Summary
이 프로토콜의 목표는 열 응력에 따라 드로소필라 배아및 이미지 내 핵 액틴 로드 어셈블리에 로다민-컨쥬게이드 구형 액틴을 주입하는 것입니다.
Abstract
이 프로토콜의 목적은 열 응력에 따라 살아있는 Drosophila 멜라노가스터 배아에서 조립되는 핵 액틴 막대를 시각화하는 것입니다. 액틴 로드는 신경 퇴행성 질환을 포함한 인간의 병리학과 함께 제공되는 보존되고 유도할 수 없는 액틴 스트레스 반응(ASR)의 특징입니다. 이전에, 우리는 ASR이 태아 발달의 형태 발생 실패 및 감소된 생존에 기여한다는 것을 보여주었습니다. 이 프로토콜은 이미징, 유전학 및 생화학에 매우 순종하는 모델 시스템에서 근본적인 actin 막대 조립 및 ASR 메커니즘의 지속적인 연구를 허용합니다. 배아는 주사를 준비하기 위해 커버슬립에 수집되고 장착됩니다. 로다민-컨쥬게이드 구형 액틴(G-actinRed)은희석되어 마이크로니들로 적재된다. 단일 주사는 각 태아의 중심으로 이루어집니다. 주사 후, 배아는 높은 온도에서 배양되고 핵 내 액틴 막대는 공초점 현미경 검사법에 의해 시각화됩니다. 광표백 후형화 회복(FRAP) 실험은 액틴 봉상에서 수행될 수 있다; 및 세포질에 있는 그밖 액틴이 풍부한 구조물은 또한 심상일 수 있습니다. 우리는 G-actin빨간 내인성 G-actin 같이 중합하고, 그 자체로, 일반적인 배아 발달을 방해하지 않는다는 것을 것을을 발견합니다. 이 프로토콜의 한 가지 제한은 태아에 심각한 부상을 피하기 위해 주입 중에주의를 기울여야한다는 것입니다. 그러나, 연습으로, Drosophila 배아에 G-액틴레드를 주입하는 것은 actin 막대를 시각화하는 빠르고 신뢰할 수있는 방법이며, 쉽게 어떤 유전자형의 파리또는 저산소증과 산화 스트레스를 포함한 다른 세포 스트레스의 도입과 함께 사용할 수 있습니다.
Introduction
이 프로토콜은 유도할 수 없는 액틴 응력 반응(ASR)1을겪고 있는 열 응력 배아에서 핵액틴 봉의 조립을 시각화하기 위해 G-actinRed를 주입하는 방법을 설명합니다. 우리는 배아에서 성기능 장애를 일으키고 생존력을 감소시키는 ASR의 연구를 돕기 위해 이 프로토콜을 개발했으며, 성인 인간 세포 유형은 신부전2,근육 근병증3,알츠하이머 및 헌팅턴병4,5,6,7,8을포함한 병리와 관련이 있다. 이러한 ASR은 열 충격9,10,11,산화 스트레스4,6,감소된 ATP 합성12,비정상적인 헌팅틴 또는 β-아밀로이드 올리고머화4,5,6,7,9,13,14, 15,16을포함한 수많은 세포응력에의해 유도된다. ASR의 특징은 반응하는 세포의 세포질 또는 핵에서 비정상적인 액틴 봉의 조립으로, 이는 작용 단백질, 코필린1,5,6,10의스트레스 유발 과잉 활성화에 의해 구동된다. 안타깝게도 ASR에 대한 주요 지식 격차는 여전히 남아 있습니다. 예를 들어 액틴 로드의 기능은 알려져 있지 않습니다. 우리는 왜 막대가 몇몇 세포 모형의 세포질에서 형성하는지 이해하지 않습니다, 그러나 그 외의 핵. ASR이 스트레스를 받고 있는 세포 또는 배아에 대한 보호또는 적응력이 있는지도 분명하지 않습니다. 마지막으로, 우리는 여전히 Cofilin 하이퍼 활성화 또는 액틴 로드 어셈블리의 기본 상세한 메커니즘을 모른다. 따라서, 이러한 프로토콜은 살아있는 과일 플라이 배아의 고도로 인가가능한 실험 시스템에서 액틴 로드 형성 및 역학을 시각화하여 ASR을 조사하는 신속하고 다재다능한 분석법을 제공한다.
살아있는 Drosophila 배아로 G-actinRed를 마이크로젝트하는 프로토콜은 조직 건물 이벤트 도중17의 일반적인 세포질 액틴 구조물의 역학을 연구하기 위하여 처음에 개발되었습니다. 그 연구 결과에서, 우리는 G-actin적부분이 세포동체증 또는 위화17,18을포함하여 태아의 초기 발달 과정에 부정적인 영향을 미치지 않았다는 것을 것을을 발견했습니다. 그런 다음 프로토콜을 수정하여 ASR1을겪고 있는 열 스트레스 배아에서 액틴 봉의 이미징을 허용하기 위해 배아 처리 및 G-actin적주입을 조정한다. G-actin빨간 주입 외에 다른 방법은 배아에서 액틴을 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 방법은 유트로핀-mCherry, Lifeact, F-로틴-GFP 및 모에신-GFP(19에서 검토됨)와 같은 액틴 결합 단백질의 영역또는 액틴 결합 단백질의도메인에 태그된 형광 단백질(FPs)을 발현하는 데 의존합니다. 그러나, 이러한 FP 프로브를 사용하면 일부 액틴 구조를 안정화하거나 방해할 수 있기 때문에 주의가 필요하며, 모든 액틴구조(20)를동등하게 라벨화하지 않으며, 액틴-GFP의 경우 스트레스 의존일뿐만 아니라 액틴 농도의존도 1인로드 어셈블리의 분석에 문제가 된다. 따라서, G-actinRed는 플라이 배아에서 막대 연구를 선호하는 프로브이며, 배아의 큰 크기는 쉽게 주입할 수 있다.
이 프로토콜의 워크플로우는 단백질, 핵산, 약물 및 형광 지표를 Drosophila 배아21,22,23,24,25,26,27에주입하는 데 사용되어 온 다른 잘 확립된 미세 주입 기술과 유사합니다. 그러나, 여기서 G-actinRed의 미세 주입에 이어, 배아는 ASR 및 핵내 액틴 로드 조립을 유도하기 위해 온화한 열 응력에 노출된다. 파리와 사출 장비에 접근할 수 있는 실험실의 경우, 이 방법은 ASR과 관련하여 특정 연구 라인에 대해 쉽게 구현가능하고 적응할 수 있어야 하며, 여기에는 다른 스트레스 또는 뚜렷한 유전 적 배경의 변조에 의한 유도가 포함됩니다.
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Protocol
1. 배아 수집 컵과 사과 주스 천 접시 준비
- 주사 실험 5일 전에,28개를 구성하거나 적어도 2개의 작은 배아 수집 컵을 조달한다. 작은 컬렉션 컵28에사용할 신선한 60mm 사과 주스 한천 접시를 확인합니다. 4 °C에서 젖은 종이 타월로 덮인 플라스틱 상자에 접시를 보관하십시오.
참고: 1.3단계에서 설명된 플라이 번호로 채워진 작은 배아 수집 컵은 실험당 충분한 배아 수를 제공하는 동시에 조기 발달 단계의 이미징을 허용하기에 충분한 시간 안에 배아 처리 및 주사를 수행할 수 있도록 보장합니다. - 사과 주스 접시를 18°C로 데우고 접시 중앙에 효모 페이스트를 넣습니다. 효모 페이스트는 활성 효모와 증류수의 간단한 페이스트입니다.
- 가장 관대한 계란 누워를 촉진하기 위해, 실험 2 일 전에 파리와 함께 수집 컵을 설정합니다. 적어도 100 암컷과 50개의 수컷 파리를 컬렉션 컵에 넣고, 준비된 사과 주스플레이트(그림 1,1단계)를얹습니다. 주사 실험으로 이어지는 날에는 사과 주스 접시를 하루에 적어도 두 번, 아침에 한 번, 저녁에 한 번 변경합니다.
참고: 배아 수집 컵이 18°C에서 12h 의 빛 온/라이트 오프 사이클로 유지될 때 최상의 주사 및 이미징 결과를 얻을 수 있습니다.
2. 미세 주입을 위한 G-액틴레드의 작업 재고 솔루션 준비
참고: 이 준비는 G-actinRed의5 mg/mL 작업 재고의 2 μL만 하므로 사용자가 미세 주입 기술에 익숙하지 않은 경우 3단계로 건너 뛰고 중립 pH 버퍼로 미세 주입을 연습하여 귀중한 작업 재고를 보존하는 것이 유리합니다. 공급 업체에서 G 액틴레드의 10 μg 스톡은 최대 6 개월 동안 4 ° C에서 건조제의 ~ 500 g와 16 온스 나사 상단 병에 원래 포장에 저장할 수 있습니다.
- 5m Tris-HCl, 0.2 mM CaCl2,pH 8.0 : 사전에 G 버퍼 스톡 솔루션을 준비합니다. 실온에서 필터링하고 보관하십시오.
- 주사 당일, 2.1단계에서 G 버퍼 스톡을 사용하여 얼음에 신선한 스냅 캡 마이크로센심분리기 튜브에 G 버퍼 작업 용액의 1mL을 준비하고, 표시된 최종 농도에서 다음과 같은 보완: 1 mM 디티오스레이톨(DTT) 및 0.2m ATP, pH 8.0.
참고: G 버퍼 작업 솔루션의 1mL 볼륨은 실험에 필요한 것보다 더 많지만 준비를 단순화합니다. 실험 후 초과를 버릴 수 있으며 사용자는 선호도에 따라 축소할 수 있습니다.- 얼음에 10 μg G-actin레드 스톡을 유지, 먼저 튜브 내부 G 액틴레드의 핑크 액적의 상단에 여과, 증류수 의 1 μL을 추가합니다.
- 다음으로, 2.2단계에서 차갑고 갓 준비된 G 버퍼 작업 용액의 1μL을 추가합니다. 파이펫 을 위아래로 ~ 20 번 파이프하여 파이펫 볼륨이 1 μL로 설정되어 잘 섞습니다. G-액틴레드 스톡은 이제 5 mg / mL의 최종 희석에있을 것입니다.
- 준비된 G-actinRed를 방해받지 않고 얼음에 30분 동안 배양합니다.
- 원심분리기는 마이크로센트심립분리기에서 4°C에서 20분 동안 16,000 x g에서 준비된 G-액틴레드를 제거하여 침전을 제거한다.
- 상피물의 1.5 μL을 얼음 위에 신선한 스냅 캡 마이크로센트심분리기 튜브에 조심스럽게 파이프하여 어두운 분홍색 펠릿을 피합니다.
- 준비된 G-actinRed 상체를 얼음에 최대 6시간 동안 보관하여 마이크로니들로 로드할 준비가 됩니다.
참고: 마이크로니들은 마이크로피펫 풀러에 미리 모세관 튜브에서 가져온 다음 100 x 20mm 페트리 접시에 있는 모델링 점토 스트립에 실온으로 보관할 수 있습니다. 마이크로니들 당기기에 대한 제안된 매개변수는 파이펫쿡북(29)에서찾을 수 있다.
3. 배아를 수집하고 주입을 위해 마운트
- 18 °C에서 효모 페이스트가있는 사과 주스 접시에 30 분 동안 파리가 배아를 놓을 수 있도록하십시오.
- 파리가 누워있는 동안, 실온에 효모 페이스트없이 사과 주스 마천 접시를 미리 따뜻하게, 면도날로 사과 주스 화분의 4cm x 1cm 직사각형 웨지를 잘라, 25mm x 75mm 유리 슬라이드에 배치.
- 수확플레이트는 신선한 표백제, 증류수로 1:1을 희석시켜 배아를 1분 동안 희석하고, 접시에 1분 동안 소용돌이치고,28(그림 1,2단계)에서기재하였다.
참고 : 표백제의 다른 브랜드는 다른 농도에서 판매됩니다. 여기서 사용되는 표백제는 병에서 6% 하이포염소산나트륨이며, 3%의 고가염소산나트륨의 최종 농도로 희석된다. 약간 낮은 농도의 다른 표백제 브랜드는 동등하게 잘 작동합니다. - 표백제와 점료 배아를 컬렉션 바구니(70 μm 세포 스트레이너)에 붓고 분출병에서 증류된 물로 접시를 두 번 헹구고, 이러한 세정을 수집 바구니에 추가합니다.
- 효모 덩어리가 보이지 않고 바구니가 종이 타월에 블랜트 할 때 여분의 표백제에서 분홍색 자국을 남기지 않고 증류수 바구니에 흩어져있는 배아를 적극적으로 헹구습니다.
- 수확플레이트는 신선한 표백제, 증류수로 1:1을 희석시켜 배아를 1분 동안 희석하고, 접시에 1분 동안 소용돌이치고,28(그림 1,2단계)에서기재하였다.
- 증류수로 감쇠된 강모가 있는 페인트브러시를 사용하여, 컬렉션 바구니에서 씻어낸 배아를 유리 슬라이드의 준비된 사과 주스 천 웨지로 옮겨 넣습니다.
- 직사각형 천 웨지(그림1,3단계)의긴 축을 따라 직선으로 10개의 배아를 정렬하기 위해 미세 팁 핀셋 또는 해부 바늘 쌍을 사용합니다. 배아를 머리대 꼬리로 배열하여 전방 기둥이 오른쪽으로 향하고 있고 등쪽측이 연구원을 마주하고있다(도 1,3단계, 확대).
- 면도날로 P200 파이펫 팁의 끝0.5cm를 잘라 "배아접착제"(28에설명)로 찍어 넣습니다. 24mm x 50mm 직사각형 커버슬립의 긴 가장자리를 따라 폭 5mm(그림1,4단계)를넉넉하게 코팅하고, 건조하고 접착제면을 위로 두십시오. 건조는 ~30s가 걸리며 전체 접착제 코팅 부위가 젖거나 반짝이지 않고 매트하게 나타나면 완료됩니다.
참고: 적어도 48시간 전에 "배아 접착제"를 준비하십시오. 28에설명된 대로 반짝이는 유리병에 양면 테이프 스트립에 n-Heptane을 추가합니다. - "배아 접착제"가 건조되면, 커버슬립 접착제 면을 한천에 정렬된 배아의 행 위에 부드럽게 놓고 덮개 슬립 가장자리와 배아 행 사이에 2-3mm의 공간을 남깁니다.
참고: 커버슬립의 가장자리에 너무 가까이 배아를 고집하면 실험 과정에서 배아가 너무 많이 건조될 수 있습니다. - 배아가 이제 향하고 있도록 커버 슬립을 뒤집습니다. 그들은 커버 슬립의 하나의 긴 가장자리를 따라 라인에 갇혀해야하며, 커버 슬립의 가장 가까운 가장자리를 향한 그들의 복부 영역(그림 1,단계 4, 확대).
- 16 온스 나사 상단 항아리에 저장된 신선한 파란색 건조제 150 g 위에 부드럽게 배아로 커버 슬립을 배치하여 배아를 desiccate. 뚜껑에 단단히 나사와 8-10 분 동안 인큐베이션(그림 1,단계 5).
- 건조 후, 디스칸트 항아리로부터 커버슬립을 제거하고 커버슬립의 각 짧은 면을 현미경 슬라이드로, 배아 측위로, 배아커버슬립이 주사 단계에 맞출 수 있도록 양면 테이프 2개(도 1,6단계)를제거한다.
- Halocarbon 27 오일 2-3 방울을 파스퇴르 파이펫으로 첨가하여 정렬된 배아를 덮고 추가 탈수로부터 보호합니다(그림1,6단계).
4. 액틴 로드 형성을 촉진하기 위해 스트레스 배아를 주입하고 가열합니다.
참고: 모든 주사는 18°C의 온도 조절실에서 수행됩니다.
- 유리 페트리 접시에서 습한 인큐베이션 챔버를 적어도 100mm x 20mm 크기로 준비하고 증류수로 감겨 실험실 조직 와이퍼의 트위스트와 챔버를 라인(그림 1,단계 8). 배아를 주입하기 전에 32°C 또는 원하는 배양 온도에서 인큐베이션 챔버를 미리 데우도록 합니다.
- 마이크로인젝터용 기류 밸브를 열고 마이크로인젝터를 켭니다(최소 90psi의 압력으로 압축공기 또는 집 공기가 적합).
- 배아가 건조되는 동안, 마이크로 로더 팁을 사용하여 이전에 준비된 G-actinRed 상판체를 마이크로니들로 백로드합니다. 파이펫을 설정하여 1-1.5 μL을 그립니다.
참고: 액틴의 점도 때문에 적재량이 정확하지 않을 수 있으며 적어도 1~2개의 마이크로니들을 로드하기에 충분한 액틴이 있을 수 있습니다. 마이크로니들을 제대로 보정하고 실험 과정에서 막히지 않으면 적재된 마이크로니들당 최대 60개의 배아를 주입할 수 있다. - 마이크로니들을 바늘 홀더에 부착하고 나사를 조입니다. 공기 튜브를 마이크로인젝터에 연결하고 마이크로니들의 역류 압력이 30hPa로 평형되는지 확인합니다.
- 마이크로인젝터 설정을 보정하여 슬라이드 마이크로미터에서 G-액틴 레드(~500pL)의 직경 100μm 버블을 추방합니다. 마이크로인젝터에 압력 노브(500-1500 hPa)와 사출 펄스 시간 노브(0.1-0.5s)를 회전하여 올바른 버블 크기를 얻습니다. 새로운 마이크로니즈가 적재될 때마다 이러한 설정을 조정하여 액틴 점도 및 마이크로니들 팁 크기의 변동성을 고려합니다.
참고: 준비된 G-actinRed는 점성이 있으며 배아를 주입하기 전에 추방되어야 하는 마이크로 니들 끝에 공기가 있을 수 있습니다. G-액틴레드가 마이크로니들 끝에서 쉽게 추방되지 않으면 마이크로니들 끝을 슬라이드 마이크로미터 가장자리로 부드럽게 부수십시오. - 장착된 배아를 장착한 슬라이드를 현미경 단계에 놓습니다.
참고: 모든 주사 설정 은 다를 것 이다, 그래서 연구원은 그에 따라 그들의 주입 방법을 조정 해야 합니다. 여기서 배아는 고정 마이크로니들과 관련하여 이동하여, 마이크로니들로 배아를 실행하여 각 배아를 주입한다. - 배아가 보이면 빛 현미경에 대한 10배 목표의 미세 조작기 단계와 초점을 조정합니다. 배아는 진동막의 윤곽이 가장 선명하고 태아가 가장 큰 것처럼 나타날 때 올바른 초점 평면에 있습니다. 올바른 발달 단계에 있는 배아를 선택하여, 주사 후 배양이 완료될 때까지 대부분의 클러치가 원하는 발달 단계에 도달하도록 한다(예를 들어, 32°C에서 열 응력 후 세포화에서 막대를 관찰하기 위해 Bownes의 스테이지 2-330단계에서 배아를 주입)한다.
- 마이크로니들 컨트롤을 사용하여 바늘을 배아와 동일한 초점 평면으로 가져옵니다.
참고: 마이크로니들스테이지 나 마이크로니들 이동 중 커버슬립을 잡는 경우 마이크로니들은 슬라이드에 너무 가깝고 올바른 초점 평면에 있지 않습니다. 마이크로니들은 커버슬립과 평행해야 하며, 유의한 각도가 없어야한다(도 1,7단계). - 배아 "적도"에서 복부 부위 의 중간에 있는 배아에 부딪히도록 마이크로니들(microneedle)을 배아에 삽입합니다. 마이크로니들 팁이 배아의 중간 내부에 보일 때 발 페달 또는 "주입" 버튼으로 주사를 유발합니다(도1,7단계).
- G-액틴레드를 한 번 주입하고 마이크로니들로 천천히 제거합니다. 적절한 발달 단계의 각 배아에 대해 스테이지를 이동하고 반복합니다.
참고: G-액틴레드가 주입되고 약간의 세포질이 배아에서 누출될 수 있기 때문에 배아의 팽창은 정상입니다. - 모든 배아가 주입된 후, 준비된 습한 배양실에 배아와 함께 슬라이드를 배치하고 뚜껑을닫습니다(도 1,8단계). 세포화에 도달하는 배아를 얻으려고 하면 습한 인큐베이션 챔버에서 60-75 분 동안 32 °C에서 배아를 응수합니다.
참고: 잠복기는 열 응압 배아세포화에서 막대의 시각화를 허용하는 것으로 지적된다. 인큐베이션 시간은 낮은온도(31)에서개발이 느려질 것이기 때문에 비열 응력 조절 배아의 경우 더 길어질 것이다. 이러한 대조군 배아는 특정 실험의 설계및 질문의 설계에 따라 18°C 또는 25°C와 같은 온도에서 습한 챔버에서 배양될 수 있다. G-액틴레드가 배아 전체에 확산되는 데 필요한 최소 잠복기시간은 30분이다.
5. 공초점 현미경 검사법에 의해 응모 배아의 이미지 액틴 봉
- 배아가 열 스트레스를 받고 있는 동안 공초점 현미경을 켜고 561 nm 레이저 채널을 선택합니다.
- 목표 렌즈(25배, 40배 또는 권장 63배)를 작업 위치로 이동합니다.
- 화상 진열이 배아를 강조하는 경우에, 32°C의 내부 온도를 달성하기 위하여 가열된 단계 인큐베이터를 설정합니다. 포인트 앤 슛 또는 적외선 온도계를 사용하여 목표 또는 그 근처에서 온도를 확인할 수 있습니다.
- 인큐베이션이 완료된 후 습한 배양실에서 주입된 배아로 슬라이드를 제거합니다(도1,9단계).
- 빠르게 작업하여, 장착된 배아로 커버슬립을 부착하는 데 사용되었던 양면 테이프 조각을 부드럽게 벗겨냅니다(그림1,9단계).
주의: 너무 많은 힘이 적용되면 커버립이 쉽게 산산조각날 수 있기 때문에 이러한 단계에서 부드럽게 하십시오. - 양면 테이프 2.5cm 의 긴 조각 2개를 함께 붙이고 테이프를 반으로 자르고 길이 2.5 x 0.5cm길이(그림 1,10)를만듭니다.
- 각 테이프 스트립의 길이의 3분의 2를 제1 커버슬립에 붙이고, 할로카본 27오일(도 1,10, 주황색)에서배아의 각 측면을 측면에 두어, 배아가 붙어 있는 첫 번째 커버슬립의 가장자리에 매달려 있는 테이프 스트립의 3분의 1을 방치한다. 장갑을 낀 손을 사용하고이 단계 동안 배아를 만지지 않도록주의하십시오.
- 테이프 스트립 위에 두 번째 직사각형 커버슬립을 부드럽게 놓아 커버립(도1, 10, 파란색)사이에배아를 끼게 합니다. 25mm 모서리를 정렬하지만 50mm 모서리가 서로 오프셋된 너비를 1cm 로 유지합니다.
참고 : 이 두 번째 커버 슬립의 전체 표면은 객관적인 렌즈에 직면 할 새로운 이미징 표면이 될 것입니다, 그래서이 두 번째 커버 슬립 표면에 지문이나 Halocarbon 27 오일을하지 않도록주의. 오프셋은 여분의 Halocarbon 27 오일을 첨가하여 배아를 균등하게 침전시킬 수 있도록 필요합니다. 필요한 경우 두 개의 커버립이 샌드위치 의 상단에 만나는 솔기에 Halocarbon 27 오일을 추가하고 모세관 작용으로 배아를 코팅합니다 (그림 1,10 단계에서파선 선 참조). - 면도날의 무딘 면이 있는 테이프 스트립 바로 위에 있는 커버슬립 영역을 부드럽게 탭하여 커버슬립을 테이프에 부착합니다.
- 커버슬립 샌드위치를 뒤집어 실험실 조직 와이퍼에 놓고 이미징 표면을 깨끗하게 유지하고 공초점 현미경으로 운반한다(도1,11 단계). 테이프가 이미징 전에 두 커버립에 완전히 고정되어 있는지 확인합니다.
- 가열 된 단계가 온도에 있는지 확인하고 반전 된 현미경을 사용하는 경우 선택한 목표 렌즈에 침지 액체를 추가하십시오.
- 새로운 이미징 표면(2nd 커버슬립)이 침수액(도 1,11)을터치하는 지 확인하기 위해 커버슬립 샌드위치를 신중하게 무대에 배치합니다.
참고: 필요한 경우 커버슬립 샌드위치를 두 개의 작은 양면 테이프로 무대에 부착하여 커버립이 가열된 스테이지에 잘 맞지 않으면 이미징 중에 불필요한 움직임을 방지합니다. - 세포화(Bownes Stage 4a30)또는 전달된 빛 또는 형광을 사용하여 원하는 발달 단계에 있는 태아에 초점을 맞춥니다.
- 배아가 집중되면 공초점 현미경의 레이저 획득 모드로 전환하고 레이저 전력과 게인, 프레임 크기, 타일링 및 프로젝션 설정을 원하는 대로 조정합니다.
- 배아 핵의 초점 평면을 통해 표면 보기를 통해 이미지를 사용하여 핵 내 액틴 봉을 찾습니다. 막대는 비교적 어두운핵(그림 2A, 2C)내부에 밝은 줄무늬 또는 점으로 여러 방향으로 나타나야 한다.
6. 대체 이미징 실험
- FRAP를 수행하여 세포화 시 플라즈마 멤브레인 고랑의 팁과 같은 핵 내 액틴 로드 또는 세포질 액틴 구조의 액틴 회전율을 조사한다.
- 이미징 소프트웨어에서 실험을 습득할 수 있는 고랑 팁 또는 액틴 로드 주변의 직사각형 영역을 선택합니다.
- 직사각형 획득 영역 내에서 액틴 로드 중심의 작은 사각형 영역을 선택하여 표백합니다. 액틴 로드의 끝이 보이고 실험 과정에서 표백되지 않도록 핵 내부의 막대를 정확하게 추적할 수 있도록 하십시오.
- 표백제 레이저를 50배 반복하여 표백제 레이저 전력을 최대로 설정합니다.
- 최대 픽셀 거주 속도에서 초당 최대 120초 동안 이미지를 획득하고 레이저를 이미지 수집 의 처음 2초 후에 표백하도록 설정하는 시간 코스를 선택합니다.
- 데이터를 정량화하여 형광 복구1의하프 타임을 결정합니다.
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Representative Results
배아 처리의 회로도 워크플로우가 도 1에묘사되고, 일반적인 실험을 위한 시간표는 표 1에제시된다. 좋은 실험 결과에 대한 추정은 주입된 10개의 배아마다, 조회된 배아의 적어도 절반은 올바른 발달 단계에 있을 것이고, 손상되지 않고, 32°C에서 열 응력으로 견고한 ASR을 나타낸다는 것입니다. 이러한 ASR은 도 2A(오른쪽 패널)에서 배아의 대표적인 표면 뷰 이미지에 도시된 바와 같이 핵내 액틴 봉의 조립에 의해 입증될 것이다. 액틴 로드는 핵 내부에 여러 방향(이미징 평면에 평행또는 수직)으로 나타나며 여러 초점 평면을 통해 이미지화될 수 있다. 이에 비해, 18°C에서 배양된 대조군 배아는 액틴로드(도 2A,좌판)를 표시하지 않는다. 막대를 함유하는 퍼센트 핵은 도 2B에서입증된 바와 같이 정량화될 수 있다. 또한, FRAP 실험은막대(도 2C)에서수행될 수 있다. FRAP 데이터에 대한 제안된 정량화 방법은1에서 참조되고 액틴 로드의 표백되지 않은 영역에 대한 형광 회수 플롯의 예가 도 2D에도시된다.
태아가 주사에 의해 심하게 손상되거나 실험 도중 너무 건조해지면, 미토성 비동기가 관찰될 수 있고 세포화는 중단될 것입니다. 때로는 배아에 충분한 액틴을 주입하지 못했기 때문에 막대가 보이지 않을 수 있습니다. 이 경우, 주입된 G-actinRed의 양이 500pL(단계 4.5에서 마이크로미터로 측정)인지 확인하고 각 배아 미세 주입 사이에 G-actin적기의 크기를 확인하기 위해 주변 오일에 시험 주사를 함으로써 배아 간에 일관된 상태를 유지한다는 것을 확인합니다. 또한, 로드 시각화를 보장하기 위해, 커버슬립을 추가하고 배아를 5.4단계에서 습한 챔버에서 가져온 후 가열된 현미경 단계로 빠르게 이동하며, 막대 조립이 가역1이고 배아가 30분 이상 32°C 미만의 온도에서 유지되면 막대가 분해될 수 있다.
그림 1: 실험 중 배아 처리에 대한 회로도 개요. (1)성인은 배아 수집 컵에 사과 주스 천접시에 배아를 낳는다. (2)배아는 1:1 표백제:증류수로 시료를 내리고, 수거 바구니에 붓고, 증류수로 철저히 세척하여 표백제와 이물질을 제거합니다. (3)배아는 페인트브러시로 슬라이드에 직사각형 사과 주스 천웨지로 옮기고, 향-투-테일, 등쪽으로 배열되어 있으며, 등쪽은 천의 가장자리를 향하고 있다. (4)유리 커버슬립(주황색)의 5 x 50mm 부위는 "배아 접착제"로 코팅되어, 한고에 배치된 배아의 행에 부드럽게 눌러 커버슬립을 부착한다. (5)배아가 마주볼 수 있도록 배아를 가진 덮개슬립이 반전된다. 배아는 나사 상단 항아리에 건조됩니다. (6)탈수 직후, 커버슬립은 슬라이드에 테이프로 붙이고, 배아는 위로 향하게 되고, 배아는 할로카본 27 오일로 덮여 있다. (7)이전에 준비된 G-actinRed로 로드된 마이크로니들은 각 배아의 복부 부위의 중심으로 단일 주사를 하는 데 사용되며, 바늘은 커버슬립과 평행하게 배치된다. (8)주사 후, 배아는 대조군 온도(18°C)에서 축축한 실험실 조직 와이퍼로 가습된 페트리 접시 내부 또는 열 응력(32°C)으로 배양된다. (9)배양 후 배아를 가진 커버슬립이 슬라이드에서 제거된다. (10)양면 테이프 2개가 서로 겹쳐서 반으로 슬라이스하고, 제1 커버슬립의 배아를 둘러싼 오일의 양쪽에 놓습니다. 두 번째 커버슬립(파란색)은 첫 번째 커버슬립(blue)을 위에 배치하여 새로운 이미징 표면을 생성하고, 필요에 따라 배아를 커버하기 위해 더 많은 오일을 첨가할 간격을 둡니다. (11)반전된 공초점 현미경에 이미징하는 경우, 커버슬립 샌드위치는 반전되어 두 번째 커버슬립이 목표에 직면하게 된다. 이미징은 배양 된 챔버에서 수행되며 액틴 막대는 각 배아의 핵의 여러 초점 평면에 걸쳐 시각화됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 열 스트레스 배아에서 액틴 봉의 대표적인 결과. (A)액틴 막대는 18°C(좌판)의 대조군 온도에서 배양된 배아에서 볼 수 없지만, 32°C(오른쪽 패널)에서 열응을 받은 배아의 핵에서 볼 수 있다. (B)대표적인 실험으로부터 액틴 봉을 가진 핵의 백분율을 정량화한다. 각 점은 막대와 핵이 전체 이미지 부위에서 계산된 하나의 배아(n = 22 배아 18°C; n = 23배32°C; 오류 막대는 표준 편차를 나타낸다). 동일하지 않은 분산이 가정된 학생의 t-test가 p 값을 계산하는 데 사용되었습니다. (C)대표적인 타임 시리즈는 액틴 로드에 FRAP를 표시합니다. 표백된 막대의 부분은 흰색 화살촉으로 표시됩니다. 사전 표백제는 표백제 단계 전에 2 s입니다. 시간 = 0s는 표백제 단계이며, 형광 회수는 60 초 표백제까지 추적되었다. (D)플롯은 동일한 막대의 표백되지 않은 부위에 비해 막대의 표백 된 영역에서 액틴 형광에 대한 복구 역학을 나타낸다. 막대는 현저하게 안정적이며 그 안에 액틴이 회전하지 않습니다. 따라서 복구가 보이지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 제안된 시간표가 있는 실험 워크플로우입니다. 이 시간표는 프로토콜의 각 단계를 완료하는 데 걸리는 예상 시간을 요약합니다.
| 순서 | 단계 | 각 단계에 필요한 시간 | 설명 |
| 1 | 1.1 | 5일 전 | 배아 수집 케이지를 만듭니다. 사과 주스 에이마 접시를 붓습니다. |
| 2 | 1.2-1.3 | 2일 전 | 성인 남성과 여성 파리컬렉션 케이지를 설치합니다. |
| 3 | 2.6 참고 | 1일 전 | 마이크로 니들을 만들기 위해 모세관 튜브를 당깁니다. |
| 4 | 2.1-2.6 | 1h | G-액틴을 준비합니다. |
| 5 | 3.1 | 30분 | 파리가 알을 낳을 수 있도록 허용하십시오. |
| 6 | 3.2-3.10 | 15-30분 | 배아를 수집, 마운트, 담정. 오일로 배아를 덮습니다. |
| 7 | 4.1 | 30분 전 | 습한 인큐베이션 챔버를 준비하십시오. |
| 8 | 4.2-4.4 | 1분 | 마이크로니들로드. |
| 9 | 4.5-4.10 | 10-20분 | G-액틴 버블 크기를 보정하고 배아를 주입합니다. |
| 10 | 4.11 | 30 분 - 1 + h | 인큐베이션/열 응력 배아. |
| 11 | 5.1-5.3 | 1시간 전 | 현미경 및 잠복기 단계를 켭니다. |
| 12 | 5.4-5.10 | 5분 | 이미징을 위한 커버립 사이 샌드위치 배아. |
| 13 | 5.11-6.6 | 15 분 - 1 + h | 배아의 이미지 내 핵 액틴 봉. |
표 2: 문제 해결 제안. 이 표에서는 프로토콜의 성공적인 완료를 돕기 위해 문제 해결에 대한 제안을 제공합니다.
| 잠재적인 문제 | 제안 |
| 파리는 충분한 배아를 낳지 않습니다. | 컵을 최소 5일 전에 설정하십시오(1.1-1.3단계를 참조). 계란 누워를 장려하기 위해 실험에 이르는 하루에 3 배 플레이트를 변경합니다. 파리가 30분 대신 1시간 동안 배아를 놓아 보도록 하십시오. 젊은 성인 파리와 컵을 설정합니다. |
| 어떤 G-actin 마이크로 니들에서 추방되지 않습니다. | 마이크로 인젝터의 압력과 시간 설정을 증가시면 됩니다. 마이크로니들 팁을 더 나누세요(4.5단계 참고)를 참조하십시오. 주요 나막신이 명확하지 않을 수 있기 때문에 새 바늘을 적재하십시오. |
| 작은 거품 크기를 보정하기 가 어렵습니다. | 압력 및 시간 설정을 조정합니다(4.5단계를 참조). 마이크로니들 팁 개구부가 너무 커서 새 바늘을 적재합니다. |
| 배아는 주입 하는 동안 커버 슬립에 접착제에서 방출. | heptane 용액에 양면 테이프를 더 추가하여 향후 커버립에 대해 "배아 접착제" 일관성을 조정합니다(3.5단계 참고). |
| 배아는 온도 배양 중에 건조합니다. | 슬라이드가 인큐베이션 챔버 (4.11 단계를 참조)의 수준이고 오일이 그것을 멀리 심을 수있는 것을 만지지 않는지 확인하십시오. 배아에 오일을 추가합니다. 주입 전 건조 시간을 줄입니다(단계 3.8을 참조). |
| 오일은 첫 번째와 두 번째 커버립 사이에 배아를 완전히 커버하지 않습니다. | 커버립 사이의 작은 간격에 모세관 작용을 통해 오일을 추가합니다(5.8노트 단계를 참조). |
| 핵내 액틴 막대는 열 응축 배아에서 볼 수 없습니다. | 더 큰 양의 G-actin을 주입하십시오(4.5단계를 참조). 주사 후 인큐베이션(step 4.11참조)과 이미징 챔버의 온도가 32°C(단계 5.3참조)인지 확인한다. |
| G-actin의 큰 기포는 배아의 주입 사이트 의 주위에 볼 수 있습니다. | G-actin의 더 작은 볼륨을 주입합니다(4.5단계를 참조). 배아 건조 시간을 증가시켜 배아 내부에 주입된 액틴의 더 나은 유지를 촉진한다(3.8단계를 참조). |
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Discussion
이 방법의중요성은 드로소필라 배아21,22, 23,24,25,26, 27에서 미세 주입의 잘 확립 된 프로토콜을 활용하여 ASR 및 동반 액틴 로드 조립에 관한 새로운 연구를 가능하게한다는 것입니다. 살아있는 배아에 G-actinRed를 주입의 주요 장점은 ASR이 다양한 맥락에서 연구 될 수 있다는 것입니다. 향후 연구를 위해, 이러한 맥락은 돌연변이 스크린의 일부로 다른 유전자형의 배아를 주입하거나 산화 스트레스4,32와같은 다른 스트레스 조건에 주입된 배아를 노출하는 것을 포함할 수 있다. 여기서 자세히 설명되지는 않지만, 본 주사 기술은 또한 핵산, 다른 단백질, 약물 및 지표 염료를 주입하도록 변형될 수 있다(예를 들어,21,22,23,24, 32참조)를 ASR을 연구한다. 따라서, 이 방법은 ASR을 유도하는 응력의 범위를 식별하고, ASR(예: 미토콘드리아 활동의 변화)를 통해 세포 반응을 더욱 특성화하고, 핵내 액틴 로드 조립의 근본적인 새로운 분자 및 메커니즘을 발견하기 위한 여러 가지 접근법을 제시한다.
프로토콜의 몇몇 중요한 단계는 다음을 포함합니다: 단계 3.8에서, 태아는 성공적인 주입 및 최고 태아 건강을 지키기 위하여 제대로 건조되어야 합니다. 건조 시간은 실험실의 주변 온도 및 습도에 따라 달라지므로 먼저 중성 pH 버퍼를 사용하여 마운팅, 건조 및 주사를 연습하여 배아 를 처리하기위한 이 매개 변수를 설정하는 것이 좋습니다. 4.5 단계에서, 마이크로니들 및 주사 설정은 충분한 G-actinRed를 배아로 주입할 수 있도록 미세 조정되어야 합니다. 너무 작은 G-actin레드가 배아에 주입되는 경우, 액틴 막대의 형성은 자유 액틴1의농도에 의존하기 때문에, 쉽게 시각화되지 않을 수 있습니다. 또한, 형광 강도가 배경 형광을 극복할 만큼 충분히 높지 않기 때문에 충분한 G-actinRed 주입이 없는 경우 FRAP 실험에서 일관된 결과를 얻기가 어려울 것입니다. 따라서 새 바늘을 적재하고 사용할 때마다 거품 크기를 보정하는 것이 중요합니다. G-actin레드는 점성이 있으며 마이크로 니들 내부를 막는 경향이 있습니다. 때때로, 이것은 배아로 G-actin의 가변적인 양을 주입하기 위하여 이끌어 낼 수 있습니다. 마이크로니들이 막히고 고압으로 마이크로니들을 제거하는 경우, 마이크로니들 끝을 더 깨거나 새로운 마이크로니들을 적재하고 새로운 배아 세트를 주입하는 것을 시도할 필요가 있을 수 있다. 마지막으로, 4.11 단계에서 배아는 높은 온도에서 배양되어야 하며 ASR이 유도되고 막대가1을형성하기에 충분한 시간 동안 배양되어야 한다. 모든 인큐베이터의 온도를 지속적으로 모니터링하고, 인큐베이터에서 배아를 인큐베이터로 옮길 시간이 제한되어있어야 하며, 타이머는 모든 인큐베이션에 사용해야 합니다. 다른 가능한 문제는 함께 문제 해결 팁과 함께 표 2에 나열됩니다.
이 프로토콜의 한 가지 주요 제한은 주사, 잠복기 및 이미징 중 배아의 건강을 보존하기 위해 예외적인 주의를 기울여야한다는 것입니다. 이 프로토콜은 배아 건강을 극대화하도록 설계되었으며, 중요한 연습을 통해 연구원은 온도 당 예상 속도로 진행되는 배아 발달을 통해 프로토콜의 모든 단계를 완료할 수 있다31. 프로토콜의 두 번째 제한은 상당히 비싸고 모든 비행 실험실에 대한 일반적인 장비가 아닌 미세 주입 장비의 필요성입니다. 그러나 인접한 실험실이 다른 배아(예: 제노푸스,제브라피시, 카노르하비시스, 및 카노르하비티스 엘레간)를주입할 수 있는 경우, 사용되는 주사 장비는 드로소필라 주사에 적합할 가능성이 높다. 이 경우, 피펫쿡북(29)의지침에 따라 드로소필라 배아에 대해 바늘의 모양만 적응할 필요가 있다. 양자 택일로, 시장에 몇 가지 덜 비싼 micoinjector 옵션이 있습니다 (예를 들어, 아날로그 마이크로 인젝터), 크게 사출 장비를 조립의 비용을 줄일 수 있습니다.
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Disclosures
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
Acknowledgments
저자는 소카크 연구소에서 이 기술을 개척하는 데 도움을 준 류류 정과 젠기이 쉬의 작품과 분석을 도운 하산 시데의 작품을 감사하게 인정합니다. 이 연구를 위한 일은 NIH (R01 GM15111)의 보조금에 의해 투자됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore-Sigma | A23835G | Component of G buffer |
| Apple juice, Mott's, 64 fl oz | Mott's | 014800000344 | Component of apple juice plates |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Component of apple juice plates |
| Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite | KIK International | 059647210020 | For dechorionating embryos |
| Calcium chloride | Millipore-Sigma | C1016500G | Component of G buffer |
| Cell strainer, 70 μm | Falcon | 352350 | For collecting dechorionated embryos |
| Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan | Zeiss | 0000001994956 | For imaging intranuclear actin rods |
| Desiccant | Drierite | 24001 | For desiccating embryos |
| Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom | Zeiss | 4350649000000 | For arranging embryos on agar wedge |
| Dissecting needle, 5 in | Fisher Scientific | 08965A | For arranging embryos on agar wedge |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP1725 | Component of G buffer |
| Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in | 3M | 021200010323 | For making embryo glue |
| Embryo collection cage | Genessee Scientific | 59100 | For housing adult flies and collecting embryos |
| Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72701D | For arranging embryos on agar wedge |
| Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm | World Precision Instruments, Inc. | TW1004 | For microneedles |
| Halocarbon oil 27 | Millipore-Sigma | H8773100ML | For hydration of embryos |
| Heated stage incubator | Zeiss | 4118579020000, 4118609020000, 4118609010000 | For confocal imaging |
| Lab Tissue Wipers, KimWipes | Kimberly-Clark | 34155 | Lab tissue wipers |
| Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished | Zeiss | Discontinued | Injection microscope |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Millipore-Sigma | H36471KG | Component of apple juice plates |
| Microinjector, FemtoJet4x | Eppendorf | 5253000025 | Microinjector |
| Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 μL | Eppendorf | 5242956003 | For loading microneedles |
| Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment | Bernard Instruments, Inc (Houston, TX) | Custom | For performing microinjections |
| Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown | Sutter Instruments | P97 | For pulling capillary tubes to make microneedles |
| Microscope cover glass 24x50-1.5 | Fisher Scientific | 12544E | For mounting embryos |
| Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm | Fisher Scientific | 22037081 | For mounting embryos for injection |
| n-Heptane | Fisher Scientific | H3601 | Component of embryo glue |
| Objective, 10x | Zeiss | Discontinued | 10x objective for injection microscope |
| Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS | Zeiss | 4217679971711 | 40x water objective for confocal |
| Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm) | Zeiss | 4208529871000 | 25x mixed immersion objective for confocal |
| Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA | Zeiss | 4207829900799 | 63x oil objective for confocal |
| Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2 | Daler-Rowney | 038372016954 | For transferring embryos |
| Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white | Kimberly-Clark | 884266344845 | For blotting cell strainer |
| Pasteur pipette, 5 3/4 in | Fisher Scientific | 1367820A | For covering embryos with oil |
| Petri dish, glass, 100 x 20 mm | Corning | 3160102 | For humid incubation chamber |
| Petri dish, plastic, 60 x 15 mm | VWR | 25384092 | For apple juice plates |
| Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 μL | Eppendorf | 2231000604 | For loading the microneedle |
| Pipette tip, xTIP4 250 μL | Biotix | 63300006 | For adding embryo glue to coverslip |
| Razor blade | VWR | 55411050 | For cutting agar wedge, tape, pipette tips |
| Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4x10 μg) | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | G-actin^Red |
| Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps | Fisher Scientific | 033377 | For making embryo glue |
| Screw top jar, 16 oz | Nalgene | 000194414195 | For desiccating embryos |
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 602104PG | For calibrating volume of G-actin injection |
| Sucrose | Millipore-Sigma | 840971KG | Component of apple juice plates |
| Trizma base | Millipore-Sigma | T15031KG | Component of G buffer |
| Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz | Lesaffre Yeast Corporation | 117929157002 | Component of yeast paste |
References
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