Summary
L'obiettivo di questo protocollo è quello di iniettare l'actina globulare coniugata con rhodamina negli embrioni di Drosophila e nell'assemblaggio dell'asta di actina intranucleare dell'immagine a seguito dello stress da calore.
Abstract
Lo scopo di questo protocollo è quello di visualizzare le barre di actina intranucleare che si assemblano in embrioni di melanogaster Drosophila vivi a seguito dello stress termico. Le canne Actin sono un segno distintivo di una risposta allo stress actina conservata e induttibile (ASR) che accompagna patologie umane, tra cui la malattia neurodegenerativa. In precedenza, abbiamo dimostrato che l'ASR contribuisce ai fallimenti della morfogenesi e alla ridotta vitalità degli embrioni in via di sviluppo. Questo protocollo consente di continuare lo studio dei meccanismi alla base dell'assemblaggio dell'asta di actina e dell'ASR in un sistema modello altamente suscettibile di imaging, genetica e biochimica. Gli embrioni vengono raccolti e montati su una coverlip per prepararli all'iniezione. L'actina globulare coniugata con rodamina (G-actinaRossa)viene diluita e caricata in un microneedle. Una singola iniezione viene effettuata al centro di ogni embrione. Dopo l'iniezione, gli embrioni vengono incubati a temperatura elevata e le barre di actina intranucleare vengono quindi visualizzate mediante microscopia confocale. Il recupero della fluorescenza dopo esperimenti di fotobleaching (FRAP) può essere eseguito sulle barre di actina; e altre strutture ricche di actina nel citoplasma possono anche essere immagini. Scopriamo che G-actinRed polimerizza come l'endogeno G-actina e non interferisce, da solo, con il normale sviluppo embrionale. Una limitazione di questo protocollo è che occorre fare attenzione durante l'iniezione per evitare gravi lesioni all'embrione. Tuttavia, con la pratica, iniettare G-actinaRossa negli embrioni di Drosophila è un modo rapido e affidabile per visualizzare le aste di actina e può essere facilmente utilizzato con mosche di qualsiasi genotipo o con l'introduzione di altri stress cellulari, tra cui ipossia e stress ossidativo.
Introduction
Questo protocollo descrive come iniettare G-actinRed per visualizzare l'assemblaggio di barre di actina intranucleare in embrioni stressati dal calore che stanno subendo un'induttibile risposta allo stress actina (ASR)1. Abbiamo sviluppato questo protocollo per aiutare gli studi dell'ASR, che negli embrioni porta a morfogenesi interrotta e ridotta vitalità, e nei tipi di cellule umane adulte è associato a patologie tra cui insufficienza renale2,miopatiemuscolari 3e morbo di Alzheimer e Huntington4,5,6,7,8. Questa ASR è indotta da numerose sollecitazioni cellulari, tra cui shocktermico 9,10,11,stress ossidativo4,6,ridotta sintesi ATP12e huntingtina anomala o oligomerizzazione β-amiloide4,5,6,7,9,13,14,15,16. Un segno distintivo dell'ASR è l'assemblaggio di aste di actina aberrante nel citoplasma o nel nucleo delle cellule colpite, che è guidato dall'iperattivazione indotta dallo stress di una proteina che interagisce con l'actina, Cofilin1,5,6,10. Sfortunatamente, permangono lacune chiave in materia di conoscenze per quanto riguarda l'ASR. Ad esempio, la funzione delle aste actin non è nota. Non capiamo perché le aste si formano nel citoplasma di alcuni tipi di cellule, ma il nucleo di altri. Né è chiaro se l'ASR sia protettivo o disadattiva per cellule o embrioni sottoposti a stress. Infine, non conosciamo ancora i meccanismi dettagliati alla base dell'iperattività cofilin o dell'assemblaggio dell'asta actina. Pertanto, questo protocollo fornisce un saggio rapido e versatile per sondare l'ASR visualizzando la formazione e la dinamica dell'asta di actina nel sistema sperimentale altamente trattabile dell'embrione di mosca della frutta vivente.
Il protocollo per microiniettare G-actinRed in embrioni viventi di Drosophila è stato inizialmente sviluppato per studiare la dinamica delle normali strutture dell'actina citoplasmatica17 durante gli eventi di costruzione dei tessuti. In questi studi, abbiamo scoperto che l'iniezione di G-actinaRed non ha influito negativamente sui primi processi di sviluppo nell'embrione, tra cui citocinesi o gastrulazione17,18. Abbiamo quindi modificato il protocollo, adattando la manipolazione dell'embrione e l'iniezione G-actinRed per consentire l'imaging di aste di actina in embrioni stressati dal calore sottoposti all'ASR1. Altri metodi oltre all'iniezione di G-actinRed possono essere utilizzati per visualizzare l'actina negli embrioni. Questi metodi si basano sull'esprimere proteine fluorescenti (FP) taggate ad actina o a domini di proteine che legano l'actina, come Utrophin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP e Moesin-GFP (recensito in19). Tuttavia, l'uso di queste sonde FP richiede cautela perché possono stabilizzare o interrompere alcune strutture actina, non etichettano allo stesso modo tutte le strutture actin20e, nel caso dell'actina-GFP, sono altamente sovraespresse – problematiche per l'analisi dell'assemblaggio dell'asta che non dipende solo dallo stress, ma agisce anche nella concentrazionedipendente 1. Pertanto, G-actinRed è la sonda preferita per gli studi sulle aste negli embrioni di mosca e le grandi dimensioni dell'embrione ne consentono la facile iniezione.
Il flusso di lavoro di questo protocollo è simile ad altre consolidate tecniche di microiniezione che sono state utilizzate per iniettare proteine, acidi nucleici, farmaci e indicatori fluorescenti negli embrioni di Drosophila 21,22,23,24,25,26,27. Tuttavia, in seguito alla microiniezione di G-actinRed qui, gli embrioni sono esposti a un leggero stress termico per indurre l'ASR e l'assemblaggio intranucleare dell'asta di actina. Per i laboratori con accesso alle mosche e un impianto di iniezione, questo metodo dovrebbe essere facilmente implementabile e adattabile per specifiche linee di studio per quanto riguarda l'ASR, compresa la sua induzione da diversi stress o modulazione in contesti genetici distinti.
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Protocol
1. Preparare tazze per la raccolta degli embrioni e piatti di agar di succo di mela
- Cinque giorni prima dell'esperimento di iniezione, costruisci28 o procura almeno due piccole tazze per la raccolta degli embrioni. Preparare piatti freschi di succo di mela da 60 mm da utilizzare con piccole tazze di raccolta28. Conservare i piatti in scatole di plastica ricoperte da tovaglioli di carta umidi a 4 °C.
NOTA: Piccole tazze per la raccolta degli embrioni, popolate con numeri di mosca come descritto al passaggio 1.3, forniranno numeri di embrioni sufficienti per esperimento, garantendo al contempo che la manipolazione e l'iniezione degli embrioni possano essere fatte in un tempo abbastanza breve da consentire l'imaging delle prime fasi di sviluppo. - Scaldare i piatti di succo di mela a 18 °C e aggiungere un tampone di pasta di lievito al centro del piatto. La pasta di lievito è una semplice pasta di lievito attivo e acqua distillata.
- Per promuovere la deposizione delle uova più generosa, impostare tazze di raccolta con mosche 2 giorni prima dell'esperimento. Aggiungere almeno 100 femmine e 50 mosche maschili alle tazze di raccolta e in alto con un piatto di succo di mela preparato(Figura 1,passo 1). Nei giorni che portano all'esperimento di iniezione cambiare i piatti di succo di mela almeno due volte al giorno, una volta al mattino e una volta alla sera.
NOTA: I migliori risultati di iniezione e imaging si ottengono quando le tazze per la raccolta degli embrioni sono mantenute a 18 °C con un ciclo di spegnimento / luce di luce di 12 ore.
2. Preparare una soluzione di stock di lavoro di G-actinRed per la microiniezione
NOTA: Questa preparazione produce solo 2 μL di uno stock di lavoro di 5 mg/mL di G-actinRed, quindi se gli utenti non sono abituati alla tecnica di microiniezione, è vantaggioso saltare al passaggio 3 e praticare le microiniezioni con un tampone di pH neutro per conservare il prezioso stock di lavoro. Lo stock da 10 μg di G-actinRed del venditore può essere conservato nella sua confezione originale in un barattolo superiore a vite da 16 once con ~ 500 g di essiccante a 4 ° C per un massimo di 6 mesi.
- Preparare in anticipo una soluzione di stock tampone G: Tris-HCl da 5 mM, CaCl2da 0,2 mM, pH 8,0. Filtrare e conservare a temperatura ambiente.
- Il giorno delle iniezioni, preparare 1 ml di una soluzione di lavoro G-buffer in un tubo di microcentrifugo a tappo a scatto fresco sul ghiaccio utilizzando la scorta tampone G del passo 2.1, integrata con le seguenti concentrazioni finali indicate: 1 mM ditiothreitol (DTT) e 0,2 mM ATP, pH 8.0.
NOTA: Il volume di 1 mL della soluzione di lavoro G-buffer è superiore a quello necessario per un esperimento, ma semplifica la preparazione. L'eccesso può essere scartato dopo l'esperimento o gli utenti possono ridimensionarsi in base alle loro preferenze.- Mantenendo lostock rosso G-actin da 10 μg sul ghiaccio, aggiungere prima 1 μL di acqua filtrata e distillata sulla parte superiore della goccia rosa di G-actinRosso all'interno del tubo.
- Aggiungere quindi 1 μL della soluzione di lavoro G-buffer fredda e preparata al momento dal passaggio 2.2. Pipettare su e giù ~20 volte per mescolare bene con il volume della pipetta impostato su 1 μL. Lo stock G-actinRed sarà ora alla diluizione finale di 5 mg/mL.
- Incubare il G-actin Rosso preparatoper 30 minuti sul ghiaccio indisturbato.
- Centrifugare il G-actinRosso preparato a 16.000 x g per 20 min a 4 °C in un microcentrifugo per rimuovere qualsiasi precipitato.
- Pipettare con cura 1,5 μL del supernatante in un tubo di microcentrifugo fresco snap cap sul ghiaccio, evitando il pellet rosa scuro.
- Conservare il supernatante G-actinRed preparato sul ghiaccio per un massimo di 6 ore fino a quando non è pronto per il caricamento in un microneedle.
NOTA: Le microneedle possono essere estratte in anticipo da tubi capillari su un estrattore di micropipette, quindi conservate a temperatura ambiente su una striscia di argilla modellante in una piastra di Petri da 100 x 20 mm. I parametri suggeriti per l'estrazione del microneedle sono disponibili nel Pipette Cookbook29.
3. Raccogliere embrioni e montare per iniezione
- Lasciare che le mosche depongono embrioni per 30 minuti su piatti di succo di mela con pasta di lievito a 18 °C.
- Mentre le mosche sono sdraiate, pre-riscaldare una piastra di agar succo di mela senza pasta di lievito a temperatura ambiente, tagliare un cuneo rettangolare di 4 cm x 1 cm di succo di mela agar con una lama di rasoio e posizionare su uno scivolo di vetro da 25 mm x 75 mm.
- Raccogli la piastra dalla raccolta di 30 minuti e gli embrioni di decoorionato versando candeggina fresca, diluita 1:1 con acqua distillata, sul piatto e ruotando il piatto per 1 minuto, come descritto alpunto 28 (Figura 1,fase 2).
NOTA: Diverse marche di candeggina sono vendute a diverse concentrazioni. La candeggina qui utilizzata è il 6% di ipoclorito di sodio dalla bottiglia e viene diluita a una concentrazione finale del 3% di ipoclorito di sodio. Altre marche di candeggina a concentrazioni leggermente inferiori funzioneranno altrettanto bene. - Versare la candeggina e gli embrioni dechorionati in un cestello di raccolta (un colino cellulare da 70 μm) e sciacquare il piatto due volte con acqua distillata da una bottiglia di schizzi, aggiungendo questi lavaggi al cesto di raccolta.
- Risciacquare vigorosamente gli embrioni dechorionated nel cesto di raccolta con acqua distillata fino a quando non sono visibili grumi di lievito e il cestello non lascia segni rosa dalla candeggina in eccesso quando macchiato su un tovagliolo di carta.
- Raccogli la piastra dalla raccolta di 30 minuti e gli embrioni di decoorionato versando candeggina fresca, diluita 1:1 con acqua distillata, sul piatto e ruotando il piatto per 1 minuto, come descritto alpunto 28 (Figura 1,fase 2).
- Utilizzando un pennello con setole inumidite con acqua distillata, trasferire embrioni dechorionati e lavati dal cesto di raccolta sul cuneo di agar del succo di mela preparato sullo scivolo di vetro.
- Utilizzare un paio di pinzette a punta fine o un ago di sezionazione per disporre dieci embrioni in linea retta lungo il lungo asse del cuneo agar rettangolare (Figura 1, fase 3). Disporre gli embrioni testa a coda, in modo che il loro polo anteriore sia rivolto verso il lato destro e dorsale sia rivolto verso il ricercatore(Figura 1,fase 3, ingrandito).
- Tagliare 0,5 cm dell'estremità di una punta della pipetta P200 con una lama di rasoio e immergersi nella "colla embrionale" (descritta in28). Rivestire generosamente una regione di 5 mm di larghezza (Figura 1, passo 4) lungo il bordo lungo di un copricapo rettangolare da 24 mm x 50 mm e lasciare asciugare, incollare il lato verso l'alto. L'asciugatura richiederà ~ 30 s ed è completa una volta che l'intera regione rivestita di colla appare opaca piuttosto che bagnata o lucida.
NOTA: Preparare "colla embrionale" con almeno 48 ore di anticipo. Aggiungere n-eptano a strisce di nastro a doppia mano in una fiala a scintillazione come descritto nel28. - Una volta che la "colla embrionale" si è asciugata, posizionare delicatamente il lato della colla di coprisciuga in cima alla fila di embrioni allineati sull'agar, lasciando 2-3 mm di spazio tra il bordo del coverslip e la fila di embrioni.
NOTA: Attaccare gli embrioni troppo vicino al bordo del coverslip può portare all'essiccazione troppo degli embrioni nel corso dell'esperimento. - Capovolgere il coverslip in modo che gli embrioni siano ora rivolti verso l'alto. Devono essere bloccati in una linea lungo un lungo bordo del coverslip e la loro regione ventrale rivolta verso il bordo più vicino del coverslip (Figura 1, passo 4, ingrandito).
- Essiccare gli embrioni posizionando delicatamente il coperchio con embrioni sopra 150 g di essiccante blu fresco conservato in un barattolo superiore a vite da 16 once. Avvitare saldamente il coperchio e incubare per 8-10 minuti(Figura 1,fase 5).
- Dopo l'essiccazione, rimuovere il coverslip dal barattolo essiccante e nastro ogni lato corto del coverslip a uno scivolo del microscopio, lato embrioneverso l'alto, con duepezzi da 4 cm 2 di nastro a doppia mano in modo che il coverslip dell'embrione si adattiallo stadio di iniezione (Figura 1,fase 6).
- Aggiungere 2-3 gocce di olio di Alocarbonio 27 con una pipetta Pasteur per coprire gli embrioni allineati e proteggerli da un'ulteriore disidratazione (Figura 1, fase 6).
4. Embrioni di iniezione e stress termico per promuovere la formazione di aste di actina
NOTA: Tutte le iniezioni vengono fatte in una stanza a temperatura controllata a 18 °C.
- Preparare camere di incubazione umide da una piastra di Petri in vetro di dimensioni di almeno 100 mm x 20 mm e allineare la camera con torsioni di tergicristalli di laboratorio inumiditi con acqua distillata(Figura 1,fase 8). Pre-riscaldare le camere di incubazione a 32 °C o la temperatura di incubazione desiderata prima di iniettare embrioni.
- Aprire la valvola di flusso d'aria per il microiniettore e accendere il microiniettore (è adatta aria compressa o aria di casa con una pressione di almeno 90 psi).
- Mentre gli embrioni sono in essiccazione, scaricare il supernatante G-actinRed precedentemente preparato nel microneedle utilizzando una punta del micro caricatore. Impostare la pipetta per disegnare 1-1,5 μL.
NOTA: A causa della viscosità dell'actina, i volumi di carico potrebbero non essere accurati e potrebbe esserci abbastanza actina per caricare almeno uno o due microneedle in più. È possibile iniettare fino a 60 embrioni per microneedle caricato se il microneedle è calibrato correttamente e non si intasa nel corso dell'esperimento. - Fissare il microneedle al supporto dell'ago e stringere la vite. Collegare il tubo dell'aria al microiniettore e assicurarsi che la pressione di riflusso sugli equilibrati del microneedle si equilibra a 30 hPa.
- Calibrare le impostazioni del microiniettore per espellere una bolla di 100 μm di diametro di G-actinRosso (~500 pL) su un micrometro a scorrimento. Ruotare la manopola di pressione (500-1500 hPa) e la manopola del tempo dell'impulso di iniezione (0,1-0,5 s) sul microiniettore per ottenere la giusta dimensione della bolla. Regolare queste impostazioni ogni volta che viene caricato un nuovo microneedle per tenere conto della variabilità nella viscosità dell'actina e nella dimensione della punta del microneedle.
NOTA: Il G-actinRosso preparato è viscoso e ci può essere aria nella punta del microrischio che deve essere espulsa prima di iniettare embrioni. Se il G-actinRed non espelle facilmente dalla punta del microneedle, rompere delicatamente la punta del microneedle contro il bordo del micrometro di scorrimento. - Posizionare lo scivolo con embrioni montati sullo stadio del microscopio.
NOTA: Ogni configurazione di iniezione sarà diversa, quindi i ricercatori dovranno regolare il loro metodo di iniezione di conseguenza. Qui gli embrioni vengono spostati rispetto a un microneedle stazionario, iniettando ogni embrione facendo correre l'embrione nel microneedle. - Regolare lo stadio del micromanipolatore e mettere a fuoco l'obiettivo 10x sul microscopio luminoso in modo che gli embrioni siano visibili. Gli embrioni si trovano nel piano focale corretto quando i contorni della membrana vitellina sono più nitidi e l'embrione appare più grande. Scegli embrioni da iniettare che si trovano nella fase di sviluppo corretta, in modo che quando l'incubazione post-iniezione è completa, la maggior parte della frizione raggiunge lo stadio di sviluppo desiderato (ad esempio, iniettare embrioni allo stadio 2-330 di Bownes per osservare le aste alla cellularizzazione dopo lo stress termico a 32 °C).
- Utilizzare i controlli del microneedle per portare l'ago nello stesso piano focale degli embrioni.
NOTA: Se il microneedle cattura il coperchio durante lo spostamento dello stadio o del microneedle, il microneedle è troppo vicino allo scivolo e non si trova nel piano focale corretto. Il microneedle deve essere parallelo al coverslip e non ad un angolo significativo (Figura 1, fase 7). - Inserire il microneedle nell'embrione in modo che colpisca l'embrione al centro della sua regione ventrale, all'embrione "equatore". Innesco dell'iniezione con il pedale o il pulsante "iniettare" quando la punta del microneedle è visibile all'interno del centro dell'embrione (Figura 1, fase 7).
- Iniettare il G-actinRed una volta e rimuovere lentamente il microneedle. Spostare lo stadio e ripetere per ogni embrione dello stadio di sviluppo appropriato.
NOTA: L'espansione dell'embrione è normale in quanto il rosso G-actina viene iniettato e un po 'di citoplasma può fuoriuscire dall'embrione. - Dopo che tutti gli embrioni sono stati iniettati, posizionare lo scivolo con gli embrioni nella camera di incubazione umida preparata e chiudere il coperchio(Figura 1,fase 8). Se si cerca di ottenere embrioni che raggiungono la cellularizzazione, il calore stressa gli embrioni a 32 °C per 60-75 min nella camera di incubazione umida.
NOTA: Si notano tempi di incubazione che consentono la visualizzazione delle aste negli embrioni stressati dal calore cellularizzanti. Il tempo di incubazione sarà più lungo per gli embrioni di controllo dello stress non termico perché lo sviluppo sarà più lento a una temperaturainferiore 31. Questi embrioni di controllo possono essere incubati in camere umide a temperature come 18 °C o 25 °C, a seconda della progettazione dell'esperimento specifico e della domanda da fare. Il tempo minimo di incubazione necessario affinché il G-actinRosso si disffondono in tutto l'embrione è di 30 minuti.
5. Aste di actina dell'immagine in embrioni stressati dal calore mediante microscopia confocale
- Mentre gli embrioni sono stressati dal calore, accendere il microscopio confocale e selezionare il canale laser a 561 nm.
- Spostare l'obiettivo (25x, 40x o 63x consigliato) nella posizione di lavoro.
- Se si imaging embrioni stressati dal calore, impostare l'incubatore di stadio riscaldato per raggiungere una temperatura interna di 32 °C. Un termometro point-and-shoot o infrarosso può essere utilizzato per controllare la temperatura a o vicino all'obiettivo.
- Rimuovere lo scivolo con embrioni iniettati dalla camera di incubazione umida al termine dell'incubazione(Figura 1,fase 9).
- Lavorando rapidamente, indiscrere delicatamente i pezzi di nastro a doppia mano utilizzati per aderire al coverslip con embrioni montati allo scivolo (Figura 1, fase 9).
ATTENZIONE: Sii gentile durante questi passaggi poiché i coprispasmi possono facilmente frantumarsi se viene applicata troppa forza. - Attaccare insieme due pezzi lunghi 2,5 cm di nastro a doppia mano e tagliare il nastro a metà longitudinalmente per realizzare due strisce, lunghe 2,5 x 0,5 cm(Figura 1,passo 10).
- Attaccare due terzi della lunghezza di ogni striscia di nastro sul primo coverslip, fiancheggiando ogni lato degli embrioni nell'olio di Alocarbonio 27(Figura 1,passo 10, arancione),lasciando un terzo delle strisce di nastro appese al bordo del primo coverslip dove gli embrioni sono bloccati. Usa le mani guantate e fai attenzione a non toccare gli embrioni durante questo passaggio.
- Posizionare delicatamente un secondo coverslip rettangolare sopra le strisce di nastro per inserire gli embrioni tra le copertine(Figura 1,passo 10, blu). Allineare i bordi di 25 mm ma mantenere i bordi di 50 mm sfalsati l'uno dall'altro di 1 cm di larghezza.
NOTA: La superficie completa di questo secondo coverslip diventerà la nuova superficie di imaging che affronterà l'obiettivo, quindi fai attenzione a non ottenere impronte digitali o olio di Alocarbonio 27 su questa seconda superficie di coverslip. L'offset è necessario in modo che sia possibile aggiungere olio extra di Alocarbonio 27 per immergere uniformemente gli embrioni. Se necessario, aggiungere l'olio di Alocarbonio 27 nella cucitura in cui i due copriscili si incontrano nella parte superiore del panino e rivestirà gli embrioni per azione capillare (vedi linee tratteggiate nella Figura 1, fase 10). - Toccare delicatamente le aree del coverslip che si trovano direttamente sopra le strisce di nastro con il lato smussato di un razorblade per ottenere il coverslip per aderire al nastro.
- Capovolgere il sandwich di coverslip e posizionarlo su un tergicristallo di laboratorio per mantenere pulita la superficie di imaging e portarlo al microscopio confocale (Figura 1, passo 11). Assicurarsi che il nastro sia completamente attaccato a entrambe le copertine prima dell'imaging.
- Verificare che lo stadio riscaldato sia a temperatura e, se si utilizza un microscopio invertito, aggiungere liquido ad immersione sull'obiettivo selezionato.
- Posizionare il sandwich di copra sul palco con attenzione per assicurarsi che la nuova superficie di imaging (2 ° coverslip) sia quella che tocca il liquido ad immersione(Figura 1,fase 11).
NOTA: Se necessario, aderire al sandwich di coverlip al palco con due piccoli pezzi di nastro a doppia faccia per evitare movimenti inutili durante l'imaging se i coprispavimenti non si adattano bene allo stadio riscaldato. - Concentrarsi su un embrione in cellularizzazione (Bownes stage 4a30) o sullo stadio di sviluppo desiderato utilizzando luce trasmessa o fluorescenza.
- Una volta che un embrione è stato messo a fuoco, passare alla modalità di acquisizione laser sul microscopio confocale e regolare la potenza e il guadagno laser, le dimensioni del fotogramma, la piastrellatura e le impostazioni di proiezione a piacere.
- Guarda le immagini della vista superficiale attraverso i piani focali dei nuclei dell'embrione per trovare barre di actina intranucleari. Le aste devono apparire in più orientamenti come striature o punti luminosi all'interno dei nuclei relativamente scuri (Figura 2A, 2C).
6. Esperimenti di imaging alternativi
- Eseguire FRAP per studiare il turnover dell'actina lungo la lunghezza delle aste di actina intranucleare o nelle strutture dell'actina citoplasmatica, come le punte dei solchi della membrana plasmatica durante la cellularizzazione.
- Nel software di imaging, scegliere una regione rettangolare attorno a punte di solco o aste actin in cui acquisire l'esperimento.
- Scegliere una piccola regione quadrata al centro di un'asta actina all'interno della regione di acquisizione rettangolare per sbiancare. Assicurarsi che le punte dell'asta actina siano visibili e non vengano sbiancate nel corso dell'esperimento per consentire un tracciamento accurato dell'asta all'interno del nucleo.
- Impostare il laser a candeggina per iterare 50x e impostare la potenza laser della candeggina al massimo.
- Scegli un percorso orario per acquisire immagini ogni secondo per un totale fino a 120 s alla massima velocità di abitare dei pixel e imposta il laser per sbiancare dopo i primi due secondi di acquisizione dell'immagine.
- Quantificare i dati per determinare l'half-time del recupero della fluorescenza1.
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Representative Results
Un flusso di lavoro schematico di gestione degli embrioni è illustrato nella figura 1e un calendario per un esperimento tipico è presentato nella tabella 1. Una stima per un buon risultato sperimentale è che per ogni 10 embrioni iniettati, almeno la metà degli embrioni visualizzati sarà nella fase di sviluppo corretta, integra, e mostrerà una ROBUSTA ASR con stress termico a 32 °C. Questo ASR sarà evidenziato dall'assemblaggio di barre di actina intranucleare, come mostrato nell'immagine rappresentativa della vista superficiale di un embrione nella figura 2A (pannello destro). Le aste actin appariranno in diversi orientamenti (paralleli o perpendicolari al piano di imaging) all'interno dei nuclei e possono essere immagini attraverso diversi piani focali. In confronto, gli embrioni di controllo incubati a 18 °C non mostrerà aste di actina(Figura 2A,pannello sinistro). La percentuale di nuclei contenenti aste può essere quantificata, come illustrato nella figura 2B. Inoltre, gli esperimenti FRAP possono essere eseguiti su barre(figura 2C). Nella figura 2Dviene illustrato un metodo di quantificazione suggerito per i dati FRAP in1 e un esempio di grafico di recupero della fluorescenza per una regione sbiancata rispetto a quella non sbiancante di un'asta di actina .
Se un embrione è gravemente danneggiato dall'iniezione o diventa troppo asciutto durante l'esperimento, potrebbe essere osservata l'ascinchronia mitotica e la cellularizzazione verrà interrotta. A volte, le aste potrebbero non essere visibili a causa dell'incapacità di ottenere abbastanza actina iniettata nell'embrione. In tal caso, assicurarsi che la quantità di G-actinaRossa iniettata sia di 500 pL (misurata con un micrometro nel passaggio 4.5) e confermare che questa quantità rimane coerente tra gli embrioni facendo un'iniezione di prova nell'olio circostante per verificare la dimensione della bolla rossa G-actina tra ogni microiniezione dell'embrione. Inoltre, per garantire la visualizzazione dell'asta, lavorare rapidamente per aggiungere il coverslip e spostare gli embrioni allo stadio del microscopio riscaldato una volta prelevati dalla camera umida nel passaggio 5.4, poiché l'assemblaggio dell'asta è reversibile1 e le aste possono smontare se gli embrioni vengono mantenuti a una temperatura inferiore a 32 °C per più di 30 minuti.
Figura 1: Panoramica schematica della manipolazione degli embrioni durante l'esperimento. (1) Le mosche adulte nelle tazze di raccolta degli embrioni depongono embrioni sulle piastre di agar del succo di mela. (2) Gli embrioni vengono dechorionati con acqua distillata 1:1, versati in un cesto di raccolta e accuratamente lavati con acqua distillata per rimuovere candeggina e detriti. (3) Gli embrioni vengono trasferiti con un pennello su un cuneo rettangolare di succo di mela agar su uno scivolo e disposti sui loro lati, testa a coda, con regione dorsale rivolta verso il bordo dell'agar. (4) Una regione di 5 x 50 mm di una coverslip di vetro (arancione) è rivestita con "colla embrionale" e pressata delicatamente sulla fila di embrioni disposti sull'agar per aderiscerli alla coverlip. (5) Il coverslip con embrioni è invertito in modo che gli embrioni si affrontino. Gli embrioni vengono essiccati in un barattolo superiore a vite. (6) Subito dopo l'essiccazione, la coverslip viene attaccata a una diapositiva, gli embrioni rivolti verso l'alto e gli embrioni sono ricoperti di olio di Alocarbonio 27. (7) Un microneedle precedentemente caricato con G-actinRed preparato viene utilizzato per effettuare una singola iniezione al centro della regione ventrale di ciascun embrione, con ago posizionato parallelamente al coverslip. ( 8 ) Dopo l'iniezione, gli embrionivengonoincubati all'interno di una piastra di Petri umidificata con tergicristalli umidi di laboratorio alla temperatura di controllo (18 °C) o con stress termico (32 °C). (9) Dopo l'incubazione, il coperchio con gli embrioni su di esso viene rimosso dalla diapositiva. (10) Due pezzi di nastro a doppia mano sono stratificati uno sopra l'altro, affettati a metà longitudinalmente e posizionati su entrambi i lati dell'olio che circonda gli embrioni sul primo copripazzo. Un secondo coverslip (blu) viene posizionato sopra il primo per creare una nuova superficie di imaging, offset in modo che lasci uno spazio per aggiungere più olio per coprire gli embrioni se necessario. (11) Se si imaging su un microscopio confocale invertito, il sandwich di coverlip viene invertito in modo che il secondo coverslip affronti l'obiettivo. L'imaging viene eseguito in una camera incubata e le aste di actina vengono visualizzati su diversi piani focali dei nuclei di ogni embrione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Risultati rappresentativi delle barre di actina negli embrioni stressati dal calore. (A) Le aste di actina non sono viste in un embrione che è stato incubato alla temperatura di controllo di 18 °C (pannello sinistro), ma si vedono nei nuclei di un embrione che è stato stressato dal calore a 32 °C (pannello destro). (B) Quantificazione della percentuale di nuclei con barre di actina provenienti da un esperimento rappresentativo. Ogni punto rappresenta un embrione in cui aste e nuclei sono stati contati nell'intera regione immagine (n = 22 embrioni a 18 °C; n = 23 embrioni a 32 °C; le barre di errore mostrano una deviazione standard). Il test t di uno studente, con una varianza disuguale assunta, è stato utilizzato per calcolare il valore p. (C) Una serie di tempo rappresentativa mostra FRAP su un'asta actin. La porzione dell'asta che è stata sbiancata è indicata da una punta di freccia bianca. La pre-candeggina è di 2 s prima della fase di candeggina. Time = 0 s è il gradino della candeggina e il recupero della fluorescenza è stato monitorato fino a 60 s post candeggina. (D) Un grafico mostra la dinamica di recupero della fluorescenza dell'actina in una regione sbiancata di un'asta, rispetto a una regione non sbiancante nella stessa asta. Le aste sono notevolmente stabili e agire al loro interno non fa turnover. Pertanto, non si vede alcun recupero. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Flusso di lavoro sperimentale con orario suggerito. Questo calendario riassume il tempo previsto per completare ogni fase del protocollo.
| Ordine | Passo | Tempo richiesto per ogni passaggio | Descrizione |
| 1 | 1.1 | Con 5 giorni di anticipo | Crea gabbie per la raccolta degli embrioni. Versare i piatti di agar del succo di mela. |
| 2 | 1.2-1.3 | Con 2 giorni di anticipo | Alleva gabbie di raccolta con mosche adulte maschili e femminili. |
| 3 | 2.6 Nota | Con 1 giorno di anticipo | Tirare tubi capillari per realizzare microneedle. |
| 4 | 2.1-2.6 | 1 h | Prepara G-actin. |
| 5 | 3.1 | 30 min | Lascia che le mosche depongono le uova. |
| 6 | 3.2-3.10 | 15-30 min | Raccogliere, montare, essiccare gli embrioni. Coprire gli embrioni con olio. |
| 7 | 4.1 | 30 min in anticipo | Preparare camere di incubazione umide. |
| 8 | 4.2-4.4 | 1 min | Caricare il microneedle. |
| 9 | 4.5-4.10 | 10-20 min | Calibrare le dimensioni della bolla G-actina e iniettare embrioni. |
| 10 | 4.11 | 30 min-1+ h | Incubare/riscaldare gli embrioni di stress. |
| 11 | 5.1-5.3 | 1 h in anticipo | Attivare il microscopio e la fase di incubazione. |
| 12 | 5.4-5.10 | 5 min | Embrioni sandwich tra le copertine per l'imaging. |
| 13 | 5.11-6.6 | 15 min-1+ h | Immagine di barre di actina intranucleare negli embrioni. |
Tabella 2: Suggerimenti per la risoluzione dei problemi. In questa tabella vengono fornite suggerimenti per la risoluzione dei problemi per il completamento del protocollo.
| Problema potenziale | Suggerimenti |
| Le mosche non depongono abbastanza embrioni. | Impostare la tazza con almeno 5 giorni di anticipo (fare riferimento ai passaggi 1.1-1.3). Cambiare le piastre 3 volte al giorno prima dell'esperimento per incoraggiare la deposizione delle uova. Lascia che le mosche depongono gli embrioni per 1 h invece di 30 minuti. Alleva tazze con mosche giovani adulte. |
| Nessun G-actin viene espulso dal microneedle. | Aumentare le impostazioni di pressione e tempo sul microiniettore. Rompere ulteriormente la punta del microneedle (fare riferimento al passaggio 4.5 Nota). Poiché gli zoccoli principali potrebbero non essere chiari, caricare un nuovo ago. |
| Difficile calibrare una dimensione della bolla abbastanza piccola. | Regolare le impostazioni di pressione e tempo (fare riferimento al passaggio 4.5). Poiché l'apertura della punta del microneedle potrebbe essere troppo grande, caricare un nuovo ago. |
| Gli embrioni rilasciano dalla colla sul copripata durante l'iniezione. | Regolare la consistenza della "colla embrionale" per le copertine future aggiungendo più nastro a doppia parte alla soluzione di eptano (fare riferimento al passaggio 3.5 Nota). |
| Gli embrioni si asciugano durante l'incubazione della temperatura. | Assicurarsi che lo scivolo sia livellato nella camera di incubazione (fare riferimento al passaggio 4.11) e che l'olio non tocchi nulla che possa allontanarlo. Aggiungere gocce di olio extra agli embrioni. Ridurre il tempo di essiccazione pre-iniezione (fare riferimento al passaggio 3.8). |
| L'olio non copre completamente gli embrioni tra il primo e il secondo coverslips. | Aggiungere olio extra tramite azione capillare al piccolo spazio tra i copripavimenti (fare riferimento al passaggio 5.8 Nota). |
| Le barre di actina intranucleare non sono visibili negli embrioni stressati dal calore. | Iniettare un volume maggiore di G-actin (fare riferimento al passaggio 4.5). Verificare che la temperatura sia dell'incubazione post-iniezione (fare riferimento al passaggio 4.11) che della camera di imaging sia di 32 °C (fare riferimento al passaggio 5.3). |
| Grandi bolle di G-actina sono visibili intorno al sito di iniezione degli embrioni. | Iniettare un volume minore di G-actina (fare riferimento al passaggio 4.5). Aumentare il tempo di essiccazione dell'embrione per promuovere una migliore ritenzione dell'actina iniettata all'interno dell'embrione (fare riferimento al passaggio 3.8). |
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Discussion
Il significato di questo metodo è che utilizza il protocollo ben consolidato di microiniezione negli embrioni di Drosophila 21,22, 23,24,25,26,27 per consentire nuove ricerche riguardanti l'ASR e l'assemblaggio dell'asta di actina di accompagnamento. Uno dei principali vantaggi dell'iniezione di G-actinRed in embrioni vivi è che l'ASR può essere studiato in una varietà di contesti. Per studi futuri, questi contesti possono includere l'iniezione di embrioni di altri genotipi come parte di uno schermo mutante o l'esposizione di embrioni iniettati a diverse condizioni di stress, come lo stress ossidativo4,32. Sebbene non descritta in dettaglio qui, questa tecnica di iniezione può anche essere modificata per iniettare acidi nucleici, altre proteine, farmaci e coloranti indicatori (per esempio,vedi 21,22,23,24,32) per studiare l'ASR. Pertanto, questo metodo presenta una serie di approcci per identificare la gamma di sollecitazioni che inducono ASR, caratterizzando ulteriormente le risposte cellulari durante l'ASR (ad esempio cambiamenti nell'attività mitocondriale) e scoprendo nuove molecole e meccanismi alla base dell'assemblaggio dell'asta di actina intranucleare.
Alcune fasi critiche del protocollo includono le seguenti: nella fase 3.8, gli embrioni devono essere adeguatamente essiccati per garantire un'iniezione di successo e la migliore salute degli embrioni. Il tempo di essiccazione dipenderà dalla temperatura e dall'umidità ambiente del laboratorio, quindi si consiglia di praticare prima il montaggio, l'essiccazione e le iniezioni con un tampone di pH neutro per stabilire questo parametro per la manipolazione degli embrioni. Nella fase 4.5, le impostazioni di microneedle e iniezione devono essere ottimizzate per consentire l'iniezione di abbastanza G-actinRosso negli embrioni. Se nell'embrione viene iniettato troppo poco G-actinRed, le aste di actina potrebbero non essere facilmente visualizzabili, poiché la formazione di aste di actina dipende dalla concentrazione di actinalibera 1. Inoltre, sarà difficile ottenere risultati coerenti dagli esperimenti FRAP se non c'è abbastanza G-actinaRosso iniettato, poiché l'intensità della fluorescenza non sarà abbastanza alta da superare la fluorescenza di fondo. Pertanto, è importante calibrare le dimensioni della bolla ogni volta che viene caricato e utilizzato un nuovo ago. G-actinRosso è viscoso e tende a ostruire all'interno del microneedle. A volte, questo può portare a iniettare quantità variabili di G-actina negli embrioni. Se il microneedle è intasato e la cancellazione del microriclo ad alta pressione si guasta, potrebbe essere necessario tentare di rompere ulteriormente la punta del microneedle o persino di caricare un nuovo microneedle e iniettare una nuova serie di embrioni. Infine, nella fase 4.11, gli embrioni devono essere incubati a temperatura elevata e per un tempo sufficiente affinché l'ASR sia indotto e le asteformino 1. Le temperature di tutti gli incubatori devono essere costantemente monitorate, il tempo per trasferire embrioni dall'incubatore all'incubatore deve essere limitato e un timer deve essere utilizzato per tutte le incubazioni. Altri possibili problemi sono elencati nella tabella 2 con suggerimenti per la risoluzione dei problemi.
Una delle principali limitazioni di questo protocollo è che occorre prestare particolare attenzione a preservare la salute degli embrioni durante le iniezioni, le incubazioni e l'imaging. Il protocollo è stato progettato per massimizzare la salute degli embrioni e, con una pratica significativa, un ricercatore può completare tutte le fasi del protocollo con lo sviluppo dell'embrione che progredisce alle velocità previste pertemperatura 31. Una seconda limitazione del protocollo è la necessità di un carro di microiniezione, che può essere abbastanza costoso e non è un'attrezzatura comune per ogni laboratorio di volo. Tuttavia, se un laboratorio adiacente è attrezzato per iniettare altri embrioni (ad esempio Xenopus,Zebrafish e Caenorhabditis elegans)o cellule aderenti, il sistema di iniezione utilizzato è probabilmente adatto per le iniezioni di Drosophila. In tal caso, solo la forma dell'ago deve essere adattata per gli embrioni di Drosophila secondo le linee guida del Pipette Cookbook29. In alternativa, ci sono alcune opzioni di micoiniettore meno costose sul mercato (ad esempio, microiniettori analogici), che possono ridurre significativamente il costo di assemblaggio di un impianto di iniezione.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono con gratitudine il lavoro di Liuliu Zheng e Zenghui Xue, che hanno contribuito a pioniere di questa tecnica nel laboratorio Sokac, così come Hasan Seede che ha aiutato con l'analisi. Il lavoro per questo studio è finanziato da una sovvenzione di NIH (R01 GM115111).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore-Sigma | A23835G | Component of G buffer |
| Apple juice, Mott's, 64 fl oz | Mott's | 014800000344 | Component of apple juice plates |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Component of apple juice plates |
| Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite | KIK International | 059647210020 | For dechorionating embryos |
| Calcium chloride | Millipore-Sigma | C1016500G | Component of G buffer |
| Cell strainer, 70 μm | Falcon | 352350 | For collecting dechorionated embryos |
| Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan | Zeiss | 0000001994956 | For imaging intranuclear actin rods |
| Desiccant | Drierite | 24001 | For desiccating embryos |
| Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom | Zeiss | 4350649000000 | For arranging embryos on agar wedge |
| Dissecting needle, 5 in | Fisher Scientific | 08965A | For arranging embryos on agar wedge |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP1725 | Component of G buffer |
| Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in | 3M | 021200010323 | For making embryo glue |
| Embryo collection cage | Genessee Scientific | 59100 | For housing adult flies and collecting embryos |
| Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72701D | For arranging embryos on agar wedge |
| Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm | World Precision Instruments, Inc. | TW1004 | For microneedles |
| Halocarbon oil 27 | Millipore-Sigma | H8773100ML | For hydration of embryos |
| Heated stage incubator | Zeiss | 4118579020000, 4118609020000, 4118609010000 | For confocal imaging |
| Lab Tissue Wipers, KimWipes | Kimberly-Clark | 34155 | Lab tissue wipers |
| Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished | Zeiss | Discontinued | Injection microscope |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Millipore-Sigma | H36471KG | Component of apple juice plates |
| Microinjector, FemtoJet4x | Eppendorf | 5253000025 | Microinjector |
| Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 μL | Eppendorf | 5242956003 | For loading microneedles |
| Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment | Bernard Instruments, Inc (Houston, TX) | Custom | For performing microinjections |
| Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown | Sutter Instruments | P97 | For pulling capillary tubes to make microneedles |
| Microscope cover glass 24x50-1.5 | Fisher Scientific | 12544E | For mounting embryos |
| Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm | Fisher Scientific | 22037081 | For mounting embryos for injection |
| n-Heptane | Fisher Scientific | H3601 | Component of embryo glue |
| Objective, 10x | Zeiss | Discontinued | 10x objective for injection microscope |
| Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS | Zeiss | 4217679971711 | 40x water objective for confocal |
| Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm) | Zeiss | 4208529871000 | 25x mixed immersion objective for confocal |
| Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA | Zeiss | 4207829900799 | 63x oil objective for confocal |
| Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2 | Daler-Rowney | 038372016954 | For transferring embryos |
| Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white | Kimberly-Clark | 884266344845 | For blotting cell strainer |
| Pasteur pipette, 5 3/4 in | Fisher Scientific | 1367820A | For covering embryos with oil |
| Petri dish, glass, 100 x 20 mm | Corning | 3160102 | For humid incubation chamber |
| Petri dish, plastic, 60 x 15 mm | VWR | 25384092 | For apple juice plates |
| Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 μL | Eppendorf | 2231000604 | For loading the microneedle |
| Pipette tip, xTIP4 250 μL | Biotix | 63300006 | For adding embryo glue to coverslip |
| Razor blade | VWR | 55411050 | For cutting agar wedge, tape, pipette tips |
| Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4x10 μg) | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | G-actin^Red |
| Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps | Fisher Scientific | 033377 | For making embryo glue |
| Screw top jar, 16 oz | Nalgene | 000194414195 | For desiccating embryos |
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 602104PG | For calibrating volume of G-actin injection |
| Sucrose | Millipore-Sigma | 840971KG | Component of apple juice plates |
| Trizma base | Millipore-Sigma | T15031KG | Component of G buffer |
| Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz | Lesaffre Yeast Corporation | 117929157002 | Component of yeast paste |
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