Summary
Bu protokolün amacı, Rhodamine konjuge globüler aksini Drosophila embriyolarına enjekte etmek ve ısı stresini takiben intranükleer aksin çubuk tertibatını görmektir.
Abstract
Bu protokolün amacı, ısı stresinden sonra canlı Drosophila melanogaster embriyolarında bir araya gelen intranükleer akin çubuklarını görselleştirmektir. Aktiin çubukları, nörodejeneratif hastalık da dahil olmak üzere insan patolojilerine eşlik eden korunmuş, indüklenen Bir Aktün Stres Yanıtı'nın (ASR) ayırt edici özelliğidir. Daha önce, ASR'nin morfogenez başarısızlıklarına ve gelişmekte olan embriyoların canlılığının azalmasına katkıda bulunduğunu gösterdik. Bu protokol, görüntüleme, genetik ve biyokimyaya son derece uygun bir model sisteminde aktin çubuk montajının ve ASR'nin altında bulunan mekanizmaların sürekli incelenmesini sağlar. Embriyolar toplanır ve enjeksiyona hazırlamak için bir kapak kapağına monte edilir. Rhodamine konjuge globüler aktilin (G-actinRed)seyreltilir ve bir mikroneedle yüklenir. Her embriyonun ortasına tek bir enjeksiyon yapılır. Enjeksiyondan sonra embriyolar yüksek sıcaklıkta inkübe edilir ve intranükleer aksin çubukları daha sonra konfokal mikroskopi ile görselleştirilir. Aktüer çubuklarında fotobleaching (FRAP) deneyleri yapıldıktan sonra floresan iyileşmesi yapılabilir; ve sitoplazmdaki diğer aktin bakımından zengin yapılar da görüntülenebilir. G-actinRed'in endojen G-actin gibi polimerize olduğunu ve kendi başına normal embriyo gelişimine müdahale etmediğini görüyoruz. Bu protokolün bir sınırlaması, embriyonun ciddi yaralanmasını önlemek için enjeksiyon sırasında dikkatli olunması gerektiğidir. Bununla birlikte, pratikte, G-actinRed'i Drosophila embriyolarına enjekte etmek, aktivin çubuklarını görselleştirmenin hızlı ve güvenilir bir yoludur ve herhangi bir genotip sinekle veya hipoksi ve oksidatif stres de dahil olmak üzere diğer hücresel streslerin girmesiyle kolayca kullanılabilir.
Introduction
Bu protokol, indükleyici bir Actin Stres Yanıtı (ASR)1geçiren ısı stresli embriyolarda intranükleer akin çubuklarının montajını görselleştirmek için G-actinRed'in nasıl enjekte edildiğini açıklar. Bu protokolü, embriyolarda morfogenezin bozulmasına ve canlılığın azalmasına yol açan ASR çalışmalarına yardımcı olmak için geliştirdik ve yetişkin insan hücre tiplerinde böbrek yetmezliği2, kas miyopatileri3ve Alzheimer ve Huntington Hastalığı 4 ,5,6,7,8gibi patolojilerle ilişkilidir. Bu ASR, ısı şoku 9 , 10 ,11,oksidatif stres4,6,azaltılmış ATP sentezi12ve anormal Huntingtin veya β-amiloid oligomerizasyon 4 , 5 , 6 ,7,9,13,14,15,16dahil olmak üzere çok sayıda hücresel stres tarafından indüklenmiştir. ASR'nin ayırt edici özelliği, etkilenen hücrelerin sitoplazmasında veya çekirdeğinde anormal aktin çubuklarının montajıdır, bu da aktin etkileşime giren bir proteinin stres kaynaklı hiperaktivasyonu ile tahrik edilir, Cofilin 1,5,6,10. Ne yazık ki, ASR ile ilgili önemli bilgi boşlukları devam etmektedir. Örneğin, akin çubuklarının işlevi bilinmemektedir. Çubukların neden bazı hücre tiplerinin sitoplazmasında, ancak diğerlerinin çekirdeğinde oluştuğunu anlamıyoruz. ASR'nin strese giren hücreler veya embriyolar için koruyucu mu yoksa uyumsuz mu olduğu da açık değildir. Son olarak, Cofilin hiperaktivasyonu veya aktüer çubuk tertibatını temel alan ayrıntılı mekanizmaları hala bilmiyoruz. Bu nedenle, bu protokol, canlı meyve sineği embriyosunun son derece çekişli deneysel sisteminde akin çubuğu oluşumunu ve dinamiklerini görselleştirerek ASR'yi araştırmak için hızlı ve çok yönlü bir test sağlar.
G-actinRed'i canlı Drosophila embriyolarına mikroenja alma protokolü başlangıçta doku oluşturma olayları sırasında normal sitoplazmik aktin yapıların17 dinamiklerini incelemek için geliştirilmiştir. Bu çalışmalarda, G-actinRed enjeksiyonunun sitokinoz veya gastrülasyon dahil olmak üzere embriyodaki erken gelişim süreçlerini olumsuz etkilemediğini bulduk17,18. Daha sonra protokolü değiştirdik, embriyo işleme ve G-actinKırmızı enjeksiyonu, ASR1'dengeçen ısı stresli embriyolarda akin çubuklarının görüntülenmesine izin vermek için uyarladık. Embriyolarda aksini görselleştirmek için G-actinRed enjeksiyonu dışında başka yöntemler de kullanılabilir. Bu yöntemler, Utrophin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP ve Moesin-GFP(19'daincelenmiştir) gibi aktivin bağlayıcı proteinlerin etki alanlarına veya aktivin bağlayıcı proteinlerin etki alanlarına etiketlenmiş floresan proteinleri (FPs) ifade etmeye dayanır. Bununla birlikte, bu FP problarını kullanmak dikkatli olmayı gerektirir, çünkü bazı aksin yapılarını stabilize edebilir veya bozabilirler, tüm akin yapılarını eşit olaraketiketlemezler 20ve akin-GFP durumunda, son derece fazla ifade edilir - sadece strese bağlı değil, aynı zamanda aksin konsantrasyonuna bağımlı olan çubuk tertibatının analizi içinsorunludur 1. Bu nedenle, G-actinRed sinek embriyolarında çubuk çalışmaları için tercih edilen probdur ve embriyonun büyüklüğü kolay enjeksiyonunu sağlar.
Bu protokolün iş akışı, Drosophila embriyolarına proteinler, nükleik asitler, ilaçlar ve floresan göstergeler enjekte etmek için kullanılan diğer köklü mikroenjeksiyon tekniklerine benzer21 , 22,23,24,25,26,27. Bununla birlikte, burada G-actinRed'in mikroenjeksiyonunun ardından embriyolar ASR ve intranükleer aksin çubuk tertibatını teşvik etmek için hafif ısı stresine maruz kalırlar. Sineklere erişimi olan laboratuvarlar ve enjeksiyon teçhizatı için, bu yöntem, farklı stresler tarafından indüksiyonu veya farklı genetik geçmişlerde modülasyon da dahil olmak üzere ASR ile ilgili belirli çalışma hatları için kolayca uygulanabilir ve uyarlanabilir olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Embriyo toplama kapları ve elma suyu agar tabakları hazırlayın
- Enjeksiyon deneyinden beş gün önce,28 tane inşa edin veya en az iki küçük embriyo toplama bardağı temin edin. Küçük toplama bardakları ile kullanılmak üzere taze 60 mm elma suyu agar tabakları yapın28. Tabakları 4 °C'de nemli kağıt havlularla kaplı plastik kutularda saklayın.
NOT: Adım 1.3'te açıklandığı gibi sinek sayılarıyla doldurulan küçük embriyo toplama bardakları, deney başına yeterli embriyo sayısı sağlarken, embriyo elleçleme ve enjeksiyonunun erken gelişim evrelerinin görüntülenmesine izin verecek kadar kısa sürede yapılabilmesini sağlayacaktır. - 18 °C'ye kadar ılık elma suyu tabakları ve tabağın ortasına bir dab maya ezmesi ekleyin. Maya macunu, aktif maya ve damıtılmış suyun basit bir macunudur.
- En cömert yumurtlamayı teşvik etmek için, deneyden 2 gün önce sinekli toplama bardakları kurun. Toplama bardaklarına en az 100 dişi ve 50 erkek sinek ekleyin ve hazır bir elma suyu tabağı ile üst üste koyun (Şekil 1, adım 1). Enjeksiyon deneyine kadar geçen günlerde elma suyu plakalarını her gün en az iki kez, sabahları bir kez ve akşamları bir kez değiştirin.
NOT: En iyi enjeksiyon ve görüntüleme sonuçları, embriyo toplama bardakları 12 saat ışık açma/kapama döngüsü ile 18 °C'de tutulduğunda elde edilir.
2. Mikroenjeksiyon için G-actinRed'in çalışan bir stok çözeltisi hazırlayın
NOT: Bu hazırlık sadece 5 mg / mL çalışma stoğunun 2 μL'sini yapar G-actinRed, bu nedenle kullanıcılar mikroenjeksiyon tekniğine alışık değilse, 3. Satıcıdan alınan 10 μg G-actinRed stoğu, orijinal ambalajında 6 aya kadar 4 °C'de ~500 g kurutuculu 16 oz vidalı üst kavanozda saklanabilir.
- Önceden bir G-tampon stok çözeltisi hazırlayın: 5 mM Tris-HCl, 0,2 mM CaCl2, pH 8,0. Oda sıcaklığında filtreleyin ve saklayın.
- Enjeksiyon gününde, belirtilen son konsantrasyonlarda aşağıdakilerle birlikte G-tampon stoğunu kullanarak buz üzerinde taze bir snap kapağı mikrosantrifüj tüpünde 1 mL G-tampon çalışma çözeltisi hazırlayın: 1 mM dithiothreitol (DTT) ve 0.2 mM ATP, pH 8.0.
NOT: 1 mL'lik G-buffer çalışma çözümü, bir deney için gerekenden daha fazladır, ancak hazırlığı kolaylaştırır. Fazlalık denemeden sonra atılabilir veya kullanıcılar tercihlerine göre ölçeklendirilebilir.- 10 μg G-actinRed stoğunu buzda tutarak, önce tüpün içindeki G-actinRed'in pembe damlacığı üzerine 1 μL filtrelenmiş, damıtılmış su ekleyin.
- Ardından, adım 2.2'den 1 μL soğuk, taze hazırlanmış G-tampon çalışma çözeltisi ekleyin. Pipet hacmi 1 μL'ye ayarlanmışken iyice karıştırmak için ~20 kez yukarı ve aşağı borulayın. G-actinRed stoğu artık 5 mg/mL'lik son seyreltmede olacak.
- Hazırlanan G-actinRed'i buz üzerinde bozulmadan 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- Hazırlanan G-actinRed'i 16.000 x g'da 4 °C'de 20 dakika boyunca bir mikrosantrifüjde santrifüjle kırarak herhangi bir çökeltmeyi çıkarın.
- Süpernatantın 1,5 μL'lik kısmını buz üzerinde taze bir kapak mikrosantrifüj tüpüne dikkatlice borulayarak koyu pembe peletten kaçının.
- Hazırlanan G-actinRed supernatant'ı bir mikroneedle yüklenmeye hazır olana kadar 6 saate kadar buzda saklayın.
NOT: Mikroneedles, bir mikropipette çekme makinesinde peşin olarak kılcal borulardan çekilebilir, daha sonra oda sıcaklığında 100 x 20 mm Petri kabındaki modelleme kil şeridinde saklanabilir. Mikroneedle çekme için önerilen parametreler Pipet Yemek Kitabı29'da bulunabilir.
3. Embriyoları toplayın ve enjeksiyon için monte edin
- Sineklerin 18 °C'de maya macunu ile elma suyu plakalarına 30 dakika boyunca embriyo bırakmasına izin verin.
- Sinekler döşenirken, maya ezmesi olmayan bir elma suyu agar tabağını oda sıcaklığına önceden ısıtın, jiletle elma suyu agarının 4 cm x 1 cm dikdörtgen kamasını kesin ve 25 mm x 75 mm'lik bir cam kaydırağa yerleştirin.
- 30 dakikalık toplamadan hasat plakası ve28'de açıklandığı gibi damıtılmış su ile 1:1 seyreltilmiş taze çamaşır suyu dökülerek ve plakayı 1 dakika döndürerek embriyoları kaynatın (Şekil 1, adım 2).
NOT: Farklı çamaşır suyu markaları farklı konsantrasyonlarda satılmaktadır. Burada kullanılan çamaşır suyu şişeden% 6 sodyum hipoklorittir ve% 3 sodyum hipoklorit nihai konsantrasyonuna seyreltilir. Biraz daha düşük konsantrasyonlardaki diğer çamaşır suyu markaları eşit derecede iyi çalışacaktır. - Çamaşır suyu ve dekonsiyone embriyoları bir toplama sepetine (70 μm hücre süzgeci) dökün ve tabağı bir fışkırtma şişesinden damıtılmış su ile iki kez durulayın ve bu yıkamaları toplama sepetine ekleyin.
- Kafeinsiz embriyoları, maya kümeleri görünmeyene ve sepet bir kağıt havluya şişirildiğinde fazla çamaşır suyundan pembe iz bırakmayana kadar damıtılmış su ile toplama sepetinde kuvvetlice durulayın.
- 30 dakikalık toplamadan hasat plakası ve28'de açıklandığı gibi damıtılmış su ile 1:1 seyreltilmiş taze çamaşır suyu dökülerek ve plakayı 1 dakika döndürerek embriyoları kaynatın (Şekil 1, adım 2).
- Damıtılmış su ile nemlendirilmiş kıllı bir boya fırçası kullanarak, dekonsiyone edilmiş ve yıkanmış embriyoları toplama sepetinden cam slayttaki hazırlanan elma suyu agar kamasına aktarın.
- Dikdörtgen agar kamasının uzun ekseni boyunca on embriyoyu düz bir çizgide düzenlemek için bir çift ince uçlu cımbız veya bir diseksiyon iğnesi kullanın (Şekil 1, adım 3). Embriyoları, ön kutupları sağa bakacak ve dorsal tarafı araştırmacıya bakacak şekilde baş döndürücü olarak düzenleyin(Şekil 1, adım 3, büyütülmüş).
- Bir P200 pipet ucunun ucunun 0,5 cm'lik kısmını jiletle kesin ve "embriyo tutkalına" daldırın(28'deaçıklanmıştır). 24 mm x 50 mm dikdörtgen kapak ucunun uzun kenarı boyunca 5 mm genişliğinde bir bölgeyi cömertçe kaplayın (Şekil 1, adım 4) ve kuru, tutkal tarafını yukarı bırakın. Kurutma ~ 30 s alacaktır ve tutkal kaplı bölgenin tamamı ıslak veya parlak değil mat göründüğünde tamamlanır.
NOT: "Embriyo tutkal" ı en az 48 saat önceden hazırlayın. 28'deaçıklandığı gibi bir scintillation şişesinde çift taraflı bant şeritlerine n-Heptane ekleyin. - "Embriyo tutkalı" kuruduktan sonra, kapak germe tutkal tarafını agar üzerindeki hizalanmış embriyo sırasının üzerine hafifçe yerleştirin ve kapak ucunun kenarı ile embriyo sırası arasında 2-3 mm boşluk bırakın.
NOT: Embriyoları kapak ucunun kenarına çok yakın yapıştırmak, deney sırasında embriyoların çok fazla kurumasına neden olabilir. - Kapak kapağını ters çevirin, böylece embriyolar şimdi yukarı bakacaktır. Kapak çizgisinin uzun bir kenarı boyunca bir çizgide sıkışıp kalmalıdırlar ve ventral bölgeleri kapak çizgisinin en yakın kenarına bakmalıdır(Şekil 1, adım 4, büyütülmüş).
- 16 oz vidalı üst kavanozda saklanan 150 g taze mavi kurutucunun üzerine embriyolarla kapak kapağını hafifçe yerleştirerek embriyoları kurulayın. Kapağı sıkıca vidalayın ve 8-10 dk boyunca kuluçkalayın(Şekil 1,adım 5).
- Tahliyeden sonra, kapak kapağını kurutucu kavanozdan çıkarın ve kapakçığın her kısa tarafını bir mikroskop kaydıramasına bantlayın, embriyo tarafı yukarı, iki adet 4 cm2 çift taraflı bantla, böylece embriyo kapak kapağı enjeksiyon aşamasına sığar (Şekil 1, adım 6).
- Hizalanmış embriyoları örtmek ve daha fazla dehidrasyondan korumak için Pasteur pipetli 2-3 damla Halocarbon 27 yağı ekleyin (Şekil 1, adım 6).
4. Aktüer çubuk oluşumunu teşvik etmek için enjeksiyon ve ısı stresi embriyoları
NOT: Tüm enjeksiyonlar 18 °C'de sıcaklık kontrollü bir odada yapılır.
- Cam petri kabından en az 100 mm x 20 mm boyutunda nemli kuluçka odaları hazırlayın ve odayı damıtılmış su ile nemlendirilmiş laboratuvar doku sileceklerinin bükümleriyle hizalayın (Şekil 1, adım 8). Embriyo enjekte etmeden önce kuluçka odalarını 32 °C'de veya istenen kuluçka sıcaklığında önceden ısıtın.
- Mikroenjektör için hava akımı vanasını açın ve mikroenjektörü açın (en az 90 psi basınçlı basınçlı basınçlı hava veya ev havası uygundur).
- Embriyolar kururken, daha önce hazırlanan G-actinRed süpernatantı mikro yükleyici ucu kullanarak mikroneedle geri yükleyin. Pipet 1-1,5 μL çekecek şekilde ayarlayın.
NOT: Akinin viskozitesi nedeniyle, yükleme hacimleri doğru olmayabilir ve en az bir ila iki mikroneedle daha yüklemek için yeterli aksini kalmış olabilir. Mikroneedle uygun şekilde kalibre edilirse ve deney sırasında tıkanmazsa, yüklenen mikroneedle başına 60 embriyo enjekte edilebilir. - Mikroneedle iğne tutucuya takın ve vidayı sıkın. Hava tüpünü mikroenjektöre bağlayın ve mikroneedle üzerindeki geri akış basıncının 30 hPa'ya kadar dengede olduğundan emin olun.
- Bir slayt mikrometresine 100 μm çapında bir G-actinKırmızısı (~500 pL) kabarcık püskürtmek için mikroenjektör ayarlarını kalibre edin. Doğru kabarcık boyutunu elde etmek için basınç düğmesini (500-1500 hPa) ve enjeksiyon darbe zaman düğmesini (0,1-0,5 s) mikroenjektör üzerinde döndürün. Aktüer viskozitesi ve mikroneedle uç boyutundaki değişkenliği hesaba katmak için her yeni mikroneedle yüklendiğinde bu ayarları yapın.
NOT: Hazırlanan G-actinKırmızısı viskozdur ve mikroneedlenin ucunda embriyo enjekte etmeden önce atılması gereken hava olabilir. G-actinRed mikroneedle ucundan kolayca dışarı atmazsa, mikroneedle ucunu slayt mikrometresinin kenarına doğru hafifçe kırın. - Slaydı monte edilmiş embriyolarla mikroskop aşamasına yerleştirin.
NOT: Kurulan her enjeksiyon farklı olacaktır, bu nedenle araştırmacılar enjeksiyon yöntemini buna göre ayarlamak zorunda kalacaktır. Burada embriyolar sabit bir mikroneedle göre hareket ettirilir ve embriyoyu mikroneedle çalıştırarak her embriyoyu enjekte eder. - 10x hedefinin mikromanipülatör aşamasını ve odak noktasını, embriyoların görünür olması için ışık mikroskobuna ayarlayın. Vitelline zarının ana hatları en keskin olduğunda ve embriyo en büyük göründüğünde embriyolar doğru odak düzlemindedir. Doğru gelişim aşamasında olan enjekte etmek için embriyoları seçin, böylece enjeksiyon sonrası inkübasyon tamamlandığında, debriyajın çoğu istenen gelişim aşamasına ulaşır (örneğin, 32 ° C'de ısı stresinden sonra hücreselleştirmede çubukları gözlemlemek için Bownes'un2-3 30 aşamasında embriyo enjekte edin).
- İğneyi embriyolarla aynı odak düzlemine getirmek için mikroneedle kontrollerini kullanın.
NOT: Aşamayı veya mikroneedleyi hareket ettirirken mikroneedle kapakta yakalanırsa, mikroneedle slayta çok yakındır ve doğru odak düzleminde değildir. Mikroneedle kapak ucuna paralel olmalı ve önemli bir açıda olmamalıdır (Şekil 1, adım 7). - Mikroneedleyi embriyoya yerleştirin, böylece embriyoyu ventral bölgesinin ortasında, embriyo "ekvatorunda" vurur. Mikroneedle ucu embriyonun ortasında göründüğünde ayak pedalı veya "enjekte" düğmesi ile enjeksiyonu tetikleyin (Şekil 1, adım 7).
- G-actinRed'i bir kez enjekte edin ve mikroneedleyi yavaşça çıkarın. Sahneyi hareket ettirin ve uygun gelişim aşamasının her embriyosu için tekrarlayın.
NOT: G-actinRed enjekte edildiği ve embriyodan biraz sitoplazma sızabileceği için embriyonun genişlemesi normaldir. - Tüm embriyolar enjekte edildikten sonra, slaytı embriyolarla birlikte hazırlanan nemli inkübasyon odasına yerleştirin ve kapağı kapatın (Şekil 1, adım 8). Hücreselleşmeye ulaşan embriyolar elde etmeye çalışıyorsanız, nemli inkübasyon odasında 60-75 dakika boyunca embriyoları 32 °C'de ısı stresine sokun.
NOT: Isı stresli embriyoların hücreselleştirilmesinde çubukların görselleştirilmesine izin veren kuluçka sürelerine dikkat edilir. İnkübasyon süresi ısı stres kontrolü olmayan embriyolar için daha uzun olacaktır, çünkü gelişim daha düşük bir sıcaklıkta daha yavaş olacaktır31. Bu kontrol embriyoları, belirli bir deneyin tasarımına ve sorulacak soruya bağlı olarak 18 °C veya 25 °C gibi sıcaklıklarda nemli odalarda inkübe edilebilir. G-actinRed'in embriyo boyunca yayılması için gereken minimum kuluçka süresi 30 dk'dır.
5. Konfokal mikroskopi ile ısı stresli embriyolarda görüntü aktivasyon çubukları
- Embriyolar ısı stresi altındayken, konfokal mikroskobu açın ve 561 nm lazer kanalını seçin.
- Objektif lensi (25x, 40x veya 63x önerilir) çalışma konumuna getirin.
- Görüntüleme embriyoları ısıtıyorsa, ısıtılmış sahne inkübatörü 32 ° C iç sıcaklığa ulaşacak şekilde ayarlayın. Hedefteki veya yakınındaki sıcaklığı kontrol etmek için bir nokta ve çekim veya kızılötesi termometre kullanılabilir.
- Kuluçka tamamlandıktan sonra enjekte edilen embriyolarla slaydı nemli inkübasyon odasından çıkarın (Şekil 1, adım 9).
- Hızlı bir şekilde çalışarak, kapak kapağını monte edilmiş embriyolarla slayta yapıştırmak için kullanılan çift taraflı bant parçalarını hafifçe çıkarın (Şekil 1, adım 9).
DİkKAT: Çok fazla kuvvet uygulandığında kapaklar kolayca parçalanabileceğinden, bu adımlar sırasında nazik olun. - İki adet 2,5 cm uzunluğunda çift taraflı bant parçasını birbirine yapıştırın ve bandı 2,5 x 0,5 cm uzunluğunda iki şerit yapmak için iki uzunlamasına kesin (Şekil 1, adım 10).
- Her bant şeridinin uzunluğunun üçte ikisini ilk kapak ucuna yapıştırın, Halocarbon 27 yağında embriyoların her iki tarafını da kuşatın (Şekil 1, adım 10, turuncu), bant şeritlerinin üçte birini embriyoların sıkıştığı ilk kapak kapağının kenarında asılı bırakın. Eldivenli eller kullanın ve bu adım sırasında embriyolara dokunmamaya dikkat edin.
- Embriyoları kapaklar arasına sandviç yapmak için bant şeritlerinin üzerine hafifçe ikinci bir dikdörtgen örtü yerleştirin(Şekil 1, adım 10, mavi). 25 mm'lik kenarları hizalayın, ancak 50 mm'lik kenarları bir birinden 1 cm genişliğinde tutun.
NOT: Bu ikinci coverlip'in tam yüzeyi objektif lense bakacak yeni görüntüleme yüzeyi olacak, bu nedenle bu ikinci kapaklı yüzeyde parmak izi veya Halocarbon 27 yağı almamaya dikkat edin. Embriyoları eşit şekilde batırmak için ekstra Halocarbon 27 yağı eklenebilmesi için ofset gereklidir. Gerekirse, iki örtünün sandviçin üst kısmında buluştuğu dikişe Halocarbon 27 yağı ekleyin ve embriyoları kılcal etki ile kaplayacaktır (Şekil 1, adım10'dakikesik çizgilere bakın). - Kapak kapağının banta yapışmasını sağlamak için bir jiletin künt tarafıyla doğrudan bant şeritlerinin üzerinde olan kapak zarının alanlarına hafifçe dokunun.
- Kapaklı sandviçi ters çevirin ve görüntüleme yüzeyini temiz tutmak ve konfokal mikroskopa taşımak için bir laboratuvar doku silecek üzerine yerleştirin (Şekil 1, adım 11). Görüntülemeden önce bandın her iki kapak kapağına da tamamen yapıştığından emin olun.
- Isıtılmış aşamanın sıcaklıkta olduğunu onaylayın ve ters bir mikroskop kullanıyorsanız, seçilen objektif lense daldırma sıvısı ekleyin.
- Yeni görüntüleme yüzeyinin (2nd coverlip) daldırma sıvısına dokunan yüzey olduğundan emin olmak için kapaklı sandviçi dikkatlice sahneye yerleştirin (Şekil 1, adım 11).
NOT: Gerekirse, kapaklar ısıtılmış aşamaya iyi uymuyorsa görüntüleme sırasında gereksiz hareketi önlemek için kapaklı sandviçi iki küçük çift taraflı bantla sahneye yapıştırın. - Bulaşan ışık veya floresan kullanarak hücreselleşme (Bownes evre4a 30)veya istenen gelişim aşamasında olan bir embriyoya odaklanın.
- Bir embriyo odak noktasına getirildikten sonra, konfokal mikroskopta lazer alma moduna geçin ve lazer gücünü ve kazancını, çerçeve boyutunu, döşemesini ve projeksiyon ayarlarını istediğiniz gibi ayarlayın.
- intranükleer aksin çubuklarını bulmak için embriyo çekirdeğinin odak düzlemlerinden yüzey görünümü görüntüleri alın. Çubuklar, nispeten koyu çekirdeklerin içinde parlak çizgiler veya noktalar olarak birden fazla yönde görünmelidir (Şekil 2A, 2C).
6. Alternatif görüntüleme deneyleri
- Hücreselleşme sırasında plazma zarı oluklarının uçları gibi intranükleer aktin çubuklarının uzunluğu boyunca veya sitoplazmik aktin yapılarında aktin cirosunu araştırmak için FRAP gerçekleştirin.
- Görüntüleme yazılımında, deneyi elde etmek için oluk uçlarının veya akran çubuklarının etrafında dikdörtgen bir bölge seçin.
- Beyazlatmak için dikdörtgen alım bölgesi içindeki bir aksin çubuğunun merkezinin küçük bir kare bölgesini seçin. Aksin çubuğunun uçlarının görünür olduğundan emin olun ve çekirdeğin içindeki çubuğun doğru bir şekilde izlenmesine izin vermek için deney sırasında ağartılmamaya dikkat edin.
- Çamaşır suyu lazerini 50x yineleye ve çamaşır suyu lazer gücünü maksimuma ayarlayın.
- Maksimum piksel bekleme hızında toplam 120 sn'ye kadar her saniye görüntü elde etmek için bir zaman kursu seçin ve görüntü alımının ilk iki saniyesi sonra lazeri ağartacak şekilde ayarlayın.
- Floresan kurtarmanın devre arasını belirlemek için verileri ölçün1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1'deembriyo işlemenin şematik iş akışı gösterilmiş ve Tablo 1'detipik bir deney için bir zaman çizelgesi sunulmuştur. İyi bir deneysel sonuç için bir tahmin, enjekte edilen her 10 embriyo için, görüntülenen embriyoların en az yarısının doğru gelişim aşamasında olacağı, hasarsız olacağı ve 32 ° C'de ısı stresi olan sağlam bir ASR sergileyeceğidir. Bu ASR, Şekil 2A'da (sağ panel) bir embriyonun temsili yüzey görünümü görüntüsünde gösterildiği gibi intranükleer aksin çubuklarının montajı ile kanıtlanacaktır. Actin çubukları çekirdeğin içinde çeşitli yönlerde (görüntüleme düzlemine paralel veya dik) görünecek ve birkaç odak düzlemi ile görüntülenebilir. Buna karşılık, 18 °C'de inkübe edilen kontrol embriyoları akin çubuklarını görüntülemez (Şekil 2A, sol panel). Çubuk içeren çekirdeklerin yüzdesi, Şekil 2B'degösterildiği gibi ölçülebilir. Ek olarak, FRAP deneyleri çubuklar üzerinde yapılabilir (Şekil 2C). FRAP verileri için önerilen bir nicelemeyöntemine 1 olarak başvurulur ve bir aktinin çubuğunun ağartılmış ve lekelenmemiş bir bölgesi için floresan kurtarma grafiği örneği Şekil 2D'de gösterilmiştir.
Bir embriyo enjeksiyonla ciddi şekilde hasar görürse veya deney sırasında çok kurursa, mitotik asenkron gözlenebilir ve hücreselleşme bozulur. Bazen, embriyoya yeterince aktüen enjekte edilemediği için çubuklar görünmeyebilir. Bu durumda, enjekte edilen G-actinRed miktarının 500 pL olduğundan emin olun (adım 4.5'te bir mikrometre ile ölçülür) ve her embriyo mikroenjeksiyonu arasındaki G-actinKırmızı baloncuğun boyutunu kontrol etmek için çevredeki yağa bir test enjeksiyonu yaparak bu miktarın embriyolar arasında tutarlı kaldığını onaylayın. Ek olarak, çubuk görselleştirmesini sağlamak için, kapak tonunu eklemek ve embriyoları 5.4 adımda nemli odadan alındıktan sonra ısıtılmış mikroskop aşamasına taşımak için hızlı bir şekilde çalışın, çünkü çubuk montajı geri dönüşümlü1'dir ve embriyolar 32 °C'den daha az bir sıcaklıkta 30 dakikadan daha az bir sıcaklıkta tutulursa çubuklar sökülebilir.
Şekil 1: Deney sırasında embriyo kullanımına şematik genel bakış. (1) Embriyo toplama bardaklarındaki yetişkin sinekler elma suyu agar tabaklarına embriyo bırakır. (2) Embriyolar 1:1 çamaşır suyu:damıtılmış su ile kaynatılır, bir toplama sepetine dökülür ve çamaşır suyu ve döküntüleri gidermek için damıtılmış su ile iyice yıkanır. (3) Embriyolar bir boya fırçası ile bir slayt üzerindeki dikdörtgen elma suyu agar takozuna aktarılır ve yanlarına, baş-kuyruğa, agarın kenarına bakan dorsal bölge ile düzenlenir. (4) Bir cam kapak kapağının (turuncu) 5 x 50 mm'lik bir bölgesi "embriyo tutkalı" ile kaplanır ve onları kapak kapağına yapıştırmak için agar üzerine yerleştirilmiş embriyo sırasına hafifçe bastırılır. (5) Embriyolu kapak ters çevrilir, böylece embriyolar yüz yüze olur. Embriyolar vidalı bir kavanozda kurudu. (6) Tahliyeden hemen sonra, kapakçık bir kaydırağa bantlanır, embriyolar yukarı bakacak şekilde ve embriyolar Halocarbon 27 yağı ile kaplanır. (7) Daha önce hazırlanmış G-actinRed yüklü bir mikroneedle, her embriyonun ventral bölgesinin merkezine, kapak ucuna paralel yerleştirilmiş iğne ile tek bir enjeksiyon yapmak için kullanılır. (8) Enjeksiyondan sonra embriyolar, kontrol sıcaklığında (18 °C) nemli laboratuvar doku silecekleri veya ısı stresi (32 °C) ile nemlendirilmiş bir Petri kabının içine inkübe edilir. (9) Kuluçkadan sonra, üzerinde embriyolar olan kapakçık slayttan çıkarılır. (10) İki parça çift taraflı bant üst üste katlanır, yarı uzunlamasına dilimlenir ve ilk kapakta embriyoları çevreleyen yağın her iki tarafına yerleştirilir. Yeni bir görüntüleme yüzeyi oluşturmak için ilkinin üzerine ikinci bir kapak (mavi) yerleştirilir, böylece embriyoları gerektiği gibi örtmek için daha fazla yağ eklenmesi için bir boşluk bırakır. (11) Ters konfokal mikroskop üzerinde görüntüleme varsa, kapaklı sandviç ters çevrilir, böylece ikinci kapak sapması amaç ile karşı karşıya kalır. Görüntüleme inkübe bir odada yapılır ve aksin çubukları her embriyo çekirdeğinin birkaç odak düzlemi üzerinde görselleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Isı stresli embriyolarda akin çubuklarının temsili sonuçları. (A) Actin çubukları 18 °C kontrol sıcaklığında (sol panel) inkübe edilmiş bir embriyoda görülmez, ancak 32 °C'de (sağ panel) ısı stresli bir embriyonun çekirdeğinde görülür. (B) Temsili bir deneyden aktiv çubuklarla çekirdek yüzdesinin ölçülmesi. Her nokta, tüm görüntülenen bölgede çubukların ve çekirdeklerin sayıldığı bir embriyoyu temsil eder (n = 18 °C'de 22 embriyo; n = 32 °C'de 23 embriyo; hata çubukları standart sapma gösterir). P değerini hesaplamak için eşit olmayan bir fark varsayılan bir Öğrencinin t testi kullanılmıştır. (C) Temsili bir zaman serisi, frap'ı bir akran çubuğunda gösterir. Çubuğun ağartılmış kısmı beyaz bir ok ucu ile gösterilir. Çamaşır suyu öncesi, çamaşır suyu adımından 2 s öncedir. Zaman = 0 s çamaşır suyu adımıdır ve floresan iyileşmesi 60 s çamaşır suyu sonrası kadar izlendi. (D) Bir arsa, aynı çubuktaki lekesiz bir bölgeye kıyasla, bir çubuğun ağartılmış bir bölgesinde aktüen floresan için geri kazanım dinamiklerini gösterir. Çubuklar oldukça kararlıdır ve içlerinde hareket eder ciro yapmaz. Böylece iyileşme görülmez. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Önerilen zaman çizelgesine sahip deneysel iş akışı. Bu zaman çizelgesi, protokolün her adımını tamamlamak için gereken beklenen süreyi özetler.
| Sipariş | Adım | Her adım için gerekli süre | Açıklama |
| 1 | 1.1 | 5 gün önceden | Embriyo toplama kafesleri yapın. Elma suyu agar tabakları dökün. |
| 2 | 1.2-1.3 | 2 gün önceden | Yetişkin erkek ve dişi sineklerle toplama kafesleri kurun. |
| 3 | 2.6 Not | 1 gün önceden | Mikroneedles yapmak için kılcal boruları çekin. |
| 4 | 2.1-2.6 | 1 saat | G-actin'i hazırlayın. |
| 5 | 3.1 | 30 dk | Sineklerin yumurta bırakmasına izin verin. |
| 6 | 3.2-3.10 | 15-30 dk | Embriyoları toplayın, monte edin, çöz. Embriyoları yağ ile örtün. |
| 7 | 4.1 | 30 dakika önceden | Nemli kuluçka odaları hazırlayın. |
| 8 | 4.2-4.4 | 1 dk | Mikroneedle yükleyin. |
| 9 | 4.5-4.10 | 10-20 dk | G-actin kabarcık boyutunu kalibre edin ve embriyoları enjekte edin. |
| 10 | 4.11 | 30 dk-1+ saat | Kuluçka/ısı stresi embriyoları. |
| 11 | 5.1-5.3 | 1 saat önceden | Mikroskop ve kuluçka aşamasını açın. |
| 12 | 5.4-5.10 | 5 dk | Görüntüleme için kapaklar arasında sandviç embriyoları. |
| 13 | 5.11-6.6 | 15 dk-1+ h | Embriyolarda görüntü intranükleer aksin çubukları. |
Tablo 2: Sorun giderme önerileri. Bu tablo, protokolün başarıyla tamamlanmasına yardımcı olmak için sorun giderme önerileri sağlar.
| Olası sorun | Öneri |
| Sinekler yeterince embriyo bırakmaz. | Fincanı en az 5 gün önceden ayarlayın (1.1-1.3 adımlarına bakın). Yumurtlamayı teşvik etmek için deneye kadar günde 3x plaka değiştirin. Sineklerin embriyoları 30 dakika yerine 1 saat bırakmasına izin verin. Genç yetişkin sineklerle bardaklar kurun. |
| Hiçbir G-actin mikroneedle atılır. | Mikroenjektör üzerindeki basınç ve zaman ayarlarını artırın. Mikroneedle ucunu daha fazla kırın (adım 4.5 Not'a bakın). Büyük tıkanmalar netleşmeyebileceğinden, yeni bir iğne yükleyin. |
| Yeterince küçük bir kabarcık boyutunu kalibre etmek zor. | Basınç ve zaman ayarlarını yapın (adım 4.5'e bakın). Mikroneedle uç açıklığı çok büyük olabileceğinden, yeni bir iğne yükleyin. |
| Embriyolar enjekte sırasında kapak üzerindeki tutkaldan salınır. | Heptan çözeltisine daha fazla çift taraflı bant ekleyerek gelecekteki kapaklar için "embriyo tutkal" kıvamını ayarlayın (adım 3.5 Not'a bakın). |
| Embriyolar sıcaklık inkübasyonu sırasında kurur. | Slaytın kuluçka odasında seviyeli olduğundan (4.11 adımına bakın) ve yağın onu yok edebilecek hiçbir şeye dokunmadığından emin olun. Embriyolara ekstra yağ damlaları ekleyin. Enjeksiyon öncesi tahliye süresini azaltın (adım 3.8'e bakın). |
| Yağ, birinci ve ikinci kapaklar arasındaki embriyoları tamamen kapsamaz. | Kapaklar arasındaki küçük boşluğa kılcal damar etkisiyle ekstra yağ ekleyin (adım 5.8 Not'a bakın). |
| İntranükleer aksin çubukları ısı stresli embriyolarda görünmez. | Daha büyük miktarda G-actin enjekte edin (adım 4.5'e bakın). Hem enjeksiyon sonrası inkübasyonun (adım 4.11'e bakın) hem de görüntüleme odasının sıcaklığının 32 °C olduğunu onaylayın (adım 5.3'e bakın). |
| Embriyoların enjeksiyon bölgesi etrafında büyük G-actin kabarcıkları görülebilir. | Daha küçük bir G-actin hacmi enjekte edin (adım 4.5'e bakın). Enjekte edilen akinin embriyo içinde daha iyi tutulmasını teşvik etmek için embriyonun çıkarılma süresini artırın (adım 3.8'e bakın). |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yöntemin önemi, ASR ve eşlik eden akin çubuk montajı ile ilgili yeni araştırmalara olanak sağlamak için Drosophila embriyoları21,22,23,24,25,26,27'de iyi kurulmuş mikroenjeksiyon protokolünü kullanmasıdır. G-actinRed'i canlı embriyolara enjekte etmenin en büyük avantajı, ASR'nin çeşitli bağlamlar altında çalışılabilmesidir. Gelecekteki çalışmalar için, bu bağlamlar mutant ekranın bir parçası olarak diğer genotiplerin embriyolarının enjekte edilmesini veya enjekte edilen embriyoların oksidatif stres4,32gibi farklı stres koşullarına maruz kalmasını içerebilir. Burada ayrıntılı olarak açıklanmasa da, bu enjeksiyon tekniği ASR'yi incelemek için nükleik asitleri, diğer proteinleri, ilaçları ve gösterge boyalarını enjekte etmek için de değiştirilebilir (örneğin, bkz.21,22,23,24,32). Bu nedenle, bu yöntem, ASR'yi indükleyen stres aralığını tanımlamak, ASR sırasında hücresel yanıtları daha da karakterize etmek (örneğin mitokondriyal aktivitedeki değişiklikler) ve intranükleer aksin çubuk tertibatının altında bulunan yeni molekülleri ve mekanizmaları ortaya çıkarmak için bir dizi yaklaşım sunar.
Protokolün bazı kritik adımları şunlardır: 3.8. adımda, başarılı enjeksiyon ve en iyi embriyo sağlığını sağlamak için embriyoların düzgün bir şekilde kurutılması gerekir. Kurutma süresi laboratuvarın ortam sıcaklığına ve nemine bağlı olacaktır, bu nedenle embriyoları işlemek için bu parametreyi belirlemek için önce nötr bir pH tamponu ile montaj, kurutma ve enjeksiyonların uygulanması önerilir. 4.5. adımda, embriyolara yeterli miktarda G-actinKırmızısı enjekte edilmesine izin vermek için mikroneedle ve enjeksiyon ayarları ince ayar yapılmalıdır. Embriyoya çok az G-actinKırmızısı enjekte edilirse, akin çubukları kolayca görselleştirilmeyebilir, çünkü akin çubuklarının oluşumu serbest akin konsantrasyonuna bağlıdır1. Ek olarak, yeterli G-actinKırmızı enjekte edilirse FRAP deneylerinden tutarlı sonuçlar almak zor olacaktır, çünkü floresan yoğunluğu arka plan floresanını aşacak kadar yüksek olmayacaktır. Bu nedenle, her yeni iğne yüklendiğinde ve kullanıldığında kabarcık boyutunu kalibre etmek önemlidir. G-actinRed viskozdur ve mikroneedle içinde tıkanma eğilimindedir. Bazen, bu embriyolara değişken miktarda G-actin enjekte etmesine neden olabilir. Mikroneedle tıkanırsa ve mikroneedle yüksek basınçla temizlenirse, mikroneedlenin ucunu daha fazla kırmaya veya hatta yeni bir mikroneedle yüklemeye ve yeni bir embriyo seti enjekte etmeye çalışmak gerekebilir. Son olarak, 4.11. Tüm inkübatörlerin sıcaklıkları sürekli izlenmeli, embriyoları inkübatörden inkübatöre aktarma süresi sınırlandırılmalı ve tüm inkübasyonlar için bir zamanlayıcı kullanılmalıdır. Diğer olası sorunlar Tablo 2'de, beraberindeki sorun giderme ipuçlarıyla birlikte listelenmiştir.
Bu protokolün önemli bir sınırlaması, enjeksiyonlar, inkübasyonlar ve görüntüleme sırasında embriyoların sağlığını korumak için istisnai özenin yapılması gerektiğidir. Protokol embriyo sağlığını en üst düzeye çıkarmak için tasarlanmıştır ve önemli bir uygulama ile bir araştırmacı, sıcaklık başına beklenen oranlarda ilerleyen embriyo gelişimi ile protokolün tüm adımlarını tamamlayabilir31. Protokolün ikinci bir sınırlaması, oldukça pahalı olabilen ve her sinek laboratuvarı için ortak ekipman olmayan bir mikroenjeksiyon teçhizatı için gerekliliktir. Bununla birlikte, bitişik bir laboratuvar diğer embriyoları (örneğin, Xenopus, Zebra balığı ve Caenorhabditis elegans)veya yapışık hücreleri enjekte etmek için donatılmışsa, kullanılan enjeksiyon makinesi drosophila enjeksiyonları için muhtemelen uygundur. Bu durumda, Pipet Yemek Kitabı29'unyönergelerine göre Drosophila embriyoları için sadece iğnenin şeklinin uyarlanmış olması gerekir. Alternatif olarak, piyasada bazı daha ucuz mikoinjektör seçenekleri vardır (örneğin, analog mikroenjektörler), bu da bir enjeksiyon makinesinin montaj maliyetini önemli ölçüde azaltabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması bildirilmedi.
Acknowledgments
Yazarlar, Sokac laboratuvarında bu tekniğin öncülükine yardımcı olan Liuliu Zheng ve Zenghui Xue'nun yanı sıra analize yardımcı olan Hasan Seede'nin çalışmalarını minnetle kabul ediyorlar. Bu çalışma nih (R01 GM115111) tarafından bir hibe ile finanse edilir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore-Sigma | A23835G | Component of G buffer |
| Apple juice, Mott's, 64 fl oz | Mott's | 014800000344 | Component of apple juice plates |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Component of apple juice plates |
| Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite | KIK International | 059647210020 | For dechorionating embryos |
| Calcium chloride | Millipore-Sigma | C1016500G | Component of G buffer |
| Cell strainer, 70 μm | Falcon | 352350 | For collecting dechorionated embryos |
| Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan | Zeiss | 0000001994956 | For imaging intranuclear actin rods |
| Desiccant | Drierite | 24001 | For desiccating embryos |
| Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom | Zeiss | 4350649000000 | For arranging embryos on agar wedge |
| Dissecting needle, 5 in | Fisher Scientific | 08965A | For arranging embryos on agar wedge |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP1725 | Component of G buffer |
| Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in | 3M | 021200010323 | For making embryo glue |
| Embryo collection cage | Genessee Scientific | 59100 | For housing adult flies and collecting embryos |
| Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72701D | For arranging embryos on agar wedge |
| Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm | World Precision Instruments, Inc. | TW1004 | For microneedles |
| Halocarbon oil 27 | Millipore-Sigma | H8773100ML | For hydration of embryos |
| Heated stage incubator | Zeiss | 4118579020000, 4118609020000, 4118609010000 | For confocal imaging |
| Lab Tissue Wipers, KimWipes | Kimberly-Clark | 34155 | Lab tissue wipers |
| Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished | Zeiss | Discontinued | Injection microscope |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Millipore-Sigma | H36471KG | Component of apple juice plates |
| Microinjector, FemtoJet4x | Eppendorf | 5253000025 | Microinjector |
| Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 μL | Eppendorf | 5242956003 | For loading microneedles |
| Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment | Bernard Instruments, Inc (Houston, TX) | Custom | For performing microinjections |
| Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown | Sutter Instruments | P97 | For pulling capillary tubes to make microneedles |
| Microscope cover glass 24x50-1.5 | Fisher Scientific | 12544E | For mounting embryos |
| Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm | Fisher Scientific | 22037081 | For mounting embryos for injection |
| n-Heptane | Fisher Scientific | H3601 | Component of embryo glue |
| Objective, 10x | Zeiss | Discontinued | 10x objective for injection microscope |
| Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS | Zeiss | 4217679971711 | 40x water objective for confocal |
| Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm) | Zeiss | 4208529871000 | 25x mixed immersion objective for confocal |
| Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA | Zeiss | 4207829900799 | 63x oil objective for confocal |
| Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2 | Daler-Rowney | 038372016954 | For transferring embryos |
| Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white | Kimberly-Clark | 884266344845 | For blotting cell strainer |
| Pasteur pipette, 5 3/4 in | Fisher Scientific | 1367820A | For covering embryos with oil |
| Petri dish, glass, 100 x 20 mm | Corning | 3160102 | For humid incubation chamber |
| Petri dish, plastic, 60 x 15 mm | VWR | 25384092 | For apple juice plates |
| Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 μL | Eppendorf | 2231000604 | For loading the microneedle |
| Pipette tip, xTIP4 250 μL | Biotix | 63300006 | For adding embryo glue to coverslip |
| Razor blade | VWR | 55411050 | For cutting agar wedge, tape, pipette tips |
| Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4x10 μg) | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | G-actin^Red |
| Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps | Fisher Scientific | 033377 | For making embryo glue |
| Screw top jar, 16 oz | Nalgene | 000194414195 | For desiccating embryos |
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 602104PG | For calibrating volume of G-actin injection |
| Sucrose | Millipore-Sigma | 840971KG | Component of apple juice plates |
| Trizma base | Millipore-Sigma | T15031KG | Component of G buffer |
| Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz | Lesaffre Yeast Corporation | 117929157002 | Component of yeast paste |
References
- Figard, L., et al. Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos. Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).
- Ashworth, S. L., et al. ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion. American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).
- Vandebrouck, A., et al. In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).
- Bamburg, J. R., et al.
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).
- Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress. Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).
- Iida, K., Iida, H., Yahara, I. Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells. Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).
- Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).
- Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin. Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).
- Minamide, L. S., et al. Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods. Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).
- Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons. The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).
- Feldman, M. L., Peters, A. Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus. Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).
- Nishida, E., et al. Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells. Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).
- Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).
- Xue, Z., Sokac, A. M. Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage. The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).
- Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization. Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 393 (2), 209-226 (2014).
- Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. Formins filter modified actin subunits during processive elongation. Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (50), 2477 (2011).
- Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 81, 50750 (2013).
- Carreira-Rosario, A., et al. Recombineering homologous recombination constructs in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (77), 50346 (2013).
- Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microinjection techniques for studying mitosis in the Drosophila melanogaster syncytial embryo. Journal of Visualized Experiments. (31), 1382 (2009).
- Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. Visualizing and tracking endogenous mRNAs in live Drosophila melanogaster egg chambers. Journal of Visualized Experiments. (148), 58545 (2019).
- Wessel, A. D., Gumalla, M., Grosshans, J., Schmidt, C. F. The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology. Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).
- Mollinari, C., González, Microinjection and transgenesis. Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols. Cid-Arregui, A., García-Carrancá, A. , Springer. Berlin. 587-603 (1998).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (49), 2503 (2011).
- Oesterle, A. Pipette Cookbook 2018: P-97 and P-1000 Micropipette Pullers. , Sutter Instruments. Novato, CA. (2018).
- Bownes, M. A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 33 (3), 789-801 (1975).
- Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).
- Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing. Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).
