Прецизионная резка легких срезов как эффективный инструмент для исследования структуры и сократимости легочных сосудов Ex vivo
Summary
Здесь представлен протокол сохранения сосудистой сократимости ткани легких мышей PCLS, в результате чего получается сложное трехмерное изображение легочной сосудистой системы и дыхательных путей, которое может сохраняться до 10 дней, подверженных многочисленным процедурам.
Abstract
Визуализация мышиной легочной ткани предоставляет ценную структурную и клеточную информацию о нижележащих дыхательных путях и сосудистой сети. Тем не менее, сохранение легочных сосудов, которые действительно представляют физиологические условия, по-прежнему представляет проблемы. Кроме того, деликатная конфигурация мышиных легких приводит к техническим проблемам при подготовке образцов для высококачественных изображений, которые сохраняют как клеточный состав, так и архитектуру. Аналогичным образом, анализы клеточной сократимости могут быть выполнены для изучения потенциала клеток реагировать на сосудосуживатели in vitro,но эти анализы не воспроизводят сложную среду неповрежденного легкого. В отличие от этих технических проблем, метод прецизионного разреза легочного среза (PCLS) может применяться в качестве эффективной альтернативы для визуализации легочной ткани в трех измерениях без регионального смещения и служить живой суррогатной моделью сократимости на срок до 10 дней. Ткань, приготовленная с использованием PCLS, имеет сохраненную структуру и пространственную ориентацию, что делает ее идеальной для изучения болезненных процессов ex vivo. Расположение эндогенных tdTomato-меченых клеток в PCLS, собранных из индуцируемой tdTomato репортерной мышиной модели, может быть успешно визуализировано с помощью конфокальной микроскопии. После воздействия сосудосуживающих средств PCLS демонстрирует сохранение как сократимости сосудов, так и структуры легких, которые могут быть захвачены модулем замедленной съемки. В сочетании с другими процедурами, такими как вестерн-блот и анализ РНК, PCLS может способствовать всестороннему пониманию сигнальных каскадов, которые лежат в основе широкого спектра расстройств и приводят к лучшему пониманию патофизиологии при заболеваниях легочных сосудов.
Introduction
Достижения в области подготовки и визуализации легочной ткани, которая сохраняет клеточные компоненты без ущерба для анатомической структуры, обеспечивают подробное понимание легочных заболеваний. Способность идентифицировать белки, РНК и другие биологические соединения при сохранении физиологической структуры предлагает жизненно важную информацию о пространственном расположении клеток, которая может расширить понимание патофизиологии при многочисленных легочных заболеваниях. Эти подробные изображения могут привести к лучшему пониманию заболеваний легочных сосудов, таких как гипертония легочной артерии, при применении к животным моделям, что потенциально приводит к улучшению терапевтических стратегий.
Несмотря на достижения в области технологий, получение высококачественных изображений мышиной легочной ткани остается проблемой. Дыхательный цикл обусловлен отрицательным внутриторакальным давлением, создаваемым при вдохе1. При традиционном получении биопсии и подготовке образцов легких к визуализации теряется отрицательный градиент давления, что приводит к коллапсу дыхательных путей и сосудистой среды, которая больше не проявляет себя в своем нынешнем состоянии. Для достижения реалистичных изображений, отражающих текущие условия, легочные дыхательные пути должны быть повторно надуты, а сосудистая система перфузирована, превращая динамическое легкое в статическую арматуру. Применение этих различных методов позволяет сохранить структурную целостность, легочную сосудистую систему и клеточные компоненты, включая иммунные клетки, такие как макрофаги, что позволяет рассматривать легочную ткань как можно ближе к ее физиологическому состоянию.
Прецизионная разрезанная нарезка легких (PCLS) является идеальным инструментом для изучения анатомии и физиологии легочной сосудистой жидкости2. PCLS обеспечивает детальную визуализацию легочной ткани в трех измерениях с сохранением структурных и клеточных компонентов. PCLS был использован в моделях животных и человека, чтобы обеспечить живые изображения клеточных функций с высоким разрешением в трех измерениях, что делает его идеальным инструментом для изучения потенциальных терапевтических целей, измерения небольшого сокращения дыхательных путей и изучения патофизиологии хронических заболеваний легких, таких как ХОБЛ, ILD и рак легких3. Используя аналогичные методы, воздействие образцов PCLS на сосудосуживающих средств может сохранить структуру легких и сократимость сосудов, воспроизводя условия in vitro. Наряду с сохранением сократимости, подготовленные образцы могут подвергаться дополнительному анализу, такому как секвенирование РНК, вестерн-блот и проточная цитометрия при правильном приготовлении. Наконец, клетки с маркировкой репортерного цвета, отмеченные флуоресценцией tdTomato после сбора урожая в легких, могут сохранять маркировку после подготовки микросрезов, что делает ее идеальной для исследований отслеживания клеток. Интеграция этих методов обеспечивает сложную модель, сохраняющую пространственное расположение клеток и сократимость сосудов, что может привести к более детальному пониманию сигнальных каскадов и потенциальных терапевтических вариантов при заболевании легочной сосудистой системы.
В этой рукописи ткань легких мыса PCLS подвергается воздействию сосудосуживающих средств, демонстрируя сохраненную структурную целостность и сократимость сосудов. Исследование показывает, что ткань, подготовленная и обработанная надлежащим образом, может оставаться жизнеспособной в течение 10 дней. Исследование также демонстрирует сохранение клеток с эндогенной флуоресценцией (tdTomato), что позволяет образцам предоставлять изображения с высоким разрешением легочной сосудистой области и архитектуры. Наконец, были описаны способы обработки и подготовки срезов тканей для измерения РНК и вестерн-блотта для исследования основных механизмов.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой рукописи описан усовершенствованный метод получения изображений легочной ткани мыса с высоким разрешением, который сохраняет сосудистую структуру и оптимизирует экспериментальную гибкость, в частности с использованием применения PCLS для получения микросрезов легочной ткани, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить докторов Юань Хао и Кайфэн Лю за их техническую поддержку. Эта работа была поддержана NIH 1R01 HL150106-01A1, стипендией Паркера Б. Фрэнсиса и премией Ассоциации исследований легочной гипертензии Aldrighetti для доктора Ке Юаня.
Materials
| 0.5cc of fractionated heparin in syringe | BD | 100 USP units per mL | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CM | |
| 20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation | Cml Supply | 90120050D | |
| 30cc syringe | BD | 309650 | |
| Anti Anti solution | Gibco | 15240096 | |
| Automated vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | |
| Cell Viability Reagent (alamarBlue) | Thermofisher | DAL1025 | |
| Confocal | Zeiss | 880 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep | Gibco | 10569-010 | |
| Endothelin-1 | Sigma | E7764 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | |
| Mortar and Pestle | Amazon | ||
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermoscientific | 89900 | |
| Surgical suture 6/0 | FST | 18020-60 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermofisher | 15596026 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200 S | |
| Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G | BD | 25-30G |
References
- Sparrow, D., Weiss, S. T. Respiratory physiology. Annual Review of Gerontology & Geriatrics. 6, 197-214 (1986).
- Gerckens, M., et al. Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58437 (2019).
- Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).
- Rosales Gerpe, M. C., et al. Use of precision-cut lung slices as an ex vivo tool for evaluating viruses and viral vectors for gene and oncolytic therapy. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 10, 245-256 (2018).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
- Liu, R., et al. Mouse lung slices: An ex vivo model for the evaluation of antiviral and anti-inflammatory agents against influenza viruses. Antiviral Research. 120, 101-111 (2015).
- de Graaf, I. A., et al. Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies. Nature Protocols. 5 (9), 1540-1551 (2010).
- Alsafadi, H. N., et al. Applications and approaches for three-dimensional precision-cut lung slices. Disease modeling and drug discovery. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (6), 681-691 (2020).
- Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
- Springer, J., Fischer, A. Substance P-induced pulmonary vascular remodelling in precision cut lung slices. The European Respiratory Journal. 22 (4), 596-601 (2003).
- Suleiman, S., et al. Argon reduces the pulmonary vascular tone in rats and humans by GABA-receptor activation. Scientific Reports. 9 (1), 1902 (2019).
- Rieg, A. D., et al. Cardiovascular agents affect the tone of pulmonary arteries and veins in precision-cut lung slices. PLoS One. 6 (12), 29698 (2011).
- Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
- Deng, C. Y., et al. Upregulation of 5-hydroxytryptamine receptor signaling in coronary arteries after organ culture. PLoS One. 9 (9), 107128 (2014).
- Sandker, S. C., et al. Adventitial dissection: A simple and effective way to reduce radial artery spasm in coronary bypass surgery. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 17 (5), 784-789 (2013).
- Naik, J. S., et al. Pressure-induced smooth muscle cell depolarization in pulmonary arteries from control and chronically hypoxic rats does not cause myogenic vasoconstriction. Journal of Applied Physiology. 98 (3), 1119-1124 (2005).
- Lopez-Lopez, J. G., et al. Diabetes induces pulmonary artery endothelial dysfunction by NADPH oxidase induction. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (5), 727-732 (2008).
- Gonzalez-Tajuelo, R., et al. Spontaneous pulmonary hypertension associated with systemic sclerosis in P-selectin glycoprotein Ligand 1-deficient mice. Arthritis & Rheumatology. 72 (3), 477-487 (2020).
- Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
- Nishiyama, S. K., et al. Vascular function and endothelin-1: tipping the balance between vasodilation and vasoconstriction. Journal of Applied Physiology. 122 (2), 354-360 (2017).
- Schneider, M. P., Inscho, E. W., Pollock, D. M. Attenuated vasoconstrictor responses to endothelin in afferent arterioles during a high-salt diet. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 292 (4), 1208-1214 (2007).
- Inscho, E. W., Imig, J. D., Cook, A. K. Afferent and efferent arteriolar vasoconstriction to angiotensin II and norepinephrine involves release of Ca2+ from intracellular stores. Hypertension. 29, 222-227 (1997).
- Vecchione, C., et al. Protection from angiotensin II-mediated vasculotoxic and hypertensive response in mice lacking PI3Kgamma. The Journal of Experimental Medicine. 201 (8), 1217-1228 (2005).
