Summary
Målet med denne protokollen er å injisere Rhodamine-konjugert kuleformede actin i Drosophila embryoer og bilde intranukleær actin stang montering etter varmestress.
Abstract
Formålet med denne protokollen er å visualisere intranukleære aktinstenger som monteres i levende Drosophila melanogaster embryoer etter varmestress. Actin stenger er et kjennetegn på en bevart, induserbar Actin Stress Response (ASR) som følger med menneskelige patologier, inkludert nevrodegenerativ sykdom. Tidligere viste vi at ASR bidrar til morfogenesefeil og redusert levedyktighet for å utvikle embryoer. Denne protokollen tillater fortsatt studie av mekanismer underliggende actin stang montering og ASR i et modellsystem som er svært mottagelig for avbildning, genetikk og biokjemi. Embryoer samles og monteres på en dekkslip for å forberede dem til injeksjon. Rhodamin-konjugert kuleformede actin (G-actinRed) fortynnes og lastes inn i et mikroneedle. En enkelt injeksjon er gjort i midten av hvert embryo. Etter injeksjon inkuberes embryoer ved forhøyet temperatur og intranukleære aktinstenger visualiseres deretter ved konfokal mikroskopi. Fluorescens utvinning etter fotobleaching (FRAP) eksperimenter kan utføres på actin stenger; og andre aktinrike strukturer i cytoplasma kan også avbildes. Vi finner at G-actinRed polymeriserer som endogene G-actin og ikke alene forstyrrer normal embryoutvikling. En begrensning av denne protokollen er at forsiktighet må tas under injeksjon for å unngå alvorlig skade på embryoet. Men med praksis er injeksjon av G-actinRed i Drosophila embryoer en rask og pålitelig måte å visualisere actin stenger og kan enkelt brukes med fluer av hvilken som helst genotype eller med innføring av andre cellulære påkjenninger, inkludert hypoksi og oksidativt stress.
Introduction
Denne protokollen beskriver hvordan du injiserer G-actinRed for å visualisere montering av intranukleære aktinstenger i varmestressede embryoer som gjennomgår en induserbar Actin Stress Response (ASR)1. Vi utviklet denne protokollen for å hjelpe studier av ASR, som i embryoer fører til forstyrret morfogenese og redusert levedyktighet, og hos voksne menneskelige celletyper er forbundet med patologier, inkludert nyresvikt2,muskel myopatier3, og Alzheimers og Huntingtons sykdom4,5,6,7,8. Denne ASR er indusert av mange cellulære påkjenninger, inkludertvarmesjokk 9,10,11, oksidativt stress4,6, redusert ATP syntese12, og unormal Huntingtin eller β-amyloid oligomerization4,5,6,7,9,13,14,15,16. Et kjennetegn på ASR er montering av avvikende aktinstenger i enten cytoplasma eller kjernen av berørte celler, som drives av stressindusert hyperaktivering av et aktininteraktiverende protein, Cofilin1,5,6,10. Dessverre gjenstår viktige kunnskapshull angående ASR. For eksempel er funksjonen til actin stenger ikke kjent. Vi forstår ikke hvorfor stenger dannes i cytoplasma av noen celletyper, men kjernen til andre. Det er heller ikke klart om ASR er beskyttende eller maladaptiv for celler eller embryoer som gjennomgår stress. Til slutt vet vi fortsatt ikke de detaljerte mekanismene som ligger til grunn for Cofilin hyperaktivering eller actinstangmontering. Dermed gir denne protokollen en rask og allsidig analyse for å sondere ASR ved å visualisere actin stangdannelse og dynamikk i det svært tractable eksperimentelle systemet til det levende fruktfluembryoet.
Protokollen til mikroinject G-actinRed til levende Drosophila embryoer ble opprinnelig utviklet for å studere dynamikken i normale cytoplasmatiske aktin strukturer17 under vev bygge hendelser. I disse studiene fant vi at G-actinRed injeksjon ikke påvirket tidlige utviklingsprosesser i embryoet negativt, inkludert cytokinese eller gastrulation17,18. Vi endret deretter protokollen, tilpasser embryohåndtering og G-actinRød injeksjon for å tillate avbildning av actin stenger i varmestressede embryoer som gjennomgår ASR1. Andre metoder i tillegg til G-actinRød injeksjon kan brukes til å visualisere actin i embryoer. Disse metodene er avhengige av å uttrykke fluorescerende proteiner (FPs) merket til actin eller til domener av actin bindende proteiner, som Utrophin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP, og Moesin-GFP (anmeldt i19). Men ved hjelp av disse FP-sondene krever forsiktighet fordi de kan stabilisere eller forstyrre noen actin strukturer, ikke like merke alle actin strukturer20, og i tilfelle av actin-GFP, er svært overuttrykt - problematisk for analyse av stang montering som ikke bare er stressavhengig, men også handlein konsentrasjon avhengig1. Dermed er G-actinRed den foretrukne sonden for stangstudier i fluembryoer, og den store størrelsen på embryoet gjør det enkelt å injeksjon.
Arbeidsflyten av denne protokollen ligner på andre veletablerte mikroinjeksjon teknikker som har blitt brukt til å injisere proteiner, nukleinsyrer, narkotika, og fluorescerende indikatorer i Drosophila embryoer21,22,23,24,25,26,27. Men etter mikroinjeksjon av G-actinRed her, embryoer er utsatt for mild varmestress for å indusere ASR og intranukleær actin stang montering. For laboratorier med tilgang til fluer og en injeksjonsrigg, bør denne metoden være lett gjennomførbar og tilpasningsdyktig for spesifikke studielinjer i forhold til ASR, inkludert induksjon av ulike påkjenninger eller modulering i distinkt genetisk bakgrunn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbered embryo samling kopper og eplejuice agar plater
- Fem dager før injeksjonseksperimentet,konstruere 28 eller anskaffe minst to små embryo samling kopper. Lag ferske 60 mm eplejuice agarplater som skal brukes med små oppsamlingskopper28. Oppbevar plater i plastbokser dekket med fuktige papirhåndklær ved 4 °C.
MERK: Små embryoinnsamlingskopper, befolket med flynumre som beskrevet i trinn 1.3, vil gi tilstrekkelige embryonumre per eksperiment, samtidig som de sikrer at embryohåndtering og injeksjon kan gjøres på kort nok tid til å tillate avbildning av tidlige utviklingsstadier. - Varm eplejuice plater til 18 ° C og legg til en dab av gjær pasta til midten av platen. Gjærpasta er en enkel pasta av aktiv gjær og destillert vann.
- For å fremme den mest sjenerøse eggleggingen, sett opp samlingskopper med fluer 2 dager før eksperimentet. Tilsett minst 100 kvinner og 50 hannfluer til oppsamlingskoppene, og topp med en tilberedt eplejuiceplate (figur 1, trinn 1). På dagene før injeksjonseksperimentet endres eplejuiceplatene minst to ganger hver dag, en gang om morgenen og en gang om kvelden.
MERK: De beste resultatene for injeksjon og bildebehandling oppnås når embryooppsamlingskopper oppbevares ved 18 °C med en 12-h lys på/lys av syklusen.
2. Klargjør en arbeidsløsningsløsning av G-actinRed for mikroinjeksjon
MERK: Dette preparatet gjør bare 2 μL av en 5 mg / ml arbeider lager av G-actinRed, så hvis brukerne er uvant til mikroinjeksjon teknikk, er det en fordel å hoppe til trinn 3 og praktisere mikroinjeksjoner med en nøytral pH-buffer for å spare dyrebar arbeidsmasse. Den 10 μg lager av G-actinRød fra leverandøren kan lagres i sin opprinnelige emballasje i en 16 oz skrue topp krukke med ~ 500 g tørkemiddel ved 4 ° C i opptil 6 måneder.
- Forbered en G-buffer lagerløsning på forhånd: 5 mM Tris-HCl, 0,2 mM CaCl2,pH 8.0. Filtrer og oppbevar ved romtemperatur.
- På injeksjonsdagen klargjør du 1 ml av en G-buffer-arbeidsløsning i et friskt snap cap mikrocentrifugerør på is ved hjelp av G-bufferlageret fra trinn 2.1, supplert med følgende ved de angitte endelige konsentrasjonene: 1 mM dithiothreitol (DTT) og 0,2 mM ATP, pH 8.0.
MERK: 1 ml volum av G-bufferarbeidsløsning er mer enn det som trengs for et eksperiment, men forenkler preparatet. Overflødig kan kastes etter eksperimentet, eller brukere kan skalere ned i henhold til deres preferanser.- Hold 10 μg G-actinRød lager på is, først tilsett 1 μL filtrert, destillert vann til toppen av den rosa dråpen av G-actinRød inne i røret.
- Deretter legger du til 1 μL av den kalde, nylagde G-bufferarbeidsløsningen fra trinn 2.2. Pipet opp og ned ~ 20 ganger for å blande godt med pipettevolumet satt til 1 μL. G-actinRød lager vil nå være på den endelige fortynningen av 5 mg / ml.
- Inkuber den forberedte G-actinRed i 30 min på is uforstyrret.
- Sentrifuger den tilberedte G-actinRød ved 16 000 x g i 20 min ved 4 °C i en mikrocentrifuge for å fjerne utfelling.
- Rør forsiktig 1,5 μL av supernatanten i en frisk snap cap mikrocentrifuge rør på is, unngår den mørke rosa pellet.
- Oppbevar den tilberedte G-actin Red-supernatanten på isen i opptil 6 timer til den er klar til å lastes inn i et mikroneedle.
MERK: Mikronegler kan trekkes fra kapillære rør på forhånd på en mikropipettetrekker, og deretter lagres ved romtemperatur på en stripe av modelleringsleire i en 100 x 20 mm petriskål. Foreslåtte parametere for mikroneedle trekking finner du i Pipette Cookbook29.
3. Samle embryoer og montere til injeksjon
- La fluer legge embryoer i 30 min på eplejuiceplater med gjærpasta ved 18 °C.
- Mens fluer legger, forvarm en eplejuice agar plate uten gjærpasta til romtemperatur, kutt ut en 4 cm x 1 cm rektangulær kile av eplejuice agar med et barberblad, og legg på en 25 mm x 75 mm glasssklie.
- Innhøst plate fra 30 minutters innsamling og dechorionate embryoer ved å helle fersk blekemiddel, fortynnet 1:1 med destillert vann, på platen og virvlende platen i 1 min, som beskrevet i28 (Figur 1, trinn 2).
MERK: Ulike merker av blekemiddel selges ved forskjellige konsentrasjoner. Blekemiddelet som brukes her er 6% natriumhypokloritt fra flasken og fortynnes til en endelig konsentrasjon på 3% natriumhypokloritt. Andre blekemiddelmerker ved litt lavere konsentrasjoner vil fungere like bra. - Hell blekemiddelet og desforerte embryoene i en oppsamlingskurv (en 70 μm cellesil) og skyll platen to ganger med destillert vann fra en sprutflaske, og legg disse vaskene til oppsamlingskurven.
- Skyll de de dechorionated embryoene kraftig i oppsamlingskurven med destillert vann til ingen gjærklumper er synlige og kurven etterlater ingen rosa merker fra overflødig blekemiddel når de er blottet på et papirhåndkle.
- Innhøst plate fra 30 minutters innsamling og dechorionate embryoer ved å helle fersk blekemiddel, fortynnet 1:1 med destillert vann, på platen og virvlende platen i 1 min, som beskrevet i28 (Figur 1, trinn 2).
- Bruk en pensel med børste fuktet med destillert vann, overfør deforionerte og vasket embryoer fra oppsamlingskurven til den tilberedte eplejuiceagarkilen på glasslysbildet.
- Bruk et par fine tips pinsett eller en dissekering nål for å ordne ti embryoer i en rett linje langs den lange aksen av rektangulær agar kile (Figur 1, trinn 3). Ordne embryoene hode-til-hale, slik at deres fremre pol vender mot høyre og dorsal side vender mot forskeren (Figur 1, trinn 3, forstørret).
- Klipp av 0,5 cm av enden av en P200 pipettespiss med barberblad og dypp i "embryolimet" (beskrevet i28). Lag et område 5 mm i bredde (figur 1, trinn 4) langs langsiden av en 24 mm x 50 mm rektangulær dekkslips, og la den tørke, lime side opp. Tørking vil ta ~ 30 s og er fullført når hele limbelagte regionen vises matt i stedet for våt eller skinnende.
MERK: Forbered "embryolim" minst 48 timer på forhånd. Legg n-Heptane til strimler av dobbeltsidig tape i et scintillation hetteglass som beskrevet i28. - Når "embryolimet" har tørket, legg forsiktig dekkglasset helt ned på toppen av raden med justerte embryoer på agaren, og etterlater 2-3 mm mellomrom mellom kanten av dekkslippen og raden av embryoer.
MERK: Å stikke embryoene for nær kanten av dekkslippen kan føre til at embryoene tørker ut for mye i løpet av eksperimentet. - Snu dekkslippen slik at embryoene nå vender opp. De bør sitte fast i en linje langs en lang kant av dekkslippen, og deres ventrale region vendt mot nærmeste kant av dekkslippen (Figur 1, trinn 4, forstørret).
- Uttørk embryoene ved å plassere dekkslippen med embryoer forsiktig på toppen av 150 g friskblå tørkemiddel lagret i en 16 oz skruetoppkrukker. Skru lokket godt fast og inkuber i 8-10 min (Figur 1, trinn 5).
- Etter uttørkelse, fjern dekkslippen fra tørkekrukken og tape hver kortside av dekkslipsen til et mikroskopsklie, embryo side opp, med to 4 cm2 stykker dobbeltsidig tape slik at embryodekslipsen passer på injeksjonsstadiet (figur 1, trinn 6).
- Tilsett 2-3 dråper Halokarbon 27-olje med en Pasteurpipette for å dekke de justerte embryoene og beskytte dem mot ytterligere dehydrering (figur 1,trinn 6).
4. Injiser og varme stress embryoer for å fremme actin stang dannelse
MERK: Alle injeksjoner gjøres i et temperaturkontrollert rom ved 18 °C.
- Forbered fuktige inkubasjonskamre fra et glass Petriskål minst 100 mm x 20 mm i størrelse og linje kammeret med vendinger av lab vevsviskere fuktet med destillert vann (Figur 1, trinn 8). Forvarm inkubasjonskamrene ved 32 °C eller ønsket inkubasjonstemperatur før injeksjon av embryoer.
- Åpne luftstrømventilen for mikroinjektoren og slå på mikroinjektoren (trykkluft eller husluft med et trykk på minst 90 psi er egnet).
- Mens embryoer uttørkes, laster du den tidligere forberedte G-actin Red-supernatanten inn i mikroneedlet ved hjelp av en mikrolasterspiss. Still pipetten til å tegne opp 1-1,5 μL.
MERK: På grunn av viskositeten til actin, kan det hende at lastevolumene ikke er nøyaktige, og det kan være nok actin igjen til å laste minst en til to mikronåler. Opptil 60 embryoer kan injiseres per lastet mikroneedle hvis mikroneedle kalibreres riktig og ikke blir tilstoppet i løpet av eksperimentet. - Fest mikronålet til nåleholderen og stram til skruen. Koble luftrøret til mikroinjektoren og sørg for at tilbakestrømningstrykket på mikroneedlelikevektene til 30 hPa.
- Kalibrer mikroinjektorinnstillingene for å utvise en boble med 100 μm diameter av G-actinRød (~500 pL) på et glidemikrometer. Drei trykkknappen (500-1500 hPa) og injeksjonspulsknappen (0,1-0,5 s) på mikroinjektoren for å få riktig boblestørrelse. Juster disse innstillingene hver gang et nytt mikronål lastes inn for å ta høyde for variabilitet i actin viskositet og mikroneedlespissstørrelse.
MERK: Den tilberedte G-actinRed er viskøs, og det kan være luft i spissen av mikronålet som skal utvises før injeksjon av embryoer injiseres. Hvis G-actinRed ikke lett utviser fra spissen av mikroneedlet, må mikroneedlespissen forsiktig brytes mot kanten av glidemikrometeret. - Plasser lysbildet med monterte embryoer på mikroskopstadiet.
MERK: Hvert injeksjonssett vil være forskjellig, så forskerne må justere injeksjonsmetoden tilsvarende. Her flyttes embryoene med hensyn til et stasjonært mikroneedle, injiserer hvert embryo ved å kjøre embryoet inn i mikroneedlet. - Juster mikromanipulatorstadiet og fokuser på 10x-målet på lysmikroskopet slik at embryoene er synlige. Embryoene er i riktig fokalplan når konturene av vitellinmembranen er skarpeste og embryoet vises størst. Velg embryoer som er i riktig utviklingsstadium, slik at når inkubasjonen etter injeksjonen er fullført, når det meste av clutchen ønsket utviklingsstadium (f.eks. injiser embryoer på Bownes' stadium2-3 30 for å observere stenger ved cellulærisering etter varmestress ved 32 °C).
- Bruk mikroneedlekontrollene til å bringe nålen inn i samme fokalplan som embryoene.
MERK: Hvis mikroneedlet fanger på dekkglasset mens du flytter scenen eller mikroneedlet, er mikroneedlet for nær lysbildet og ikke er i riktig fokalplan. Mikrolet skal være parallelt med dekkglasset, og ikke i en betydelig vinkel (figur 1, trinn 7). - Sett mikroneedlet inn i embryoet slik at det treffer embryoet midt i ventralregionen, ved embryoet "ekvator". Triggerinjeksjon med fotpedalen eller "injiser"-knappen når mikroneedlespissen er synlig inne i midten av embryoet (figur 1, trinn 7).
- Injiser G-actinRød én gang og fjern mikronålet langsomt. Flytt scenen og gjenta for hvert embryo i riktig utviklingsstadium.
MERK: Utvidelse av embryoet er normalt da G-actinRed injiseres og litt cytoplasma kan lekke ut av embryoet. - Etter at alle embryoene er injisert, plasser lysbildet med embryoene i det tilberedte fuktige inkubasjonskammeret og lukk lokket (figur 1, trinn 8). Hvis du prøver å få tak i embryoer som når cellulærisering, varmestress embryoene ved 32 °C i 60-75 min i det fuktige inkubasjonskammeret.
MERK: Inkubasjonstider bemerkes som tillater visualisering av stenger i cellulære varmestressede embryoer. Inkubasjonstiden vil være lengre for ikke-varmestresskontroll embryoer fordi utviklingen vil bli langsommere ved en lavere temperatur31. Disse kontrollembryoene kan inkuberes i fuktige kamre ved temperaturer som 18 °C eller 25 °C, avhengig av utformingen av det spesifikke eksperimentet og spørsmålet som skal stilles. Minimum inkubasjonstid som er nødvendig for at G-actinRed skal spre seg gjennom hele embryoet er 30 min.
5. Bilde actin stenger i varme stresset embryoer av konfokal mikroskopi
- Mens embryoene blir varmestresset, slå på konfokalmikroskopet og velg 561 nm laserkanal.
- Flytt objektivet (25x, 40x eller 63x anbefales) til arbeidsstilling.
- Hvis bildevarme stresset embryoer, deretter sette oppvarmet stadium inkubator for å oppnå en intern temperatur på 32 °C. Et pek-og-skyte eller infrarødt termometer kan brukes til å kontrollere temperaturen på eller i nærheten av målet.
- Fjern lysbildet med injiserte embryoer fra det fuktige inkubasjonskammeret etter at inkubasjonen er fullført (figur 1, trinn 9).
- Arbeide raskt, forsiktig lirke av dobbeltsidig tape stykker som ble brukt til å feste dekkslips med montert embryoer til lysbildet (Figur 1, trinn 9).
FORSIKTIG: Vær forsiktig under disse trinnene, da dekkglass lett kan knuses hvis det påføres for mye kraft. - Stick to 2,5 cm lange stykker dobbeltsidig tape sammen og kutt båndet i to på langs for å lage to strimler, 2,5 x 0,5 cm lang (Figur 1, trinn 10).
- Stick to tredjedeler av lengden på hver tape stripe på den første coverslip, flankerer hver side av embryoene i Halocarbon 27 olje (Figur 1, trinn 10, oransje), slik at en tredjedel av tape strimler hengende av kanten av den første dekkslip der embryoene sitter fast. Bruk hansker og vær forsiktig så du ikke berører embryoene i løpet av dette trinnet.
- Plasser forsiktig en annen rektangulær dekkslipp på toppen av båndstrimler for å smøre embryoene mellom dekkslips (Figur 1, trinn 10, blå). Juster kantene på 25 mm, men hold kantene på 50 mm forskyvning fra hverandre med 1 cm i bredden.
MERK: Denne andre dekkglassets fulle overflate blir den nye bildeoverflaten som vil møte objektivet, så vær forsiktig så du ikke får fingeravtrykk eller Halocarbon 27-olje på denne andre dekkglassoverflaten. Forskyvningen er nødvendig slik at ekstra Halokarbon 27-olje kan tilsettes for å tette embryoene jevnt. Om nødvendig, tilsett Halocarbon 27 olje i sømmen der de to dekkslips møtes på toppen av sandwichen, og det vil belegge embryoene ved kapillær handling (se stiplede linjer i figur 1, trinn 10). - Trykk forsiktig ned på områdene på dekkslippen som er direkte på toppen av båndstripene med den stumpe siden av et barberblad for å få dekkslippen til å feste seg til båndet.
- Snu dekkslipsmørbrødet over og plasser på en labvevsvisker for å holde bildeoverflaten ren og bære til det konfokale mikroskopet (figur 1, trinn 11). Kontroller at tapen sitter helt fast i begge dekkslepper før bildebehandling.
- Bekreft at det oppvarmede stadiet er ved temperatur, og hvis du bruker et omvendt mikroskop, tilsett nedsenkingsvæske på den valgte objektive linsen.
- Plasser dekkslipsmørbrødet forsiktig på scenen for å sikre at den nye bildeoverflaten (2. deksleglass) er den som berører nedsenkingsvæsken (figur 1, trinn 11).
MERK: Om nødvendig, fest dekkslipsmørbrødet til scenen med to små biter av dobbeltsidig tape for å unngå unødvendig bevegelse under avbildning hvis dekkglassene ikke passer godt i det oppvarmede stadiet. - Fokuser på et embryo som er i cellulærisering (Bownes stadium 4a30) eller ønsket utviklingsstadium ved hjelp av enten overført lys eller fluorescens.
- Når et embryo er satt i fokus, bytt til laseroppkjøpsmodus på det konokale mikroskopet og justerer laserkraft og forsterkning, rammestørrelse, flislegging og projeksjonsinnstillinger etter ønske.
- Ta overflatevisningsbilder gjennom fokalplanene i embryoets kjerner for å finne intranukleære aktinstenger. Stenger skal vises i flere retninger som lyse striper eller prikker inne i de relativt mørke kjernene (Figur 2A, 2C).
6. Alternative bildeforsøk
- Utfør FRAP for å undersøke actin omsetning langs lengden av intranukleære actin stenger eller i cytoplasmatiske actin strukturer, for eksempel spissene av plasmamembran furer under cellulærisering.
- I bildebehandlingsprogramvaren velger du et rektangulært område rundt furespisser eller actin stenger for å skaffe eksperimentet.
- Velg en liten firkantet region av midten av en actin stang innenfor den rektangulære oppkjøpsregionen for å bleke. Sørg for at spissene på actinstangen er synlige og ikke blir bleket i løpet av forsøket for å tillate nøyaktig sporing av stangen inne i kjernen.
- Sett blekemiddellaseren til å yt 50x og sett blekemiddellaserkraften til maksimum.
- Velg et tidskurs for å skaffe bilder hvert sekund for totalt opptil 120 s ved maksimal pikselbohastighet og sett laseren til blekemiddel etter de to første sekundene av bildeoppkjøp.
- Kvantifisere dataene for å bestemme halvtid for fluorescens utvinning1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skjematisk arbeidsflyt for embryohåndtering er avbildet i figur 1, og en tidsplan for et typisk eksperiment presenteres i tabell 1. Et anslag for et godt eksperimentelt utfall er at for hver 10 embryoer injisert, vil minst halvparten av embryoene som vises være på riktig utviklingsstadium, uskadet, og utvise en robust ASR med varmestress ved 32 °C. Denne ASR vil bli dokumentert ved montering av intranukleære actin stenger som vist i den representative overflatevisning bilde av et embryo i figur 2A (høyre panel). Actin stenger vil vises i flere retninger (parallell eller vinkelrett på bildeplanet) inne i kjernene og kan avbildes gjennom flere fokale fly. Til sammenligning vil kontrollembryoer inkubert ved 18 °C ikke vise actin stenger (Figur 2A, venstre panel). Prosentkjernene som inneholder stenger kan kvantifiseres, som vist i figur 2B. I tillegg kan FRAP-eksperimenter utføres på stenger (figur 2C). En foreslått kvantifiseringsmetode for FRAP-data refereres tili 1, og et eksempel på en fluorescensutvinningsplott for et bleket versus bleket område av en aktinstang er vist i figur 2D.
Hvis et embryo er alvorlig skadet ved injeksjon eller blir for tørr under forsøket, kan mitotisk asynkronitet observeres og cellulærisering vil bli forstyrret. Noen ganger kan stenger ikke være synlige på grunn av manglende evne til å få nok akt injisert i embryoet. Hvis dette skjer, må du kontrollere at mengden G-actinRed injisert er 500 pL (målt med et mikrometer i trinn 4.5) og bekreft at denne mengden forblir konsistent mellom embryoer ved å gjøre en testinjeksjon i den omkringliggende oljen for å kontrollere størrelsen på G-actinRed boble mellom hver embryo mikroinjeksjon. I tillegg, for å sikre stangvisualisering, arbeid raskt for å legge til dekkslipsen og flytte embryoene til det oppvarmede mikroskopstadiet når de er tatt fra det fuktige kammeret i trinn 5.4, da stangenheten er reversibel1 og stenger kan demonteres hvis embryoene holdes ved en temperatur mindre enn 32 ° C i mer enn 30 min.
Figur 1: Skjematisk oversikt over embryohåndtering under forsøket. (1) Voksne fluer i embryosamlingskopper legger embryoer på eplejuice agar plater. (2) Embryoer er dehorionated med 1:1 blekemiddel: destillert vann, helles i en oppsamlingskurv, og grundig vasket med destillert vann for å fjerne blekemiddel og rusk. (3) Embryoer overføres med en pensel til en rektangulær eplejuice agar kile på et lysbilde og arrangert på sidene, head-to-tail, med dorsal region vendt mot kanten av agar. (4) En 5 x 50 mm region av en glassdekslerlip (oransje) er belagt med "embryolim" og trykkes forsiktig ned på raden av embryoer arrangert på agaren for å holde dem til dekkslipsen. (5) Dekkslippen med embryoer er invertert slik at embryoer vender opp. Embryoene er uttørket i en skruetoppkrukke. (6) Umiddelbart etter utskalkingen teipes dekkglasset til et lysbilde, embryoer vendt opp, og embryoer er dekket med Halocarbon 27 olje. (7) Et mikroneedle som tidligere var lastet med forberedt G-actinRed brukes til å foreta en enkelt injeksjon i midten av ventralområdet på hvert embryo, med nål plassert parallelt med dekkslippen. (8) Etter injeksjon inkuberes embryoer inne i en petriskål fuktet med fuktige laboratorievevsviskere ved kontrolltemperatur (18 °C) eller med varmestress (32 °C). (9) Etter inkubasjon fjernes dekkglasset med embryoene på den fra lysbildet. (10) To stykker dobbeltsidig tape er lagdelt oppå hverandre, skåret i to på langs, og plassert på hver side av oljen rundt embryoene på den første dekkslippen. En annen dekkslipp (blå) er plassert på toppen av den første for å skape en ny bildeoverflate, motvirket slik at det etterlater et gap for mer olje som skal legges til for å dekke embryoene etter behov. (11) Hvis avbildning på et omvendt konfokalt mikroskop, er deksleglasssandwichen invertert slik at den andre dekkslipen vender mot målet. Bildebehandling gjøres i et inkubert kammer, og actin stenger visualiseres over flere fokale plan av hvert embryoer kjerner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative resultater av actin stenger i varmestressede embryoer. (A) Actin stenger er ikke sett i et embryo som ble inkubert ved kontrolltemperaturen på 18 ° C (venstre panel), men er sett i kjernen av et embryo som var varmestresset ved 32 ° C (høyre panel). (B)Kvantifisering av prosentandelen av kjerner med actin stenger fra et representativt eksperiment. Hver prikk representerer ett embryo der stenger og kjerner ble talt i hele det avbildede området (n = 22 embryoer ved 18 °C; n = 23 embryoer ved 32 °C; feilfelt viser standardavvik). En student t-test, med ulik varians antatt, ble brukt til å beregne p-verdien. (C) En representativ tidsserie viser FRAP på en aktinstang. Den delen av stangen som ble bleket er indikert av et hvitt pilhode. Pre-blekemiddel er 2 s før blekemiddeltrinnet. Tid = 0 s er blekemiddel trinn, og fluorescens utvinning ble sporet til 60 s innlegg blekemiddel. (D) Et plott viser utvinning dynamikk for actin fluorescens i en bleket region av en stang, sammenlignet med en lettet region i samme stang. Stenger er bemerkelsesverdig stabile og actin i dem handler ikke. Dermed er ingen utvinning sett. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Eksperimentell arbeidsflyt med foreslått tidsplan. Denne tidsplanen oppsummerer forventet tid det vil ta å fullføre hvert trinn i protokollen.
| Rekkefølge | Trinn | Nødvendig tid for hvert trinn | Beskrivelse |
| 1 | 1.1 | 5 dager i forveien | Lag embryosamlingsbur. Hell eplejuice agar plater. |
| 2 | 1.2-1.3 | 2 dager i forveien | Sett opp samlingsbur med voksne mannlige og kvinnelige fluer. |
| 3 | 2.6 Note | 1 dag i forveien | Trekk kapillære rør for å lage mikronegler. |
| 4 | 2.1-2.6 | 1 t (1 t) | Forbered G-actin. |
| 5 | 3.1 | 30 min. | La fluer legge egg. |
| 6 | 3.2-3.10 | 15-30 min | Samle, montere, uttørke embryoer. Dekk embryoer med olje. |
| 7 | 4.1 | 30 min på forhånd | Forbered fuktige inkubasjonskamre. |
| 8 | 4.2-4.4 | 1 min. | Last mikroneedle. |
| 9 | 4.5-4.10 | 10-20 min | Kalibrer G-actin boblestørrelse og injiser embryoer. |
| 10 | 4.11 | 30 min-1+ t | Inkuber/varmestressembryoer. |
| 11 | 5.1-5.3 | 1 t på forhånd | Slå på mikroskop og inkubasjonsstadium. |
| 12 | 5.4-5.10 | 5 min. | Sandwich embryoer mellom dekkglass for avbildning. |
| 13 | 5.11-6.6 | 15 min-1+ t | Bilde intranukleære actin stenger i embryoer. |
Tabell 2: Feilsøking av forslag. Denne tabellen inneholder forslag til feilsøking for å hjelpe til med vellykket fullføring av protokollen.
| Potensielt problem | Forslag |
| Fluer legger ikke nok embryoer. | Sett opp koppen minst 5 dager i forveien (se trinn 1.1-1.3). Endre plater 3x per dag før eksperimentet for å oppmuntre egg legging. La fluer legge embryoer i 1 t i stedet for 30 min. Sett opp kopper med unge voksne fluer. |
| Ingen G-actin er utvist fra mikronålet. | Øk trykk- og tidsinnstillingene på mikroinjektoren. Bryt mikroneedletippen ytterligere (se trinn 4.5 Merk). Siden store tresko kanskje ikke er klare, last en ny nål. |
| Vanskelig å kalibrere en liten nok boblestørrelse. | Juster trykk- og tidsinnstillingene (se trinn 4.5). Siden åpningen av mikroneedlet kan være for stor, legg i en ny nål. |
| Embryoer løsner fra limet på dekkslippen under injeksjon. | Juster "embryolim" konsistens for fremtidige dekkglass ved å legge til mer dobbeltsidig tape til heptaneløsningen (se trinn 3.5 Merk). |
| Embryoer tørker ut under temperaturinkubasjon. | Kontroller at lysbildet er jevnt i inkubasjonskammeret (se trinn 4.11) og at oljen ikke berører noe som kan transportere det bort. Tilsett ekstra dråper olje til embryoene. Reduser utspreksjonstiden (se trinn 3.8). |
| Olje dekker ikke helt embryoene mellom første og andre dekkglass. | Tilsett ekstra olje via kapillærhandling til det lille gapet mellom dekkglassene (se trinn 5.8 Merk). |
| Intranukleære aktinstenger er ikke synlige i varmestressede embryoer. | Injiser et større volum G-actin (se trinn 4.5). Kontroller at temperaturen på både inkubasjonen etter injeksjonen (se trinn 4.11) og bildekammeret er 32 °C (se trinn 5.3). |
| Store bobler av G-actin er synlige rundt injeksjonsstedet for embryoer. | Injiser et mindre volum G-actin (se trinn 4.5). Øk embryodesiccation tid for å fremme bedre oppbevaring av injisert actin inne i embryoet (se trinn 3.8). |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Betydningen av denne metoden er at den benytter den veletablerte protokollen for mikroinjeksjon i Drosophila embryoer 21,22,23,24,25,26,27 for å muliggjøre ny forskning om ASR og tilhørende actin stang montering. En stor fordel med å injisere G-actinRed i levende embryoer er at ASR kan studeres under en rekke sammenhenger. For fremtidige studier kan disse sammenhengene omfatte injeksjon av embryoer av andre genotyper som en del av en mutantskjerm eller utsette injiserte embryoer for forskjellige stressforhold, for eksempel oksidativt stress4,32. Selv om den ikke er beskrevet i detalj her, kan denne injeksjonsteknikken også endres for å injisere nukleinsyrer, andre proteiner, legemidler og indikatorfargestoffer (for eksempel se21,22,23,24,32) for å studere ASR. Dermed presenterer denne metoden en rekke tilnærminger for å identifisere omfanget av påkjenninger som induserer ASR, som ytterligere karakteriserer cellulære responser under ASR (f.eks. endringer i mitokondrieaktivitet), og avdekke nye molekyler og mekanismer underliggende intranukleær actin stangmontering.
Noen kritiske trinn i protokollen inkluderer følgende: I trinn 3.8 må embryoer være riktig uttørket for å sikre vellykket injeksjon og beste embryohelse. Utskalkingstiden vil avhenge av omgivelsestemperaturen og fuktigheten i laboratoriet, så det anbefales å øve på montering, utskalking og injeksjoner med en nøytral pH-buffer først for å etablere denne parameteren for håndtering av embryoene. I trinn 4.5 må mikronålet og injeksjonsinnstillingene finjusteres for å tillate injeksjon av nok G-actinRed i embryoer. Hvis for lite G-actinRød injiseres i embryoet, kan actin stenger ikke lett visualiseres, siden dannelsen av actin stenger er avhengig av konsentrasjonen av fri aktin1. I tillegg vil det være vanskelig å få konsistente resultater fra FRAP eksperimenter hvis det ikke er nok G-actinRed injisert, siden fluorescensintensiteten ikke vil være høy nok til å overvinne bakgrunnsfluorescens. Derfor er det viktig å kalibrere boblestørrelsen hver gang en ny nål lastes og brukes. G-actinRød er viskøs og har en tendens til å tette inne i mikroneedle. Noen ganger kan dette føre til injeksjon av variable mengder G-actin i embryoene. Hvis mikroneedlet er tilstoppet og rydding av mikroneedle med høyt trykk mislykkes, kan det være nødvendig å forsøke å bryte spissen av mikroneedlet videre eller til og med laste et nytt mikroneedle og injisere et nytt sett med embryoer. Til slutt, i trinn 4.11, må embryoer inkuberes ved forhøyet temperatur og for tilstrekkelig tid for at ASR skal induseres og stenger til form1. Temperaturene på alle inkubatorer bør overvåkes kontinuerlig, tid til å overføre embryoer fra inkubator til inkubator må begrenses, og en timer skal brukes til alle inkubasjoner. Andre mulige problemer er oppført i tabell 2 med tilhørende feilsøkingstips.
En viktig begrensning av denne protokollen er at eksepsjonell forsiktighet må tas for å bevare helsen til embryoene under injeksjoner, inkubasjoner og bildebehandling. Protokollen er utformet for å maksimere embryohelsen, og med betydelig praksis kan en forsker fullføre alle trinnene i protokollen med embryoutvikling som utvikler seg med de forventede prisene per temperatur31. En annen begrensning av protokollen er nødvendigheten av en mikroinjeksjonsrigg, som kan være ganske dyrt og ikke er vanlig utstyr for hvert flylaboratorium. Men hvis et tilstøtende laboratorium er utstyrt for å injisere andre embryoer (f.eks. Xenopus,Sebrafisk og Caenorhabditis elegans) eller tilhengerceller, er injeksjonsriggen som brukes sannsynligvis egnet for Drosophila injeksjoner. I så fall må bare formen på nålen tilpasses Drosophila-embryoene i henhold til retningslinjene til Pipette Cookbook29. Alternativt er det noen rimeligere micoinjector alternativer på markedet (f.eks analoge mikroinjektorer), som kan redusere kostnadene ved å montere en injeksjonsrigg betydelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner takknemlig arbeidet til Liuliu Zheng og Zenghui Xue, som hjalp pioner denne teknikken i Sokac-laboratoriet, samt Hasan Seede som hjalp til med analysen. Arbeidet for denne studien er finansiert av et stipend fra NIH (R01 GM115111).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore-Sigma | A23835G | Component of G buffer |
| Apple juice, Mott's, 64 fl oz | Mott's | 014800000344 | Component of apple juice plates |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Component of apple juice plates |
| Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite | KIK International | 059647210020 | For dechorionating embryos |
| Calcium chloride | Millipore-Sigma | C1016500G | Component of G buffer |
| Cell strainer, 70 μm | Falcon | 352350 | For collecting dechorionated embryos |
| Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan | Zeiss | 0000001994956 | For imaging intranuclear actin rods |
| Desiccant | Drierite | 24001 | For desiccating embryos |
| Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom | Zeiss | 4350649000000 | For arranging embryos on agar wedge |
| Dissecting needle, 5 in | Fisher Scientific | 08965A | For arranging embryos on agar wedge |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP1725 | Component of G buffer |
| Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in | 3M | 021200010323 | For making embryo glue |
| Embryo collection cage | Genessee Scientific | 59100 | For housing adult flies and collecting embryos |
| Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72701D | For arranging embryos on agar wedge |
| Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm | World Precision Instruments, Inc. | TW1004 | For microneedles |
| Halocarbon oil 27 | Millipore-Sigma | H8773100ML | For hydration of embryos |
| Heated stage incubator | Zeiss | 4118579020000, 4118609020000, 4118609010000 | For confocal imaging |
| Lab Tissue Wipers, KimWipes | Kimberly-Clark | 34155 | Lab tissue wipers |
| Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished | Zeiss | Discontinued | Injection microscope |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Millipore-Sigma | H36471KG | Component of apple juice plates |
| Microinjector, FemtoJet4x | Eppendorf | 5253000025 | Microinjector |
| Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 μL | Eppendorf | 5242956003 | For loading microneedles |
| Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment | Bernard Instruments, Inc (Houston, TX) | Custom | For performing microinjections |
| Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown | Sutter Instruments | P97 | For pulling capillary tubes to make microneedles |
| Microscope cover glass 24x50-1.5 | Fisher Scientific | 12544E | For mounting embryos |
| Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm | Fisher Scientific | 22037081 | For mounting embryos for injection |
| n-Heptane | Fisher Scientific | H3601 | Component of embryo glue |
| Objective, 10x | Zeiss | Discontinued | 10x objective for injection microscope |
| Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS | Zeiss | 4217679971711 | 40x water objective for confocal |
| Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm) | Zeiss | 4208529871000 | 25x mixed immersion objective for confocal |
| Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA | Zeiss | 4207829900799 | 63x oil objective for confocal |
| Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2 | Daler-Rowney | 038372016954 | For transferring embryos |
| Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white | Kimberly-Clark | 884266344845 | For blotting cell strainer |
| Pasteur pipette, 5 3/4 in | Fisher Scientific | 1367820A | For covering embryos with oil |
| Petri dish, glass, 100 x 20 mm | Corning | 3160102 | For humid incubation chamber |
| Petri dish, plastic, 60 x 15 mm | VWR | 25384092 | For apple juice plates |
| Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 μL | Eppendorf | 2231000604 | For loading the microneedle |
| Pipette tip, xTIP4 250 μL | Biotix | 63300006 | For adding embryo glue to coverslip |
| Razor blade | VWR | 55411050 | For cutting agar wedge, tape, pipette tips |
| Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4x10 μg) | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | G-actin^Red |
| Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps | Fisher Scientific | 033377 | For making embryo glue |
| Screw top jar, 16 oz | Nalgene | 000194414195 | For desiccating embryos |
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 602104PG | For calibrating volume of G-actin injection |
| Sucrose | Millipore-Sigma | 840971KG | Component of apple juice plates |
| Trizma base | Millipore-Sigma | T15031KG | Component of G buffer |
| Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz | Lesaffre Yeast Corporation | 117929157002 | Component of yeast paste |
References
- Figard, L., et al. Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos. Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).
- Ashworth, S. L., et al. ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion. American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).
- Vandebrouck, A., et al. In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).
- Bamburg, J. R., et al.
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).
- Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress. Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).
- Iida, K., Iida, H., Yahara, I. Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells. Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).
- Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).
- Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin. Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).
- Minamide, L. S., et al. Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods. Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).
- Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons. The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).
- Feldman, M. L., Peters, A. Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus. Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).
- Nishida, E., et al. Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells. Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).
- Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).
- Xue, Z., Sokac, A. M. Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage. The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).
- Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization. Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 393 (2), 209-226 (2014).
- Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. Formins filter modified actin subunits during processive elongation. Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (50), 2477 (2011).
- Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 81, 50750 (2013).
- Carreira-Rosario, A., et al. Recombineering homologous recombination constructs in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (77), 50346 (2013).
- Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microinjection techniques for studying mitosis in the Drosophila melanogaster syncytial embryo. Journal of Visualized Experiments. (31), 1382 (2009).
- Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. Visualizing and tracking endogenous mRNAs in live Drosophila melanogaster egg chambers. Journal of Visualized Experiments. (148), 58545 (2019).
- Wessel, A. D., Gumalla, M., Grosshans, J., Schmidt, C. F. The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology. Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).
- Mollinari, C., González, Microinjection and transgenesis. Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols. Cid-Arregui, A., García-Carrancá, A. , Springer. Berlin. 587-603 (1998).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (49), 2503 (2011).
- Oesterle, A. Pipette Cookbook 2018: P-97 and P-1000 Micropipette Pullers. , Sutter Instruments. Novato, CA. (2018).
- Bownes, M. A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 33 (3), 789-801 (1975).
- Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).
- Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing. Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).
