Summary
该协议的目标是将罗达明结合球蛋白注射到 果蝇 胚胎中，并在热应力后将图像核作用杆组装。
Abstract
该协议的目的是可视化在热应激后在活 的果蝇黑色素酯 胚胎中组装的核内作用棒。Actin 棒是伴随人类病理（包括神经退行性疾病）的保存、诱导的阿克廷应激反应 （ASR） 的标志。以前，我们表明ASR会导致形态发生失败，降低胚胎的存活率。该协议允许在高度适应成像、遗传学和生物化学的模型系统中继续研究作用杆组装和ASR的基础机制。胚胎被收集并安装在盖片上，为注射做准备。罗达明结合球蛋白（G-actin红）被稀释并加载到微需要中。每个胚胎的中心只注射一次。注射后，胚胎在高温下孵育，然后通过分泌显微镜对核细胞内作用杆进行可视化。光漂白（FRAP）实验后的荧光恢复可以在作用杆上进行：细胞质中其他富含作用的结构也可以成像。我们发现，G-actin红 聚合物像内源性G-actin，本身并不干扰正常的胚胎发育。此协议的一个限制是，在注射过程中必须小心谨慎，以避免对胚胎造成严重伤害。然而，在实践中，将G-actinRed 注射到 果蝇 胚胎中是一种快速可靠的可视化作用杆的方法，可以很容易地用于任何基因型的苍蝇或引入其他细胞应力，包括缺氧和氧化应激。
Introduction
该协议描述了如何注射G-actinRed，以可视化在热应力胚胎中核作用杆的组装，这些胚胎正在经历不可诱导的Actin应激反应（ASR）1。我们开发了这个协议，以帮助研究ASR，在胚胎导致破坏形态生成和降低生存能力，并在成人细胞类型与病理学，包括肾衰竭2，肌肉肌病3，阿尔茨海默氏症和亨廷顿舞蹈症4，5，6，7，8。这种ASR是由许多细胞应力引起的，包括热休克9，10，11，氧化应激4，6，减少ATP合成12，和异常亨廷丁或β淀粉样寡头化4，5，6，7，9，13，14，15，16。ASR的一个标志是在受影响细胞的细胞质或细胞核中组装异常作用素棒，这是由压力引起的活性相互作用蛋白，Cofilin1，5，6，10的过度激活驱动的。不幸的是，在ASR方面仍然存在关键的知识差距。例如，行为棒的功能尚不清楚。我们不明白为什么棒在某些细胞类型的细胞质中形成，但其他细胞核。也不清楚ASR是保护性的还是对承受压力的细胞或胚胎的不适应。最后，我们仍然不知道科菲林多活化或作用杆组装背后的详细机制。因此，该方案提供了一个快速和多才多艺的检测，通过可视化活果蝇胚胎高度可处理的实验系统中的活杆形成和动力学来探测ASR。
将G-actinRed微导入活体果蝇胚胎的方案最初是为了研究组织构建事件期间正常细胞质作用素结构17的动态而开发的。在这些研究中，我们发现G-actin红注射不会对胚胎的早期发育过程产生负面影响，包括细胞因子或胃痛17，18。然后，我们修改了协议，调整了胚胎处理和G-actin红注射，以允许在进行ASR1的热应激胚胎中成像作用素棒。除G-actin红注射外，其他方法可用于在胚胎中可视化作用素。这些方法依赖于表达荧光蛋白（FPs）标记为作用素或作用素结合蛋白的领域，如营养素-mCherry、生命-生命-GFP和莫辛-GFP（在19年审查）。然而，使用这些FP探头需要谨慎，因为它们可以稳定或破坏一些行为结构，不等于标记所有行为结构20，在actin-GFP的情况下，是高度过度表达-有问题的杆组装分析，这不仅是压力依赖，而且行动浓度依赖1。因此，G-actinRed是苍蝇胚胎中棒研究的首选探针，胚胎的大尺寸允许其轻松注射。
该协议的工作流程类似于其他成熟的微注射技术，这些技术已被用于将蛋白质、核酸、药物和荧光指标注射到果蝇胚胎21、22、23、24、25、26、27。然而，在G-actinRed的微注射之后，胚胎暴露在轻度热应激下，诱导ASR和核内作用杆组装。对于能够接触苍蝇和注射钻机的实验室，这种方法应易于实施，并适应与ASR有关的具体研究路线，包括它通过不同的应力或在不同遗传背景的调制而诱导。
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Protocol
1. 准备胚胎收集杯和苹果汁琼脂盘
- 在注射实验前五天，建造28 个或采购至少两个小胚胎收集杯。制作新鲜的60毫米苹果汁琼脂板，用于小收集杯28。在4°C时用湿纸巾覆盖的塑料盒中的存储板。
注：小胚胎收集杯，填充了第1.3步描述的苍蝇数量，将提供足够的胚胎数量每个实验，同时也确保胚胎处理和注射可以在足够短的时间内完成，使早期发育阶段的成像。 - 将苹果汁盘加热至18°C，并在盘子中央加入一点酵母膏。酵母糊是活性酵母和蒸馏水的简单糊。
- 为了促进最慷慨的产卵，在实验前2天用苍蝇设置收集杯。将至少100只雌性苍蝇和50只雄性苍蝇添加到收集杯中，并配上准备好的苹果汁盘（图1，第1步）。在注射实验之前的几天里，每天至少换两次苹果汁盘，一次在早上，一次在晚上。
注：当胚胎收集杯保持在18°C，并具有12小时的开灯/光关闭周期时，将获得最佳的注射和成像结果。
2. 为微弹射准备 G-actin红色 工作库存解决方案
注：此制剂仅生产 G-actinRed5 mg/mL 工作库存的 2 μL，因此，如果用户不习惯微击技术，则可以跳过第 3 步，使用中性 pH 缓冲器练习微注射，以保存宝贵的工作库存。供应商的 10 微克 G-actinRed 库存可存放在 16 盎司螺丝顶罐中，在 4 °C 下用 500 克干燥剂存放长达 6 个月。
- 提前准备一个 G 缓冲库存解决方案： 5 mm 特里斯 - Hcl， 0.2 mm Cacl2，ph 8.0 。在室温下过滤和存储。
- 在注射当天，使用第 2.1 步的 G 缓冲液库存在冰上使用新的捕捉帽微中心管中准备 1 mL 的 G 缓冲工作液，并在指示的最终浓度下补充以下：1 m 二硫三醇 （DTT） 和 0.2 mM ATP，pH 8.0。
注：G缓冲工作解决方案的1mL体积超过实验所需的量，但简化了准备。实验后可以丢弃多余的，或者用户可以根据自己的喜好缩小规模。- 将 10 μg G-actin红色 股票保留在冰上，首先在管内 G-actinRed 的粉红色液滴顶部添加 1 μL 过滤蒸馏水。
- 接下来，从步骤 2.2 添加 1 μL 的冷、新鲜准备的 G 缓冲工作解决方案。向上和向下管道~20次，与设置为1μL的移液器音量很好地混合。G-actin红 股票现在将在最后稀释5毫克/mL。
- 在不受干扰的冰上孵化准备好的G-actin红色 30分钟。
- 将准备好的 G-actinRed 在微中心中以 16，000 x g 为 20 分钟、在 4 °C 下进行离心，以去除任何沉淀物。
- 小心地将 1.5 μL 的超纳坦放入冰上新鲜的捕捉帽微中心管中，避免深粉色颗粒。
- 将准备好的 G-actin红色 超强剂储存在冰上长达 6 小时，直到准备加载到微需要中。
注：微食水可以提前从毛细管中拉出微点拉拔器，然后在室温下储存在 100 x 20 mm Petri 盘中的建模粘土条上。建议的微尼拔参数可以在派珀特食谱29中找到。
3. 收集胚胎并安装注射
- 允许苍蝇在苹果汁盘上放置胚胎30分钟，酵母糊在18°C。
- 当苍蝇铺设时，预先加热苹果汁琼脂板 ，不将酵母糊粘贴 到室温下，用剃须刀刀片切出4厘米×1厘米的苹果汁琼脂矩形楔子，放在25毫米×75毫米的玻璃滑梯上。
- 通过倒入新鲜漂白剂，用蒸馏水稀释1：1，在盘子上旋转1分钟，从而从30分钟的采集中收获盘子，并去除胚胎，如28（图1，第2步）所述。
注：不同品牌的漂白剂以不同浓度出售。这里使用的漂白剂是瓶中6%的次氯酸钠，被稀释为3%的次氯酸钠。其他浓度稍低的漂白剂品牌同样有效。 - 将漂白剂和被分离的胚胎倒入收集篮（70μm细胞过滤器），用喷出的瓶子中的蒸馏水冲洗两次，将这些洗涤液加入收集篮中。
- 用蒸馏水大力冲洗收集篮中残缺的胚胎，直到看不到酵母团，篮子在纸巾上弄脏时不会留下多余的漂白剂的粉红色痕迹。
- 通过倒入新鲜漂白剂，用蒸馏水稀释1：1，在盘子上旋转1分钟，从而从30分钟的采集中收获盘子，并去除胚胎，如28（图1，第2步）所述。
- 使用用蒸馏水浸湿的刷毛的画笔，将收集篮中的浸出和洗净的胚胎转移到玻璃滑梯上准备好的苹果汁琼脂楔子上。
- 使用一对细尖钳或解剖针，沿着长方形琼脂楔子的长轴（图1，步骤3）将十个胚胎排列成一条直线。将胚胎从头到尾排列，使胚胎前极朝右，正对着研究人员（图1，步骤3，放大）。
- 用剃须刀刀片切断P200移液器尖端的0.5厘米，浸入"胚胎胶水"（28中描述）。慷慨地涂上一个区域 5 毫米宽 （图 1，步骤 4）沿 24 毫米 x 50 毫米矩形封面的长边， 让干燥， 胶水侧向上。干燥需要~30s，一旦整个胶涂层区域出现哑光而不是潮湿或有光泽，干燥就会完成。
注：提前至少48小时准备"胚胎胶水"。在闪烁的瓶中将n-Heptane添加到双面胶带条中，如28年所述。 - 一旦"胚胎胶水"干涸，轻轻地将盖片胶面放在一排对齐的胚胎上，在盖片边缘和一排胚胎之间留下2-3毫米的空间。
注意：将胚胎粘在离盖片边缘太近的地方可能导致胚胎在实验过程中大量干燥。 - 翻转盖片，使胚胎现在朝上。它们应该卡在沿着盖片的一条长边的一条线上，其腹腔区域面对着盖片的最近边缘（图1，第4步，放大）。
- 将带胚胎的盖片轻轻地放在储存在16盎司螺丝顶部罐中的150克新鲜蓝色干燥剂上，使胚胎脱脂。紧紧拧在盖子上，孵育8-10分钟（图1，第5步）。
- 干燥后，从干燥罐中取出盖片，将盖片的每个短侧胶带移到显微镜滑动，胚胎侧面向上，用两块4厘米2的双面胶带使胚胎盖片贴入注射阶段（图1，步骤6）。
- 加入2-3滴卤碳27油与巴斯德移液器覆盖对齐的胚胎，并保护他们免受进一步脱水（图1，步骤6）。
4. 注射和加热应激胚胎，促进作用杆形成
注：所有注射均在18°C的温度控制室进行。
- 准备湿润的孵化室从玻璃培养皿至少100毫米×20毫米的大小和线与扭曲的实验室组织雨刷器与蒸馏水（图1，步骤8）。在注射胚胎之前，在32°C或所需的孵化温度前预热孵化室。
- 打开微型喷射器的气流阀，打开微型喷射器（压力至少为 90 psi 的压缩空气或内部空气是合适的）。
- 当胚胎干燥时，使用微型装载机尖端将先前制备的G-actin红色 超强剂倒入微需要。设置移液器以绘制 1-1.5 μL。
注：由于行为素的粘度，加载量可能不准确，可能有足够的作用素来加载至少一到两个微需要。如果微食量校准正确，并且在实验过程中不堵塞，每个加载的微注射器最多可注射60个胚胎。 - 将微针连接到针架上并拧紧螺钉。将气管连接到微喷射器，确保微呼吸平衡上的回流压力达到 30 hPa。
- 校准微注射器设置，在幻灯片微米上排出直径为 100μm 的 G-actinRed 气泡 （+500 pL）。在微容器上旋转压力旋钮（500-1500 hPa）和注脉冲时间旋钮（0.1-0.5 s），以获得正确的气泡大小。每次加载新的微内窥镜时，都会调整这些设置，以考虑行为粘度和微细端尺寸的变异性。
注：制备的G-actin红 是粘稠的，在注射胚胎之前，微针尖端可能有空气应被排出。如果 G-actinRed 不容易从微尼德的尖端排出，则轻轻将微线尖端从滑动微米的边缘打破。 - 将装有胚胎的幻灯片放在显微镜阶段。
注：每次注射设置将有所不同，因此研究人员将不得不相应地调整他们的注射方法。在这里，胚胎被移动到固定的微针，通过运行胚胎到微针注射每个胚胎。 - 调整微操纵器阶段，将10倍目标的焦点放在光显微镜上，使胚胎可见。当葡萄线膜的轮廓最锋利，胚胎出现最大时，胚胎处于正确的焦点平面中。选择处于正确发育阶段的胚胎注射，以便在注射后孵化完成时，大部分离合器达到所需的发育阶段（例如，在Bownes的阶段2-330 注射胚胎，以便观察在32°C的热应激后细胞化棒）。
- 使用微针控制，将针头带入与胚胎相同的聚焦平面。
注意：如果微针在移动舞台或微针时在盖片上捕获，则微针离滑动太近，不在正确的焦距平面中。微针应与盖夹平行，而不是以显著的角度（图1，步骤7）。 - 将微需要插入胚胎中，使其在胚胎"赤道"处击中其腹腔区域中间的胚胎。当微型针尖在胚胎中间可见时，用脚踏板或"注射"按钮触发注射（图1，步骤7）。
- 注射一次G-actin红色 ，慢慢去除微针。移动舞台，为适当的发育阶段的每个胚胎重复。
注：胚胎的膨胀是正常的，因为注射了G-actin红 ，一点细胞质可能会从胚胎中泄漏出来。 - 所有胚胎注射完后，将带胚胎的滑梯放在制备的潮湿孵化室中，并合上盖子（图1，步骤8）。如果试图获得达到细胞化的胚胎，热应力在32°C的胚胎在潮湿的孵化室60-75分钟。
注：潜伏时间被注意到，允许在细胞化热应力胚胎的棒可视化。非热应激控制胚胎的潜伏时间会更长，因为在较低的温度31下发育会变慢。这些控制胚胎可以在潮湿的室中孵育，温度为18°C或25°C，具体实验的设计和要问的问题。G-actin红 在胚胎中扩散所需的最短潜伏时间为30分钟。
5. 通过分泌显微镜在高温受压胚胎中的图像作用棒
- 当胚胎受到热压时，打开包膜显微镜，选择561nm激光通道。
- 将目标透镜（建议为 25 倍、40 倍或 63 倍）移到工作位置。
- 如果成像热应力胚胎，则设置加热阶段孵化器，以达到32°C的内部温度。 点对点或红外温度计可用于检查目标处或附近的温度。
- 孵化完成后，用注射的胚胎从潮湿的孵化室中取出滑梯（图1，步骤9）。
- 工作迅速，轻轻地撬开双面胶带片，用于粘附盖片与安装胚胎到幻灯片（图1，步骤9）。
注意：在这些步骤中要温和，因为如果施加过多的力，盖片很容易破碎。 - 将两块2.5厘米长的双面胶带粘在一起，将胶带切成两半，制作两条，长2.5×0.5厘米（图1，步骤10）。
- 将每个胶带长度的三分之二贴在第一个盖片上，在 Halocarbon 27 油中胚胎的两侧（图 1，步骤 10，橙色），留下三分之一的胶带条挂在胚胎卡住的第一个盖片的边缘。在这一步中，使用戴手套的手，小心不要触摸胚胎。
- 轻轻地将第二个矩形盖片放在胶带条上，将胚胎夹在盖片之间（图1，步骤10，蓝色）。对齐 25 毫米边缘，但保持 50 毫米边缘相互偏移 1 厘米宽度。
注：这第二个盖片的全表面将成为新的成像表面，将面对客观的镜头，所以要小心不要得到指纹或卤素27油在这第二个盖片表面。偏移是必要的，以便额外的卤素27油可以添加到均匀浸入胚胎。如有必要，在三明治顶部两个盖片相遇的接缝处加入 Halocarbon 27 油，它会通过毛细管作用覆盖胚胎（见图 1中的虚线，第 10 步）。 - 轻轻轻点直接在胶带顶部的盖片区域，用剃须刀的钝侧让盖片粘附在胶带上。
- 翻转盖滑三明治，放在实验室组织雨刷器上，以保持成像表面清洁，并携带到结肠显微镜（图1，第11步）。在成像前，确保磁带完全粘在两个盖片上。
- 确认加热阶段处于温度，如果使用倒置显微镜，请在选定的客观透镜上添加浸入液。
- 小心地将盖片三明治放在舞台上，以确保新的成像表面（2和盖片）是触摸浸入式液体（图1，步骤11）。
注意：如果需要，请将盖片三明治用两小块双面胶带粘在舞台上，以防止在成像过程中出现不必要的移动，如果盖片不适合加热阶段。 - 聚焦于处于细胞化（Bownes阶段4a30）或使用传播光或荧光进行发育阶段的胚胎。
- 胚胎聚焦后，切换到显微镜上的激光采集模式，并根据需要调整激光功率和增益、帧大小、平铺和投影设置。
- 通过胚胎核的焦点平面拍摄表面图像，以找到核内部作用杆。棒应以多个方向显示为相对较暗的原子核（图 2A，2C）内的亮条纹或点。
6. 替代成像实验
- 执行 FRAP，以调查沿核作用杆长度或细胞质作用素结构（如细胞化过程中等离子膜皱眉的尖端）的变换。
- 在成像软件中，选择一个围绕沟尖或行动棒的矩形区域来获取实验。
- 选择矩形采集区域内行为杆中心的小方形区域进行漂白。确保作用杆的尖端是可见的，在实验过程中不要漂白，以便准确跟踪细胞核内的杆。
- 将漂白激光器设置为 50 倍，并将漂白激光功率设置为最大。
- 选择每秒获取图像的时间过程，以最高像素的停留速度总共达到 120 秒，并在图像采集的前两秒后将激光设置为漂白。
- 量化数据，以确定荧光恢复的一半时间1。
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Representative Results
图1中描绘了胚胎处理的示意图工作流程，并在表1中介绍了典型实验的时间表。一个好的实验结果的估计是，每注射10个胚胎，至少一半的被观察的胚胎将处于正确的发育阶段，没有损坏，并表现出强大的ASR与热应力在32°C。 图2A（右面板）中胚胎的代表性表面视图图像中所示，将通过核内作用素棒的组装来证明此 ASR。Actin 棒将出现在原子核内的多个方向（平行或垂直于成像平面），并且可以通过几个焦点平面进行成像。相比之下，在18°C下孵育的对照胚胎不会显示作用杆（图2A，左面板）。包含棒的百分比核可以量化，如图 2B所示。此外，FRAP实验可以在棒（图2C）上进行。1 中引用了一种建议的 FRAP 数据量化方法，图 2D中显示了行为杆漂白与未漂白区域的荧光恢复图示例。
如果胚胎在实验中被注射严重损坏或太干，可能会观察到线粒体异步，细胞化将被破坏。有时，由于未能将足够的作用素注射到胚胎中，棒子可能看不见。如果发生这种情况，请确保注射的 G-actinRed 的量为 500 pL（用微米测量步骤 4.5），并通过对周围油进行测试注射来检查每个胚胎微注射之间的 G-actin红色 气泡的大小，确认该量在胚胎之间保持一致。此外，为了确保棒可视化，快速工作，添加盖片，并将胚胎移动到加热显微镜阶段，一旦他们从潮湿的腔室在第5.4步，因为棒组装是可逆的1 和棒可以拆解，如果胚胎保持在温度低于32°C超过30分钟。
图1：实验期间胚胎处理的示意图概述。（1） 胚胎收集杯中的成年苍蝇在苹果汁琼脂盘上放置胚胎。（2） 胚胎用1：1漂白剂：蒸馏水，倒入收集篮，用蒸馏水彻底清洗，以清除漂白剂和碎屑。（3） 胚胎用画笔转移到滑梯上的长方形苹果汁琼脂楔子上，并排列在两侧，从头到尾，背带区域朝向琼脂的边缘。（4） 一个5×50毫米区域的玻璃盖片（橙色）涂有"胚胎胶"，轻轻压在一排胚胎上，将它们粘在盖片上。（5） 胚胎的盖片倒置，使胚胎朝上。胚胎在螺丝顶罐中干燥。（6） 干燥后，盖片立即贴在滑梯上，胚胎朝上，胚胎上覆盖着光环碳27油。（7） 以前装有预制的G-actinRed的微针用于将单次注射到每个胚胎的腹腔区域中心，针头的位置与盖片平行。（8） 注射后，胚胎在控制温度（18°C）或热应力（32°C）下，用潮湿的实验室组织雨刷器在培养皿内孵育。（9） 孵化后，上面有胚胎的盖片从滑梯上移走。（10） 两块双面胶带相互分层，半长切成两半，并放在胚胎周围的油的两侧，在第一个盖片上。第二个盖片（蓝色）被放置在第一个表面的顶部，以创建一个新的成像表面，抵消，以便它留下一个缺口，更多的油添加，以覆盖胚胎，如有必要。（11） 如果在倒置的腹膜显微镜上成像，盖脂三明治是倒置的，以便第二个盖夹面对目标。成像是在孵化室中完成的，在每个胚胎核的几个焦点平面上可视化作用杆。请点击这里查看此数字的较大版本。
图2：热应激胚胎中作用杆的代表性结果。（A） 在18°C（左面板）的控制温度下孵育的胚胎中看不到Actin棒，但在32°C（右面板）的热应力胚胎核中可以看到。（B） 从有代表性的实验中量化带作用杆的核百分比。每个点代表一个胚胎，其中棒和核被计算在整个图像区域（n = 22 胚胎在 18 °C; n = 23 胚胎在 32 °C;错误条显示标准偏差）。学生的t测试，假设有不平等的差异，被用来计算p值。（C） 一个有代表性的时间系列显示 FRAP 在行动棒上。漂白的杆的部分由白色箭头表示。预漂白剂在漂白步骤前2s。时间=0s是漂白剂步骤，荧光恢复被跟踪到60后漂白剂。（D） 图示显示杆漂白区域中行为荧光的恢复动态，与同一杆中的未漂白区域相比。杆是非常稳定的，并在其中的行为不周转。因此，看不到任何恢复。 请点击这里查看此数字的较大版本。
表1：带建议时间表的实验工作流程。此时间表总结了完成协议每个步骤的预期时间。
| 以 | 步 | 每个步骤所需的时间 | 描述 |
| 1 | 1.1 | 提前5天 | 制作胚胎收集笼。倒苹果汁琼脂盘。 |
| 2 | 1.2-1.3 | 提前2天 | 与成年雄蝇和雌蝇一起设置收集笼。 |
| 3 | 2.6 注 | 提前1天 | 拉毛细管做微需要。 |
| 4 | 2.1-2.6 | 1 小时 | 准备 G - 行动。 |
| 5 | 3.1 | 30分钟 | 允许苍蝇产卵。 |
| 6 | 3.2-3.10 | 15-30分钟 | 收集、安装、干燥胚胎。用油盖住胚胎。 |
| 7 | 4.1 | 提前30分钟 | 准备潮湿的孵化室。 |
| 8 | 4.2-4.4 | 1分钟 | 加载微需要。 |
| 9 | 4.5-4.10 | 10-20分钟 | 校准G-actin气泡大小并注射胚胎。 |
| 10 | 4.11 | 30分钟-1+小时 | 孵化/加热应激胚胎。 |
| 11 | 5.1-5.3 | 提前1小时 | 打开显微镜和孵化阶段。 |
| 12 | 5.4-5.10 | 5分钟 | 用于成像的盖片之间的三明治胚胎。 |
| 13 | 5.11-6.6 | 15分钟-1+小时 | 在胚胎中成像核内作用棒。 |
表2：故障排除建议。此表提供了故障排除建议，以帮助协议的顺利完成。
| 潜在问题 | 建议 |
| 苍蝇没有放置足够的胚胎。 | 至少提前 5 天设置杯子（参阅步骤 1.1-1.3）。在实验之前，每天更换3次盘子，以鼓励产卵。让苍蝇将胚胎放置1小时而不是30分钟。与年轻的成年苍蝇一起设置杯子。 |
| 没有G-actin被逐出微需要。 | 增加微型喷射器上的压力和时间设置。进一步打破微需要提示（指步骤4.5注意）。由于主要木块可能不清楚，请装上新的针头。 |
| 很难校准足够小的气泡大小。 | 调整压力和时间设置（指步骤 4.5）。由于微针尖开口可能太大，加载一个新的针。 |
| 胚胎在注射过程中从盖片上的胶水中释放。 | 通过在赫普坦溶液中添加更多双面胶带来调整未来盖片的"胚胎胶水"一致性（请参阅步骤 3.5 注）。 |
| 胚胎在温度孵化过程中干涸。 | 确保滑梯在孵化室中处于水平（指步骤 4.11），并且油不会触及任何可能将其芯走的东西。在胚胎中加入额外的油滴。减少注射前干燥时间（指步骤 3.8）。 |
| 油不能完全覆盖第一和第二个盖片之间的胚胎。 | 通过毛细拉作用向盖片之间的小间隙添加额外的油（请参阅步骤 5.8 注）。 |
| 在热应激胚胎中看不到核作用素棒。 | 注入较大体积的 G-actin（指步骤 4.5）。确认注射后孵化（指步骤 4.11）和成像室的温度均为 32 °C（指步骤 5.3）。 |
| 在胚胎的注射部位周围可以看到G-actin的大气泡。 | 注入体积较小的 G-actin（指步骤 4.5）。增加胚胎干燥时间，促进胚胎内注射作用素的更好保留（指步骤3.8）。 |
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Discussion
这种方法的意义在于，它利用了在果蝇胚胎21、22、23、24、25、26、27中建立的微射方案，使有关ASR和伴随作用杆组装的新研究得以进行。将G-actinRed注射到活胚胎中的一个主要优点是，ASR可以在各种背景下进行研究。对于未来的研究，这些背景可能包括注射其他基因型的胚胎作为突变筛选的一部分，或暴露注射胚胎到不同的应激条件，如氧化应激4，32。虽然这里没有详细描述，这种注射技术也可以修改，以注入核酸，其他蛋白质，药物和指标染料（例如，见21，22，23，24，32）研究ASR。因此，该方法提供了多种方法，用于识别诱导ASR的应力范围，进一步描述ASR期间的细胞反应（例如线粒体活动的变化），并发现核作用素棒组装背后的新分子和机制。
协议的一些关键步骤包括：在第3.8步，胚胎必须适当干燥，以确保成功的注射和最佳的胚胎健康。干燥时间将取决于实验室的环境温度和湿度，因此建议首先使用中性 pH 缓冲器练习安装、干燥和注射，以确定处理胚胎的参数。在第 4.5 步中，必须微调微针和注射设置，以便将足够的 G-actinRed 注射到胚胎中。如果注射到胚胎中的G-actinRed 太少，作用杆可能不容易被可视化，因为作用杆的形成取决于自由行动素1的浓度。此外，如果注射的G-actinRed 不够，则很难从FRAP实验中获得一致的结果，因为荧光强度不会足够高，无法克服背景荧光。因此，每次装载和使用新针头时，都要校准气泡大小。G-actin红色 是粘性的，往往堵塞在微内。有时，这可能导致将可变量的G-actin注射到胚胎中。如果微针堵塞，用高压清除微针失败，可能需要尝试进一步打破微针尖端，甚至装载新的微针并注入一组新的胚胎。最后，在第4.11步，胚胎必须在高温下孵育，并有足够的时间诱导ASR和棒形成1。应不断监测所有孵化器的温度，必须限制将胚胎从孵化器转移到孵化器的时间，并应使用定时器用于所有孵化器。 表2 中列出了其他可能的问题，并附有故障排除提示。
此协议的一个主要限制是，在注射、孵化和成像过程中，必须特别小心，以保持胚胎的健康。该协议旨在最大限度地提高胚胎健康，通过重要的实践，研究人员可以完成协议的所有步骤，胚胎发育以预期的每个温度31的速度进展。协议的第二个限制是需要一个微喷射钻机，它可以是相当昂贵的，不是每个飞行实验室的常见设备。然而，如果相邻的实验室配备注射其他胚胎（如 异种虫、斑马鱼和 卡诺哈布迪炎等）或附体细胞，则所使用的注射装置可能适合 嗜血杆菌 注射。在这种情况下，只有针的形状需要适应 果蝇 胚胎根据管道食谱29的指导方针。或者，市场上有一些更便宜的 micoin 喷射器选项（例如模拟微注射器），可以显著降低组装注射钻机的成本。
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Disclosures
没有宣布利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢郑柳柳和薛增辉（在索卡克实验室帮助开创这项技术）以及帮助分析的哈桑·西德（Hasan Seede）的工作。这项研究的工作由国家卫生研究院（R01 GM115111）的赠款资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore-Sigma | A23835G | Component of G buffer |
| Apple juice, Mott's, 64 fl oz | Mott's | 014800000344 | Component of apple juice plates |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Component of apple juice plates |
| Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite | KIK International | 059647210020 | For dechorionating embryos |
| Calcium chloride | Millipore-Sigma | C1016500G | Component of G buffer |
| Cell strainer, 70 μm | Falcon | 352350 | For collecting dechorionated embryos |
| Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan | Zeiss | 0000001994956 | For imaging intranuclear actin rods |
| Desiccant | Drierite | 24001 | For desiccating embryos |
| Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom | Zeiss | 4350649000000 | For arranging embryos on agar wedge |
| Dissecting needle, 5 in | Fisher Scientific | 08965A | For arranging embryos on agar wedge |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP1725 | Component of G buffer |
| Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in | 3M | 021200010323 | For making embryo glue |
| Embryo collection cage | Genessee Scientific | 59100 | For housing adult flies and collecting embryos |
| Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72701D | For arranging embryos on agar wedge |
| Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm | World Precision Instruments, Inc. | TW1004 | For microneedles |
| Halocarbon oil 27 | Millipore-Sigma | H8773100ML | For hydration of embryos |
| Heated stage incubator | Zeiss | 4118579020000, 4118609020000, 4118609010000 | For confocal imaging |
| Lab Tissue Wipers, KimWipes | Kimberly-Clark | 34155 | Lab tissue wipers |
| Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished | Zeiss | Discontinued | Injection microscope |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Millipore-Sigma | H36471KG | Component of apple juice plates |
| Microinjector, FemtoJet4x | Eppendorf | 5253000025 | Microinjector |
| Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 μL | Eppendorf | 5242956003 | For loading microneedles |
| Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment | Bernard Instruments, Inc (Houston, TX) | Custom | For performing microinjections |
| Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown | Sutter Instruments | P97 | For pulling capillary tubes to make microneedles |
| Microscope cover glass 24x50-1.5 | Fisher Scientific | 12544E | For mounting embryos |
| Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm | Fisher Scientific | 22037081 | For mounting embryos for injection |
| n-Heptane | Fisher Scientific | H3601 | Component of embryo glue |
| Objective, 10x | Zeiss | Discontinued | 10x objective for injection microscope |
| Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS | Zeiss | 4217679971711 | 40x water objective for confocal |
| Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm) | Zeiss | 4208529871000 | 25x mixed immersion objective for confocal |
| Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA | Zeiss | 4207829900799 | 63x oil objective for confocal |
| Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2 | Daler-Rowney | 038372016954 | For transferring embryos |
| Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white | Kimberly-Clark | 884266344845 | For blotting cell strainer |
| Pasteur pipette, 5 3/4 in | Fisher Scientific | 1367820A | For covering embryos with oil |
| Petri dish, glass, 100 x 20 mm | Corning | 3160102 | For humid incubation chamber |
| Petri dish, plastic, 60 x 15 mm | VWR | 25384092 | For apple juice plates |
| Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 μL | Eppendorf | 2231000604 | For loading the microneedle |
| Pipette tip, xTIP4 250 μL | Biotix | 63300006 | For adding embryo glue to coverslip |
| Razor blade | VWR | 55411050 | For cutting agar wedge, tape, pipette tips |
| Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4x10 μg) | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | G-actin^Red |
| Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps | Fisher Scientific | 033377 | For making embryo glue |
| Screw top jar, 16 oz | Nalgene | 000194414195 | For desiccating embryos |
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 602104PG | For calibrating volume of G-actin injection |
| Sucrose | Millipore-Sigma | 840971KG | Component of apple juice plates |
| Trizma base | Millipore-Sigma | T15031KG | Component of G buffer |
| Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz | Lesaffre Yeast Corporation | 117929157002 | Component of yeast paste |
References
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