Summary
Цель этого протокола заключается в том, чтобы ввести родамина конъюгированных шаровых актин в дрозофила эмбрионов и изображения внутриядерных актин стержня сборки после теплового стресса.
Abstract
Целью данного протокола является визуализация внутриядерных актин-стержней, которые собираются в живых эмбрионах drosophila melanogaster после теплового стресса. Actin стержней являются отличительной чертой сохраняется, неудобоваемые Actin стресс ответ (ASR), который сопровождает человеческие патологии, в том числе нейродегенеративных заболеваний. Ранее мы показали, что ASR способствует морфогенеза неудачи и снижение жизнеспособности развивающихся эмбрионов. Этот протокол позволяет продолжить изучение механизмов, лежащих в основе сборки актин стержня и ASR в модельной системе, которая очень податлима для визуализации, генетики и биохимии. Эмбрионы собираются и устанавливаются на крышку, чтобы подготовить их к инъекциям. Родамин-конъюгированный шаровые актин (G-actinRed) разбавляется и загружается в микроиглу. В центр каждого эмбриона делается одна инъекция. После инъекции эмбрионы инкубируется при повышенной температуре, а внутриядерные актиновые стержни визуализируются с помощью конфокалярной микроскопии. Восстановление флуоресценции после фотоотбивания (FRAP) эксперименты могут быть выполнены на актин стержней; и другие богатые актином структуры в цитоплазме также могут быть изображены. Мы находим, чтоG-актин красный полимеризируется как эндогенный G-актин и не, сам по себе, вмешиваться в нормальное развитие эмбриона. Одним из ограничений этого протокола является то, что необходимо позаботиться о том, чтобы во время инъекции избежать серьезных повреждений эмбриона. Однако, с практикой, инъекционные G-актинкрасный в drosophila эмбрионов является быстрым и надежным способом визуализации актин стержней и может быть легко использован с мухами любого генотипа или с введением других клеточных стрессов, в том числе гипоксии и окислительного стресса.
Introduction
Этот протокол описывает, как вводить G-actinRed, чтобы визуализировать сборку внутриядерных актин-стержней в термечных эмбрионах, которые проходят неопругиваемый actin Stress Response (ASR)1. Мы разработали этот протокол, чтобы помочь исследованиям ASR, который в эмбрионах приводит к нарушению морфогенеза и снижению жизнеспособности, а у взрослых типов клеток человека связано с патологиями,включая почечную недостаточность 2,мышечные миопатии 3, и болезнь Альцгеймераи болезнь Хантингтона 4,5,6,7,8. Это ASR вызвано многочисленными клеточными напряжениями, в томчисле тепловой шок 9,10,11,окислительный стресс 4,6, снижениесинтеза АТФ 12, и ненормальные Хантингтин или β-амилоидаолигомеризации 4,5,6,7,9,13,14,15,16. Отличительной чертой ASR является сборка аноматических актиновых стержней либо в цитоплазме, либо в ядре пораженных клеток, что обусловлено вызванной стрессом гиперактивацией актин-взаимодействующих белков, cofilin1,5,6,10. К сожалению, по-прежнему сохраняются пробелы в знаниях в отношении ASR. Например, функция актин-стержней неизвестна. Мы не понимаем, почему стержни образуются в цитоплазме некоторых типов клеток, но ядро других. Также не ясно, является ли ASR защитным или неадаптивным для клеток или эмбрионов, переживая стресс. Наконец, мы до сих пор не знаем подробных механизмов, лежащих в основе гиперактивации Cofilin или сборки актин стержня. Таким образом, этот протокол обеспечивает быстрый и универсальный анализ для зондирования ASR путем визуализации актин формирования стержня и динамики в высокоуроспособной экспериментальной системы эмбриона живой плодовой мухи.
Протокол микроинъекций G-actinRed в живые эмбрионы дрозофилы был первоначально разработан для изучения динамики нормальных цитоплазмических актиновыхструктур 17 во время построения тканей. В этих исследованиях мы обнаружили, что инъекция G-actinRed не оказывает негативного влияния на ранние процессы развития эмбриона, включая цитокинезили гастрипуляцию 17,18. Затем мы изменили протокол, адаптируя обработку эмбриона и G-actinRed инъекции, чтобы изображение актин стержней в тепловой подчеркнул эмбрионов, проходящих ASR1. Другие методы, кроме инъекции G-actinRed, могут быть использованы для визуализации актина в эмбрионах. Эти методы опираются на выражение флуоресцентных белков (FPs) помечены актина или доменов актин связывания белков, таких как Утрофин-мчерри, Lifeact, F-tractin-GFP, и Moesin-GFP (рассмотренв 19). Однако, используя эти FP зонды требует осторожности, потому что они могут стабилизировать или нарушить некоторые актин структуры, не в равной степенимаркировать все актин структуры 20, а в случае актин-GFP, очень переэкспрессированы - проблематично для анализа стержня сборки, которая является не только стресс зависит, но и actin концентрациизависит 1. Таким образом, G-actinRed является предпочтительным зондом для исследования стержня в эмбрионах мух, а большой размер эмбриона позволяет его легко инъекцию.
Рабочий процесс этого протокола похож на другие устоявшиеся методы микроинъекции, которые были использованы для инъекций белков, нуклеиновых кислот, лекарств и флуоресцентных индикаторов в эмбрионы дрозофилы21,22,23,24,25,26,27. Однако, после микроинъекции G-actinRed здесь, эмбрионы подвергаются легкому тепловому стрессу, чтобы вызвать сборку ASR и внутриядерного актина стержня. Для лабораторий с доступом к мухам и инъекционной установке этот метод должен быть легко реализуемым и адаптируемым для конкретных линий исследования в отношении ASR, включая его индукцию различными стрессами или модуляцией в различных генетических фонов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка эмбриона сбора чашки и яблочный сок агар пластин
- За пять дней до инъекционного эксперимента, построить28 или закупить по крайней мере две небольшие чашки сбора эмбрионов. Сделать свежие 60 мм яблочный сок агар пластины, которые будут использоваться с небольшой коллекциичашки 28. Храните тарелки в пластиковых коробках, покрытых влажными бумажными полотенцами при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшие чашки для сбора эмбрионов, населенные номерами мух, описанные в шаге 1.3, обеспечат достаточное количество эмбрионов за эксперимент, а также обеспечат, чтобы обработка и инъекция эмбриона можно было сделать в достаточно короткие сроки, чтобы сделать визуализацию ранних стадий развития. - Теплый яблочный сок пластины до 18 градусов по Цельсию и добавить мазок дрожжевой пасты в центр пластины. Дрожжевая паста – это простая паста из активных дрожжей и дистиллированной воды.
- Для продвижения самых щедрых яйцекладка, создать сбор чашки с мухами 2 дней до эксперимента. Добавьте не менее 100 самок и 50 самцов мух в чашки коллекции, а сверху с подготовленной тарелкой яблочного сока(рисунок 1, шаг 1). В дни, предшествующие эксперименту по инъекциям, меняются тарелки яблочного сока не реже двух раз в день, один раз утром и один раз вечером.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лучшие результаты инъекций и визуализации получены, когда чашки для сбора эмбрионов хранятся при 18 градусах Цельсия при свете 12 ч/свет от цикла.
2. Подготовить рабочее решение фонда G-actinRed для микроинъекции
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот препарат составляет всего 2 л из 5 мг / мл рабочего запаса G-actinRed, так что если пользователи непривычны к методу микроинъекции, это выгодно, чтобы пропустить шаг 3 и практиковать микроинъекции с нейтральным буфером рН для сохранения драгоценного рабочего запаса. 10 мкг запас G-actinКрасный от поставщика могут храниться в оригинальной упаковке в 16 унций винт верхней банке с 500 г desiccant при 4 КК на срок до 6 месяцев.
- Подготовь решение для G-буферного запаса заранее: 5 мМ Трис-HCl, 0,2 мММ CaCl2, рН 8,0. Фильтр и хранить при комнатной температуре.
- В день инъекций подготовьте 1 мл G-буферного рабочего раствора в свежей микроцентрифуге крышки на льду с использованием G-буферного запаса от шага 2.1, дополненного следующими в указанных конечных концентрациях: 1 мМ дитиотрейтол (DTT) и 0,2 мМ АТФ, рН 8,0.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем работы G-буфера объемом 1 мл больше, чем требуется для эксперимента, но упрощает подготовку. Избыток может быть отброшен после эксперимента или пользователи могут сократить в зависимости от их предпочтений.- Сохраняя 10 мкг G-actinКрасный бульон на льду, сначала добавить 1 йл фильтруемой, дистиллированной воды в верхней части розовой капли G-actinRed внутри трубки.
- Затем добавьте 1 мл холодного, свежеприготовленного рабочего решения G-буфера из шага 2.2. Труба вверх и вниз в 20 раз, чтобы хорошо перемешать с объемом пипетки установлен на 1 мкл. G-actinКрасный запас теперь будет на окончательное разбавление 5 мг/мл.
- Инкубировать подготовленный G-actinRed в течение 30 минут на льду спокойно.
- Центрифуга подготовленный G-актинкрасный при 16000 х г в течение 20 мин при 4 градусов по Цельсию в микроцентрифуге, чтобы удалить любой осадок.
- Тщательно пипетки 1,5 йл супернатанта в свежей крышкой оснастки микроцентрифуг трубки на льду, избегая темно-розовый гранулы.
- Храните подготовленный G-актинкрасный супернатант на льду до 6 ч, пока не будет готов к загрузке в микроиглу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Микроиглы можно заранее вытащить из капиллярных трубок на шкиве микропипеда, а затем хранить при комнатной температуре на полоске модели глины в чашке Петри диаметром 100 х 20 мм. Предлагаемые параметры для вытягивания микроиглы можно найти в Pipette Cookbook29.
3. Собирать эмбрионы и монтировать для инъекций
- Разрешить мухам выкладывать эмбрионы в течение 30 мин на тарелках яблочного сока с дрожжевой пастой при 18 градусах Цельсия.
- Пока мухи укладываются, предварительно разогревайте агарную тарелку яблочного сока без дрожжевой пасты до комнатной температуры, вырежьте прямоугольный клин яблочного сока агара длиной 4 см и поместите на 25 мм х 75 мм стеклянную горку.
- Урожай пластины из 30-минутного сбора и дехорионата эмбрионов путем заливки свежего отбеливателя, разбавленной 1:1 с дистиллированной водой, на тарелку и закрученного пластины в течение 1 мин,как описано в 28 (Рисунок 1, шаг 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные марки отбеливателя продаются в разных концентрациях. Отбеливатель, используемый здесь 6% гипохлорит натрия из бутылки и разбавлен до окончательной концентрации 3% гипохлорита натрия. Другие бренды отбеливателя при несколько более низких концентрациях будут работать одинаково хорошо. - Налейте отбеливатель и dechorionated эмбрионов в корзину сбора (70 мкм клетки ситечко) и промыть пластину дважды дистиллированной водой из бутылки шприц, добавив эти моет в корзину сбора.
- Энергично промойте дехорионизированные эмбрионы в корзине сбора дистиллированной водой до тех пор, пока не будут видны дрожжевые сгустки и корзина не оставляет розовых следов от лишнего отбеливателя при смытости на бумажном полотенце.
- Урожай пластины из 30-минутного сбора и дехорионата эмбрионов путем заливки свежего отбеливателя, разбавленной 1:1 с дистиллированной водой, на тарелку и закрученного пластины в течение 1 мин,как описано в 28 (Рисунок 1, шаг 2).
- Используя кисть с щетиной, смоченной дистиллированной водой, перенесите дехорионированные и вымытые эмбрионы из корзины для сбора на подготовленный яблочный сок агар-клин на стеклянной горке.
- Используйте пару тонкого кончика пинцета или вскрытия иглы, чтобы организовать десять эмбрионов по прямой вдоль длинной оси прямоугольногоагар-клина (рисунок 1, шаг 3). Упорядочить эмбрионы голова к хвосту, так что их передний полюс обращен к правой и спинной стороне сталкивается с исследователем(рисунок 1, шаг 3, увеличенный).
- Отрежьте 0,5 см конца наконечника пипетки P200 лезвием бритвы и окунитесь в «эмбриональный клей» (описанныйв 28). Обильно пальто области 5 мм в ширину(рисунок 1, шаг 4) вдоль длинного края 24 мм х 50 мм прямоугольный крышкой, и дайте высохнуть, клей вверх. Сушка займет 30 с и будет завершена, как только весь клей покрытием области появляется матовый, а не мокрый или блестящий.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте "эмбриональный клей" по крайней мере 48 ч заранее. Добавьте n-Heptane к полоскам односторонней ленты в флаконе сцинтилляции, как описано в28. - После того, как "эмбрион клей" высохнет, осторожно поместите крышку клея сторону вниз на верхней части ряда выровненных эмбрионов на агар, оставляя 2-3 мм пространства между краем крышки и ряд эмбрионов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Прилипание эмбрионов слишком близко к краю крышки может привести к высыханию эмбрионов слишком много в ходе эксперимента. - Переверните крышку над так, что эмбрионы в настоящее время сталкиваются вверх. Они должны быть застряли в линии вдоль одного длинного края крышки, и их брюшной области, обращенной к ближайшему краю крышки (Рисунок 1, шаг 4, увеличенный).
- Высасывайте эмбрионы, поместив крышку с эмбрионами мягко на вершине 150 г свежего синего desiccant хранится в 16 унций винт верхней банке. Плотно винт на крышке и инкубировать в течение 8-10 мин(рисунок 1, шаг 5).
- После высыхания, удалить крышки из desiccant банку и ленты каждой короткой стороне крышки на микроскоп слайд, эмбрион сторонувверх , с двумя 4см 2 куска двусторонний ленты так, что эмбрион coverslip будет соответствовать на стадии инъекции(рисунок 1, шаг 6).
- Добавьте 2-3 капли масла Halocarbon 27 с пипеткой Pasteur, чтобы покрыть выровненные эмбрионы и защитить их от дальнейшегообезвоживания (рисунок 1, шаг 6).
4. Инъекционные и тепловые эмбрионы стресса для содействия образованию актин стержня
ПРИМЕЧАНИЕ: Все инъекции делаются в комнате, контролируемой температурой, при температуре 18 градусов по Цельсию.
- Подготовка влажных инкубационные камеры из стеклянной чашки Петри по крайней мере 100 мм х 20 мм в размерах и линии камеры с поворотами лабораторных стеклоочистителей ткани смоченнойдистиллированной водой (рисунок 1, шаг 8). Предварительно разогреть инкубационной камеры при температуре 32 градусов по Цельсию или желаемую температуру инкубации до введения эмбрионов.
- Откройте клапан воздушного потока для микроинъектора и включите микроинъектор (подходит сжатый воздух или домашний воздух с давлением не менее 90 пси).
- В то время как эмбрионы высасывания, backload ранее подготовленных G-актинкрасный супернатант в микроиглы с помощью микро погрузчика отзыв. Установите пипетки, чтобы составить 1-1,5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за вязкости актина, объемы загрузки не могут быть точными и может быть достаточно актина осталось загрузить по крайней мере один-два микроиглы. До 60 эмбрионов могут быть введены на загруженную микроиглу, если микроигла откалибровывается должным образом и не засоряется в ходе эксперимента. - Прикрепите микроиглу к держателю иглы и затяните винт. Подключите воздушную трубку к микроинъектору и убедитесь, что давление обратного потока на микроигле эквилибраты до 30 hPa.
- Калибруйте настройки микроинъектора, чтобы изгнать пузырь диаметром 100 мкм G-actinRed (500 мл) на слайд-микрометре. Поверните ручку давления (500-1500 hPa) и ручку времени импульса впрыска (0.1-0.5 s) на микроинъекторе для того чтобы получить правый размер пузыря. Отрегулируйте эти настройки каждый раз, когда новый микроигл загружается для учета изменчивости в вязкости актина и размера наконечника микроиглы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовленный G-актинкрасный вязкий и может быть воздух в кончике микроиглы, которые должны быть исключены до введения эмбрионов. Если G-actinRed не легко изгоняется из кончика микроиглы, аккуратно разбейте кончик микроиглы по краю слайд-микрометра. - Поместите слайд с установленными эмбрионами на сцену микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая инъекция создана будет отличаться, так что исследователи должны будут настроить их метод инъекции соответственно. Здесь эмбрионы перемещаются по стационарному микроиглу, вводя каждый эмбрион путем запуска эмбриона в микроиглу. - Отрегулируйте стадию микроманипулятора и сосредоточьте цель 10x на световом микроскопе так, чтобы эмбрионы были видны. Эмбрионы находятся в правильной фокусной плоскости, когда очертания вителлиновой мембраны являются острыми и эмбрион кажется крупнейшим. Выберите эмбрионы для инъекций, которые находятся в правильной стадии развития, так что к тому времени, когда после инъекции инкубации завершена, большая часть сцепления достигает желаемой стадии развития (например, вводить эмбрионы на стадии Боунса 2-330 для того, чтобы наблюдать стержней при клетчатой после теплового стресса при температуре 32 градусов по Цельсию).
- Используйте элементы управления микроиглами, чтобы привести иглу в ту же фокусную плоскость, что и эмбрионы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если микроигла ловит на крышке при перемещении стадии или микроиглы, то микроигла слишком близко к слайду и не находится в правильной фокусной плоскости. Микроигла должна быть параллельно крышке, а не под значительным углом(рисунок 1, шаг 7). - Вставьте микроиглу в эмбрион так, чтобы он попал в эмбрион в середине его брюшной области, на эмбрионе "экватор". Инъекция триггера с педалью ноги или кнопкой "впрыскить", когда кончик микроиглы виден внутри середины эмбриона(рисунок 1, шаг 7).
- Введать G-актинкрасный один раз и медленно удалить микроиглы. Переместите сцену и повторите для каждого эмбриона соответствующую стадию развития.
ПРИМЕЧАНИЕ: Расширение эмбриона нормально, как G-актинкрасный вводится и немного цитоплазмы может просочиться из эмбриона. - После того, как все эмбрионы были введены, поместите слайд с эмбрионами в подготовленную влажную инкубационную камеру и закройте крышку(рисунок 1, шаг 8). При попытке получить эмбрионы, которые достигают клеточной, тепло стресс эмбрионов при температуре 32 градусов по Цельсию в течение 60-75 мин во влажной инкубационой камере.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации отмечается, что позволяют визуализировать стержни в клеточной тепла подчеркнул эмбрионов. Инкубацио время будет больше для не теплового стресса контроля эмбрионов, потому что развитие будет медленнее при более низкойтемпературе 31. Эти контрольные эмбрионы могут быть инкубированы во влажных камерах при температурах, таких как 18 градусов по Цельсию или 25 градусов по Цельсию, в зависимости от конструкции конкретного эксперимента и вопроса, который необходимо задать. Минимальное время инкубации, необходимое для G-actinRed, чтобы рассеять по всему эмбриону составляет 30 мин.
5. Изображение актин стержней в тепло подчеркнул эмбрионов конфокальная микроскопия
- В то время как эмбрионы в настоящее время тепло подчеркнул, включите конфокальный микроскоп и выбрать 561 нм лазерного канала.
- Перемести объективный объектив (25x, 40x или 63x рекомендуется) на рабочую позицию.
- При визуализации тепла подчеркнул эмбрионов, а затем установить инкубатор нагретой стадии для достижения внутренней температуры 32 градусов по Цельсию. Точечный и стрелять или инфракрасный термометр может быть использован для проверки температуры на или вблизи цели.
- Удалите слайд с вводимых эмбрионов из влажной инкубационной камеры после инкубации завершена(рисунок 1, шаг 9).
- Работая быстро, аккуратно вырвать двустороннюю ленту штук, которые были использованы для прилипания крышки с установленными эмбрионами на слайде(рисунок 1, шаг 9).
ВНИМАНИЕ: Будьте нежны во время этих шагов, как coverslips может легко разрушить, если слишком много силы применяется. - Stick два 2,5 см в длину куски двусторонний ленты вместе и сократить ленту пополам вдоль, чтобы сделать две полосы, 2,5 х 0,5 см в длину(рисунок 1, шаг 10).
- Stick две трети длины каждой ленты полосы на первый coverslip, фланговые каждой стороне эмбрионов в Halocarbon 27 нефти (Рисунок 1, шаг 10, оранжевый), в результате чего одна треть ленты полосы висит от края первого крышки, где эмбрионы застряли. Используйте руки в перчатках и будьте осторожны, чтобы не коснуться эмбрионов во время этого шага.
- Аккуратно поместите второй прямоугольный крышку поверх ленточных полос, чтобы зажатие эмбрионов между крышками(рисунок 1, шаг 10, синий). Выровнять 25 мм края, но сохранить 50 мм края смещены друг от друга на 1 см в ширину.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полная поверхность этого второго крышки станет новой поверхностью изображения, которая столкнется с объективом цели, так что позаботьтесь, чтобы не получить отпечатки пальцев или Масло Halocarbon 27 на этой второй поверхности крышки. Смещение необходимо для того, чтобы дополнительное масло Halocarbon 27 можно было добавить, чтобы равномерно погрузить эмбрионы. При необходимости добавьте масло Halocarbon 27 в шов, где две крышки встречаются в верхней части сэндвича, и это покроет эмбрионы капиллярным действием (см. пунктирной линии на рисунке 1, шаг 10). - Аккуратно нажмите вниз на области крышки, которые находятся непосредственно на верхней части ленты полосы с тупой стороной razorblade, чтобы получить крышку придерживаться ленты.
- Переверните сэндвич с крышкой и поместите на стеклоочиститель лабораторной ткани, чтобы сохранить поверхность изображения чистой и нести в конфокальный микроскоп(рисунок 1, шаг 11). Убедитесь, что лента полностью прилипает к обеим обложкам перед визуализацией.
- Подтвердите, что нагретая стадия находится при температуре и при использовании перевернутого микроскопа, добавьте жидкость для погружения в выбранную объективную линзу.
- Поместите сэндвич с крышкой на сцену тщательно, чтобы убедиться, что новая поверхность изображения(2-й крышкой) является одним касаясь погружения жидкости (Рисунок 1, шаг 11).
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости, придерживаться крышки сэндвич на сцену с двумя небольшими кусочками двусторонний ленты для предотвращения ненужного движения во время изображения, если coverslips не вписываются хорошо в стадии нагревания. - Сосредоточьтесь на эмбрионе, который находится в клеточной (Bownes этапе 4a30) или желаемой стадии развития с использованием либо передаваемого света или флуоресценции.
- После того, как эмбрион был привлечен к фокусу, переключитесь на режим лазерного приобретения на конфокальном микроскопе и отрегулируйте мощность и увеличение мощности лазера, размер рамы, плитку и настройки проекции по желанию.
- Сделайте снимки с поверхности через фокусные плоскости ядер эмбриона, чтобы найти внутриядерные актиновые стержни. Роды должны отображаться в нескольких ориентациях в виде ярких полос или точек внутри сравнительно темныхядер (рисунок 2A, 2C).
6. Альтернативные эксперименты с визуализацией
- Выполните FRAP для исследования актин оборота по длине внутриядерных актин стержней или в цитоплазмических структур актина, таких как кончики плазменной мембраны борозды во время клетчатой.
- В программном обеспечении для визуализации выберите прямоугольную область вокруг кончиков борозды или актиновые стержни, в которых будут проведены эксперименты.
- Выберите небольшую квадратную область центра актин стержня в прямоугольной области приобретения для отбеливания. Убедитесь, что кончики актин стержня видны и не отбеливаться в ходе эксперимента, чтобы обеспечить точное отслеживание стержня внутри ядра.
- Установите отбеливатель лазер для итерировать 50x и установить мощность лазера отбеливателя до максимума.
- Выберите курс времени для получения изображений каждую секунду в общей сложности до 120 с на максимальной скорости пиксельного жителя и установите лазер для отбеливания после первых двух секунд получения изображения.
- Количественная оценка данных для определения половины времени восстановления флуоресценции1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Схематический рабочий процесс обработки эмбрионов изображен на рисунке 1,а расписание типичного эксперимента представлено в таблице 1. Оценка хорошего экспериментального результата заключается в том, что на каждые 10 вводимых эмбрионов, по крайней мере половина эмбрионов рассматривается будет на правильной стадии развития, неповрежденной, и проявляют надежную ASR с тепловым стрессом при температуре 32 градусов по Цельсию. Об этом ASR будет свидетельствует сборка внутриядерных актин-стержней, как показано на репрезентативном изображении поверхностного вида эмбриона на рисунке 2A (правая панель). Actin стержни будут отображаться в нескольких ориентациях (параллельно или перпендикулярно плоскости изображения) внутри ядер и могут быть изображены через несколько фокусных плоскостей. Для сравнения, контроль эмбрионов, инкубированных при 18 градусов по Цельсию, не будет отображатьактин-стержни (рисунок 2A, левая панель). Процент ядер, содержащих стержни могут быть количественно, как попродемонстрировано на рисунке 2B. Кроме того, эксперименты FRAP могут проводиться на стержнях(рисунок 2C). Предлагаемый метод количественной оценки данных FRAP упоминаетсяв 1, а на рисунке 2D показан пример участка восстановления флуоресценции для обесцвеченной и неотбеленной области актин-стержня.
Если эмбрион серьезно поврежден инъекцией или становится слишком сухим во время эксперимента, митотическая асинхрония может наблюдаться и клетчатая связь будет нарушена. Иногда стержни могут быть не видны из-за неспособности получить достаточно актина вводят в эмбрион. Если это произойдет, убедитесь, что количество G-actinRed вводили составляет 500 мл (измеряется с микрометром в шаге 4,5) и подтвердить, что это количество остается последовательным между эмбрионами, делая тест инъекции в окружающую нефть, чтобы проверить размер G-актинкрасный пузырь между каждым эмбрионом микроинъекции. Кроме того, чтобы обеспечить визуализацию стержня, работайте быстро, чтобы добавить крышку и переместить эмбрионы в стадию нагретого микроскопа, как только они взяты из влажной камеры в шаге 5.4, так как сборкастержня обратима 1 и стержни могут разобрать, если эмбрионы хранятся при температуре менее 32 градусов по Цельсию в течение более 30 минут.
Рисунок 1: Схематический обзор обработки эмбрионов во время эксперимента. (1) Взрослые мухи в чашках сбора эмбрионов лежал эмбрионов на яблочный сок агар пластин. (2)Эмбрионы дехорионированы с 1:1 отбеливателем: дистиллированная вода, налил в корзину сбора, и тщательно промывают дистиллированной водой, чтобы удалить отбеливатель и мусор. (3)Эмбрионы передаются с кистью в прямоугольный яблочный сок агар клин на слайде и расположены по бокам, голова к хвосту, с спинной области, обращенной к краю агара. (4) Область стеклянной крышки (оранжевый) 5 х 50 мм покрыта "эмбриональным клеем" и мягко прижата к ряду эмбрионов, расположенных на агаре, чтобы приклеить их к крышке. (5)Обложка с эмбрионами инвертирована так, что эмбрионы лицом вверх. Эмбрионы высасылись в банку с винтом. (6) Сразу после высыхания, coverslip заклеен на слайд, эмбрионы вверх, и эмбрионы покрыты Halocarbon 27 нефти. (7) Микроигла, ранее загруженная подготовленным G-actinRed, используется для одной инъекции в центр брюшной области каждого эмбриона, с иглой, расположенной параллельно крышке. (8)После инъекции эмбрионы инкубируется внутри чашки Петри, увлажненной влажными лабораторными стеклоочистителями при контрольной температуре (18 градусов по Цельсию) или при тепловом стрессе (32 градусов по Цельсию). (9)После инкубации, крышки с эмбрионами на нем удаляется со слайда. (10) Два куска двусторонний ленты слоистых друг на друга, нарезанный пополам вдоль, и размещены по обе стороны от нефти, окружающей эмбрионы на первом coverslip. Вторая крышка (синий) помещается поверх первой для создания новой поверхности изображения, смещения так, что она оставляет пробел для большего количества масла, которые будут добавлены для покрытия эмбрионов по мере необходимости. (11) Если изображение на перевернутый конфокальный микроскоп, сэндвич coverslip инвертирован так, что второй coverslip сталкивается с целью. Изображение делается в инкубационной камере, а актиновые стержни визуализируются на нескольких фокусных плоскостях ядер каждого эмбриона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Репрезентативные результаты актин стержней в тепловых эмбрионов. (A) Actin стержни не видели в эмбрионе, который был инкубирован при контрольной температуре 18 градусов по Цельсию (левая панель), но видны в ядрах эмбриона, который был тепло-напряженный при температуре 32 градусов по Цельсию (правая панель). (B)Количественная оценка процента ядер с актин стержнями из репрезентативного эксперимента. Каждая точка представляет собой один эмбрион, где стержни и ядра были подсчитаны во всей изображенной области (n 22 эмбриона при 18 градусах Цельсия; n 23 эмбриона при 32 градусах Цельсия; бары ошибок показывают стандартное отклонение). Для расчета p-стоимости использовался тест студента t-test с предполагаемой неравной дисперсией. (C)Репрезентативная серия времени показывает FRAP на актин-удилище. Часть стержня, которая была обесцвечена, обозначена белой наконечником стрелы. Предварительное отбеливатель составляет 2 с до отбеливателя шаг. Время No 0 с является отбеливатель шаг, и восстановление флуоресценции отслеживается до 60 с пост отбеливателя. (D)Участок показывает динамику восстановления актин флуоресценции в обесцвеченной области стержня, по сравнению с неотбеленной области в том же стержне. Роды удивительно стабильны и действуют внутри них не оборот. Таким образом, никакого восстановления не наблюдается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Таблица 1: Экспериментальный рабочий процесс с предлагаемым графиком. В этом расписании кратко излагается ожидаемое время, необходимое для завершения каждого шага протокола.
| Заказ | Шаг | Требуемое время для каждого шага | Описание |
| 1 | 1.1 | 5 дней вперед | Сделать эмбрион коллекции клеток. Налейте яблочный сок агар тарелки. |
| 2 | 1.2-1.3 | 2 дня вперед | Настройка коллекции клетки со взрослыми мужскими и женскими мухами. |
| 3 | 2.6 Примечание | 1 день вперед | Потяните капиллярные трубки, чтобы сделать микроиглы. |
| 4 | 2.1-2.6 | 1 ч | Подготовь G-актин. |
| 5 | 3.1 | 30 мин. | Разрешить мух откладывать яйца. |
| 6 | 3.2-3.10 | 15-30 мин. | Сбор, монтаж, высохшей эмбрионов. Обложка эмбрионов с маслом. |
| 7 | 4.1 | 30 мин заранее | Подготовка влажных инкубационых камер. |
| 8 | 4.2-4.4 | 1 мин. | Загрузите микроиглу. |
| 9 | 4.5-4.10 | 10-20 мин. | Калибруйте размер пузыря G-actin и вводите эмбрионы. |
| 10 | 4.11 | 30 мин-1 ч | Инкубационые/тепловые эмбрионы стресса. |
| 11 | 5.1-5.3 | 1 ч заранее | Включите микроскоп и инкубационный этап. |
| 12 | 5.4-5.10 | 5 мин. | Сэндвич эмбрионов между крышками для визуализации. |
| 13 | 5.11-6.6 | 15 мин-1 ч | Изображение внутриядерных актинных стержней в эмбрионах. |
Таблица 2: Предложения по устранению неполадок. В этой таблице содержатся предложения по устранению неполадок, чтобы помочь успешному завершению протокола.
| Потенциальная проблема | Предложения |
| Мухи не закладывают достаточно эмбрионов. | Настройка чашки не менее чем за 5 дней (обратитесь к шагам 1.1-1.3). Изменение пластин 3x в день, ведущих к эксперименту, чтобы поощрять откладки яиц. Пусть мухи закладывают эмбрионы на 1 ч вместо 30 мин. Найми чашки с молодыми взрослыми мухами. |
| Ни один G-актин не исключен из микроиглы. | Увеличьте давление и настройки времени на микроинъекторе. Разбей кончик микроиглы дальше (ссылка на шаг 4.5 Примечание). Так как основные забивает не может очистить, загрузить новую иглу. |
| Трудно откалибровать достаточно небольшой размер пузыря. | Отрегулируйте настройки давления и времени (обратитесь к шагу 4.5). Так как микроигла кончик открытия может быть слишком большим, загрузить новую иглу. |
| Эмбрионы высвобождаются из клея на крышке во время инъекций. | Отрегулируйте консистенцию «эмбрионального клея» для будущих обложек, добавив к гептановому раствору более двустороннюю ленту (ссылка на шаг 3.5 Note). |
| Эмбрионы высыхают во время температурной инкубации. | Убедитесь, что слайд находится на уровне инкубационой камеры (ссылка на шаг 4.11) и что масло не касается ничего, что может фитиль его прочь. Добавьте дополнительные капли масла эмбрионам. Снижение времени предварительного инъекционного высыхания (ссылка на шаг 3.8). |
| Масло не полностью покрывает эмбрионы между первой и второй крышками. | Добавьте дополнительное масло через капиллярное действие к небольшому зазору между крышками (ссылка на шаг 5.8 Note). |
| Внутриядерные актиновые стержни не видны в тепловых эмбрионах. | Ввись больший объем G-акта (ссылка на шаг 4.5). Подтвердите, что температура инкубации после инъекций (ссылка на шаг 4.11) и камеры визуализации составляет 32 градуса по Цельсию (ссылка на шаг 5.3). |
| Вокруг места инъекции эмбрионов видны большие пузырьки G-актина. | Ввись меньший объем G-акта (ссылка на шаг 4.5). Увеличьте время высыхания эмбриона, чтобы способствовать лучшему удержанию вводимого актина внутри эмбриона (обратитесь к шагу 3.8). |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Значение этого метода заключается втом,что он использует устоявшийся протокол микроинъекции в дрозофила эмбрионов 21,22,23,24,25,26,27, чтобы новые исследования в отношении ASR и сопровождающих актин стержня сборки. Основным преимуществом инъекций G-actinRed в живые эмбрионы является то, что ASR может быть изучен в различных контекстах. Для будущих исследований, эти контексты могут включать инъекционные эмбрионы других генотипов как часть экрана мутанта или подвергая инъекционных эмбрионов к различным стрессовым условиям, таким как окислительныйстресс 4,32. Хотя это и не описано подробно здесь, этот метод инъекций также может быть изменен для инъекций нуклеиновых кислот, других белков, лекарств и красителей индикатора(например, см. 21,22,23,24,32) для изучения ASR. Таким образом, этот метод представляет собой ряд подходов для выявления диапазона стрессов, которые вызывают ASR, дальнейшей характеристики клеточных реакций во время ASR (например, изменения в митохондриальной активности), и выявление новых молекул и механизмов, лежащих в основе внутриядерной сборки актин стержня.
Некоторые важные шаги протокола включают в себя следующее: В шаге 3.8, эмбрионы должны быть должным образом высушены, чтобы обеспечить успешную инъекцию и лучшее здоровье эмбриона. Время высыхания будет зависеть от температуры окружающей среды и влажности в лаборатории, поэтому рекомендуется практиковать монтаж, высыхание и инъекции с нейтральным буфером рН сначала установить этот параметр для обработки эмбрионов. В шаге 4.5, микроиглы и инъекции настройки должны быть доработаны, чтобы позволить инъекции достаточно G-актинкрасный в эмбрионы. Если в эмбрион вводится слишком мало G-actinRed, актин-стержни могут быть нелегко визуализированы, так как образование актин-стержней зависит от концентрации свободного актина1. Кроме того, будет трудно получить последовательные результаты экспериментов FRAP, если не будет достаточно G-актин красныйвводили, так как интенсивность флуоресценции не будет достаточно высока, чтобы преодолеть фоновую флуоресценцию. Поэтому важно откалибровать размер пузыря каждый раз, когда новая игла загружается и используется. G-actinКрасный вязкий и имеет тенденцию к засорему внутри микроиглы. Иногда это может привести к введению переменного количества G-актина в эмбрионы. Если микроигла засоряется и очистка микроиглы с высоким давлением не удается, это может быть необходимо, чтобы попытаться разорвать кончик микроиглы дальше или даже загрузки нового микроиглы и введения свежего набора эмбрионов. Наконец, в шаге 4.11, эмбрионы должны быть инкубированы при повышенной температуре и в течение достаточного времени для ASR быть индуцированы и стержнейдля формирования 1. Температура всех инкубаторов должна постоянно контролироваться, время переноса эмбрионов из инкубатора в инкубатор должно быть ограничено, а таймер должен использоваться для всех инкубаций. Другие возможные проблемы перечислены в таблице 2 с сопутствующими советами по устранению неполадок.
Одним из основных ограничений этого протокола является то, что для сохранения здоровья эмбрионов во время инъекций, инкубаций и визуализации необходимо позаботиться об исключительной заботе. Протокол был разработан, чтобы максимизировать здоровье эмбриона, и со значительной практикой, исследователь может завершить все этапы протокола с развитием эмбриона прогрессирует со скоростью, ожидаемой натемпературу 31. Вторым ограничением протокола является необходимость микроинъекции буровой установки, которая может быть довольно дорогой и не является обычным оборудованием для каждой летной лаборатории. Однако, если соседняя лаборатория оборудована для инъекций других эмбрионов (например, Ксенопус,Зебрафиш, и Caenorhabditis elegans)или адепт клеток, инъекционная установка используется, вероятно, подходит для инъекций дрозофилы. В этом случае, только форма иглы должны быть адаптированы для эмбрионов Drosophila в соответствии с руководящими принципами Pipette Cookbook29. Кроме того, на рынке есть несколько менее дорогих вариантов микоинаторов (например, аналоговые микроинъекторы), которые могут значительно снизить стоимость сборки буровой установки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Никакого конфликта интересов не объявлено.
Acknowledgments
Авторы с благодарностью признают работу Лиулиу Чжэна и Цзэнхуэй Сюэ, которые помогли пионером этой техники в лаборатории Sokac, а также Хасана Сидэ, который помог с анализом. Работа по этому исследованию финансируется за счет гранта NIH (R01 GM115111).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore-Sigma | A23835G | Component of G buffer |
| Apple juice, Mott's, 64 fl oz | Mott's | 014800000344 | Component of apple juice plates |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Component of apple juice plates |
| Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite | KIK International | 059647210020 | For dechorionating embryos |
| Calcium chloride | Millipore-Sigma | C1016500G | Component of G buffer |
| Cell strainer, 70 μm | Falcon | 352350 | For collecting dechorionated embryos |
| Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan | Zeiss | 0000001994956 | For imaging intranuclear actin rods |
| Desiccant | Drierite | 24001 | For desiccating embryos |
| Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom | Zeiss | 4350649000000 | For arranging embryos on agar wedge |
| Dissecting needle, 5 in | Fisher Scientific | 08965A | For arranging embryos on agar wedge |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP1725 | Component of G buffer |
| Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in | 3M | 021200010323 | For making embryo glue |
| Embryo collection cage | Genessee Scientific | 59100 | For housing adult flies and collecting embryos |
| Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72701D | For arranging embryos on agar wedge |
| Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm | World Precision Instruments, Inc. | TW1004 | For microneedles |
| Halocarbon oil 27 | Millipore-Sigma | H8773100ML | For hydration of embryos |
| Heated stage incubator | Zeiss | 4118579020000, 4118609020000, 4118609010000 | For confocal imaging |
| Lab Tissue Wipers, KimWipes | Kimberly-Clark | 34155 | Lab tissue wipers |
| Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished | Zeiss | Discontinued | Injection microscope |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Millipore-Sigma | H36471KG | Component of apple juice plates |
| Microinjector, FemtoJet4x | Eppendorf | 5253000025 | Microinjector |
| Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 μL | Eppendorf | 5242956003 | For loading microneedles |
| Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment | Bernard Instruments, Inc (Houston, TX) | Custom | For performing microinjections |
| Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown | Sutter Instruments | P97 | For pulling capillary tubes to make microneedles |
| Microscope cover glass 24x50-1.5 | Fisher Scientific | 12544E | For mounting embryos |
| Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm | Fisher Scientific | 22037081 | For mounting embryos for injection |
| n-Heptane | Fisher Scientific | H3601 | Component of embryo glue |
| Objective, 10x | Zeiss | Discontinued | 10x objective for injection microscope |
| Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS | Zeiss | 4217679971711 | 40x water objective for confocal |
| Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm) | Zeiss | 4208529871000 | 25x mixed immersion objective for confocal |
| Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA | Zeiss | 4207829900799 | 63x oil objective for confocal |
| Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2 | Daler-Rowney | 038372016954 | For transferring embryos |
| Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white | Kimberly-Clark | 884266344845 | For blotting cell strainer |
| Pasteur pipette, 5 3/4 in | Fisher Scientific | 1367820A | For covering embryos with oil |
| Petri dish, glass, 100 x 20 mm | Corning | 3160102 | For humid incubation chamber |
| Petri dish, plastic, 60 x 15 mm | VWR | 25384092 | For apple juice plates |
| Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 μL | Eppendorf | 2231000604 | For loading the microneedle |
| Pipette tip, xTIP4 250 μL | Biotix | 63300006 | For adding embryo glue to coverslip |
| Razor blade | VWR | 55411050 | For cutting agar wedge, tape, pipette tips |
| Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4x10 μg) | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | G-actin^Red |
| Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps | Fisher Scientific | 033377 | For making embryo glue |
| Screw top jar, 16 oz | Nalgene | 000194414195 | For desiccating embryos |
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 602104PG | For calibrating volume of G-actin injection |
| Sucrose | Millipore-Sigma | 840971KG | Component of apple juice plates |
| Trizma base | Millipore-Sigma | T15031KG | Component of G buffer |
| Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz | Lesaffre Yeast Corporation | 117929157002 | Component of yeast paste |
References
- Figard, L., et al. Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos. Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).
- Ashworth, S. L., et al. ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion. American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).
- Vandebrouck, A., et al. In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).
- Bamburg, J. R., et al.
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).
- Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress. Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).
- Iida, K., Iida, H., Yahara, I. Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells. Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).
- Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).
- Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin. Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).
- Minamide, L. S., et al. Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods. Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).
- Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons. The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).
- Feldman, M. L., Peters, A. Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus. Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).
- Nishida, E., et al. Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells. Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).
- Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).
- Xue, Z., Sokac, A. M. Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage. The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).
- Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization. Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 393 (2), 209-226 (2014).
- Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. Formins filter modified actin subunits during processive elongation. Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (50), 2477 (2011).
- Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 81, 50750 (2013).
- Carreira-Rosario, A., et al. Recombineering homologous recombination constructs in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (77), 50346 (2013).
- Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microinjection techniques for studying mitosis in the Drosophila melanogaster syncytial embryo. Journal of Visualized Experiments. (31), 1382 (2009).
- Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. Visualizing and tracking endogenous mRNAs in live Drosophila melanogaster egg chambers. Journal of Visualized Experiments. (148), 58545 (2019).
- Wessel, A. D., Gumalla, M., Grosshans, J., Schmidt, C. F. The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology. Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).
- Mollinari, C., González, Microinjection and transgenesis. Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols. Cid-Arregui, A., García-Carrancá, A. , Springer. Berlin. 587-603 (1998).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (49), 2503 (2011).
- Oesterle, A. Pipette Cookbook 2018: P-97 and P-1000 Micropipette Pullers. , Sutter Instruments. Novato, CA. (2018).
- Bownes, M. A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 33 (3), 789-801 (1975).
- Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).
- Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing. Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).
