemble et couper le ruban en deux dans le sens de la longueur pour faire deux bandes de 2,5 x 0,5 cm de long (figure 1, étape 10).
  7. Coller les deux tiers de la longueur de chaque bande de ruban sur le premier coverslip, flanquant chaque côté des embryons dans l’huile d’Halocarbon 27 (Figure 1, étape 10, orange), laissant un tiers des bandes de ruban suspendu au bord de la première couverture où les embryons sont coincés. Utilisez des mains gantées et veillez à ne pas toucher les embryons pendant cette étape.
  8. Placez délicatement un deuxième coverslip rectangulaire sur les bandes de ruban pour prendre en sandwich les embryons entre les coverslips(figure 1, étape 10, bleu). Alignez les bords de 25 mm, mais gardez les bords de 50 mm décalés les uns des autres de 1 cm de largeur.
    REMARQUE : La surface complète de ce deuxième coverslip deviendra la nouvelle surface d’imagerie qui fera face à la lentille objective, alors prenez soin de ne pas obtenir d’empreintes digitales ou d’huile Halocarbon 27 sur cette deuxième surface de coverslip. Le décalage est nécessaire pour que l’huile supplémentaire Halocarbon 27 puisse être ajoutée pour immerger uniformément les embryons. Si nécessaire, ajouter l’huile Halocarbon 27 à la couture où les deux coverslips se rencontrent au sommet du sandwich et il enrobera les embryons par action capillaire (voir lignes pointillées dans la figure 1, étape 10).
  9. Appuyez doucement sur les zones du coverslip qui sont directement sur le dessus des bandes de ruban adhésif avec le côté émoussé d’une lame de rasoir pour obtenir le coverslip pour adhérer à la bande.
  10. Retournez le sandwich coverslip et placez-le sur un essuie-glace de tissu de laboratoire pour garder la surface d’imagerie propre et porter au microscope confocal (figure 1, étape 11). Assurez-vous que la bande est complètement collée aux deux coverslips avant l’imagerie.
  11. Confirmez que le stade chauffé est à température et si vous utilisez un microscope inversé, ajoutez du liquide d’immersion sur la lentille objective sélectionnée.
  12. Placez soigneusement le sandwich coverslip sur la scène pour vous assurer que la nouvelle surface d’imagerie (2nd coverslip) est celle qui touche le liquide d’immersion (figure 1, étape 11).
    REMARQUE : Si nécessaire, adhérez le sandwich coverslip à la scène avec deux petits morceaux de ruban adhésif à double face pour éviter les mouvements inutiles pendant l’imagerie si les coverslips ne s’adaptent pas bien dans le stade chauffé.
  13. Concentrez-vous sur un embryon en cellularisation (stade Bownes 4a30)ou sur le stade de développement souhaité à l’aide de la lumière transmise ou de la fluorescence.
  14. Une fois qu’un embryon a été mis au point, passez au mode d’acquisition laser sur le microscope confocal et ajustez la puissance et le gain laser, la taille du cadre, le carrelage et les paramètres de projection comme vous le souhaitez.
  15. Prenez des images de surface à travers les plans focaux des noyaux de l’embryon pour trouver des tiges d’actine intranucléaires. Les tiges doivent apparaître dans de multiples orientations sous forme de stries brillantes ou de points à l’intérieur des noyaux relativement foncés (figure 2A, 2C).

6. Expériences d’imagerie alternative

  1. Effectuer FRAP pour étudier le chiffre d’affaires de l’actine le long de la longueur des tiges d’actine intranucléaire ou dans les structures cytoplasmiques d’actine, telles que les extrémités des sillons de membrane de plasma pendant la cellularisation.
  2. Dans le logiciel d’imagerie, choisissez une région rectangulaire autour des pointes de sillon ou des tiges d’actine dans lesquelles acquérir l’expérience.
  3. Choisissez une petite région carrée du centre d’une tige d’actine dans la région d’acquisition rectangulaire pour blanchir. Assurez-vous que les extrémités de la tige d’actine sont visibles et ne sont pas blanchies au cours de l’expérience pour permettre un suivi précis de la tige à l’intérieur du noyau.
  4. Réglez le laser d’eau de Javel pour itérer 50x et réglez la puissance laser d’eau de Javel au maximum.
  5. Choisissez un cours du temps pour acquérir des images chaque seconde pour un total jusqu’à 120 s à la vitesse maximale de séjour pixel et régler le laser à l’eau de Javel après les deux premières secondes de l’acquisition d’image.
  6. Quantifier les données pour déterminer la mi-temps de la récupération de la fluorescence1.

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Representative Results

Un flux de travail schématique de la manipulation des embryons est représenté à la figure 1,et un calendrier pour une expérience typique est présenté dans le tableau 1. Une estimation pour un bon résultat expérimental est que pour chaque 10 embryons injectés, au moins la moitié des embryons vus seront au stade de développement correct, intact, et présentent un ASR robuste avec le stress thermique à 32 °C. Cet ASR sera démontré par l’assemblage de tiges d’actine intranucléaires, comme le montre l’image représentative de vue de surface d’un embryon à la figure 2A (panneau droit). Les tiges d’actine apparaîtront dans plusieurs orientations (parallèles ou perpendiculaires au plan d’imagerie) à l’intérieur des noyaux et peuvent être photographiées à travers plusieurs plans focaux. En comparaison, les embryons de contrôle incubés à 18 °C n’afficheront pas de tiges d’actine(figure 2A, panneau gauche). Le pourcentage de noyaux contenant des tiges peut être quantifié, comme le démontre la figure 2B. De plus, des expériences frap peuvent être réalisées sur des tiges (figure 2C). Une méthode de quantification suggérée pour les données frap est référencéedans 1 et un exemple de parcelle de récupération de fluorescence pour une région blanchie par rapport aux non blanchis d’une tige d’actine est indiqué dans la figure 2D.

Si un embryon est gravement endommagé par injection ou devient trop sec pendant l’expérience, l’asynchronie mitotique peut être observée et la cellularisation sera perturbée. Parfois, les tiges peuvent ne pas être visibles en raison d’un défaut d’obtenir suffisamment d’actine injectée dans l’embryon. Si cela se produit, assurez-vous que la quantité de G-actineinjectée par le rouge est de 500 pL (mesurée à l’aide d’un micromètre à l’étape 4.5) et confirmez que cette quantité reste constante entre les embryons en faisant une injection d’essai dans l’huile environnante pour vérifier la taille de la bulle rouge G-actine entre chaque microinjection embryonnaire. En outre, pour assurer la visualisation de la tige, travaillez rapidement pour ajouter le coverslip et déplacez les embryons au stade chauffé de microscope une fois qu’ils sont pris de la chambre humide dans l’étape 5.4, car l’assemblage de tige estréversible 1 et les tiges peuvent démonter si les embryons sont maintenus à une température inférieure à 32°C pendant plus de 30 min.

Figure 1
Figure 1 : Aperçu schématique de la manipulation des embryons pendant l’expérience. (1) Les mouches adultes dans les tasses de collecte d’embryons pondent des embryons sur des plaques d’agar de jus de pomme. (2) Les embryons sont déchorionés avec 1:1 eau de Javel: eau distillée, versé dans un panier de collecte, et soigneusement lavé avec de l’eau distillée pour enlever l’eau de Javel et les débris. (3) Les embryons sont transférés avec un pinceau à un coin de gélose rectangulaire de jus de pomme sur une lame et disposés sur leurs côtés, tête à queue, avec la région dorsale face au bord de l’agar. (4) Une région de 5 x 50 mm d’un coverslip en verre (orange) est recouverte de « colle embryonnaire » et pressé doucement sur la rangée d’embryons disposés sur l’agar pour les adhérer à la couverture. (5) Le coverslip avec des embryons est inversé de sorte que les embryons face vers le haut. Les embryons sont desséchés dans un bocal à vis. (6) Immédiatement après la dessiccation, le coverslip est scotché à une diapositive, les embryons orientés vers le haut, et les embryons sont couverts d’huile halocarbone 27. (7) Un microneedle précédemment chargé de rouge G-actinpréparé est utilisé pour faire une seule injection dans le centre de la région ventrale de chaque embryon, avec aiguille positionnée parallèlement à la couverture. (8) Après injection, les embryons sont incubés à l’intérieur d’une boîte de Petri humidifiée avec des essuie-glaces humides de tissu de laboratoire à la température de contrôle (18 °C) ou avec le stress thermique (32 °C). (9) Après incubation, le coverslip avec les embryons sur elle est retiré de la diapositive. (10) Deux morceaux de ruban adhésif à double face sont superposés les uns sur les autres, tranchés en deux dans le sens de la longueur, et placés de chaque côté de l’huile entourant les embryons sur le premier coverslip. Un deuxième coverslip (bleu) est placé sur le dessus de la première pour créer une nouvelle surface d’imagerie, offset de sorte qu’il laisse un espace pour plus d’huile à ajouter pour couvrir les embryons si nécessaire. (11) Si l’imagerie sur un microscope confocal inversé, le sandwich coverslip est inversé de sorte que le deuxième coverslip fait face à l’objectif. L’imagerie se fait dans une chambre incubée, et les tiges d’actine sont visualisées sur plusieurs plans focaux des noyaux de chaque embryon. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Résultats représentatifs des tiges d’actine dans les embryons stressés par la chaleur. (A) Les tiges d’actine ne sont pas observées dans un embryon qui a été incubé à la température de contrôle de 18 °C (panneau gauche), mais sont observées dans les noyaux d’un embryon qui a été stressé par la chaleur à 32 °C (panneau droit). (B) Quantification du pourcentage de noyaux avec des tiges d’actine d’une expérience représentative. Chaque point représente un embryon où les tiges et les noyaux ont été comptés dans toute la région image (n = 22 embryons à 18 °C; n = 23 embryons à 32 °C; les barres d’erreur montrent l’écart type). Le t-test d’un étudiant, avec une variance inégale assumée, a été utilisé pour calculer la valeur p. (C) Une série de temps représentative montre FRAP sur une tige d’actine. La partie de la tige qui a été blanchie est indiquée par une pointe de flèche blanche. Pré-eau de Javel est de 2 s avant l’étape de l’eau de Javel. Temps = 0 s est l’étape de l’eau de Javel, et la récupération de fluorescence a été suivie jusqu’à 60 s après l’eau de Javel. (D) Une parcelle montre la dynamique de récupération de la fluorescence de l’actine dans une région blanchie d’une tige, par rapport à une région non blanchie dans la même tige. Les tiges sont remarquablement stables et l’actine en leur sein ne se chiffre pas. Ainsi, aucune reprise n’est observée. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Tableau 1 : Flux de travail expérimental avec horaire suggéré. Ce calendrier résume le temps prévu pour compléter chaque étape du protocole.

commande Étape Temps requis pour chaque étape Description
1 1.1 5 jours à l’avance Faire des cages de collecte d’embryons. Verser les assiettes d’agar au jus de pomme.
2 1.2-1.3 2 jours à l’avance Installez des cages de collecte avec des mouches mâles et femelles adultes.
3 2.6 Note 1 jour à l’avance Tirez les tubes capillaires pour faire des micronedles.
4 2.1-2.6 1 h Préparez G-actin.
5 3.1 30 min Laisser les mouches pondre des œufs.
6 3.2-3.10 15-30 min Recueillir, monter, dessicquer les embryons. Couvrir les embryons d’huile.
7 4.1 30 min à l’avance Préparer les chambres d’incubation humides.
8 4.2-4.4 1 min Chargez le microneedle.
9 4.5-4.10 10-20 min Calibrer la taille des bulles de G-actine et injecter des embryons.
10 4.11 30 min-1+ h Incuber/chauffer les embryons de stress.
11 5.1-5.3 1 h à l’avance Allumez le microscope et le stade d’incubation.
12 5.4-5.10 5 min Embryons sandwich entre couvre-t-il pour l’imagerie.
13 5.11-6.6 15 min-1+ h Tiges intranucléaires d’actine d’image dans les embryons.

Tableau 2 : Suggestions de dépannage. Ce tableau fournit des suggestions pour le dépannage pour faciliter la réussite du protocole.

Problème potentiel Suggestions
Les mouches ne pondent pas assez d’embryons. Configurer la tasse au moins 5 jours à l’avance (reportez-vous aux étapes 1.1-1.3). Changez les assiettes 3 fois par jour avant l’expérience pour encourager la ponte. Laisser les mouches pondent des embryons pendant 1 h au lieu de 30 min. Installez des tasses avec de jeunes mouches adultes.
Aucun G-actin n’est expulsé du microneedle. Augmentez la pression et les paramètres de temps sur le microinjecteur. Casser davantage la pointe du microneedle (reportez-vous à l’étape 4.5 Note). Comme les principaux sabots peuvent ne pas se dégager, chargez une nouvelle aiguille.
Difficile de calibrer une taille de bulle assez petite. Ajustez les paramètres de pression et de temps (reportez-vous à l’étape 4.5). Comme l’ouverture de la pointe du micronèdre peut être trop grande, chargez une nouvelle aiguille.
Les embryons libèrent de la colle sur le coverslip pendant l’injection. Ajustez la consistance de la « colle embryonnaire » pour les futures couvertures en ajoutant plus de ruban adhésif à double face à la solution heptane (reportez-vous à l’étape 3.5 Note).
Les embryons se dessèchent pendant l’incubation de la température. Assurez-vous que la glissière est de niveau dans la chambre d’incubation (se référer à l’étape 4.11) et que l’huile ne touche rien qui pourrait l’évacue. Ajouter des gouttes d’huile supplémentaires aux embryons. Diminuer le temps de dessiccation avant l’injection (voir l’étape 3.8).
L’huile ne couvre pas complètement les embryons entre le premier et le deuxième coverslips. Ajouter de l’huile supplémentaire par action capillaire au petit écart entre les coverslips (reportez-vous à l’étape 5.8 Note).
Les tiges d’actine intranucléaire ne sont pas visibles dans les embryons stressés par la chaleur. Injecter un plus grand volume de G-actine (se référer à l’étape 4.5). Confirmer que la température de l’incubation post-injection (voir étape 4.11) et de la chambre d’imagerie est de 32 °C (se référer à l’étape 5.3).
De grandes bulles de G-actine sont visibles autour du site d’injection d’embryons. Injecter un plus petit volume de G-actine (se référer à l’étape 4.5). Augmenter le temps de dessiccation de l’embryon pour favoriser une meilleure rétention de l’actine injectée à l’intérieur de l’embryon (se référer à l’étape 3.8).

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Discussion

L’importance de cette méthode est qu’elle utilise le protocole bien établi de microinjection chez les embryons de Drosophile 21 , 22,23,24,25,26,27pour permettre de nouvelles recherches concernant l’ASR et l’assemblage de tiges d’actine qui l’accompagnent. Un avantage majeur de l’injection de G-actinRouge dans les embryons vivants est que l’ASR peut être étudié dans une variété de contextes. Pour de futures études, ces contextes peuvent inclure l’injection d’embryons d’autres génotypes dans le cadre d’un écran mutant ou l’exposition d’embryons injectés à différentes conditions de stress, telles que le stress oxydatif4,32. Bien qu’elle ne soit pas décrite en détail ici, cette technique d’injection peut également être modifiée pour injecter des acides nucléiques, d’autres protéines, des médicaments et des sous-formes indicateurs (par exemple,voir 21,22,23,24,32) pour étudier l’ASR. Ainsi, cette méthode présente un certain nombre d’approches pour identifier l’éventail des contraintes qui induisent l’ASR, caractérisant davantage les réponses cellulaires pendant l’ASR (par exemple les changements dans l’activité mitochondriale), et découvrant de nouvelles molécules et mécanismes sous-jacents à l’assemblage intranucléaire de tige d’actine.

Voici quelques étapes critiques du protocole : à l’étape 3.8, les embryons doivent être correctement dessiccated pour assurer une injection réussie et la meilleure santé de l’embryon. Le temps de dessiccation dépendra de la température ambiante et de l’humidité du laboratoire, il est donc recommandé de pratiquer le montage, la dessiccation et les injections avec un tampon de pH neutre d’abord pour établir ce paramètre pour la manipulation des embryons. À l’étape 4.5, les paramètres de micronéné et d’injection doivent être affinés pour permettre l’injection de suffisamment de G-actinerouge dans les embryons. Si trop peu de G-actineRouge est injecté dans l’embryon, les tiges d’actine peuvent ne pas être facilement visualisées, puisque la formation de tiges d’actine dépend de la concentration d’actinelibre 1. En outre, il sera difficile d’obtenir des résultats cohérents des expériences FRAP s’il n’y a pas assez de G-actineRouge injecté, puisque l’intensité de fluorescence ne sera pas assez élevée pour surmonter la fluorescence de fond. Par conséquent, il est important de calibrer la taille de la bulle chaque fois qu’une nouvelle aiguille est chargée et utilisée. G-actinRouge est visqueux et a tendance à obstruer à l’intérieur du microneedle. Parfois, cela peut conduire à injecter des quantités variables de G-actine dans les embryons. Si le microneedle est obstrué et que le microneedle à haute pression tombe en panne, il peut être nécessaire de tenter de briser davantage la pointe du micronèdre ou même de charger un nouveau microneedle et d’injecter un nouvel ensemble d’embryons. Enfin, à l’étape 4.11, les embryons doivent être incubés à haute température et suffisamment de temps pour que l’ASR soit induit et que les tiges seforment 1. Les températures de tous les incubateurs doivent être constamment surveillées, le temps de transférer les embryons de l’incubateur à l’incubateur doit être limité, et une insurrable doit être utilisée pour toutes les incubations. D’autres problèmes possibles sont énumérés dans le tableau 2 avec des conseils de dépannage qui l’accompagnent.

L’une des principales limites de ce protocole est qu’il faut prendre des mesures exceptionnelles pour préserver la santé des embryons pendant les injections, les incubations et l’imagerie. Le protocole a été conçu pour maximiser la santé de l’embryon, et avec une pratique significative, un chercheur peut compléter toutes les étapes du protocole avec le développement de l’embryon progresse aux taux attendus partempérature 31. Une deuxième limitation du protocole est la nécessité d’une plate-forme de microinjection, qui peut être assez coûteux et n’est pas un équipement commun pour chaque laboratoire de mouches. Toutefois, si un laboratoire adjacent est équipé pour injecter d’autres embryons (p. ex., Xenopus,Zebrafish et Caenorhabditis elegans)ou des cellules adhérentes, la plate-forme d’injection utilisée convient probablement aux injections de Drosophila. Dans ce cas, seule la forme de l’aiguille doit être adaptée pour les embryons de Drosophila selon les lignes directrices du Pipette Cookbook29. Alternativement, il existe des options de micoinjector moins coûteuses sur le marché (p. ex., microinjecteurs analogiques), ce qui peut réduire considérablement le coût d’assemblage d’une plate-forme d’injection.

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Disclosures

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Acknowledgments

Les auteurs reconnaissent avec gratitude le travail de Liuliu Zheng et Zenghui Xue, qui ont contribué au pionnier de cette technique dans le laboratoire Sokac, ainsi que Hasan Seede qui a aidé à l’analyse. Les travaux de cette étude sont financés par une subvention des NIH (R01 GM115111).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine triphosphate (ATP) Millipore-Sigma A23835G Component of G buffer
Apple juice, Mott's, 64 fl oz Mott's 014800000344 Component of apple juice plates
Bacto Agar BD 214010 Component of apple juice plates
Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite KIK International 059647210020 For dechorionating embryos
Calcium chloride Millipore-Sigma C1016500G Component of G buffer
Cell strainer, 70 μm Falcon 352350 For collecting dechorionated embryos
Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan Zeiss 0000001994956 For imaging intranuclear actin rods
Desiccant Drierite 24001 For desiccating embryos
Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom Zeiss 4350649000000 For arranging embryos on agar wedge
Dissecting needle, 5 in Fisher Scientific 08965A For arranging embryos on agar wedge
Dithiothreitol (DTT) Fisher Scientific BP1725 Component of G buffer
Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in 3M 021200010323 For making embryo glue
Embryo collection cage Genessee Scientific 59100 For housing adult flies and collecting embryos
Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5 Electron Microscopy Sciences 72701D For arranging embryos on agar wedge
Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm World Precision Instruments, Inc. TW1004 For microneedles
Halocarbon oil 27 Millipore-Sigma H8773100ML For hydration of embryos
Heated stage incubator Zeiss 4118579020000, 4118609020000, 4118609010000 For confocal imaging
Lab Tissue Wipers, KimWipes Kimberly-Clark 34155 Lab tissue wipers
Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished Zeiss Discontinued Injection microscope
Methyl-4-hydroxybenzoate Millipore-Sigma H36471KG Component of apple juice plates
Microinjector, FemtoJet4x Eppendorf 5253000025 Microinjector
Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 μL Eppendorf 5242956003 For loading microneedles
Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment Bernard Instruments, Inc (Houston, TX) Custom For performing microinjections
Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown Sutter Instruments P97 For pulling capillary tubes to make microneedles
Microscope cover glass 24x50-1.5 Fisher Scientific 12544E For mounting embryos
Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm Fisher Scientific 22037081 For mounting embryos for injection
n-Heptane Fisher Scientific H3601 Component of embryo glue
Objective, 10x Zeiss Discontinued 10x objective for injection microscope
Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS Zeiss 4217679971711 40x water objective for confocal
Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm) Zeiss 4208529871000 25x mixed immersion objective for confocal
Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA Zeiss 4207829900799 63x oil objective for confocal
Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2 Daler-Rowney 038372016954 For transferring embryos
Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white Kimberly-Clark 884266344845 For blotting cell strainer
Pasteur pipette, 5 3/4 in Fisher Scientific 1367820A For covering embryos with oil
Petri dish, glass, 100 x 20 mm Corning 3160102 For humid incubation chamber
Petri dish, plastic, 60 x 15 mm VWR 25384092 For apple juice plates
Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 μL Eppendorf 2231000604 For loading the microneedle
Pipette tip, xTIP4 250 μL Biotix 63300006 For adding embryo glue to coverslip
Razor blade VWR 55411050 For cutting agar wedge, tape, pipette tips
Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4x10 μg) Cytoskeleton, Inc. APHR-A G-actin^Red
Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps Fisher Scientific 033377 For making embryo glue
Screw top jar, 16 oz Nalgene 000194414195 For desiccating embryos
Stage micrometer Electron Microscopy Sciences 602104PG For calibrating volume of G-actin injection
Sucrose Millipore-Sigma 840971KG Component of apple juice plates
Trizma base Millipore-Sigma T15031KG Component of G buffer
Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz Lesaffre Yeast Corporation 117929157002 Component of yeast paste

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Biologie du développement Numéro 159 Drosophila Embryon G-actine Microinjection Réponse au stress actin Tiges d’actine intranucléaire FRAP Microscopie confocale
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Biel, N., Figard, L., Sokac, A. M. Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (159), e61297, doi:10.3791/61297 (2020).

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