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Developmental Biology

लाइव हीट में इमेजिंग इंट्रान्यूक्लियर ऐक्टिन रॉड्स ने ड्रोसोफिला भ्रूण पर जोर दिया

Published: May 15, 2020 doi: 10.3791/61297
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2,3
1Integrative Molecular and Biomedical Sciences, Baylor College of Medicine, 2Department of Cell and Molecular Biology, School of Molecular and Cellular Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य हीट तनाव के बाद ड्रोसोफिला भ्रूण और छवि इंट्रान्यूक्लियर ऐक्टिन रॉड असेंबली में रोडामाइन-संयुग्मित गोलाकार ऐक्टिन इंजेक्ट करना है।

Abstract

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य इंट्रान्यूक्लियर ऐक्टिन रॉड की कल्पना करना है जो गर्मी के तनाव के बाद लाइव ड्रोसोफिला मेलनोगास्टर भ्रूण में इकट्ठा होते हैं। ऐक्टिन रॉड एक संरक्षित, अकांक्षित ऐक्टिन स्ट्रेस रिस्पांस (एएसआर) की पहचान है जो न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग सहित मानव विकृतियों के साथ है। पहले, हमने दिखाया कि ASR morphogenesis विफलताओं और भ्रूण के विकास की क्षमता को कम करने के लिए योगदान देता है । यह प्रोटोकॉल एक मॉडल प्रणाली में ऐक्टिन रॉड असेंबली और एएसआर अंतर्निहित तंत्रों के निरंतर अध्ययन की अनुमति देता है जो इमेजिंग, जेनेटिक्स और बायोकेमिस्ट्री के लिए अत्यधिक उत्तरदायी है। भ्रूण एकत्र कर रहे हैं और उन्हें इंजेक्शन के लिए तैयार करने के लिए एक कवरस्लिप पर घुड़सवार। रोडामाइन-कंजूगेटेड गोलाकार ऐक्टिन (जी-ऐक्टिनरेड)को पतला कर माइक्रोनीडल में लोड किया जाता है। प्रत्येक भ्रूण के केंद्र में एक ही इंजेक्शन बनाया जाता है। इंजेक्शन के बाद, भ्रूण को ऊंचा तापमान पर इनक्यूबेटेड किया जाता है और इंट्रान्यूक्लियर ऐक्टिन रॉड को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना की जाती है। फोटोब्लैचिंग (एफआरएपी) प्रयोगों के बाद फ्लोरेसेंस रिकवरी ऐक्टिन छड़ पर की जा सकती है; और साइटोप्लाज्म में अन्य ऐक्टिन-समृद्ध संरचनाओं को भी चित्रित किया जा सकता है। हम पाते हैं कि जी-ऐक्टिनरेड पॉलीमराइज अंतर्जात जी-ऐक्टिन की तरह है और अपने आप में सामान्य भ्रूण विकास में हस्तक्षेप नहीं करता है । इस प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि भ्रूण को गंभीर चोट से बचने के लिए इंजेक्शन के दौरान देखभाल की जानी चाहिए । हालांकि, अभ्यास के साथ, ड्रोसोफिला भ्रूण में जी-ऐक्टिनरेड इंजेक्शन एक तेज और विश्वसनीय तरीका है जो ऐक्टिन छड़ की कल्पना करता है और आसानी से किसी भी जीनोटाइप की मक्खियों के साथ या हाइपोक्सिया और ऑक्सीडेटिव तनाव सहित अन्य सेलुलर तनावों की शुरूआत के साथ उपयोग किया जा सकता है।

Introduction

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे जी-actinलाल सुई के लिए गर्मी में इंट्रान्यूक्लियर ऐक्टिन छड़ की विधानसभा की कल्पना करने के लिए जोर दिया भ्रूण है कि एक शिक्षादायक ऐक्टिन तनाव प्रतिक्रिया(ASR) 1के दौर से गुजर रहे हैं । हमने एएसआर के अध्ययनों में सहायता करने के लिए यह प्रोटोकॉल विकसित किया है, जो भ्रूण में बाधित मॉर्फोजेनेसिस और कम व्यवहार्यता की ओर जाता है, और वयस्क मानव कोशिका प्रकार गुर्दे की विफलता2,मांसपेशियों के मायोपैथी3,और अल्जाइमर और हंटिंगटन रोग4,5,6,7, 8सहित विकृतियों से जुड़ा हुआ है। यह एएसआर कई सेलुलर तनावों से प्रेरित होता है, जिसमें हीट शॉक9,10,11,ऑक्सीडेटिव स्ट्रेस4,6,कम एटीपी संश्लेषण12,और असामान्य हंटिंगटिन या β-एमिलॉयड ओलिगोमेराइजेशन4,5,6,7,9,13,14,15, 16शामिल हैं। एएसआर की एक बानगी प्रभावित कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म या नाभिक में एबररेंट ऐक्टिन छड़ की असेंबली है, जो एक ऐक्टिन इंटरैक्टिंग प्रोटीन, कोफिलिन 1,5,6,10के तनाव-प्रेरित अतिसक्रियण से प्रेरित है। दुर्भाग्य से, प्रमुख ज्ञान अंतराल एएसआर के बारे में रहते हैं। उदाहरण के लिए, ऐक्टिन रॉड के कार्य की जानकारी नहीं है। हमें समझ में नहीं आता कि छड़ कुछ कोशिका प्रकारों के साइटोप्लाज्म में क्यों बनते हैं, लेकिन दूसरों के नाभिक। और न ही यह स्पष्ट है कि ASR कोशिकाओं या तनाव के दौर से गुजर भ्रूण के लिए सुरक्षात्मक या दुर्अनुके है । अंत में, हम अभी भी विस्तृत तंत्र अंतर्निहित Cofilin अति सक्रियता या actin रॉड विधानसभा पता नहीं है । इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल जीवित फल फ्लाई भ्रूण की अत्यधिक पथीय प्रायोगिक प्रणाली में ऐक्टिन रॉड गठन और गतिशीलता की कल्पना करके एएसआर की जांच करने के लिए एक तेजी से और बहुमुखी परख प्रदान करता है।

जीवित ड्रोसोफिला भ्रूण में जी-ऐक्टिनरेड को माइक्रोजेक्ट करने का प्रोटोकॉल शुरू में ऊतक निर्माण की घटनाओं के दौरान सामान्य साइटोप्लाज्मिक ऐक्टिनसंरचनाओं 17 की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था। उन अध्ययनों में, हमने पाया कि जी-ऐक्टिनलाल इंजेक्शन भ्रूण में प्रारंभिक विकास प्रक्रियाओं को प्रतिकूल रूप से प्रभावित नहीं करता था, जिसमें साइटोकिन्सिस या गैस्ट्रुलेशन17,18शामिल हैं। हम तो प्रोटोकॉल संशोधित, भ्रूण हैंडलिंग और जी actinलाल इंजेक्शन अनुकूल करने के लिए गर्मी में ऐक्टिन छड़ की इमेजिंग की अनुमति के लिएएएसआर 1के दौर से गुजर भ्रूण पर बल दिया । जी-ऐक्टिनरेड इंजेक्शन के अलावा अन्य तरीकों का इस्तेमाल भ्रूण में ऐक्टिन की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है। ये तरीके ऐक्टिन या ऐक्टिन बाइंडिंग प्रोटीन के डोमेन के लिए टैग किए गए फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपीएस) को व्यक्त करने पर भरोसा करते हैं, जैसे यूट्रोफिन-एमएचरी, लाइफएक्ट, एफ-ट्रैक्टिन-जीएफपी, और मोसिन-जीएफपी(19में समीक्षा) । हालांकि, इन एफपी जांच का उपयोग करने के लिए सावधानी की आवश्यकता होती है क्योंकि वे कुछ ऐक्टिन संरचनाओं को स्थिर या बाधित कर सकते हैं, सभी ऐक्टिन संरचनाओं को समान रूप से लेबल नहीं कर सकते हैं20,और ऐक्टिन-जीएफपी के मामले में, अत्यधिक अतिएक्सप्रेस किए गए हैं - रॉड असेंबली के विश्लेषण के लिए समस्याग्रस्त जो न केवल तनाव पर निर्भर है बल्कि एकाग्रता निर्भर भी है1। इस प्रकार, जी-ऐक्टिनरेड फ्लाई भ्रूण में रॉड अध्ययन के लिए पसंदीदा जांच है, और भ्रूण का बड़ा आकार इसके आसान इंजेक्शन की अनुमति देता है।

इस प्रोटोकॉल का कार्यप्रवाह अन्य सुस्थापित माइक्रोइंजेक्शन तकनीकों के समान है जिनकाउपयोग ड्रोसोफिला भ्रूण21, 22, 23,24,25,26,27मेंप्रोटीन,न्यूक्लिकएसिड,ड्रग्स और फ्लोरोसेंट संकेतकों को इंजेक्शन लगाने के लिए किया गया है। हालांकि, यहां जी-ऐक्टिनरेड के माइक्रोइंजेक्शन के बाद भ्रूण को एएसआर और इंट्रान्यूक्लियर ऐक्टिन रॉड असेंबली को प्रेरित करने के लिए हल्के गर्मी के तनाव के संपर्क में आते हैं । मक्खियों और एक इंजेक्शन रिग तक पहुंच वाली प्रयोगशालाओं के लिए, इस विधि को एएसआर के संबंध में अध्ययन की विशिष्ट पंक्तियों के लिए आसानी से लागू करने योग्य और अनुकूलनीय होना चाहिए, जिसमें अलग-अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि में विभिन्न तनावों या मॉड्यूलेशन द्वारा इसका शामिल होना शामिल है।

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Protocol

1. भ्रूण संग्रह कप और सेब का रस आगर प्लेटें तैयार

  1. इंजेक्शन प्रयोग से पांच दिन पहले,28 का निर्माण या कम से दो छोटे भ्रूण संग्रह कप की खरीद । छोटे संग्रह कप28के साथ उपयोग किए जाने वाले ताजा 60 मिमी सेब के रस आगर प्लेटें बनाएं। प्लास्टिक के बक्से में प्लेटों को 4 डिग्री सेल्सियस पर नम पेपर तौलिए से ढका हुआ स्टोर करें।
    नोट: छोटे भ्रूण संग्रह कप, फ्लाई नंबर के साथ आबादी के रूप में कदम १.३ में वर्णित है, प्रयोग प्रति पर्याप्त भ्रूण संख्या प्रदान करेगा, जबकि यह भी सुनिश्चित करना है कि भ्रूण हैंडलिंग और इंजेक्शन एक कम पर्याप्त समय में किया जा सकता है प्रारंभिक विकास के चरणों की इमेजिंग की अनुमति ।
  2. गर्म सेब का रस प्लेटें 18 डिग्री सेल्सियस के लिए और थाली के केंद्र में खमीर पेस्ट का एक थपका जोड़ें। खमीर पेस्ट सक्रिय खमीर और आसुत पानी का एक सरल पेस्ट है।
  3. सबसे उदार अंडा बिछाने को बढ़ावा देने के लिए, प्रयोग से 2 दिन पहले मक्खियों के साथ संग्रह कप स्थापित करें। संग्रह कप में कम से कम 100 मादाएं और 50 नर मक्खियों को जोड़ें, और एक तैयार सेब के रस की प्लेट(चित्रा 1,चरण 1)के साथ शीर्ष करें। इंजेक्शन प्रयोग करने के लिए अग्रणी दिनों पर सेब का रस प्लेटें कम से कम दो बार प्रत्येक दिन, एक बार सुबह में और शाम को एक बार बदल जाते हैं ।
    नोट: सबसे अच्छा इंजेक्शन और इमेजिंग परिणाम प्राप्त कर रहे है जब भ्रूण संग्रह कप एक 12 घंटे प्रकाश के साथ 18 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है/

2. माइक्रोइंजेक्शन के लिए जी-ऐक्टिनरेड का वर्किंग स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें

नोट: यह तैयारी केवल जी-ऐक्टिनरेडके 5 मिलीग्राम/एमएल वर्किंग स्टॉक के 2 माइक्रोल बनाती है, इसलिए यदि उपयोगकर्ता माइक्रोइंजेक्शन तकनीक के आदी नहीं हैं, तो 3 कदम बढ़ाने के लिए छोड़ना और कीमती काम करने वाले स्टॉक को संरक्षित करने के लिए तटस्थ पीएच बफर के साथ माइक्रोइंजेक्शन का अभ्यास करना लाभप्रद है। विक्रेता से जी-ऐक्टिनरेड के 10 माइक्रोन स्टॉक को 16 ऑउंस स्क्रू टॉप जार में अपनी मूल पैकेजिंग में संग्रहीत किया जा सकता है जिसमें ~500 ग्राम डेसिकेंट 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 महीने तक के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।

  1. पहले से जी-बफर स्टॉक समाधान तैयार करें: 5 एमएम ट्रिस-एचसीएल, 0.2 mM CaCl2,पीएच 8.0। फिल्टर और कमरे के तापमान पर स्टोर।
  2. इंजेक्शन के दिन, चरण 2.1 से जी-बफर स्टॉक का उपयोग करके बर्फ पर एक ताजा स्नैप कैप माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में जी-बफर वर्किंग सॉल्यूशन का 1 एमएल तैयार करें, जो इंगित अंतिम सांद्रता पर निम्नलिखित के साथ पूरक है: 1 m M dithiothreitol (DTT) और 0.2 m M एटीपी, पीएच 8.0।
    नोट: जी-बफर वर्किंग सॉल्यूशन की 1 एमएल वॉल्यूम एक प्रयोग के लिए जरूरी से ज्यादा है लेकिन तैयारी को सरल बनाता है । प्रयोग के बाद अतिरिक्त को छोड़ दिया जा सकता है या उपयोगकर्ता अपनी पसंद के अनुसार नीचे स्केल कर सकते हैं।
    1. बर्फ पर 10 माइक्रोन जी-ऐक्टिनरेड स्टॉक रखते हुए सबसे पहले ट्यूब के अंदर जी-ऐक्टिनरेड की गुलाबी बूंद के शीर्ष पर फिल्टर्ड, डिस्टिल्ड वॉटर का 1 माइक्रोल डालें ।
    2. इसके बाद, स्टेप 2.2 से ठंड, हौसले से तैयार जी-बफर वर्किंग सॉल्यूशन के 1 माइक्रोल जोड़ें। 1 माइक्रोल के लिए सेट पिपेट वॉल्यूम के साथ अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए ~ 20 बार ऊपर और नीचे पाइप्ट। जी-ऐक्टिनरेड स्टॉक अब 5 मिलीग्राम/एमएल के अंतिम कमजोर पड़ने पर होगा ।
  3. तैयार जी-ऐक्टिनरेड को बर्फ पर 30 मिनट के लिए अशान्त कर देते हैं ।
  4. किसी भी वर्षा को दूर करने के लिए एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज में 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 16,000 x ग्राम पर तैयार जी-ऐक्टिनलाल पर सेंट्रलाइज करें।
  5. गहरे गुलाबी गोली से बचने, बर्फ पर एक ताजा स्नैप कैप माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में सुपरनेट के 1.5 माइक्रोन को ध्यान से पिपेट करें।
  6. तैयार जी-ऐक्टिनरेड सुपरनेट को बर्फ पर 6 घंटे तक स्टोर करें जब तक कि माइक्रोनीडल में लोड करने के लिए तैयार न हो जाए।
    नोट: माइक्रोनीडल्स को माइक्रोपिपेट पुलर पर पहले से केशिका ट्यूबों से खींचा जा सकता है, फिर 100 x 20 मिमी पेट्री डिश में मॉडलिंग क्ले की एक पट्टी पर कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है। माइक्रोनीडल पुलिंग के लिए सुझाए गए पैरामीटर पिपेट कुकबुक29में पाए जा सकते हैं ।

3. भ्रूण ले लीजिए और इंजेक्शन के लिए माउंट

  1. मक्खियों को 18 डिग्री सेल्सियस पर खमीर पेस्ट के साथ सेब के रस प्लेटों पर 30 मिनट के लिए भ्रूण बिछाने की अनुमति दें।
  2. जबकि मक्खियों बिछाने रहे हैं, कमरे के तापमान के लिए खमीर पेस्ट के बिना एक सेब का रस आगर प्लेट पूर्व गर्म, एक रेजर ब्लेड के साथ सेब का रस आगर के एक 4 सेमी x 1 सेमी आयताकार कील बाहर काट, और एक 25 मिमी x ७५ मिमी ग्लास स्लाइड पर जगह है ।
    1. 30 मिनट के संग्रह से हार्वेस्ट प्लेट और ताजा ब्लीच डालने के द्वारा भ्रूण डिकोरियोनेट, आसुत पानी के साथ 1:1 पतला, थाली पर और 1 मिनट के लिए थाली घूमता है, के रूप में28 मेंवर्णित (चित्रा 1,चरण 2)।
      नोट: ब्लीच के विभिन्न ब्रांडों को विभिन्न सांद्रता पर बेचा जाता है। यहां उपयोग की जाने वाली ब्लीच बोतल से 6% सोडियम हाइपोक्लोराइट है और 3% सोडियम हाइपोक्लोराइट की अंतिम एकाग्रता के लिए पतला है। थोड़ा कम सांद्रता पर अन्य ब्लीच ब्रांड समान रूप से अच्छी तरह से काम करेंगे।
    2. एक संग्रह टोकरी (एक ७० μm सेल छलनी) में ब्लीच और डिक्वेशनेटेड भ्रूण डालो और एक धार की बोतल से आसुत पानी के साथ दो बार थाली कुल्ला, संग्रह टोकरी के लिए इन धोता जोड़ने ।
    3. सख्ती से आसुत पानी के साथ संग्रह टोकरी में dechorionated भ्रूण कुल्ला जब तक कोई खमीर झुरमुट दिखाई दे रहे है और टोकरी अतिरिक्त ब्लीच से कोई गुलाबी निशान छोड़ देता है जब एक कागज तौलिया पर दाग ।
  3. आसुत पानी के साथ घटा ब्रिस्टल के साथ एक तूलिका का उपयोग करना, कांच स्लाइड पर तैयार सेब का रस आगर कील पर संग्रह टोकरी से डिकोरियोनेटेड और धोया भ्रूण हस्तांतरण ।
  4. आयताकार आगार कील(चित्रा 1,चरण 3)की लंबी धुरी के साथ एक सीधी रेखा में दस भ्रूणों की व्यवस्था करने के लिए ठीक टिप चिमटी या विच्छेदन सुई की एक जोड़ी का उपयोग करें । भ्रूण सिर से पूंछ की व्यवस्था, इस तरह है कि उनके पूर्वकाल ध्रुव सही करने के लिए सामना करना पड़ रहा है और पृष्ठीय पक्ष शोधकर्ता का सामना करना पड़ रहा है(चित्रा 1,कदम 3, बढ़ाया)।
  5. एक रेजर ब्लेड के साथ एक P200 पिपेट टिप के अंत के 0.5 सेमी काट लें और "भ्रूण गोंद"(28में वर्णित) में डुबकी लगाएं। उदारता से एक क्षेत्र को 5 मिमी चौड़ाई में कोट करें(चित्रा 1,चरण 4) 24मिमी x 50 मिमी आयताकार कवरलिप के लंबे किनारे के साथ, और सूखी, गोंद की ओर जाने दें। सुखाने ~ 30 एस ले जाएगा और पूरा हो गया है एक बार पूरे गोंद लेपित क्षेत्र गीला या चमकदार के बजाय मैट दिखाई देता है ।
    नोट: पहले से कम से कम 48 घंटे "भ्रूण गोंद" तैयार करें। 28में वर्णित एक प्रस्फुटन शीशी में दो तरफा टेप की स्ट्रिप्स में एन-हेप्टेन जोड़ें ।
  6. एक बार "भ्रूण गोंद" सूख गया है, धीरे से एगर पर गठबंधन भ्रूण की पंक्ति के शीर्ष पर नीचे कवरस्लिप गोंद पक्ष जगह है, कवरस्लिप के किनारे और भ्रूण की पंक्ति के बीच अंतरिक्ष के 2-3 मिमी जा रहा है ।
    नोट: भ्रूण भी कवरस्लिप के किनारे के करीब चिपके हुए प्रयोग के दौरान बहुत ज्यादा सूख भ्रूण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
  7. कवरस्लिप को फ्लिप करें ताकि भ्रूण अब ऊपर का सामना कर रहे हैं। उन्हें कवरस्लिप के एक लंबे किनारे के साथ एक लाइन में फंस जाना चाहिए, और उनके वेंट्रल क्षेत्र को कवरस्लिप के निकटतम किनारे का सामना करना पड़ना चाहिए(चित्र 1,चरण 4, बढ़ायागया)।
  8. एक 16 ऑउंस स्क्रू टॉप जार में संग्रहीत ताजा नीले डिसकेंट के 150 ग्राम के शीर्ष पर धीरे से भ्रूण के साथ कवरस्लिप रखकर भ्रूण को डिसिकेट करें। ढक्कन पर कसकर पेंच और 8-10 मिनट के लिए इनक्यूबेट(चित्रा 1,चरण 5)।
  9. Desiccation के बाद, एक डेसीकेंट जार से कवरस्लिप को हटा दें और कवरस्लिप के प्रत्येक छोटे पक्ष को माइक्रोस्कोप स्लाइड में टेप करें, भ्रूण साइड अप,दो4 सेमी 2 टुकड़ों के साथ डबल-तरफा टेप के ताकि भ्रूण कवरस्लिप इंजेक्शन चरण पर फिट हो जाए(चित्रा 1,चरण 6)।
  10. गठबंधन भ्रूण को कवर करने और उन्हें आगे निर्जलीकरण(चित्रा 1,चरण 6) से बचाने के लिए एक पाश्चर पिपेट के साथ हेलोकार्बन 27 तेल की2-3 बूंदेंजोड़ें।

4. इंजेक्शन और गर्मी तनाव भ्रूण actin रॉड गठन को बढ़ावा देने के लिए

नोट: सभी इंजेक्शन 18 डिग्री सेल्सियस पर तापमान नियंत्रित कमरे में किए जाते हैं।

  1. एक ग्लास पेट्री डिश से आर्द्र इनक्यूबेशन कक्ष तैयार करें कम से कम 100 मिमी x 20 मिमी आकार में और आसुत पानी(चित्रा 1,चरण 8)के साथ घटा प्रयोगशाला ऊतक वाइपर के ट्विस्ट के साथ कक्ष लाइन। भ्रूण इंजेक्शन से पहले 32 डिग्री सेल्सियस या वांछित इनक्यूबेशन तापमान पर इनक्यूबेशन कक्षों को पहले से गर्म करें।
  2. माइक्रोइंजेक्टर के लिए एयरफ्लो वाल्व खोलें और माइक्रोइंजेक्टर (कम से कम 90 साई के दबाव के साथ संकुचित हवा या घर की हवा उपयुक्त है) चालू करें।
  3. जबकि भ्रूण डिसेकेट कर रहे हैं, माइक्रो लोडर टिप का उपयोग करके माइक्रोनीडल में पहले से तैयार जी-ऐक्टिनरेड सुपरनेट को बैकलोड करें। 1-1.5 माइक्रोन को आकर्षित करने के लिए पिपेट सेट करें।
    नोट: ऐक्टिन की चिपचिपाहट के कारण, लोडिंग वॉल्यूम सटीक नहीं हो सकता है और कम से कम एक से दो और माइक्रोनीडल लोड करने के लिए पर्याप्त ऐक्टिन छोड़ी जा सकती है। यदि माइक्रोनीडल को ठीक से कैलिब्रेट किया जाता है और प्रयोग के दौरान भरा नहीं जाता है तो प्रति लोडेड माइक्रोनीडल को 60 भ्रूण इंजेक्ट किए जा सकते हैं।
  4. सुई धारक को माइक्रोनीडल अटैच करें और पेंच कस लें। एयर ट्यूब को माइक्रोइंजेक्टर से कनेक्ट करें और यह सुनिश्चित करें कि माइक्रोनीडल समतुल्य पर बैकफ्लो दबाव 30 एचपीए तक हो।
  5. स्लाइड माइक्रोमीटर पर जी-ऐक्टिनरेड (~ 500 पीएल) के 100 माइक्रोन व्यास बुलबुले को निष्कासित करने के लिए माइक्रोइंजेक्टर सेटिंग्स को कैलिब्रेट करें। सही बुलबुला आकार प्राप्त करने के लिए माइक्रोइंजेक्टर पर दबाव घुंडी (500-1500 एचपीए) और इंजेक्शन पल्स टाइम नॉब (0.1-0.5 एस) घुमाएं। इन सेटिंग्स को समायोजित करें हर बार एक नया माइक्रोनीडल ऐक्टिन चिपचिपाहट और माइक्रोनीडल टिप आकार में परिवर्तनशीलता के लिए खाते में लोड किया जाता है।
    नोट: तैयार जी-ऐक्टिनलाल चिपचिपा है और माइक्रोनीडल की नोक में हवा हो सकती है जिसे भ्रूण इंजेक्शन लगाने से पहले निष्कासित कर दिया जाना चाहिए। यदि जी-ऐक्टिनलाल माइक्रोनीडल की नोक से आसानी से निष्कासित नहीं होता है, तो धीरे-धीरे स्लाइड माइक्रोमीटर के किनारे के खिलाफ माइक्रोनीडल टिप को तोड़ें।
  6. माइक्रोस्कोप चरण पर घुड़सवार भ्रूण के साथ स्लाइड रखें।
    नोट: हर इंजेक्शन की स्थापना अलग होगी, तो शोधकर्ताओं को अपने इंजेक्शन विधि तदनुसार समायोजित करना होगा । यहां भ्रूण को एक स्थिर माइक्रोनीडल के संबंध में ले जाया जाता है, जो भ्रूण को माइक्रोनीडल में चलाकर प्रत्येक भ्रूण को इंजेक्शन देता है।
  7. माइक्रोमैनीपुलेटर स्टेज को एडजस्ट करें और लाइट माइक्रोस्कोप पर 10x ऑब्जेक्टिव का फोकस करें ताकि भ्रूण दिखाई दे। भ्रूण सही फोकल प्लेन में होते हैं जब विटेललाइन झिल्ली की रूपरेखा सबसे तेज होती है और भ्रूण सबसे बड़ा दिखाई देता है । सही विकास के चरण में इंजेक्शन लगाने के लिए भ्रूण चुनें, ताकि जब तक इंजेक्शन इनक्यूबेशन पूरा हो जाए, तब तक अधिकांश क्लच वांछित विकासात्मक चरण तक पहुंच जाता है (उदाहरण के लिए, 32 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी तनाव के बाद सेलुलराइजेशन पर छड़ का पालन करने के लिए बोनेस के चरण 2-330 पर भ्रूण इंजेक्ट करें)।
  8. भ्रूण के रूप में एक ही फोकल विमान में सुई लाने के लिए माइक्रोनीडल नियंत्रण का प्रयोग करें।
    नोट: यदि चरण या माइक्रोनीडल को हिलाते समय माइक्रोनीडल कवरस्लिप पर पकड़ता है, तो माइक्रोनीडल स्लाइड के बहुत करीब है और सही फोकल प्लेन में नहीं है। माइक्रोनीडल कवरस्लिप के समानांतर होना चाहिए, न कि एक महत्वपूर्ण कोण(चित्रा 1,चरण 7)पर।
  9. भ्रूण में माइक्रोनीडल डालें ताकि यह भ्रूण "भूमध्य रेखा" पर अपने वेंट्रल क्षेत्र के बीच में भ्रूण से टकराए। पैर पेडल या "इंजेक्ट" बटन के साथ इंजेक्शन ट्रिगर जब माइक्रोनीडल टिप भ्रूण के बीच के अंदर दिखाई दे रहा है(चित्रा 1,चरण 7)।
  10. एक बार जी-ऐक्टिनरेड इंजेक्ट करें और धीरे-धीरे माइक्रोनीडल को हटा दें। मंच ले जाएँ और उचित विकास चरण के प्रत्येक भ्रूण के लिए दोहराएं।
    नोट: भ्रूण का विस्तार सामान्य है क्योंकि जी-ऐक्टिनरेड इंजेक्शन है और साइटोप्लाज्म का एक सा भ्रूण से बाहर रिसाव हो सकता है ।
  11. सभी भ्रूण इंजेक्शन के बाद, तैयार आर्द्र इनक्यूबेशन कक्ष में भ्रूण के साथ स्लाइड जगह है और ढक्कन बंद(चित्रा 1,चरण 8)। यदि सेलुलराइजेशन तक पहुंचने वाले भ्रूण प्राप्त करने की कोशिश कर रहे हैं, तो गर्मी आर्द्र इनक्यूबेशन कक्ष में 60-75 मिनट के लिए 32 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण को तनाव देती है।
    नोट: इनक्यूबेशन बार ध्यान दिया जाता है कि गर्मी पर बल दिया भ्रूण सेलुलराइजिंग में छड़ के दृश्य की अनुमति देते हैं । इनक्यूबेशन समय नॉन हीट स्ट्रेस कंट्रोल भ्रूण के लिए लंबा होगा क्योंकि विकास कम तापमान31पर धीमा होगा । इन नियंत्रण भ्रूणों को विशिष्ट प्रयोग के डिजाइन और पूछे जाने वाले प्रश्न के आधार पर 18 डिग्री सेल्सियस या 25 डिग्री सेल्सियस तापमान पर आर्द्र कक्षों में इनक्यूबेटेड किया जा सकता है। जी-ऐक्टिनरेड के लिए पूरे भ्रूण को फैलाना जरूरी इनक्यूबेशन समय 30 मिनट का होता है ।

5. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा गर्मी पर बल दिया भ्रूण में छवि actin छड़

  1. जबकि भ्रूण गर्मी पर बल दिया जा रहा है, कंफोकल माइक्रोस्कोप पर बारी और ५६१ एनएम लेजर चैनल का चयन करें ।
  2. ऑब्जेक्टिव लेंस (25x, 40x या 63x अनुशंसित) को काम करने की स्थिति में ले जाएं।
  3. यदि इमेजिंग गर्मी ने भ्रूण पर बल दिया है, तो 32 डिग्री सेल्सियस के आंतरिक तापमान को प्राप्त करने के लिए गर्म चरण इनक्यूबेटर सेट करें। एक बिंदु और गोली मार या अवरक्त थर्मामीटर पर या उद्देश्य के पास तापमान की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  4. इनक्यूबेशन पूरा होने के बाद आर्द्र इनक्यूबेशन कक्ष से इंजेक्शन भ्रूण के साथ स्लाइड निकालें(चित्रा 1,चरण 9)।
  5. जल्दी से काम करना, धीरे से डबल तरफा टेप टुकड़े कि स्लाइड करने के लिए घुड़सवार भ्रूण के साथ कवरस्लिप का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था बंद जिज्ञासा(चित्रा 1,चरण 9)।
    सावधानी: इन चरणों के दौरान कोमल रहें क्योंकि यदि बहुत अधिक बल लागू किया जाता है तो कवर्लिप आसानी से चकनाचूर हो सकते हैं।
  6. दो तरफा टेप के दो 2.5 सेमी लंबे टुकड़ों को एक साथ चिपकाएं और टेप को दो स्ट्रिप्स बनाने के लिए आधे लंबाई में काट लें, 2.5 x 0.5 सेमी लंबा(चित्रा 1,चरण 10)।
  7. पहले कवरस्लिप पर प्रत्येक टेप पट्टी की लंबाई का दो तिहाई चिपकाएं, हेलोकार्बन 27 तेल(चित्रा 1,चरण 10, नारंगी)में भ्रूण के प्रत्येक पक्ष को फ्लैंक करते हैं, जिससे एक तिहाई टेप स्ट्रिप्स पहले कवर्लिप के किनारे से लटक जाती हैं जहां भ्रूण फंस जाते हैं। दस्ताने हाथों का प्रयोग करें और इस कदम के दौरान भ्रूण को छूने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
  8. धीरे-धीरे टेप स्ट्रिप्स के शीर्ष पर एक दूसरा आयताकार कवरलिप रखें ताकि कवरस्लिप(चित्रा 1,चरण 10, नीला)के बीच भ्रूण को सैंडविच किया जा सके। 25 मिमी किनारों को संरेखित करें लेकिन 50 मिमी किनारों को चौड़ाई में 1 सेमी से एक दूसरे से ऑफसेट रखें।
    नोट: यह दूसरा कवरस्लिप की पूरी सतह नई इमेजिंग सतह बन जाएगी जो उद्देश्य लेंस का सामना करेगी, इसलिए इस दूसरे कवरस्लिप सतह पर उंगलियों के निशान या हेलोकार्बन 27 तेल न पाए जाने का ध्यान रखें। ऑफसेट आवश्यक है ताकि अतिरिक्त हेलोकार्बन 27 तेल भ्रूण को समान रूप से विसर्जित करने के लिए जोड़ा जा सके। यदि आवश्यक हो, तो सीवन में हेलोकार्बन 27 तेल जोड़ें जहां दो कवरस्लिप सैंडविच के शीर्ष पर मिलते हैं और यह केशिका कार्रवाई द्वारा भ्रूण को कोट करेगा (चित्रा 1,चरण 10में धराशायी लाइनें देखें)।
  9. टेप का पालन करने के लिए कवरस्लिप प्राप्त करने के लिए कवरस्लिप के क्षेत्रों पर धीरे-धीरे टैप करें जो सीधे टेप स्ट्रिप्स के शीर्ष पर एक रेज़रब्लेड के कुंद पक्ष के साथ हैं।
  10. इमेजिंग सतह को साफ रखने और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप(चित्रा 1, चरण 11)तक ले जाने के लिए एक प्रयोगशाला ऊतक वाइपर पर कवरस्लिप सैंडविच को फ्लिप करें औररखें। सुनिश्चित करें कि टेप इमेजिंग से पहले दोनों कवर्लिप्स के लिए पूरी तरह से अटक गया है।
  11. पुष्टि करें कि गर्म चरण तापमान पर है और यदि एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, चयनित उद्देश्य लेंस पर विसर्जन तरल जोड़ें ।
  12. कवरस्लिप सैंडविच को सावधानी से स्टेज पर रखें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि नई इमेजिंग सतह (2व कवरस्लिप) विसर्जन तरल(चित्रा 1,चरण11)को छू रही है।
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो इमेजिंग के दौरान अनावश्यक आंदोलन को रोकने के लिए दो तरफा टेप के दो छोटे टुकड़ों के साथ मंच पर कवरस्लिप सैंडविच का पालन करें यदि कवरस्लिप गर्म चरण में अच्छी तरह से फिट नहीं होते हैं।
  13. एक भ्रूण पर ध्यान केंद्रित करें जो सेलुलराइजेशन (बोनेस चरण 4 ए30)या वांछित विकासात्मक चरण में या तो संचारित प्रकाश या फ्लोरेसेंस का उपयोग करके है।
  14. एक बार एक भ्रूण ध्यान में लाया गया है, कंफोकल माइक्रोस्कोप पर लेजर अधिग्रहण मोड के लिए स्विच और लेजर शक्ति और लाभ, फ्रेम आकार, टाइलिंग, और प्रक्षेपण सेटिंग्स के रूप में वांछित समायोजित करें ।
  15. इंट्रान्यूक्लियर ऐक्टिन रॉड खोजने के लिए भ्रूण के नाभिक के फोकल विमानों के माध्यम से सतह-दृश्य छवियों को लें। छड़ को तुलनात्मक रूप से अंधेरे नाभिक(चित्रा 2ए, 2सी)के अंदर उज्ज्वल धारियाँ या डॉट्स के रूप में कई झुकाव में दिखाई देना चाहिए।

6. वैकल्पिक इमेजिंग प्रयोग

  1. इंट्रान्यूक्लियर ऐक्टिन रॉड की लंबाई के साथ या साइटोप्लाज्मिक ऐक्टिन संरचनाओं में ऐक्टिन टर्नओवर की जांच करने के लिए एफआरएपी करें, जैसे कि सेलुलराइजेशन के दौरान प्लाज्मा झिल्ली के सुझाव।
  2. इमेजिंग सॉफ्टवेयर में, प्रयोग प्राप्त करने के लिए फरो टिप्स या ऐक्टिन रॉड के आसपास एक आयताकार क्षेत्र चुनें।
  3. ब्लीच करने के लिए आयताकार अधिग्रहण क्षेत्र के भीतर एक ऐक्टिन रॉड के केंद्र का एक छोटा वर्ग क्षेत्र चुनें। सुनिश्चित करें कि ऐक्टिन रॉड के टिप्स दिखाई दे रहे हैं और प्रयोग के दौरान प्रक्षालित नहीं होते हैं ताकि नाभिक के अंदर रॉड की सटीक ट्रैकिंग की अनुमति मिल सके।
  4. ब्लीच लेजर को 50x को फिर से शुरू करने के लिए सेट करें और ब्लीच लेजर पावर को अधिकतम सेट करें।
  5. अधिकतम पिक्सेल निवास गति पर कुल 120 एस तक के लिए हर सेकंड छवियों को प्राप्त करने के लिए एक समय पाठ्यक्रम चुनें और छवि अधिग्रहण के पहले दो सेकंड के बाद ब्लीच करने के लिए लेजर सेट करें।
  6. फ्लोरेसेंस रिकवरी1के आधे समय का निर्धारण करने के लिए डेटा की मात्रा निर्धारित करें ।

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Representative Results

चित्रा 1में भ्रूण हैंडलिंग का एक योजनाबद्ध कार्यप्रवाह दर्शाया गया है और तालिका 1में एक विशिष्ट प्रयोग की समय सारिणी प्रस्तुत की गई है । एक अच्छा प्रयोगात्मक परिणाम के लिए एक अनुमान यह है कि इंजेक्शन हर 10 भ्रूण के लिए, देखा भ्रूण के कम से कम आधे सही विकास के स्तर पर होगा, अक्षतिग्रस्त, और ३२ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी तनाव के साथ एक मजबूत ASR प्रदर्शन । इस ASR इंट्रान्यूक्लियर ऐक्टिन छड़ की विधानसभा द्वारा सबूत के रूप में चित्रा 2A (सही पैनल) में एक भ्रूण के प्रतिनिधि सतह दृश्य छवि में दिखाया जाएगा । ऐक्टिन छड़ नाभिक के अंदर कई झुकाव (इमेजिंग विमान के समानांतर या लंबवत) में दिखाई देगा और कई फोकल विमानों के माध्यम से चित्रित किया जा सकता है। इसकी तुलना में, 18 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड नियंत्रित भ्रूण ऐक्टिन रॉड(चित्रा 2 ए, बाएंपैनल) प्रदर्शित नहीं करेगा। छड़ युक्त प्रतिशत नाभिक को निर्धारित किया जा सकता है, जैसा कि चित्र 2 बीमें प्रदर्शित किया गया है। इसके अलावा, एफआरएपी प्रयोग छड़(चित्रा 2C)पर किए जा सकते हैं। एफआरएपी डेटा के लिए एक सुझाई गई मात्राकरण विधि1 में संदर्भित है और एक ऐक्टिन रॉड के प्रक्षालित बनाम बिना ब्लीच वाले क्षेत्र के लिए फ्लोरेसेंस रिकवरी प्लॉट का एक उदाहरण चित्रा 2 डीमें दिखाया गया है।

यदि एक भ्रूण इंजेक्शन से गंभीर रूप से क्षतिग्रस्त हो जाता है या प्रयोग के दौरान बहुत शुष्क हो जाता है, तो मिटोटिक असिंक्रोनी देखा जा सकता है और सेलुलराइजेशन बाधित हो जाएगा। कभी-कभी, भ्रूण में पर्याप्त ऐक्टिन इंजेक्ट करने में विफलता के कारण छड़ दिखाई नहीं दे सकते हैं। यदि ऐसा होता है, तो सुनिश्चित करें कि जी-ऐक्टिनरेड इंजेक्शन की मात्रा 500 पीएल (चरण 4.5 में माइक्रोमीटर के साथ मापा जाता है) और पुष्टि करें कि यह राशि प्रत्येक भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन के बीच जी-ऐक्टिनलाल बुलबुले के आकार की जांच करने के लिए आसपास के तेल में एक परीक्षण इंजेक्शन करके भ्रूण के बीच सुसंगत बनी हुई है। इसके अतिरिक्त, रॉड विज़ुअलाइज़ेशन सुनिश्चित करने के लिए, कवरस्लिप को जोड़ने और भ्रूण को गर्म माइक्रोस्कोप चरण में ले जाने के लिए जल्दी से काम करें एक बार वे चरण 5.4 में आर्द्र कक्ष से ले जाए जाते हैं, क्योंकि रॉड असेंबली रिवर्सेबल1 है और छड़ 30 मिनट से अधिक के लिए 32 डिग्री सेल्सियस से कम तापमान पर रखे जाने पर अलग हो सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोग के दौरान भ्रूण हैंडलिंग का योजनाबद्ध सिंहावलोकन। 1)भ्रूण संग्रह कप में वयस्क मक्खियों सेब के रस आगर प्लेटों पर भ्रूण रखना। (2)भ्रूण को 1:1 ब्लीच के साथ डिकेरियन किया जाता है: आसुत पानी, संग्रह टोकरी में डाला जाता है, और ब्लीच और मलबे को हटाने के लिए आसुत पानी से अच्छी तरह से धोया जाता है। (3)भ्रूण एक पेंटब्रश के साथ एक आयताकार सेब का रस आगर कील के लिए एक स्लाइड पर स्थानांतरित कर रहे है और उनके पक्ष, सिर से पूंछ पर व्यवस्था की, पृष्ठीय क्षेत्र के साथ आगर के किनारे का सामना करना पड़ रहा । (4)एक ग्लास कवरस्लिप (नारंगी) का 5 x 50 मिमी क्षेत्र "भ्रूण गोंद" से लेपित होता है और उन्हें कवरस्लिप का पालन करने के लिए एगर पर व्यवस्थित भ्रूण की पंक्ति पर धीरे से दबाया जाता है। 5)भ्रूण के साथ कवरलिप उलटा होता है ताकि भ्रूण का सामना हो। भ्रूण एक पेंच शीर्ष जार में desiccated हैं । (6)इंडिस्केशन के तुरंत बाद, कवरस्लिप को एक स्लाइड पर टेप किया जाता है, भ्रूण का सामना करना पड़ता है, और भ्रूण हेलोकार्बन 27 तेल से ढके होते हैं। (7)पहले से तैयार जी-ऐक्टिनरेड से भरी हुई एक माइक्रोनीडल का उपयोग प्रत्येक भ्रूण के वेंट्रल क्षेत्र के केंद्र में एक इंजेक्शन बनाने के लिए किया जाता है, जिसमें सुई कवरस्लिप के समानांतर तैनात होती है । (8)इंजेक्शन के बाद, भ्रूण को नियंत्रण तापमान (18 डिग्री सेल्सियस) पर या गर्मी के तनाव (32 डिग्री सेल्सियस) पर नम प्रयोगशाला ऊतक वाइपर के साथ आर्द्र एक पेट्री डिश के अंदर इनक्यूबेटेड किया जाता है। (9)इनक्यूबेशन के बाद, उस पर भ्रूण के साथ कवरलिप स्लाइड से हटा दिया जाता है। (10)दो तरफा टेप के दो टुकड़े एक दूसरे के ऊपर स्तरित होते हैं, आधे लंबाई में कटा हुआ होता है, और पहले कवरस्लिप पर भ्रूण के आसपास के तेल के दोनों ओर रखा जाता है। एक दूसरा कवरस्लिप (नीला) पहले के शीर्ष पर रखा गया है एक नई इमेजिंग सतह बनाने के लिए, इतना ऑफसेट है कि यह अधिक तेल के लिए एक अंतर छोड़ देता है के रूप में आवश्यक भ्रूण को कवर जोड़ा जाएगा । (11) यदिउल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग की जाती है, तो कवरस्लिप सैंडविच उलटा होता है ताकि दूसरा कवरलिप उद्देश्य का सामना कर सके। इमेजिंग एक इनक्यूबेटेड कक्ष में किया जाता है, और प्रत्येक भ्रूण के नाभिक के कई फोकल विमानों पर ऐक्टिन रॉड की कल्पना की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: गर्मी पर बल दिया भ्रूण में actin छड़ के प्रतिनिधि परिणाम। (क)ऐक्टिन रॉड एक भ्रूण में नहीं देखा जाता है जो 18 डिग्री सेल्सियस (बाएं पैनल) के नियंत्रण तापमान पर इनक्यूबेटेड था, लेकिन एक भ्रूण के नाभिक में देखा जाता है जो 32 डिग्री सेल्सियस (दाएं पैनल) पर गर्मी पर बल दिया गया था। (ख)प्रतिनिधि प्रयोग से ऐक्टिन छड़ के साथ नाभिक के प्रतिशत का परिमाणीकरण । प्रत्येक डॉट एक भ्रूण का प्रतिनिधित्व करता है जहां छड़ और नाभिक पूरे चित्र क्षेत्र में गिना जाता था (n = 22 भ्रूण 18 डिग्री सेल्सियस पर; n = 23 भ्रूण ३२ डिग्री सेल्सियस पर; त्रुटि सलाखों मानक विचलन दिखाते हैं) । एक छात्र की टी-परीक्षा, असमान विचरण के साथ ग्रहण किया गया था, पी-वैल्यू की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । (ग)एक प्रतिनिधि समय श्रृंखला एक ऐक्टिन रॉड पर FRAP से पता चलता है । रॉड के जिस हिस्से को ब्लीच किया गया था, वह सफेद तीर के सिर से दर्शाया गया है। प्री-ब्लीच ब्लीच स्टेप से पहले 2 एस है। समय = 0 एस ब्लीच कदम है, और फ्लोरेसेंस वसूली 60 एस पोस्ट ब्लीच तक ट्रैक किया गया था। (घ)एक भूखंड एक ही रॉड में एक अवियुक्त क्षेत्र की तुलना में एक छड़ी के प्रक्षालित क्षेत्र में ऐक्टिन फ्लोरेसेंस के लिए वसूली गतिशीलता दिखाता है । छड़ उल्लेखनीय रूप से स्थिर हैं और उनके भीतर ऐक्टिन कारोबार नहीं करता है। इस प्रकार, कोई वसूली नहीं देखी जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका 1: सुझाए गए समय सारिणी के साथ प्रायोगिक कार्यप्रवाह। यह समय सारिणी प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण को पूरा करने में अपेक्षित समय का सारांश देती है।

आदेश कहीं जाना प्रत्येक चरण के लिए आवश्यक समय या क़िस्‍म
1 1.1 5 दिन पहले भ्रूण संग्रह पिंजरों बनाओ। सेब का रस आगर प्लेटें डालो।
2 1.2-1.3 2 दिन पहले वयस्क पुरुष और महिला मक्खियों के साथ संग्रह पिंजरों की स्थापना करें।
3 2.6 नोट 1 दिन पहले माइक्रोनीडल बनाने के लिए केशिका ट्यूब खींचें।
4 2.1-2.6 1 घंटे जी-ऐक्टिन तैयार करें।
5 3.1 30 मिनट मक्खियों को अंडे डालने की अनुमति दें।
6 3.2-3.10 15-30 मिनट भ्रूण ले लीजिए, माउंट, डिसेकेट भ्रूण। तेल के साथ भ्रूण को कवर करें।
7 4.1 30 मिनट पहले आर्द्र इनक्यूबेशन कक्ष तैयार करें।
8 4.2-4.4 1 मिनट माइक्रोनीडल लोड करें।
9 4.5-4.10 10-20 मिनट जी-ऐक्टिन बबल साइज को कैलिब्रेट करें और भ्रूण इंजेक्ट करें।
10 4.11 30 मिनट-1 + एच इनक्यूबेट/हीट स्ट्रेस भ्रूण।
11 5.1-5.3 पहले से 1 घंटे माइक्रोस्कोप चालू करें और इनक्यूबेशन चरण।
12 5.4-5.10 5 मिनट इमेजिंग के लिए कवरस्लिप के बीच सैंडविच भ्रूण।
13 5.11-6.6 15 मिनट-1 + एच भ्रूण में छवि इंट्रान्यूक्लियर ऐक्टिन छड़।

तालिका 2: समस्या निवारण सुझाव। यह तालिका प्रोटोकॉल के सफल समापन में सहायता करने के लिए समस्या निवारण के लिए सुझाव प्रदान करती है।

संभावित समस्या सुझाव
मक्खियां पर्याप्त भ्रूण नहीं बिछाती हैं। कप को कम से कम 5 दिन पहले सेट करें (चरण 1.1-1.3 को देखें)। अंडे बिछाने को प्रोत्साहित करने के लिए प्रयोग करने के लिए अग्रणी प्रति दिन प्लेटें 3x बदलें । मक्खियों को 30 मिनट के बजाय 1 घंटे के लिए भ्रूण रखने दें। युवा वयस्क मक्खियों के साथ कप सेट करें।
कोई जी-ऐक्टिन माइक्रोनीडल से निष्कासित नहीं किया जाता है। माइक्रोइंजेक्टर पर प्रेशर और टाइम सेटिंग्स बढ़ाएं। माइक्रोनीडल टिप को आगे तोड़ें (चरण 4.5 नोट को देखें)। चूंकि प्रमुख मोज़री स्पष्ट नहीं हो सकते हैं, इसलिए एक नई सुई लोड करें।
एक छोटे से पर्याप्त बुलबुले के आकार को जांचना मुश्किल है। दबाव और समय सेटिंग्स को समायोजित करें (चरण 4.5 को देखें)। चूंकि माइक्रोनीडल टिप खोलना बहुत बड़ा हो सकता है, इसलिए एक नई सुई लोड करें।
इंजेक्शन के दौरान कवरस्लिप पर गोंद से भ्रूण छोड़ते हैं। हेप्टेन समाधान में अधिक दो तरफा टेप जोड़कर भविष्य के कवर्लिप्स के लिए "भ्रूण गोंद" स्थिरता को समायोजित करें (चरण 3.5 नोट को देखें)।
इनक्यूबेशन तापमान के दौरान भ्रूण सूख जाते हैं। सुनिश्चित करें कि स्लाइड इनक्यूबेशन कक्ष में स्तर है (4.11 कदम का उल्लेख) और है कि तेल कुछ भी है कि यह बाती दूर हो सकता है छू नहीं है। भ्रूण में तेल की अतिरिक्त बूंदें जोड़ें। पूर्व इंजेक्शन desiccation समय कम (चरण 3.8 को देखें) ।
तेल पूरी तरह से पहले और दूसरे कवर्लिप के बीच में भ्रूण को कवर नहीं करता है। कवर्लिप्स के बीच छोटे अंतर में केशिका कार्रवाई के माध्यम से अतिरिक्त तेल जोड़ें (चरण 5.8 नोट को देखें)।
इंट्रान्यूक्लियर ऐक्टिन रॉड गर्मी में तनावग्रस्त भ्रूण में दिखाई नहीं देते हैं। जी-ऐक्टिन की एक बड़ी मात्रा इंजेक्ट करें (चरण 4.5 को देखें)। पुष्टि करें कि इंजेक्शन के बाद दोनों का तापमान इनक्यूबेशन (चरण 4.11 को देखें) और इमेजिंग कक्ष 32 डिग्री सेल्सियस (चरण 5.3 को संदर्भित करते हैं)।
भ्रूण के इंजेक्शन साइट के आसपास जी-ऐक्टिन के बड़े बुलबुले दिखाई दे रहे हैं। जी-ऐक्टिन की एक छोटी मात्रा इंजेक्ट करें (चरण 4.5 को देखें)। भ्रूण के अंदर इंजेक्शन ऐक्टिन की बेहतर अवधारण को बढ़ावा देने के लिए भ्रूण के समय को बढ़ाएं (चरण 3.8 को देखें)।

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Discussion

इस विधि का महत्व यह है कि यह21, 22, 23, 24, 25,26, 27 में माइक्रोइंजेक्शन के सुस्थापित प्रोटोकॉल का उपयोग करता है ताकि एएसआर और साथ में ऐक्टिन रॉड असेंबली के बारे में नए शोध को सक्षम किया जा सके। जी-ऐक्टिनरेड को लाइव भ्रूण में इंजेक्ट करने का एक बड़ा फायदा यह है कि एएसआर का अध्ययन विभिन्न संदर्भों के तहत किया जा सकता है । भविष्य के अध्ययनों के लिए, इन संदर्भों में उत्परिवर्ती स्क्रीन के हिस्से के रूप में अन्य जीनोटाइप के भ्रूण को इंजेक्ट करना या विभिन्न तनाव स्थितियों में इंजेक्शन भ्रूण को उजागर करना शामिल हो सकता है, जैसे ऑक्सीडेटिव स्ट्रेस4,32। हालांकि यहां विस्तार से वर्णित नहीं है, इस इंजेक्शन तकनीक को न्यूक्लिक एसिड, अन्य प्रोटीन, दवाओं और संकेतक रंगों को इंजेक्ट करने के लिए भी संशोधित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, एएसआर का अध्ययन करने के लिए21,22,23,24,32देखें। इस प्रकार, यह विधि एएसआर को प्रेरित करने वाले तनावों की सीमा की पहचान करने के लिए कई दृष्टिकोण प्रस्तुत करती है, एएसआर के दौरान सेलुलर प्रतिक्रियाओं को आगे की विशेषता देती है (उदाहरण के लिए माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि में परिवर्तन), और इंट्रान्यूक्लियर ऐक्टिन रॉड असेंबली में अंतर्निहित नए अणुओं और तंत्रों को उजागर करती है।

प्रोटोकॉल के कुछ महत्वपूर्ण चरणों में निम्नलिखित शामिल हैं: चरण 3.8 में, सफल इंजेक्शन और सर्वोत्तम भ्रूण स्वास्थ्य सुनिश्चित करने के लिए भ्रूण को ठीक से डिसकेटेड किया जाना चाहिए। Desiccation समय परिवेश के तापमान और प्रयोगशाला की आर्द्रता पर निर्भर करेगा, इसलिए भ्रूण को संभालने के लिए इस पैरामीटर को स्थापित करने के लिए पहले तटस्थ पीएच बफर के साथ बढ़ते, सिसिकेशन और इंजेक्शन का अभ्यास करने की सिफारिश की जाती है। चरण 4.5 में, माइक्रोनीडल और इंजेक्शन सेटिंग्स को भ्रूण में पर्याप्त जी-ऐक्टिनरेड के इंजेक्शन की अनुमति देने के लिए ठीक-ट्यून किया जाना चाहिए। यदि बहुत कम जी-ऐक्टिनलाल भ्रूण में इंजेक्ट किया जाता है, तो ऐक्टिन रॉड आसानी से कल्पना नहीं की जा सकती है, क्योंकि ऐक्टिन रॉड का गठन मुफ्त ऐक्टिन1की एकाग्रता पर निर्भर करता है। इसके अतिरिक्त, एफआरएपी प्रयोगों से लगातार परिणाम प्राप्त करना मुश्किल होगा यदि पर्याप्त जी-ऐक्टिनरेड इंजेक्शन नहीं है, क्योंकि फ्लोरेसेंस तीव्रता पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस को दूर करने के लिए पर्याप्त उच्च नहीं होगी। इसलिए, हर बार जब एक नई सुई भरी हुई और उपयोग की जाती है तो बुलबुले के आकार को जांचना महत्वपूर्ण है। जी-ऐक्टिनरेड चिपचिपा है और माइक्रोनीडल के अंदर रोकना पड़ता है। कभी-कभी, इससे भ्रूण में जी-ऐक्टिन की चर मात्रा का इंजेक्शन लग सकता है। यदि माइक्रोनीडल भरा हुआ है और उच्च दबाव के साथ माइक्रोनीडल को साफ़ करता है, तो माइक्रोनीडल की नोक को तोड़ने का प्रयास करना या यहां तक कि एक नया माइक्रोनीडल लोड करना और भ्रूण का एक ताजा सेट इंजेक्शन देना आवश्यक हो सकता है। अंत में, चरण 4.11 में, भ्रूण को ऊंचा तापमान पर और एएसआर के लिए पर्याप्त समय के लिए प्रेरित किया जाना चाहिए और छड़ को1बनाने के लिए। सभी इनक्यूबेटर के तापमान पर लगातार नजर रखी जानी चाहिए, इनक्यूबेटर से इनक्यूबेटर तक भ्रूण को स्थानांतरित करने का समय सीमित होना चाहिए, और सभी इनक्यूबेटर के लिए एक टाइमर का उपयोग किया जाना चाहिए। अन्य संभावित समस्याओं को साथ में समस्या निवारण सुझावों के साथ तालिका 2 में सूचीबद्ध किया गया है।

इस प्रोटोकॉल की एक प्रमुख सीमा यह है कि इंजेक्शन, ऊष्मायन और इमेजिंग के दौरान भ्रूण के स्वास्थ्य को संरक्षित करने के लिए असाधारण देखभाल की जानी चाहिए । प्रोटोकॉल भ्रूण स्वास्थ्य को अधिकतम करने के लिए डिजाइन किया गया है, और महत्वपूर्ण अभ्यास के साथ, एक शोधकर्ता भ्रूण विकास के साथ प्रोटोकॉल के सभी चरणों को पूरा कर सकते है प्रति तापमान31की उंमीद दरों पर प्रगति । प्रोटोकॉल की एक दूसरी सीमा एक माइक्रोइंजेक्शन रिग की आवश्यकता है, जो काफी महंगा हो सकता है और हर फ्लाई लैब के लिए आम उपकरण नहीं है। हालांकि, यदि एक आसन्न प्रयोगशाला अन्य भ्रूण (जैसे, ज़ेनोपस,ज़ेब्राफ़िश, और कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस)या अनुयायी कोशिकाओं को इंजेक्ट करने के लिए सुसज्जित है, तो उपयोग की जाने वाली इंजेक्शन रिग ड्रोसोफिला इंजेक्शन के लिए उपयुक्त है। उस मामले में, पिपेट कुकबुक29के दिशानिर्देशों के अनुसार ड्रोसोफिला भ्रूण के लिए केवल सुई के आकार को अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है। वैकल्पिक रूप से, बाजार पर कुछ कम महंगे मिकूइंजेक्टर विकल्प हैं (उदाहरण के लिए, एनालॉग माइक्रोइंजेक्टर), जो इंजेक्शन रिग को कोडांतरण करने की लागत को काफी कम कर सकते हैं।

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Disclosures

हितों का कोई टकराव घोषित नहीं ।

Acknowledgments

लेखकों ने लिउलु झेंग और जेंगहुई Xue के काम को स्वीकार किया, जिन्होंने सोक लैब में इस तकनीक को अग्रणी करने में मदद की, साथ ही हसन सीडे ने विश्लेषण में मदद की। इस अध्ययन के लिए काम NIH (R01 GM115111) से एक अनुदान द्वारा वित्त पोषित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine triphosphate (ATP) Millipore-Sigma A23835G Component of G buffer
Apple juice, Mott's, 64 fl oz Mott's 014800000344 Component of apple juice plates
Bacto Agar BD 214010 Component of apple juice plates
Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite KIK International 059647210020 For dechorionating embryos
Calcium chloride Millipore-Sigma C1016500G Component of G buffer
Cell strainer, 70 μm Falcon 352350 For collecting dechorionated embryos
Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan Zeiss 0000001994956 For imaging intranuclear actin rods
Desiccant Drierite 24001 For desiccating embryos
Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom Zeiss 4350649000000 For arranging embryos on agar wedge
Dissecting needle, 5 in Fisher Scientific 08965A For arranging embryos on agar wedge
Dithiothreitol (DTT) Fisher Scientific BP1725 Component of G buffer
Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in 3M 021200010323 For making embryo glue
Embryo collection cage Genessee Scientific 59100 For housing adult flies and collecting embryos
Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5 Electron Microscopy Sciences 72701D For arranging embryos on agar wedge
Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm World Precision Instruments, Inc. TW1004 For microneedles
Halocarbon oil 27 Millipore-Sigma H8773100ML For hydration of embryos
Heated stage incubator Zeiss 4118579020000, 4118609020000, 4118609010000 For confocal imaging
Lab Tissue Wipers, KimWipes Kimberly-Clark 34155 Lab tissue wipers
Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished Zeiss Discontinued Injection microscope
Methyl-4-hydroxybenzoate Millipore-Sigma H36471KG Component of apple juice plates
Microinjector, FemtoJet4x Eppendorf 5253000025 Microinjector
Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 μL Eppendorf 5242956003 For loading microneedles
Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment Bernard Instruments, Inc (Houston, TX) Custom For performing microinjections
Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown Sutter Instruments P97 For pulling capillary tubes to make microneedles
Microscope cover glass 24x50-1.5 Fisher Scientific 12544E For mounting embryos
Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm Fisher Scientific 22037081 For mounting embryos for injection
n-Heptane Fisher Scientific H3601 Component of embryo glue
Objective, 10x Zeiss Discontinued 10x objective for injection microscope
Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS Zeiss 4217679971711 40x water objective for confocal
Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm) Zeiss 4208529871000 25x mixed immersion objective for confocal
Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA Zeiss 4207829900799 63x oil objective for confocal
Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2 Daler-Rowney 038372016954 For transferring embryos
Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white Kimberly-Clark 884266344845 For blotting cell strainer
Pasteur pipette, 5 3/4 in Fisher Scientific 1367820A For covering embryos with oil
Petri dish, glass, 100 x 20 mm Corning 3160102 For humid incubation chamber
Petri dish, plastic, 60 x 15 mm VWR 25384092 For apple juice plates
Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 μL Eppendorf 2231000604 For loading the microneedle
Pipette tip, xTIP4 250 μL Biotix 63300006 For adding embryo glue to coverslip
Razor blade VWR 55411050 For cutting agar wedge, tape, pipette tips
Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4x10 μg) Cytoskeleton, Inc. APHR-A G-actin^Red
Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps Fisher Scientific 033377 For making embryo glue
Screw top jar, 16 oz Nalgene 000194414195 For desiccating embryos
Stage micrometer Electron Microscopy Sciences 602104PG For calibrating volume of G-actin injection
Sucrose Millipore-Sigma 840971KG Component of apple juice plates
Trizma base Millipore-Sigma T15031KG Component of G buffer
Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz Lesaffre Yeast Corporation 117929157002 Component of yeast paste

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 159 ड्रोसोफिला,भ्रूण जी-ऐक्टिन माइक्रोइंजेक्शन ऐक्टिन स्ट्रेस रिस्पांस इंट्रान्यूक्लियर ऐक्टिन रॉड्स एफआरएपी कॉन्फोक्लिक माइक्रोस्कोपी
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Biel, N., Figard, L., Sokac, A. M.… More

Biel, N., Figard, L., Sokac, A. M. Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (159), e61297, doi:10.3791/61297 (2020).

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