Corte de precisão Fatias pulmonares como uma ferramenta eficiente para ex vivo estrutura de vasos pulmonares e estudos de contratibilidade
Summary
Apresentado aqui é um protocolo para preservar a contração vascular do tecido pulmonar murino PCLS, resultando em uma imagem tridimensional sofisticada da vasculatura pulmonar e das vias aéreas, que pode ser preservada por até 10 dias suscetíveis a inúmeros procedimentos.
Abstract
A visualização do tecido pulmonar murino fornece informações estruturais e celulares valiosas sobre as vias aéreas subjacentes e a vasculatura. No entanto, a preservação de vasos pulmonares que realmente representam condições fisiológicas ainda apresenta desafios. Além disso, a delicada configuração dos pulmões murinos resulta em desafios técnicos na preparação de amostras para imagens de alta qualidade que preservam tanto a composição celular quanto a arquitetura. Da mesma forma, ensaios de contrailidade celular podem ser realizados para estudar o potencial das células para responder aos vasoconstritores in vitro,mas esses ensaios não reproduzem o ambiente complexo do pulmão intacto. Em contraste com essas questões técnicas, o método de corte de precisão da fatia pulmonar (PCLS) pode ser aplicado como uma alternativa eficiente para visualizar o tecido pulmonar em três dimensões sem viés regional e servir como um modelo de contração de substituto vivo por até 10 dias. Tecido preparado com PCLS tem estrutura preservada e orientação espacial, tornando-se ideal para estudar processos de doença ex vivo. A localização de células etiquetadas tdTomato endógenas em PCLS colhidas a partir de um modelo de murina tdTomato indutível pode ser visualizada com sucesso por microscopia confocal. Após a exposição aos vasoconstritores, o PCLS demonstra a preservação tanto da contração do vaso quanto da estrutura pulmonar, que pode ser capturada por um módulo de lapso de tempo. Em combinação com os outros procedimentos, como a análise da mancha ocidental e do RNA, o PCLS pode contribuir para a compreensão abrangente das cascatas sinalizadoras que sustentam uma ampla variedade de distúrbios e levam a uma melhor compreensão da fisiopatologia em doenças vasculares pulmonares.
Introduction
Avanços na preparação e imagem do tecido pulmonar que preserva componentes celulares sem sacrificar a estrutura anatômica fornecem uma compreensão detalhada das doenças pulmonares. A capacidade de identificar proteínas, RNA e outros compostos biológicos, mantendo a estrutura fisiológica, oferece informações vitais sobre o arranjo espacial das células que podem ampliar a compreensão da fisiopatologia em inúmeras doenças pulmonares. Essas imagens detalhadas podem levar a uma melhor compreensão de doenças vasculares pulmonares, como a hipertensão arterial pulmonar, quando aplicadas a modelos animais, potencialmente levando a melhores estratégias terapêuticas.
Apesar dos avanços tecnológicos, a obtenção de imagens de alta qualidade do tecido pulmonar murino continua sendo um desafio. O ciclo respiratório é impulsionado por uma pressão intratorácica negativa gerada durante a inalação1. Ao tradicionalmente obter biópsias e preparar amostras pulmonares para imagem, o gradiente de pressão negativa é perdido resultando no colapso das vias aéreas e da vasculatura, que não se representa mais em seu estado atual. Para alcançar imagens realistas refletindo as condições atuais, as vias aéreas pulmonares devem ser reinfladas, e a vasculatura perfundida, transformando o pulmão dinâmico em uma luminária estática. A aplicação dessas técnicas distintas permite a preservação da integridade estrutural, vasculatura pulmonar e componentes celulares, incluindo células imunes, como macrófagos, permitindo que o tecido pulmonar seja visto o mais próximo possível de seu estado fisiológico.
O corte de precisão do corte pulmonar (PCLS) é uma ferramenta ideal para estudar a anatomia e a fisiologia da vasculatura pulmonar2. O PCLS fornece imagens detalhadas do tecido pulmonar em três dimensões, preservando componentes estruturais e celulares. O PCLS tem sido usado em modelos animais e humanos para permitir imagens vivas e de alta resolução de funções celulares em três dimensões, tornando-se uma ferramenta ideal para estudar potenciais alvos terapêuticos, medir a contração das pequenas vias aéreas e estudar a fisiopatologia de doenças pulmonares crônicas como DPOC, ILD e câncer de pulmão3. Utilizando técnicas semelhantes, a exposição de amostras de PCLS a vasoconstritores pode preservar a estrutura pulmonar e a contratilidade do vaso, replicando condições in vitro. Juntamente com a preservação da contratilidade, as amostras preparadas podem passar por análises adicionais, como sequenciamento de RNA, mancha ocidental e citometria de fluxo quando preparadas corretamente. Finalmente, as células rotuladas de cor repórter marcadas com fluorescência tdTomato após a colheita pulmonar podem preservar a rotulagem após o preparo de microslices, tornando-a ideal para estudos de rastreamento celular. A integração dessas técnicas proporciona um modelo sofisticado preservando o arranjo espacial das células e da contratude dos vasos que podem levar a uma compreensão mais detalhada das cascatas sinalizadoras e potenciais opções terapêuticas na doença da vasculatura pulmonar.
Neste manuscrito, o tecido pulmonar murino PCLS é exposto a vasoconstritores, demonstrando integridade estrutural preservada e contratlidade do vaso. O estudo demonstra que o tecido preparado e manuseado adequadamente pode permanecer viável por 10 dias. O estudo também demonstra a preservação de células com fluorescência endógena (tdTomato), permitindo que as amostras forneçam imagens de alta resolução da vasculatura pulmonar e da arquitetura. Finalmente, foram descritas formas de manusear e preparar fatias de tecido para a medição do RNA e da mancha ocidental para investigar mecanismos subjacentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste manuscrito, descreve-se um método aprimorado para produzir imagens de alta resolução do tecido pulmonar murino que preserva a estrutura vascular e otimiza a flexibilidade experimental, utilizando especificamente a aplicação do PCLS para obter microsapos de tecido pulmonar que podem ser visualizados em três dimensões com contrariedade preservada da vasculatura. Usando o reagente de viabilidade, o protocolo demonstra que fatias cuidadosamente preparadas e preservadas podem reter viabilidade por mais de uma sem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer aos Drs. Yuan Hao e Kaifeng Liu pelo apoio técnico. Este trabalho foi apoiado por um NIH 1R01 HL150106-01A1, a Parker B. Francis Fellowship, e o Prêmio de Pesquisa da Associação de Hipertensão Pulmonar Aldrighetti ao Dr. Ke Yuan.
Materials
| 0.5cc of fractionated heparin in syringe | BD | 100 USP units per mL | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CM | |
| 20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation | Cml Supply | 90120050D | |
| 30cc syringe | BD | 309650 | |
| Anti Anti solution | Gibco | 15240096 | |
| Automated vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | |
| Cell Viability Reagent (alamarBlue) | Thermofisher | DAL1025 | |
| Confocal | Zeiss | 880 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep | Gibco | 10569-010 | |
| Endothelin-1 | Sigma | E7764 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | |
| Mortar and Pestle | Amazon | ||
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermoscientific | 89900 | |
| Surgical suture 6/0 | FST | 18020-60 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermofisher | 15596026 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200 S | |
| Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G | BD | 25-30G |
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