الدقة قص شرائح الرئة كأداة فعالة لهيكل الأوعية الرئوية في الجسم الحي السابق ودراسات الانقباض
Summary
يقدم هنا بروتوكول للحفاظ على انقباض الأوعية الدموية لأنسجة الرئة المورين PCLS ، مما يؤدي إلى صورة ثلاثية الأبعاد متطورة للمجرى الوعائي الرئوي والمجرى الهوائي ، والتي يمكن الحفاظ عليها لمدة تصل إلى 10 أيام عرضة للعديد من الإجراءات.
Abstract
التصور من أنسجة الرئة مورين يوفر معلومات هيكلية وخليوية قيمة بشأن مجرى الهواء الكامنة وvasculature. ومع ذلك ، فإن الحفاظ على الأوعية الرئوية التي تمثل حقا الظروف الفسيولوجية لا يزال يمثل تحديات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التكوين الدقيق لرئتي مورين يؤدي إلى تحديات تقنية في إعداد عينات للصور عالية الجودة التي تحافظ على التركيب الخلوي والهندسة المعمارية. وبالمثل ، يمكن إجراء فحوصات الانقباض الخلوي لدراسة إمكانات الخلايا للاستجابة لمغيري الأوعية في المختبر، ولكن هذه المقايسات لا تستنسخ البيئة المعقدة للرئة السليمة. وعلى النقيض من هذه القضايا التقنية، يمكن تطبيق طريقة قطع شريحة الرئة بدقة (PCLS) كبديل فعال لتصور أنسجة الرئة في ثلاثة أبعاد دون تحيز إقليمي وتكون بمثابة نموذج انقباض بديل حي لمدة تصل إلى 10 أيام. وقد حافظت الأنسجة المعدة باستخدام PCLS الهيكل والتوجه المكاني، مما يجعلها مثالية لدراسة عمليات المرض في الجسم الحي السابق. يمكن تصور موقع الخلايا الذاتية التي تحمل علامة tdTomato في PCLS التي يتم حصادها من نموذج مورين مراسل tdTomato غير القابل للاختزال بنجاح عن طريق المجهر الكونفوكوكال. بعد التعرض لمكونات الأوعية الدموية ، يوضح PCLS الحفاظ على كل من انقباض الأوعية وبنية الرئة ، والتي يمكن التقاطها بواسطة وحدة الفاصل الزمني. بالاقتران مع الإجراءات الأخرى، مثل لطخة الغربية وتحليل الحمض النووي الريبي، PCLS يمكن أن تسهم في فهم شامل للشلالات الإشارات التي تكمن وراء مجموعة واسعة من الاضطرابات ويؤدي إلى فهم أفضل للفيزيولوجيا المرضية في أمراض الأوعية الدموية الرئوية.
Introduction
تقدم في إعداد وتصوير أنسجة الرئة التي تحافظ على المكونات الخلوية دون التضحية الهيكل التشريحي توفير فهم مفصل للأمراض الرئوية. القدرة على تحديد البروتينات والحمرنا الريبي، والمركبات البيولوجية الأخرى مع الحفاظ على الهيكل الفسيولوجي يقدم معلومات حيوية عن الترتيب المكاني للخلايا التي يمكن أن توسع فهم الفيزيولوجيا المرضية في العديد من الأمراض الرئوية. يمكن أن تؤدي هذه الصور التفصيلية إلى فهم أفضل لأمراض الأوعية الدموية الرئوية ، مثل ارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي ، عند تطبيقها على النماذج الحيوانية ، مما قد يؤدي إلى تحسين الاستراتيجيات العلاجية.
على الرغم من التقدم في التكنولوجيا، والحصول على صور عالية الجودة من أنسجة الرئة مورين لا يزال يشكل تحديا. تحرك الدورة التنفسية ضغط داخلي سلبي يتم توليده أثناء الاستنشاق1. عند الحصول تقليديا الخزعات وإعداد عينات الرئة للتصوير، يتم فقدان الانحدار الضغط السلبي مما أدى إلى انهيار مجرى الهواء وvasculature، والتي لم تعد تمثل نفسها في حالتها الراهنة. لتحقيق صور واقعية تعكس الظروف الحالية ، يجب إعادة تضخم الشعب الهوائية الرئوية ، وثقب الأوعية الدموية ، وتغيير الرئة الديناميكية إلى لاعبا اساسيا ثابتا. يسمح تطبيق هذه التقنيات المتميزة بالحفاظ على السلامة الهيكلية ، والرئة الوعائية ، والمكونات الخلوية ، بما في ذلك الخلايا المناعية مثل الضامة ، مما يسمح بالنظر إلى أنسجة الرئة على أقرب ما يمكن إلى حالته الفسيولوجية.
الدقة قطع تشريح الرئة (PCLS) هو أداة مثالية لدراسة التشريح وعلم وظائف الأعضاء من الأوعية الدموية الرئوية2. PCLS يوفر التصوير التفصيلي للأنسجة الرئة في ثلاثة أبعاد مع الحفاظ على المكونات الهيكلية والخلوية. وقد استخدمت PCLS في النماذج الحيوانية والبشرية للسماح للصور الحية وعالية الدقة من الوظائف الخلوية في ثلاثة أبعاد, مما يجعلها أداة مثالية لدراسة الأهداف العلاجية المحتملة, قياس تقلص مجرى الهواء الصغيرة ودراسة الفيزيولوجيا المرضية لأمراض الرئة المزمنة مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن, ILD, وسرطان الرئة3. وباستخدام تقنيات مماثلة، يمكن أن يحافظ تعرض عينات PCLS لمكونات الأوعية على هيكل الرئة وانقباض الأوعية، وتكرارها في ظروف المختبر. جنبا إلى جنب مع الحفاظ على الانقباض، يمكن أن تخضع العينات المعدة لتحليل إضافي مثل تسلسل الحمض النووي الريبي، وصمة عار غربية، وقياس التدفق الخلوي عند إعدادها بشكل صحيح. وأخيرا، يمكن للخلايا المسماة بلون المراسل والتي تحمل علامة تضان tdTomato بعد حصاد الرئة الحفاظ على وضع العلامات بعد إعداد الميكروسليكس، مما يجعلها مثالية لدراسات تتبع الخلايا. يوفر دمج هذه التقنيات نموذجا متطورا يحافظ على الترتيب المكاني للخلايا وانقباض الأوعية التي يمكن أن تؤدي إلى فهم أكثر تفصيلا لسلاسل الإشارات والخيارات العلاجية المحتملة في مرض الأوعية الدموية الرئوية.
في هذه المخطوطة، تتعرض أنسجة الرئة المورين PCLS إلى الأوعية الدموية، مما يدل على السلامة الهيكلية المحفوظة وانقباض الأوعية. وتبين الدراسة أن الأنسجة التي تم إعدادها والتعامل معها بشكل مناسب يمكن أن تظل قابلة للحياة لمدة 10 أيام. كما توضح الدراسة الحفاظ على الخلايا ذات الفلورة الذاتية (tdTomato)، مما يسمح للعينات بتوفير صور عالية الدقة للرئة والعمارة. وأخيرا، تم وصف طرق للتعامل مع شرائح الأنسجة وإعدادها لقياس الحمض النووي الريبي واللطخة الغربية للتحقيق في الآليات الأساسية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المخطوطة، يتم وصف طريقة محسنة لإنتاج صور عالية الدقة لأنسجة الرئة المورين التي تحافظ على بنية الأوعية الدموية وتحسين المرونة التجريبية، وذلك على وجه التحديد باستخدام تطبيق PCLS للحصول على ميكروسيلكات من أنسجة الرئة التي يمكن مشاهدتها في ثلاثة أبعاد مع الانقباض المحفوظة للمحرك الوع…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفان أن يشكرا الدكتورين يوان هاو وكايفنغ ليو على دعمهما التقني. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة 1R01 HL150106-01A1 ، وزمالة باركر ب. فرانسيس ، وجائزة أبحاث رابطة ارتفاع ضغط الدم الرئوي للدكتور كي يوان.
Materials
| 0.5cc of fractionated heparin in syringe | BD | 100 USP units per mL | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CM | |
| 20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation | Cml Supply | 90120050D | |
| 30cc syringe | BD | 309650 | |
| Anti Anti solution | Gibco | 15240096 | |
| Automated vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | |
| Cell Viability Reagent (alamarBlue) | Thermofisher | DAL1025 | |
| Confocal | Zeiss | 880 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep | Gibco | 10569-010 | |
| Endothelin-1 | Sigma | E7764 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | |
| Mortar and Pestle | Amazon | ||
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermoscientific | 89900 | |
| Surgical suture 6/0 | FST | 18020-60 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermofisher | 15596026 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200 S | |
| Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G | BD | 25-30G |
References
- Sparrow, D., Weiss, S. T. Respiratory physiology. Annual Review of Gerontology & Geriatrics. 6, 197-214 (1986).
- Gerckens, M., et al. Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58437 (2019).
- Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).
- Rosales Gerpe, M. C., et al. Use of precision-cut lung slices as an ex vivo tool for evaluating viruses and viral vectors for gene and oncolytic therapy. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 10, 245-256 (2018).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
- Liu, R., et al. Mouse lung slices: An ex vivo model for the evaluation of antiviral and anti-inflammatory agents against influenza viruses. Antiviral Research. 120, 101-111 (2015).
- de Graaf, I. A., et al. Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies. Nature Protocols. 5 (9), 1540-1551 (2010).
- Alsafadi, H. N., et al. Applications and approaches for three-dimensional precision-cut lung slices. Disease modeling and drug discovery. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (6), 681-691 (2020).
- Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
- Springer, J., Fischer, A. Substance P-induced pulmonary vascular remodelling in precision cut lung slices. The European Respiratory Journal. 22 (4), 596-601 (2003).
- Suleiman, S., et al. Argon reduces the pulmonary vascular tone in rats and humans by GABA-receptor activation. Scientific Reports. 9 (1), 1902 (2019).
- Rieg, A. D., et al. Cardiovascular agents affect the tone of pulmonary arteries and veins in precision-cut lung slices. PLoS One. 6 (12), 29698 (2011).
- Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
- Deng, C. Y., et al. Upregulation of 5-hydroxytryptamine receptor signaling in coronary arteries after organ culture. PLoS One. 9 (9), 107128 (2014).
- Sandker, S. C., et al. Adventitial dissection: A simple and effective way to reduce radial artery spasm in coronary bypass surgery. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 17 (5), 784-789 (2013).
- Naik, J. S., et al. Pressure-induced smooth muscle cell depolarization in pulmonary arteries from control and chronically hypoxic rats does not cause myogenic vasoconstriction. Journal of Applied Physiology. 98 (3), 1119-1124 (2005).
- Lopez-Lopez, J. G., et al. Diabetes induces pulmonary artery endothelial dysfunction by NADPH oxidase induction. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (5), 727-732 (2008).
- Gonzalez-Tajuelo, R., et al. Spontaneous pulmonary hypertension associated with systemic sclerosis in P-selectin glycoprotein Ligand 1-deficient mice. Arthritis & Rheumatology. 72 (3), 477-487 (2020).
- Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
- Nishiyama, S. K., et al. Vascular function and endothelin-1: tipping the balance between vasodilation and vasoconstriction. Journal of Applied Physiology. 122 (2), 354-360 (2017).
- Schneider, M. P., Inscho, E. W., Pollock, D. M. Attenuated vasoconstrictor responses to endothelin in afferent arterioles during a high-salt diet. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 292 (4), 1208-1214 (2007).
- Inscho, E. W., Imig, J. D., Cook, A. K. Afferent and efferent arteriolar vasoconstriction to angiotensin II and norepinephrine involves release of Ca2+ from intracellular stores. Hypertension. 29, 222-227 (1997).
- Vecchione, C., et al. Protection from angiotensin II-mediated vasculotoxic and hypertensive response in mice lacking PI3Kgamma. The Journal of Experimental Medicine. 201 (8), 1217-1228 (2005).
