Summary
O objetivo deste protocolo é injetar actina globular conjugada por Rhodamine em embriões Drosophila e montagem de haste de actina intranuclear de imagem após estresse térmico.
Abstract
O objetivo deste protocolo é visualizar hastes de actina intranucleares que se reúnem em embriões de melanogaster Drosophila vivos após estresse térmico. As hastes actina são uma marca registrada de uma Resposta ao Estresse Actin (ASR) conservada e indutível que acompanha patologias humanas, incluindo doenças neurodegenerativas. Anteriormente, mostramos que o ASR contribui para falhas de morfogênese e viabilidade reduzida do desenvolvimento de embriões. Este protocolo permite o estudo contínuo dos mecanismos subjacentes à montagem da haste actin e do ASR em um sistema modelo altamente favorável à imagem, genética e bioquímica. Os embriões são coletados e montados em uma tampa para prepará-los para injeção. A actina globular conjugada por rhodamina(G-actin Red) é diluída e carregada em uma microacela. Uma única injeção é feita no centro de cada embrião. Após a injeção, os embriões são incubados a temperatura elevada e as hastes de actina intranuclear são então visualizadas por microscopia confocal. A recuperação da fluorescência após experimentos de fotobleaching (FRAP) pode ser realizada nas hastes de actin; e outras estruturas ricas em actina no citoplasma também podem ser imagens. Descobrimos que o G-actinRed polimeriza como g-actina endógeno e não interfere, por si só, no desenvolvimento normal de embriões. Uma limitação deste protocolo é que deve-se tomar cuidado durante a injeção para evitar ferimentos graves no embrião. No entanto, com a prática, injetar G-actinRed em embriões de Drosophila é uma maneira rápida e confiável de visualizar hastes de actina e pode ser facilmente usada com moscas de qualquer genótipo ou com a introdução de outros estresses celulares, incluindo hipóxia e estresse oxidativo.
Introduction
Este protocolo descreve como injetar G-actinRed para visualizar a montagem de hastes de actina intranuclear em embriões estressados pelo calor que estão passando por uma Resposta de Estresse Actina indutível (ASR)1. Desenvolvemos este protocolo para auxiliar estudos do ASR, que em embriões leva à morfogênese interrompida e à viabilidade reduzida, e em tipos de células humanas adultas está associado a patologias incluindo insuficiência renal2,miopatias musculares3,e Alzheimer e Doença de Huntington4,5,6,7,8. Este ASR é induzido por numerosos estresses celulares, incluindo choque térmico9,10,11, estresse oxidativo4,6, síntese ATP reduzida12, e huntingtin anormal ou β-amilóide oligomerização4,5,6,7,9,13,14,15,16. Uma marca registrada do ASR é a montagem de hastes de actina aberrantes no citoplasma ou núcleo das células afetadas, que é impulsionada pela hiperativação induzida pelo estresse de uma proteína interativa de actina, Cofilin1,5,6,10. Infelizmente, permanecem as principais lacunas de conhecimento em relação ao ASR. Por exemplo, a função das hastes de actin não é conhecida. Não entendemos por que as hastes se formam no citoplasma de alguns tipos de células, mas o núcleo de outros. Também não está claro se o ASR é protetor ou mal adaptável para células ou embriões submetidos a estresse. Finalmente, ainda não sabemos os mecanismos detalhados subjacentes à hiperativação de Cofilin ou ao conjunto de hastes actin. Assim, este protocolo fornece um ensaio rápido e versátil para sondar o ASR visualizando a formação e dinâmica da haste actin no sistema experimental altamente tratável do embrião de mosca de fruta viva.
O protocolo para microinjetar G-actinRed em embriões Drosophila vivos foi inicialmente desenvolvido para estudar a dinâmica das estruturas normais de actina citoplasmática17 durante eventos de construção de tecidos. Nesses estudos, descobrimos que a injeçãovermelha G-actin não afetou negativamente os processos de desenvolvimento precoce no embrião, incluindo citocina ou gastraculação17,18. Em seguida, modificamos o protocolo, adaptando o manuseio de embriões e a injeçãovermelha G-actin para permitir a imagem de hastes de actina em embriões estressados pelo calor submetidos ao ASR1. Outros métodos além da injeção de G-actinRed podem ser usados para visualizar actina em embriões. Esses métodos dependem da expressão de proteínas fluorescentes (FPs) marcadas para atuar ou para domínios de proteínas de ligação de actina, como Utrophin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP e Moesin-GFP (revisada em19). No entanto, o uso dessas sondas FP requer cautela, pois podem estabilizar ou interromper algumas estruturas de actina, não rotular igualmente todas as estruturas actin20, e no caso de actin-GFP, são altamente superexpressas – problemáticas para a análise da montagem de haste que não só é dependente do estresse, mas também atua na concentração dependente1. Assim, g-actinred é a sonda preferida para estudos de vara em embriões de mosca, e o grande tamanho do embrião permite sua fácil injeção.
O fluxo de trabalho deste protocolo é semelhante a outras técnicas de microinjeção bem estabelecidas que têm sido utilizadas para injetar proteínas, ácidos nucleicos, drogas e indicadores fluorescentes nos embriões de Drosophila 21,22,23,24,25,26,27. No entanto, após a microinjeção do G-actinRed aqui, os embriões são expostos a um leve estresse térmico para induzir o conjunto de hastes de actina ASR e intranuclear. Para laboratórios com acesso a moscas e uma plataforma de injeção, este método deve ser facilmente implementável e adaptável para linhas específicas de estudo em relação ao ASR, incluindo sua indução por diferentes estresses ou modulação em diferentes origens genéticas.
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Protocol
1. Prepare copos de coleta de embriões e pratos de ágar de suco de maçã
- Cinco dias antes do experimento de injeção, construa28 ou obtenha pelo menos dois pequenos copos de coleta de embriões. Faça pratos frescos de 60 mm de suco de maçã para serem usados com pequenos copos de coleta28. Armazene placas em caixas plásticas cobertas com toalhas de papel úmidas a 4 °C.
NOTA: Pequenos copos de coleta de embriões, preenchidos com números de moscas descritos na etapa 1.3, fornecerão números suficientes de embriões por experimento, ao mesmo tempo em que garantem que o manuseio e a injeção de embriões possam ser feitos em um curto espaço de tempo para permitir imagens de estágios iniciais de desenvolvimento. - Aqueça os pratos de suco de maçã a 18 °C e adicione um pouco de pasta de levedura ao centro da placa. Pasta de levedura é uma pasta simples de levedura ativa e água destilada.
- Para promover a colocação de ovos mais generosa, configure copos de coleta com moscas 2 dias antes do experimento. Adicione pelo menos 100 fêmeas e 50 moscas machos aos copos de coleta, e cubra com um prato de suco de maçã preparado(Figura 1, passo 1). Nos dias que antecederam o experimento de injeção, troque os pratos de suco de maçã pelo menos duas vezes por dia, uma pela manhã e uma vez à noite.
NOTA: Os melhores resultados de injeção e imagem são obtidos quando os copos de coleta de embriões são mantidos a 18 °C com um ciclo de luz de 12 h/luz fora.
2. Prepare uma solução de estoque de trabalho da G-actinRed para microinjeção
NOTA: Esta preparação só faz 2 μL de um estoque de trabalho de 5 mg/mL de G-actinRed, portanto, se os usuários não estão acostumados à técnica de microinjeção, é vantajoso pular para o passo 3 e praticar as microinjeções com um tampão de pH neutro para conservar precioso estoque de trabalho. O estoque de 10 μg de G-actinRed do fornecedor pode ser armazenado em sua embalagem original em um frasco de rosca de 16 oz com ~500 g de dessecante a 4 °C por até 6 meses.
- Prepare uma solução de estoque de buffer G com antecedência: 5 mM Tris-HCl, 0,2 mM CaCl2, pH 8.0. Filtrar e armazenar à temperatura ambiente.
- No dia das injeções, prepare 1 mL de uma solução de trabalho de buffer G em um tubo de microcentrifus de tampa de snap fresco no gelo usando o estoque de buffer G a partir do passo 2.1, complementado com o seguinte nas concentrações finais indicadas: 1 mM dithiothreitol (DTT) e 0,2 mM ATP, pH 8.0.
NOTA: O volume de 1 mL da solução de trabalho com buffer G é mais do que o necessário para um experimento, mas simplifica a preparação. O excesso pode ser descartado após o experimento ou os usuários podem reduzir de acordo com sua preferência.- Mantendo o estoquevermelho G-actin de 10 μg no gelo, adicione primeiro 1 μL de água filtrada e destilada ao topo da gota rosa de G-actinVermelho dentro do tubo.
- Em seguida, adicione 1 μL da solução de trabalho de tampão G recém-preparada a partir da etapa 2.2. Pipetar para cima e para baixo ~20 vezes para misturar bem com o volume de pipeta definido para 1 μL. O estoque G-actinRed estará agora na diluição final de 5 mg/mL.
- Incubar o G-actinRed preparado por 30 minutos no gelo sem ser perturbado.
- Centrifugar o G-actinRed preparado a 16.000 x g por 20 min a 4 °C em um microcentrifuuge para remover qualquer precipitado.
- Tubo cuidadosamente 1,5 μL do supernacido em um tubo de microcentrifus de tampa de snap fresco no gelo, evitando a pelota rosa escura.
- Armazene o supernanato G-actinRed preparado no gelo por até 6 h até estar pronto para carregar em uma microaceria.
NOTA: As microaídas podem ser retiradas dos tubos capilares com antecedência em um puxador de micropipette, depois armazenadas à temperatura ambiente em uma tira de argila modeladora em uma placa de Petri de 100 x 20 mm. Os parâmetros sugeridos para a retirada de microaícetas podem ser encontrados no Pipette Cookbook29.
3. Colete embriões e monte para injeção
- Deixe as moscas colocarem embriões por 30 minutos em pratos de suco de maçã com pasta de levedura a 18 °C.
- Enquanto as moscas estão colocando, pré-aqueça um prato de ágar de suco de maçã sem pasta de levedura à temperatura ambiente, corte uma cunha retangular de 4 cm x 1 cm de ágar de suco de maçã com uma lâmina de barbear, e coloque em uma lâmina de vidro de 25 mm x 75 mm.
- Colher placa da coleção de 30 minutos e descorionato embriões derramando alvejante fresco, diluído 1:1 com água destilada, sobre a placa e rodopiando a placa por 1 min, como descrito em28 (Figura 1, passo 2).
NOTA: Diferentes marcas de alvejante são vendidas em diferentes concentrações. O alvejante usado aqui é 6% de hipoclorito de sódio da garrafa e é diluído para uma concentração final de 3% de hipoclorito de sódio. Outras marcas alvejantes em concentrações ligeiramente menores funcionarão igualmente bem. - Despeje o alvejante e os embriões descolados em uma cesta de coleta (um coador de células de 70 μm) e enxágue a placa duas vezes com água destilada de uma garrafa de esguicho, adicionando essas lavagens à cesta de coleta.
- Enxágue vigorosamente os embriões descoresados na cesta de coleta com água destilada até que não sejam visíveis os aglomerados de leveduras e a cesta não deixe marcas cor-de-rosa do excesso de alvejante quando manchada em uma toalha de papel.
- Colher placa da coleção de 30 minutos e descorionato embriões derramando alvejante fresco, diluído 1:1 com água destilada, sobre a placa e rodopiando a placa por 1 min, como descrito em28 (Figura 1, passo 2).
- Usando um pincel com cerdas umedecidas com água destilada, transfira embriões descolados e lavados da cesta de coleta para a cunha de ágar de suco de maçã preparada no escorregador de vidro.
- Use um par de pinças de ponta fina ou uma agulha dissecando para organizar dez embriões em linha reta ao longo do eixo longo da cunha de ágar retangular(Figura 1, passo 3). Disponha os embriões frente a frente, de tal forma que seu polo anterior esteja voltado para o lado direito e dorsal esteja voltado para o pesquisador (Figura 1, passo 3, ampliado).
- Corte 0,5 cm da extremidade de uma ponta de pipeta P200 com uma lâmina de barbear e mergulhe na "cola de embrião" (descrita em28). Cubra generosamente uma região de 5 mm de largura(Figura 1, passo 4) ao longo da borda longa de uma tampa retangular de 24 mm x 50 mm, e deixe secar, cola lateral para cima. A secagem levará ~30 s e estará completa quando toda a região revestida de cola parecer fosca em vez de molhada ou brilhante.
NOTA: Prepare "cola de embrião" com pelo menos 48h de antecedência. Adicione n-Heptane a tiras de fita dupla face em um frasco de cintilação como descrito em28. - Uma vez que a "cola de embrião" tenha secado, coloque suavemente o lado da cola do deslizamento de cobertura para baixo na parte superior da linha de embriões alinhados no ágar, deixando 2-3 mm de espaço entre a borda da tampa e a linha de embriões.
NOTA: Enfiar os embriões muito perto da borda da tampa pode levar os embriões a secarem demais durante o experimento. - Vire a tampa para que os embriões estejam agora voltados para cima. Eles devem ficar presos em uma linha ao longo de uma borda longa da tampa, e sua região ventral de frente para a borda mais próxima do deslizamento de tampas (Figura 1, passo 4, ampliada).
- Dessecado os embriões colocando o deslizamento de tampas com embriões suavemente em cima de 150 g de dessecante azul fresco armazenado em um frasco de rosca de 16 oz. Aparafusar firmemente a tampa e incubar por 8-10 min(Figura 1, passo 5).
- Após a dessecação, remova o deslizamento do frasco dessecante e tape cada lado curto da tampa para um slide de microscópio, lado embrião para cima,com duas peças de 4 cm2 de fita dupla face para que o deslizamento de embrião se encaixe no estágio de injeção (Figura 1, passo 6).
- Adicione 2-3 gotas de óleo halocarboneto 27 com uma pipeta Pasteur para cobrir os embriões alinhados e proteja-os de mais desidratação(Figura 1, passo 6).
4. Embriões de injeção e estresse térmico para promover a formação de varas de actina
NOTA: Todas as injeções são feitas em uma sala controlada pela temperatura a 18 °C.
- Preparem câmaras de incubação úmidas a partir de uma placa de vidro Petri de pelo menos 100 mm x 20 mm de tamanho e forrem a câmara com torções de limpadores de tecido de laboratório umedecidos com água destilada(Figura 1,passo 8). Pré-aqueça as câmaras de incubação a 32 °C ou a temperatura de incubação desejada antes de injetar embriões.
- Abra a válvula de fluxo de ar para o microinjetor e ligue o microinjetor (ar comprimido ou ar da casa com uma pressão de pelo menos 90 psi é adequado).
- Enquanto os embriões estão dessecando, recarregue o supernatante G-actinRed previamente preparado no microaícedo usando uma ponta de micro carregadeira. Defina a pipeta para elaborar 1-1.5 μL.
NOTA: Devido à viscosidade do actin, os volumes de carregamento podem não ser precisos e pode haver ato suficiente para carregar pelo menos mais uma a duas microasselas. Até 60 embriões podem ser injetados por microaícedo carregado se o microacle for calibrado corretamente e não ficar entupido durante o experimento. - Coloque o microagulha no suporte da agulha e aperte o parafuso. Conecte o tubo de ar ao microinjetor e certifique-se de que a pressão de backflow sobre o microativo se equilibra a 30 hPa.
- Calibrar as configurações do microinjetor para expelir uma bolha de 100 μm de diâmetro de G-actinRed (~500 pL) em um micrômetro de lâmina. Gire o botão de pressão (500-1500 hPa) e o botão de tempo de pulso de injeção (0,1-0,5 s) no microinjetor para obter o tamanho certo da bolha. Ajuste essas configurações cada vez que um novo microacle é carregado para explicar a variabilidade na viscosidade actina e no tamanho da ponta do microacele.
NOTA: O G-actinRed preparado é viscoso e pode haver ar na ponta do microaclel que deve ser expelido antes de injetar embriões. Se o G-actinRed não expulsar prontamente da ponta do microacle, quebre suavemente a ponta da microaceção contra a borda do micrômetro de lâmina. - Coloque o slide com embriões montados no estágio do microscópio.
NOTA: Cada injeção configurada será diferente, então os pesquisadores terão que ajustar seu método de injeção de acordo. Aqui os embriões são movidos em relação a um microaícedo estacionário, injetando cada embrião executando o embrião no microaídole. - Ajuste o estágio do micromanipulador e o foco do objetivo de 10x no microscópio de luz para que os embriões sejam visíveis. Os embriões estão no plano focal correto quando os contornos da membrana vitellina são mais nítidos e o embrião parece maior. Escolha embriões para injetar que estejam no estágio correto de desenvolvimento, de modo que, quando a incubação pós-injeção estiver completa, a maior parte da embreagem atinja o estágio de desenvolvimento desejado (por exemplo, injete embriões no estágio 2-330 de Bownes para observar hastes na celularização após estresse térmico a 32 °C).
- Use os controles de microagulha para trazer a agulha para o mesmo plano focal que os embriões.
NOTA: Se o microacle pegar na tampa enquanto move o palco ou microacle, então o microacle está muito perto do slide e não está no plano focal correto. A microacle deve ser paralela à mancha de cobertura, e não em um ângulo significativo(Figura 1, passo 7). - Insira o microagundo no embrião para que ele atinja o embrião no meio de sua região ventral, no embrião "equador". Injeção de gatilho com o pedal do pé ou botão "injetar" quando a ponta do microaclese é visível dentro do meio do embrião (Figura 1, passo 7).
- Injete oG-actin Red uma vez e remova lentamente a microacela. Mova o palco e repita para cada embrião do estágio de desenvolvimento apropriado.
NOTA: A expansão do embrião é normal, pois overmelho G-actin é injetado e um pouco de citoplasma pode vazar do embrião. - Depois de todos os embriões terem sido injetados, coloque o slide com os embriões na câmara de incubação úmida preparada e feche a tampa(Figura 1, passo 8). Se tentar obter embriões que atinjam a cellularização, o calor estressa os embriões a 32 °C por 60-75 min na câmara de incubação úmida.
NOTA: São observados tempos de incubação que permitem a visualização de hastes em embriões estressados pelo calor. O tempo de incubação será maior para embriões de controle de estresse térmico, pois o desenvolvimento será mais lento a uma temperatura mais baixade 31. Estes embriões de controle podem ser incubados em câmaras úmidas a temperaturas como 18 °C ou 25 °C, dependendo do desenho do experimento específico e da pergunta a ser feita. O tempo mínimo de incubação necessário para que oVermelho G-actin se difundir ao longo do embrião seja de 30 minutos.
5. Hastes de actina de imagem em embriões estressados pelo calor estressado por microscopia confocal
- Enquanto os embriões estão sendo estressados pelo calor, ligue o microscópio confocal e selecione o canal laser de 561 nm.
- Mova a lente objetiva (25x, 40x ou 63x recomendada) para a posição de trabalho.
- Se a imagem de calor estressou embriões, então ajuste a incubadora de estágio aquecido para alcançar uma temperatura interna de 32 °C. Um termômetro de ponto e tiro ou infravermelho pode ser usado para verificar a temperatura em ou perto do objetivo.
- Remova a lâmina com embriões injetados da câmara de incubação úmida após a incubação ser concluída(Figura 1, etapa 9).
- Trabalhando rapidamente, retire suavemente as peças de fita de dupla face que foram usadas para aderir ao deslizamento com embriões montados ao slide(Figura 1, passo 9).
ATENÇÃO: Seja gentil durante essas etapas, pois as manchas podem facilmente quebrar se muita força for aplicada. - Coloque duas peças de 2,5 cm de comprimento de fita dupla face e corte a fita ao meio do comprimento para fazer duas tiras, 2,5 x 0,5 cm de comprimento(Figura 1,passo 10).
- Coloque dois terços do comprimento de cada tira de fita na primeira tampa, flanqueando cada lado dos embriões em óleo halocarbono 27(Figura 1, passo 10, laranja), deixando um terço das tiras de fita penduradas na borda da primeira tampa onde os embriões estão presos. Use as mãos enluvadas e tenha cuidado para não tocar nos embriões durante esta etapa.
- Coloque delicadamente uma segunda mancha retangular em cima das tiras de fita para sanduíche dos embriões entre as tampas(Figura 1, passo 10, azul). Alinhe as bordas de 25 mm, mas mantenha as bordas de 50 mm compensadas umas das outras em 1 cm de largura.
NOTA: Esta segunda superfície completa da tampa se tornará a nova superfície de imagem que enfrentará a lente objetiva, por isso tome cuidado para não obter impressões digitais ou óleo halocarboneto 27 nesta segunda superfície de deslizamento de cobertura. O deslocamento é necessário para que o óleo extra halocarboneto 27 possa ser adicionado para imergir uniformemente os embriões. Se necessário, adicione óleo halocarboneto 27 na costura onde as duas tampas se encontram na parte superior do sanduíche e ele irá revestir os embriões por ação capilar (ver linhas tracejadas na Figura 1, passo 10). - Bata suavemente nas áreas do deslizamento que estão diretamente no topo das tiras de fita com o lado contundente de um razorblade para obter o deslizamento de tampa para aderir à fita.
- Vire o sanduíche de deslizamento de tampa e coloque em um limpador de tecido de laboratório para manter a superfície de imagem limpa e leve para o microscópio confocal(Figura 1, passo 11). Certifique-se de que a fita está completamente presa em ambos os clipes antes da imagem.
- Confirme se o estágio aquecido está à temperatura e se usar um microscópio invertido, adicione líquido de imersão na lente objetiva selecionada.
- Coloque o sanduíche de deslizamento no palco cuidadosamente para garantir que a nova superfície de imagem (2nd coverlip) seja aquela que toca o líquido de imersão(Figura 1, passo 11).
NOTA: Se necessário, adere ao sanduíche de deslizamento de tampas ao palco com dois pequenos pedaços de fita dupla face para evitar movimentos desnecessários durante a imagem se as manchas não se encaixarem bem na fase aquecida. - Concentre-se em um embrião que esteja em celularização (estágio Bownes 4a30) ou estágio de desenvolvimento desejado usando luz transmitida ou fluorescência.
- Uma vez que um embrião tenha sido colocado em foco, mude para o modo de aquisição a laser no microscópio confocal e ajuste a potência e ganho do laser, tamanho do quadro, revestimento e configurações de projeção conforme desejado.
- Veja imagens de visão de superfície através dos planos focais dos núcleos do embrião para encontrar hastes de actina intranuclear. As hastes devem aparecer em múltiplas orientações como listras brilhantes ou pontos dentro dos núcleos relativamente escuros(Figura 2A, 2C).
6. Experimentos alternativos de imagem
- Realize frap para investigar a rotatividade de actina ao longo do comprimento de hastes de actina intranuclear ou em estruturas de actina citoplasmática, como as pontas dos sulcos da membrana plasmática durante a cellularização.
- No software de imagem, escolha uma região retangular em torno de pontas de sulco ou hastes de actin para adquirir o experimento.
- Escolha uma pequena região quadrada do centro de uma haste actin dentro da região de aquisição retangular para alvejar. Certifique-se de que as pontas da haste actin são visíveis e não fiquem branqueadas durante o curso do experimento para permitir um rastreamento preciso da haste dentro do núcleo.
- Defina o laser de alvejante para iterar 50x e defina a potência do laser alvejante ao máximo.
- Escolha um curso de tempo para adquirir imagens a cada segundo para um total de até 120 s a velocidade máxima de consumo de pixels e ajuste o laser para alvejar após os dois primeiros segundos de aquisição de imagem.
- Quantifique os dados para determinar o intervalo darecuperaçãoda fluorescência 1 .
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Representative Results
Um fluxo de trabalho esquemático de manuseio de embriões é retratado na Figura 1, e um cronograma para um experimento típico é apresentado na Tabela 1. Uma estimativa para um bom resultado experimental é que para cada 10 embriões injetados, pelo menos metade dos embriões vistos estará no estágio correto de desenvolvimento, não danificado, e exibirá um ASR robusto com estresse térmico a 32 °C. Este ASR será evidenciado pela montagem de hastes de actina intranuclear, como mostrado na imagem de visão de superfície representativa de um embrião na Figura 2A (painel direito). As hastes actina aparecerão em várias orientações (paralelas ou perpendiculares ao plano de imagem) dentro dos núcleos e podem ser imagens através de vários planos focais. Em comparação, os embriões de controle incubados a 18 °C não exibirão hastes de actin(Figura 2A, painel esquerdo). Os núcleos por cento contendo hastes podem ser quantificados, como demonstrado na Figura 2B. Além disso, experimentos FRAP podem ser realizados em hastes(Figura 2C). Um método de quantificação sugerido para dados FRAP é referenciado em1 e um exemplo de um gráfico de recuperação de fluorescência para uma região branqueada versus não branqueada de uma haste de actin é mostrado na Figura 2D.
Se um embrião for severamente danificado pela injeção ou ficar muito seco durante o experimento, a assincronia mitótica pode ser observada e a celularização será interrompida. Às vezes, as hastes podem não ser visíveis por causa da falha em ter a actina suficiente injetada no embrião. Se isso acontecer, certifique-se de que a quantidade de G-actinRed injetado é de 500 pL (medido com um micrômetro na etapa 4.5) e confirme que essa quantidade permanece consistente entre os embriões fazendo uma injeção de teste no óleo circundante para verificar o tamanho da bolhavermelha G-actin entre cada microinjeção de embriões. Além disso, para garantir a visualização da haste, trabalhe rapidamente para adicionar o deslizamento de tampa e mover os embriões para o estágio de microscópio aquecido uma vez que eles são retirados da câmara úmida na etapa 5.4, pois o conjunto da haste é reversível1 e as hastes podem desmontar se os embriões forem mantidos a uma temperatura inferior a 32°C por mais de 30 minutos.
Figura 1: Visão geral esquemática do manuseio de embriões durante o experimento. (1) Moscas adultas em copos de coleta de embriões colocam embriões em pratos de ágar de suco de maçã. (2) Os embriões são descorrioados com 1:1 água alvejada: destilada, derramada em uma cesta de coleta e completamente lavada com água destilada para remover alvejante e detritos. (3) Os embriões são transferidos com um pincel para uma cunha retangular de suco de maçã em um escorregador e dispostos em seus lados, cabeça-a-cauda, com região dorsal voltada para a borda do ágar. (4) Uma região de 5 x 50 mm de um deslizamento de vidro (laranja) é revestida com "cola de embrião" e pressionada suavemente para baixo na fileira de embriões dispostos no ágar para aderir ao deslizamento de cobertura. (5) O deslizamento com embriões é invertido para que os embriões enfrentem. Os embriões são dessecados em um frasco de rosca. (6) Imediatamente após a proficação, o deslizamento é colado a um slide, embriões voltados para cima e embriões são cobertos com óleo halocarboneto 27. (7) Um microagulha previamente carregado com vermelho G-actin preparado é usado para fazer uma única injeção no centro da região ventral de cada embrião, com agulha posicionada paralelamente à mancha de cobertura. (8) Após a injeção, os embriões são incubados dentro de uma placa de Petri umidificada com limpadores de tecido de laboratório úmidos na temperatura de controle (18 °C) ou com estresse térmico (32 °C). (9) Após a incubação, a mancha de cobertura com os embriões sobre ele é removida do slide. (10) Duas peças de fita dupla face são colocadas em camadas uma em cima da outra, cortadas ao meio do comprimento e colocadas em ambos os lados do óleo ao redor dos embriões na primeira mancha de cobertura. Uma segunda mancha de cobertura (azul) é colocada em cima da primeira para criar uma nova superfície de imagem, compensada de modo que deixe uma lacuna para que mais óleo seja adicionado para cobrir os embriões conforme necessário. (11) Se a imagem em um microscópio confocal invertido, o sanduíche de deslizamento de cobertura é invertido de modo que o segundo deslizamento de cobertura enfrenta o objetivo. A imagem é feita em uma câmara incubada, e as hastes de actina são visualizadas sobre vários planos focais dos núcleos de cada embrião. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Resultados representativos de hastes de actina em embriões estressados pelo calor. (A) As hastes de actina não são vistas em um embrião que foi incubado à temperatura de controle de 18 °C (painel esquerdo), mas são vistas nos núcleos de um embrião que foi estressado pelo calor a 32 °C (painel direito). (B) Quantificação do percentual de núcleos com hastes actinas de um experimento representativo. Cada ponto representa um embrião onde varas e núcleos foram contados em toda a região imagem (n = 22 embriões a 18 °C; n = 23 embriões a 32 °C; barras de erro mostram desvio padrão). O teste t de um aluno, com variância desigual assumida, foi usado para calcular o valor p. (C) Uma série temporal representativa mostra FRAP em uma haste actin. A porção da haste que foi branqueada é indicada por uma ponta de flecha branca. O pré-alvejante é 2 s antes do passo alvejante. Tempo = 0 s é o passo do alvejante, e a recuperação da fluorescência foi rastreada até os 60 ºC pós-alvejante. (D) Uma trama mostra a dinâmica de recuperação da fluorescência actin em uma região branqueada de uma haste, em comparação com uma região não branqueada na mesma haste. As hastes são notavelmente estáveis e a actin dentro delas não faz volume de negócios. Assim, nenhuma recuperação é vista. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Fluxo de trabalho experimental com cronograma sugerido. Este cronograma resume o tempo esperado para completar cada etapa do protocolo.
| Ordem | Passo | Tempo necessário para cada etapa | Descrição |
| 1 | 1.1 | 5 dias de antecedência | Faça gaiolas de coleta de embriões. Despeje pratos de ágar de suco de maçã. |
| 2 | 1.2-1.3 | 2 dias de antecedência | Montar gaiolas de coleta com moscas adultas masculinas e femininas. |
| 3 | 2.6 Nota | 1 dia de antecedência | Puxe tubos capilares para fazer microaídas. |
| 4 | 2.1-2.6 | 1 h | Prepare G-actin. |
| 5 | 3.1 | 30 min. | Permita que as moscas coloquem ovos. |
| 6 | 3.2-3.10 | 15-30 min | Coletar, montar, dessiccate embriões. Cubra embriões com óleo. |
| 7 | 4.1 | 30 min de antecedência | Prepare câmaras de incubação úmidas. |
| 8 | 4.2-4.4 | 1 min | Carregar microaída. |
| 9 | 4.5-4.10 | 10-20 min | Calibrar o tamanho da bolha G-actin e injetar embriões. |
| 10 | 4.11 | 30 min-1+ h | Incubar/aquecer embriões de estresse. |
| 11 | 5.1-5.3 | 1h de antecedência | Ligue o microscópio e o estágio de incubação. |
| 12 | 5.4-5.10 | 5 min. | Embriões de sanduíche entre tampas para imagens. |
| 13 | 5.11-6.6 | 15 min-1+ h | Imagem de actina intranuclear em embriões. |
Tabela 2: Sugestões de solução de problemas. Esta tabela fornece sugestões para a solução de problemas para ajudar na conclusão bem sucedida do protocolo.
| Problema potencial | Sugestões |
| Moscas não colocam embriões suficientes. | Configure o copo com pelo menos 5 dias de antecedência (consulte as etapas 1.1-1.3). Troque as placas 3x por dia que antecedem o experimento para incentivar a colocação de ovos. Deixe as moscas colocarem embriões por 1 h em vez de 30 min. Montar copos com moscas jovens adultas. |
| Nenhum G-actin é expulso do microaícedo. | Aumente as configurações de pressão e tempo no microinjetor. Quebre ainda mais a ponta da microacele (consulte a etapa 4.5 Nota). Já que os grandes tamancos podem não limpar, carregue uma nova agulha. |
| Difícil calibrar um tamanho de bolha pequeno o suficiente. | Ajuste as configurações de pressão e tempo (consulte a etapa 4.5). Uma vez que a abertura da ponta da microagulha pode ser muito grande, carregue uma agulha nova. |
| Os embriões liberam da cola na tampa durante a injeção. | Ajuste a consistência de "cola de embrião" para deslizamentos de cobertura futuras adicionando mais fita dupla face à solução heptana (consulte a etapa 3.5 Nota). |
| Embriões secam durante a incubação da temperatura. | Certifique-se de que o slide está nivelado na câmara de incubação (consulte a etapa 4.11) e que o óleo não está tocando em nada que possa afastá-lo. Adicione gotas extras de óleo aos embriões. Diminua o tempo de profetação pré-injeção (consulte a etapa 3.8). |
| O óleo não cobre completamente os embriões entre a primeira e a segunda tampas. | Adicione óleo extra através de ação capilar à pequena lacuna entre as tampas (consulte a etapa 5.8 Nota). |
| As hastes de actina intranuclear não são visíveis em embriões estressados pelo calor. | Injete um volume maior de G-actin (consulte a etapa 4.5). Confirme que a temperatura tanto da incubação pós-injeção (refere-se à etapa 4.11) quanto da câmara de imagem são de 32 °C (consulte a etapa 5.3). |
| Grandes bolhas de G-actin são visíveis ao redor do local de injeção de embriões. | Injete um volume menor de G-actin (consulte a etapa 4.5). Aumente o tempo de dessecação do embrião para promover uma melhor retenção da actina injetada dentro do embrião (consulte a etapa 3.8). |
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Discussion
A importância deste método é que utiliza o protocolo bem estabelecido de microinjeção em embriões Drosophila 21,22,23,24,25,26,27 para viabilizar novas pesquisas sobre o ASR e a montagem da haste actin. Uma grande vantagem de injetar G-actinRed em embriões vivos é que o ASR pode ser estudado sob uma variedade de contextos. Para estudos futuros, esses contextos podem incluir injetar embriões de outros genótipos como parte de uma tela mutante ou expor embriões injetados a diferentes condições de estresse, como estresse oxidativo4,32. Embora não descrito em detalhes aqui, esta técnica de injeção também pode ser modificada para injetar ácidos nucleicos, outras proteínas, drogas e corantes indicadores (por exemplo, ver21,22,23,24,32) para estudar o ASR. Assim, este método apresenta uma série de abordagens para identificar a gama de tensões que induzem as RS, caracterizando ainda mais as respostas celulares durante a ASR (por exemplo, mudanças na atividade mitocondrial) e a descoberta de novas moléculas e mecanismos subjacentes à montagem da haste de actina intranuclear.
Algumas etapas críticas do protocolo incluem: Na etapa 3.8, os embriões devem ser devidamente dessecados para garantir a injeção bem sucedida e a melhor saúde do embrião. O tempo de dessecação dependerá da temperatura ambiente e da umidade do laboratório, por isso recomenda-se praticar a montagem, dessecação e injeções com um tampão de pH neutro primeiro para estabelecer este parâmetro para o manuseio dos embriões. Na etapa 4.5, as configurações de microavermelh e injeção devem ser ajustadas para permitir a injeção de G-actinRed suficiente em embriões. Se muito pouco G-actinRed for injetado no embrião, as hastes actina podem não ser facilmente visualizadas, uma vez que a formação de hastes de actin depende da concentração de ato livre em1. Além disso, será difícil obter resultados consistentes de experimentos FRAP se não houver injeção suficiente de G-actinRed, uma vez que a intensidade da fluorescência não será alta o suficiente para superar a fluorescência de fundo. Portanto, é importante calibrar o tamanho da bolha cada vez que uma nova agulha é carregada e usada. G-actinRed é viscoso e tende a entupir dentro do microaclese. Às vezes, isso pode levar à injeção de quantidades variáveis de G-actin nos embriões. Se o microatado estiver entupido e limpar o microaícedo com alta pressão falhar, pode ser necessário tentar quebrar ainda mais a ponta do microacele ou até mesmo carregar um novo microaído e injetar um conjunto fresco de embriões. Finalmente, na etapa 4.11, os embriões devem ser incubados a temperatura elevada e por tempo suficiente para que o ASR seja induzido e as hastes se formem1. As temperaturas de todas as incubadoras devem ser constantemente monitoradas, o tempo para transferir embriões da incubadora para a incubadora deve ser limitado, e um temporizador deve ser usado para todas as incubações. Outros possíveis problemas estão listados na Tabela 2 com dicas de solução de problemas.
Uma das principais limitações deste protocolo é que deve-se tomar um cuidado excepcional para preservar a saúde dos embriões durante injeções, incubações e imagens. O protocolo foi projetado para maximizar a saúde dos embriões e, com uma prática significativa, um pesquisador pode completar todas as etapas do protocolo com o desenvolvimento de embriões progredindo nas taxas esperadas por temperatura31. Uma segunda limitação do protocolo é a necessidade de uma plataforma de microinjeção, que pode ser bastante cara e não é equipamento comum para todos os laboratórios de moscas. No entanto, se um laboratório adjacente estiver equipado para injetar outros embriões (por exemplo, Xenopus, Zebrafish e Caenorhabditis elegans) ou células aderentes, a plataforma de injeção usada é provavelmente adequada para injeções de Dphilrosoa. Nesse caso, apenas a forma da agulha precisa ser adaptada para embriões de Drosophila de acordo com as diretrizes do Pipette Cookbook29. Alternativamente, existem algumas opções de micoinjector menos caras no mercado (por exemplo, microinjetores analógicos), o que pode reduzir significativamente o custo de montagem de uma plataforma de injeção.
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Disclosures
Nenhum conflito de interesses declarado.
Acknowledgments
Os autores reconhecem com gratidão o trabalho de Liuliu Zheng e Zenghui Xue, que ajudaram a pioneira nesta técnica no laboratório Sokac, bem como Hasan Seede, que ajudou na análise. O trabalho deste estudo é financiado por uma bolsa do NIH (R01 GM115111).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore-Sigma | A23835G | Component of G buffer |
| Apple juice, Mott's, 64 fl oz | Mott's | 014800000344 | Component of apple juice plates |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Component of apple juice plates |
| Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite | KIK International | 059647210020 | For dechorionating embryos |
| Calcium chloride | Millipore-Sigma | C1016500G | Component of G buffer |
| Cell strainer, 70 μm | Falcon | 352350 | For collecting dechorionated embryos |
| Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan | Zeiss | 0000001994956 | For imaging intranuclear actin rods |
| Desiccant | Drierite | 24001 | For desiccating embryos |
| Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom | Zeiss | 4350649000000 | For arranging embryos on agar wedge |
| Dissecting needle, 5 in | Fisher Scientific | 08965A | For arranging embryos on agar wedge |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP1725 | Component of G buffer |
| Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in | 3M | 021200010323 | For making embryo glue |
| Embryo collection cage | Genessee Scientific | 59100 | For housing adult flies and collecting embryos |
| Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72701D | For arranging embryos on agar wedge |
| Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm | World Precision Instruments, Inc. | TW1004 | For microneedles |
| Halocarbon oil 27 | Millipore-Sigma | H8773100ML | For hydration of embryos |
| Heated stage incubator | Zeiss | 4118579020000, 4118609020000, 4118609010000 | For confocal imaging |
| Lab Tissue Wipers, KimWipes | Kimberly-Clark | 34155 | Lab tissue wipers |
| Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished | Zeiss | Discontinued | Injection microscope |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Millipore-Sigma | H36471KG | Component of apple juice plates |
| Microinjector, FemtoJet4x | Eppendorf | 5253000025 | Microinjector |
| Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 μL | Eppendorf | 5242956003 | For loading microneedles |
| Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment | Bernard Instruments, Inc (Houston, TX) | Custom | For performing microinjections |
| Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown | Sutter Instruments | P97 | For pulling capillary tubes to make microneedles |
| Microscope cover glass 24x50-1.5 | Fisher Scientific | 12544E | For mounting embryos |
| Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm | Fisher Scientific | 22037081 | For mounting embryos for injection |
| n-Heptane | Fisher Scientific | H3601 | Component of embryo glue |
| Objective, 10x | Zeiss | Discontinued | 10x objective for injection microscope |
| Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS | Zeiss | 4217679971711 | 40x water objective for confocal |
| Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm) | Zeiss | 4208529871000 | 25x mixed immersion objective for confocal |
| Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA | Zeiss | 4207829900799 | 63x oil objective for confocal |
| Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2 | Daler-Rowney | 038372016954 | For transferring embryos |
| Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white | Kimberly-Clark | 884266344845 | For blotting cell strainer |
| Pasteur pipette, 5 3/4 in | Fisher Scientific | 1367820A | For covering embryos with oil |
| Petri dish, glass, 100 x 20 mm | Corning | 3160102 | For humid incubation chamber |
| Petri dish, plastic, 60 x 15 mm | VWR | 25384092 | For apple juice plates |
| Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 μL | Eppendorf | 2231000604 | For loading the microneedle |
| Pipette tip, xTIP4 250 μL | Biotix | 63300006 | For adding embryo glue to coverslip |
| Razor blade | VWR | 55411050 | For cutting agar wedge, tape, pipette tips |
| Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4x10 μg) | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | G-actin^Red |
| Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps | Fisher Scientific | 033377 | For making embryo glue |
| Screw top jar, 16 oz | Nalgene | 000194414195 | For desiccating embryos |
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 602104PG | For calibrating volume of G-actin injection |
| Sucrose | Millipore-Sigma | 840971KG | Component of apple juice plates |
| Trizma base | Millipore-Sigma | T15031KG | Component of G buffer |
| Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz | Lesaffre Yeast Corporation | 117929157002 | Component of yeast paste |
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