Summary
Présenté ici est un protocole pour préserver la contractilité vasculaire du tissu pulmonaire murin PCLS, résultant en une image tridimensionnelle sophistiquée du système vasculaire pulmonaire et des voies respiratoires, qui peut être préservée jusqu’à 10 jours et qui est sensible à de nombreuses procédures.
Abstract
La visualisation du tissu pulmonaire murin fournit des informations structurelles et cellulaires précieuses concernant les voies respiratoires et le système vasculaire sous-jacent. Cependant, la préservation des vaisseaux pulmonaires qui représente vraiment des conditions physiologiques présente encore des défis. De plus, la configuration délicate des poumons murins entraîne des défis techniques dans la préparation d’échantillons pour des images de haute qualité qui préservent à la fois la composition cellulaire et l’architecture. De même, des tests de contractilité cellulaire peuvent être effectués pour étudier le potentiel des cellules à répondre aux vasoconstricteurs in vitro,mais ces tests ne reproduisent pas l’environnement complexe du poumon intact. Contrairement à ces problèmes techniques, la méthode de la tranche pulmonaire coupée avec précision (PCLS) peut être appliquée comme une alternative efficace pour visualiser le tissu pulmonaire en trois dimensions sans biais régional et servir de modèle de contractilité de substitution vivant jusqu’à 10 jours. Les tissus préparés à l’aide de PCLS ont conservé la structure et l’orientation spatiale, ce qui les rend idéaux pour étudier les processus pathologiques ex vivo. L’emplacement des cellules endogènes tdTomato-marqué dans le PCLS récoltées à partir d’un modèle murin tdTomato reporter inductible peut être visualisé avec succès par microscopie confocale. Après exposition à des vasoconstricteurs, le PCLS démontre la préservation de la contractilité des vaisseaux et de la structure pulmonaire, qui peuvent être capturées par un module time-lapse. En combinaison avec les autres procédures, telles que le transfert de Western et l’analyse de l’ARN, le PCLS peut contribuer à la compréhension globale des cascades de signalisation qui sous-tendent une grande variété de troubles et conduire à une meilleure compréhension de la physiopathologie dans les maladies vasculaires pulmonaires.
Introduction
Les progrès dans la préparation et l’imagerie du tissu pulmonaire qui préserve les composants cellulaires sans sacrifier la structure anatomique fournissent une compréhension détaillée des maladies pulmonaires. La capacité d’identifier les protéines, l’ARN et d’autres composés biologiques tout en maintenant la structure physiologique offre des informations vitales sur l’arrangement spatial des cellules qui peuvent élargir la compréhension de la physiopathologie dans de nombreuses maladies pulmonaires. Ces images détaillées peuvent conduire à une meilleure compréhension des maladies vasculaires pulmonaires, telles que l’hypertension artérielle pulmonaire, lorsqu’elles sont appliquées à des modèles animaux, ce qui peut conduire à des stratégies thérapeutiques améliorées.
Malgré les progrès technologiques, l’obtention d’images de haute qualité du tissu pulmonaire murin reste un défi. Le cycle respiratoire est entraîné par une pression intrathoracique négative générée lors de l’inhalation1. Lors de l’obtention traditionnelle de biopsies et de la préparation d’échantillons pulmonaires pour l’imagerie, le gradient de pression négative est perdu, ce qui entraîne l’effondrement des voies respiratoires et du système vasculaire, qui ne se représente plus dans son état actuel. Pour obtenir des images réalistes reflétant les conditions actuelles, les voies respiratoires pulmonaires doivent être regonflées et le système vasculaire perfusé, transformant le poumon dynamique en un luminaire statique. L’application de ces techniques distinctes permet de préserver l’intégrité structurelle, le système vasculaire pulmonaire et les composants cellulaires, y compris les cellules immunitaires telles que les macrophages, ce qui permet de voir le tissu pulmonaire aussi près que possible de son état physiologique.
Le tranchage pulmonaire coupé avec précision (PCLS) est un outil idéal pour étudier l’anatomie et la physiologie du système vasculaire pulmonaire2. PCLS fournit une imagerie détaillée du tissu pulmonaire en trois dimensions tout en préservant les composants structurels et cellulaires. Le PCLS a été utilisé dans des modèles animaux et humains pour permettre des images vivantes et à haute résolution des fonctions cellulaires en trois dimensions, ce qui en fait un outil idéal pour étudier des cibles thérapeutiques potentielles, mesurer la contraction des petites voies respiratoires et étudier la physiopathologie des maladies pulmonaires chroniques telles que la MPOC, la MFI et le cancer du poumon3. En utilisant des techniques similaires, l’exposition d’échantillons de PCLS à des vasoconstricteurs peut préserver la structure pulmonaire et la contractilité des vaisseaux, reproduisant ainsi des conditions in vitro. En plus de préserver la contractilité, les échantillons préparés peuvent subir des analyses supplémentaires telles que le séquençage de l’ARN, le transfert Western et la cytométrie en flux lorsqu’ils sont préparés correctement. Enfin, les cellules marquées par couleur rapporteur marquées avec la fluorescence tdTomato après la récolte pulmonaire peuvent préserver l’étiquetage après la préparation des microselices, ce qui le rend idéal pour les études de suivi cellulaire. L’intégration de ces techniques fournit un modèle sophistiqué préservant l’arrangement spatial des cellules et la contractilité des vaisseaux qui peut conduire à une compréhension plus détaillée des cascades de signalisation et des options thérapeutiques potentielles dans la maladie vasculaire pulmonaire.
Dans ce manuscrit, le tissu pulmonaire murin PCLS est exposé à des vasoconstricteurs, démontrant une intégrité structurelle préservée et une contractilité des vaisseaux. L’étude démontre que les tissus préparés et manipulés de manière appropriée peuvent rester viables pendant 10 jours. L’étude démontre également la préservation des cellules à fluorescence endogène (tdTomato), permettant aux échantillons de fournir des images à haute résolution du système vasculaire pulmonaire et de l’architecture. Enfin, des moyens de manipuler et de préparer des tranches de tissu pour la mesure de l’ARN et le transfert Western pour étudier les mécanismes sous-jacents ont été décrits.
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Protocol
Tous les soins aux animaux ont été conformes aux lignes directrices du Boston Children’s Hospital et les protocoles approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux. Les souris utilisées dans cette étude sont des souris sauvages de type C57/B6 et des souris croisées Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato.
1. Préparation des solutions
- Préparer à l’avance une solution tampon de phosphate (1x PBS) et une solution d’agarose à 2% requise pendant l’expérience.
- Mélanger 2 g de poudre d’agarose dans 100 mL d’eau autoclavée. Chauffez-le au micro-ondes quelques secondes à la fois jusqu’à ce que la solution soit claire.
- Placer la solution au bain-marie à 42 °C jusqu’à utilisation.
REMARQUE: Le PBS et l’agarose à 2% peuvent être conservés à température ambiante pendant des semaines.
2. Extraction du poumon de la souris
- Euthanasier la souris par surdosage d’isoflurane. Obtenez un surdosage d’isoflurane en plaçant une petite quantité d’isoflurane sur du papier de soie au niveau inférieur et en plaçant la souris au niveau supérieur dans un dessiccateur. La souris reste dans le dessiccateur jusqu’à ce qu’elle soit inconsciente.
- Assurer la mort de la souris en appliquant une pression inférieure sur le cou et en tirant caudale sur la queue. Amenez la souris sur la surface de dissection.
- Placez la souris en position couchée et fixez-la en place en scotchant les pattes et le nez à la table avec du ruban adhésif.
- Vaporisez la surface ventrale de la souris avec 70% d’éthanol et essuyez l’excès d’éthanol.
- Soulevez la peau abdominale de la souris avec une pince à l’emplacement de la vessie et coupez à la ligne médiane avec des ciseaux chirurgicaux, en se déplaçant de manière supérieure vers la région cervicale, exposant la trachée.
- Soulevez la couche fasciale sous-jacente avec une pince à épiler et coupez-la avec des ciseaux chirurgicaux pour exposer les organes viscéraux et le compartiment médiastinal, en coupant à nouveau de manière inférieure à supérieure.
- Coupez le sternum à la ligne médiane pour exposer le cœur et les poumons.
- À l’aide d’une dissection émoussée, détachez le diaphragme du foie et du compartiment abdominal.
- Localisez la veine cave inférieure (CIV) sous les intestins et coupez la CIV.
- Localisez le ventricule droit.
REMARQUE: Le ventricule droit aura un aspect plus léger par rapport au ventricule gauche et le septum intraventriculaire doit être visualisé, séparant le ventricule droit du ventricule gauche. - Injecter 0,5 mL d’héparine fractionnée à 1 % dans le ventricule droit avec une aiguille papillon de 25 à 30 G, puis rincer lentement mais régulièrement avec 10 à 15 mL de 1x PBS(Figure 1A).
- Attention à ne pas insérer l’aiguille dans le cœur et à injecter de l’héparine dans la cavité médiastinale.
REMARQUE: L’injection de 1x PBS rend le tissu pulmonaire blanc. Le liquide extravasant de l’aorte abdominale doit être clair et incolore et le foie peut devenir blanc en apparence après un rinçage réussi.
- Attention à ne pas insérer l’aiguille dans le cœur et à injecter de l’héparine dans la cavité médiastinale.
- Localisez le larynx et disséquez le fascia et les tissus environnants à l’aide d’une pince à épiler à pointe émoussée.
- Placez la suture chirurgicale sous la trachée et nouez lâchement un nœud chirurgical.
- Placez un petit trou dans la trachée supérieur à la ficelle et canulez avec une aiguille émoussée de 20 G.
- Serrez la suture autour de l’aiguille et de la trachée à l’aide d’un nœud chirurgical.
- Injecter 2,5 à 4 mL d’agarose dans la trachée et surveiller l’inflation du poumon.
- Après l’instillage de l’agarose, versez 1x PBS froid et réfrigéré sur le poumon pour solidifier l’agarose.
- Coupez la trachée supérieure à la suture chirurgicale et disséquez le poumon et le cœur du médiastin en enlevant les adhérences et le fascia.
- Après solidification, placer 1x DMEM (assez pour immerger les tissus) dans une boîte de Petri pour rester sur la glace. Trancher immédiatement un lobe à l’aide d’une machine à vibratome (Figure 1B).
3. Tranches de poumon coupées avec précision
- Fixez l’échantillon à la plate-forme avec de la supercolle, en gardant le côté médial de l’échantillon tourné vers le haut.
- Remplissez le récipient d’échantillon avec 1x PBS, en vous assurant que l’échantillon est complètement immergé.
- Remplissez le récipient entourant le récipient d’échantillon avec de la glace pour garder le PBS environnant et l’échantillon au froid.
- Allumez le vibratome et ajustez-le aux paramètres souhaités ci-dessous.
- Réglez l’épaisseur sur 300um.
- Réglez la fréquence sur 100 Hz.
- Réglez l’amplitude sur 0,6 mm.
- Réglez la vitesse sur 5 μm/s.
- À l’aide d’une clé Allen, tournez le porte-lame en position de sécurité et ouvrez les mâchoires pour insérer une lame.
- Serrez les mâchoires avec une clé Allen et tournez le porte-lame dans la position appropriée pour le tranchage.
- Placez l’échantillon et la plate-forme sur la boîte et faites glisser devant la lame.
- Remplissez la boîte autour de la plate-forme d’échantillon avec 1x PBS jusqu’à ce que l’échantillon soit submergé.
- Amenez la lame du vibratome jusqu’au bord du bloc et abaissez manuellement la lame jusqu’à ce qu’elle soit uniforme avec le haut de l’échantillon.
- Confirmez les paramètres appropriés et exécutez le vibratome (Figure 2).
- Au fur et à mesure que les tranches fraîches sont coupées, retirez les échantillons du PBS et placez-les dans une boîte de Petri stérile avec 10 mL de 1x DMEM contenant 1x antibiotique-antimycotique.
- Lorsque vous avez terminé, rétractez entièrement la lame, puis utilisez la clé Allen pour la mettre dans une position sûre.
- Conservez les échantillons dans 1x DMEM dans un incubateur à 37 °C avec une viabilité préservée jusqu’à 10 jours (voir l’expérience de viabilité ci-dessous).
4. Exemple d’expérience vasoconstrictrice
- Placez une tranche de vibratome sur une lame de microscope.
- Avant de le placer sur la glissière, utilisez une lingette nettoyante pour vous débarrasser de l’excès de milieu (PBS).
- Placez l’échantillon sous microscopie à contraste de phase et utilisez un grossissement de 10 à 20x pour identifier un récipient.
- Mettez 500 μL de vasoconstricteurs, tels que 60 mM KCl ou 1 μM d’endothéline-1 pour immerger complètement la lame.
- Observez et capturez la vidéo en enregistrant pendant 30 s-60 s (Vidéo 1).
5. Préparation du tissu pour la lyse de l’ARN ou des protéines sur le PCLS
- Avant de commencer l’expérience, remplissez une petite boîte en mousse de polystyrène avec 1 L d’azote liquide.
- Placer deux petits tubes de microcentrifugation (1,5 mL) dans le récipient avec de l’azote liquide avant de commencer.
REMARQUE: L’azote liquide doit refroidir à l’extérieur des tubes, mais pas à l’intérieur. Assurez-vous de manipuler l’azote liquide avec soin et n’exposez pas la peau à l’azote liquide. Utilisez des pinces et des gants pour placer et retirer les tubes de la boîte. - Placez 4-5 tranches de vibratome frais dans un bol de mortier.
- Versez 5 à 10 mL de liquide N2 sur les tranches dans le bol de mortier.
- Utilisez rapidement le pilon pour broyer les tranches de congélation éclair en poudre avant que l’azote liquide ne s’évapore.
REMARQUE: Les tissus doivent se condenser en une poudre fine. Si ce n’est pas le cas, ajoutez de l’azote liquide supplémentaire jusqu’à ce qu’il soit atteint. - À l’aide d’une pelle de laboratoire en acier (pré-refroidie avec de l’azote liquide), pré-cuillère la poudre dans les deux tubes de microcentrifugation réfrigérés.
- Lyser la poudre en ajoutant 500 μL de réactif d’extraction d’ARN pour procéder à l’isolement de l’ARN ou 500 μL de tampon RIPA (contient 1x inhibiteurs de la protéase) pour procéder à la lyse des protéines.
- Conservez les échantillons à -80 °C jusqu’à l’isolement supplémentaire de l’ARN, la mesure de l’ACA et le transfert western.
6. Détermination de la viabilité
- Après la préparation du vibratome, placer deux tranches de poumon dans une plaque de culture de 24 puits avec 450 μL de milieu DMEM et 50 μL de réactif de viabilité cellulaire (assurez-vous que le tissu est entièrement immergé).
- Replacez les échantillons dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C pendant la nuit avec une exposition minimale à la lumière.
- Le matin, observez la solution pour le changement de couleur. La solution bleue devient rose lorsque le tissu est viable.
7. Préservation de l’étiquetage cellulaire
- Traiter un Cdh5-CreERT2 transgénique croisé avec une souris Ai14 tdTomato avec une injection IP de tamoxifène (2 mg/ jour) pendant un total de 5 jours (dose totale de 10 mg de tamoxifène) pour induire des cellules tdTomato label Cre positives.
- Une semaine après l’injection, préparez les poumons en suivant les étapes 1 à 3 ci-dessus.
- Après la préparation de la tranche de poumon coupée avec précision, placez le tissu sur une lame de microscope et placez un couvercle sur le dessus du tissu.
- Utilisez un microscope confocal pour détecter la coloration tdTomato (en utilisant la longueur d’onde d’excitation 555 nm).
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Representative Results
Lorsqu’il est ajouté aux cellules ou aux tissus, le réactif de viabilité est modifié par l’environnement réducteur des tissus viables et devient rose / rouge, devenant très fluorescent. Les changements de couleur représentatifs détectés du jour 0-1 et du jour 9-10 sont illustrés à la figure 3. Comme indiqué, la solution a commencé en bleu et est devenue rose du jour au lendemain, démontrant ainsi sa viabilité. Le changement de couleur se produit généralement dans les 1-4 h; cependant, un délai plus long peut être nécessaire. Pour déterminer la viabilité, un lecteur de plaque a été utilisé pour déterminer l’absorbance d’un échantillon préparé par vibratome et d’une tranche pulmonaire fixe à 4% de PFA, servant de témoin. Les solutions dans lesquelles les échantillons ont été incubés ont été lues à une absorbance de 562 nm et 630 nm conformément à la recommandation du fabricant. La différence quotidienne entre l’absorbance à 562 nm et la longueur d’onde de 630 nm pour le tissu préparé par vibratome et la comparaison avec le tissu témoin sont illustrées à la figure 3.
Pour démontrer la contractilité du tissu pulmonaire préparé par vibratome, un morceau de tissu frais a été placé sous le microscope à champ lumineux à 400x et traité à l’aide de KCL ou d’Endothelian-1 jusqu’à ce que le tissu soit submergé. Une vidéo prise sur 30-60 s du tissu révèle une constriction du système vasculaire (Vidéo 1).
Pour démontrer la préservation du étiquetage cellulaire 1 semaine après l’injection de tamoxifène, les tranches pulmonaires obtenues après sectionnement vibratome en utilisant le protocole ci-dessus ont été observées au microscope confocal. Le tdTomato marqué dans les tranches de poumon est illustré à la figure 4.
Figure 1: Préparation du tissu pulmonaire murin pour la section des vibratomes. (A) Le VR est canulé avec une aiguille papillon de 30G pour faciliter le passage des solutions de l’héparine au PBS. (B) Lobes pulmonaires entiers après inflation de l’agarose Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Tranches de poumons à l’aide de la section vibratome. Épaisseur : 300 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Expérience de viabilité pour les tranches PCLS du jour 1 au jour 10. (A) Images représentatives du changement de couleur du réactif des tissus préparés par PCLS par rapport à 4% de tissus fixés par PFA. Du tissu PCLS frais et du tissu PFA fixe à 4 % ont été placés dans 450 μL de milieux tissulaires et 50 μL de réactif de viabilité. La couleur de la solution est initialement violette, comme on peut le voir le jour 0 et le jour 9. Après l’incubation pendant la nuit, la solution contenant des tissus PCLS fraîchement préparés est passée à la couleur pourpre / rose (jour 1 et jour 10) en raison de l’environnement réducteur des tissus vivants. (B) Quantification de la viabilité du PCLS du jour 1 au jour 10 par le rapport de l’absorbance à 562 nm et 630 nm avec un lecteur de plaques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Démonstration du étiquetage des cellules tdTomato positives conservées après la récolte. La préparation PCLS provient d’une souris transgénique Cdh5-tdT. Barre d’échelle = 20 μm Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Vidéo 1 : Constriction des vaisseaux à l’aide d’Endothelin-1 sur PCLS. Les souris wildtype C57/B6 sont gonflées avec 1,5 mL d’agarose à 1,5 % et sectionnées en 130 μm à l’aide d’un vibratome. Un morceau de tissu frais a été placé sous le microscope à champ lumineux à 400x et traité à l’aide de KCL ou d’Endothelian-1. Grossissement: 400x. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
Dans ce manuscrit, une méthode améliorée pour produire des images à haute résolution du tissu pulmonaire murin qui préserve la structure vasculaire et optimise la flexibilité expérimentale est décrite, en utilisant spécifiquement l’application de PCLS pour obtenir des microslices de tissu pulmonaire qui peuvent être visualisés en trois dimensions avec une contractilité préservée du système vasculaire. En utilisant le réactif de viabilité, le protocole démontre que des tranches soigneusement préparées et conservées peuvent conserver la viabilité pendant plus d’une semaine. La viabilité préservée des microselices permet d’effectuer des expériences multiples et prolongées sur les structures vasculaires et des voies respiratoires, ce qui en fait un échantillon idéal pour tester la réponse ex vivo de plusieurs médicaments, évaluer les mécanismes moléculaires sous-jacents et tester les réactifs. Cela fait des échantillons préparés la plate-forme idéale pour étudier les effets thérapeutiques potentiels sur le tonus vasculaire avant les essais in vivo 4. La préservation des voies respiratoires pulmonaires et du système vasculaire permet de traiter les échantillons préparés avec des techniques supplémentaires telles que les tests de contractilité décrits dans cet article et résumés dans le tableau 1. Cela permet de fournir des images à haute résolution détaillant la disposition spatiale du système vasculaire pulmonaire et des cascades de signalisation, contribuant ainsi à la pathogenèse des maladies vasculaires pulmonaires.
La préparation de microtranches tissulaires pour l’expérimentation est une technique qui utilise un vibratome, ou lame vibrante, pour produire des tranches organotypiques coupées avec précision. Cela permet d’augmenter la précision et la reproductibilité par rapport aux techniques traditionnelles5. Les microslices des poumons obtenues avec pcLS maintiennent la structure physiologique du tissu pulmonaire au niveau cellulaire, ce qui en fait un outil utile pour étudier une variété de maladies vasculaires pulmonaires. La technologie a été utilisée dans des modèles animaux et humains pour étudier l’anatomie pulmonaire complexe et la pathologie pulmonaire, avec un accent particulier sur les expositions toxiques, les maladies infectieuses et les études immunologiques6,7,8. Selon la physiopathologie sous-jacente, il est possible d’obtenir des microslices des lobes spécifiques d’intérêt ou un ou tous les lobes pour comparer l’hétérogénéité de la maladie. Les tranches trop minces entraînent des difficultés à préserver l’intégrité structurelle, tandis que les tranches plus épaisses peuvent être plus difficiles à effectuer des colorations supplémentaires ou à approfondir l’imagerie tissulaire.
Spécifique aux maladies vasculaires, le PCLS a été utilisé pour étudier l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP), permettant un modèle sophistiqué pour analyser les effets des thérapies potentielles9,10,11. La préservation de la contractilité vasculaire dans les échantillons de poumons murins présente de nombreux avantages thérapeutiques et expérimentaux. En incorporant une technique préservant à la fois la structure et la contractilité du système vasculaire pulmonaire, les échantillons préparés peuvent modéliser la maladie vasculaire pulmonaire ex vivo. Cela a été démontré dans le passé par Rieg et al., qui avec des échantillons de PCLS ont pu démontrer que les veines pulmonaires étaient plus sensibles avec les agonistes a1 et les agonistes b2, suggérant que l’utilisation de ces médicaments dans l’insuffisance cardiaque gauche peut provoquer une augmentation de l’œdème pulmonaire12. En utilisant ce modèle pour étudier les effets des médicaments, ex vivo aide à identifier les agents thérapeutiques potentiels pour d’éventuels essais cliniques. Dans ce manuscrit, le protocole décrit des méthodes pour manipuler et stocker le tissu avec une viabilité préservée pendant 10 jours, permettant la surveillance des tissus après des interventions potentielles et offre une plus grande flexibilité expérimentale. Des études antérieures ont appliqué des méthodes similaires pour préserver la contractilité des voies respiratoires dans des modèles d’asthme, l’effet IL-13 persistant jusqu’à 15 jours3. L’immunocoloration de l’ARN et des cytokines peut conduire à une meilleure compréhension de la pathogenèse sous-jacente responsable de la progression et du développement de la maladie dans diverses maladies vasculaires. Les échantillons préparés peuvent conserver l’étiquetage cellulaire après préparation, démontré dans ce manuscrit avec la préservation des cellules endothéliales tdTomato étiquetées Cdh5+. La préservation d’un tel étiquetage dans des échantillons préparés par vibratome permet de préserver la structure avec l’étiquetage cellulaire, ce qui en fait un outil idéal pour effectuer des expériences de suivi cellulaire. Enfin, les échantillons préparés sont susceptibles d’être étudiés plus avant, tels que la lyse de l’ARN ou le transfert western décrits dans ce protocole, afin d’étudier plus avant la physiopathologie sous-jacente et les mécanismes à l’origine de la progression de la maladie.
Malgré ses avantages par rapport à d’autres techniques, il existe des limites aux tissus préparés par PCLS. L’exécution de PCLS transforme le poumon dynamique en un élément statique, fournissant un instantané dans le temps des cellules et des molécules présentes dans le tissu pulmonaire au moment de la biopsie. À moins que de nombreux échantillons ne soient obtenus, il ne tient pas compte de la vaste hétérogénéité couramment observée dans de nombreuses maladies pulmonaires telles que la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC). Les tissus préparés avec le PCLS sont principalement limités aux petites maladies des voies respiratoires et des vaisseaux. Cela est dû aux défis techniques liés au prélèvement de tissus, car la trachée est généralement incisée pour l’inflation pulmonaire et l’identification et l’isolement des grandes bronches sont difficiles. Ces limitations techniques rendent l’utilisation du tissu PCLS sous-optimale pour étudier les bronches plus grandes et les voies respiratoires conductrices. Les tests dynamiques sont également limités, ce qui en fait une plate-forme loin d’être idéale pour étudier les maladies pulmonaires et les barotraumatismes associés aux ventilateurs. Enfin, l’application du PCLS au domaine de la pneumologie s’est principalement concentrée sur le tissu pulmonaire murin, et d’autres tests et protocoles sont nécessaires avant d’être appliqués aux tissus humains dans un scénario cliniquement pertinent.
En résumé, le manuscrit fournit une méthode complémentaire préservant la contractilité vasculaire du tissu pulmonaire murin PCLS, résultant en des images à haute résolution du système vasculaire pulmonaire jusqu’à 10 jours qui contient des cellules fluorescentes endogènes et de nombreuses autres procédures.
Tableau 1 : Caractéristiques et utilisations de divers vasoconstricteurs. (*utilisé dans cette étude) Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier les Drs Yuan Hao et Kaifeng Liu pour leur soutien technique. Ce travail a été soutenu par un NIH 1R01 HL150106-01A1, la bourse Parker B. Francis et le prix de recherche Aldrighetti de l’Association pour l’hypertension pulmonaire au Dr Ke Yuan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5cc of fractionated heparin in syringe | BD | 100 USP units per mL | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CM | |
| 20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation | Cml Supply | 90120050D | |
| 30cc syringe | BD | 309650 | |
| Anti Anti solution | Gibco | 15240096 | |
| Automated vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | |
| Cell Viability Reagent (alamarBlue) | Thermofisher | DAL1025 | |
| Confocal | Zeiss | 880 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep | Gibco | 10569-010 | |
| Endothelin-1 | Sigma | E7764 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | |
| Mortar and Pestle | Amazon | ||
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermoscientific | 89900 | |
| Surgical suture 6/0 | FST | 18020-60 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermofisher | 15596026 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200 S | |
| Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G | BD | 25-30G |
References
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