精密切肺切片作为 离体 肺血管结构和收缩力研究的有效工具
Summary
这里介绍的是用于保存PCLS小鼠肺组织的血管收缩力的方案，从而产生肺脉管系统和气道的复杂三维图像，可以保存长达10天，容易受到许多程序的影响。
Abstract
鼠肺组织的可视化提供了有关潜在气道和脉管系统的有价值的结构和细胞信息。然而，真正代表生理状况的肺血管的保存仍然存在挑战。此外，鼠肺的精细配置导致技术挑战，为保留细胞组成和结构的高质量图像制备样品。类似地，可以进行细胞收缩力测定来研究细胞 在体外对血管收缩剂作出反应的潜力，但这些测定不能再现完整肺的复杂环境。与这些技术问题相反，精确切割肺切片（PCLS）方法可以作为一种有效的替代方案，在没有区域偏倚的情况下以三维方式可视化肺组织，并作为长达10天的实时替代收缩力模型。使用PCLS制备的组织保留了结构和空间取向，使其成为 离体研究疾病过程的理想选择。从诱导的tdTomato报告小鼠模型中收获的PCLS中内源性tdTomato标记细胞的位置可以通过共聚焦显微镜成功可视化。暴露于血管收缩剂后，PCLS显示出血管收缩性和肺结构的保存，这可以通过延时模块捕获。结合其他程序，如蛋白质印迹和RNA分析，PCLS有助于全面了解各种疾病背后的信号级联反应，并导致更好地理解肺血管疾病的病理生理学。
Introduction
在不牺牲解剖结构的情况下保留细胞成分的肺组织的制备和成像的进步提供了对肺部疾病的详细了解。在保持生理结构的同时识别蛋白质，RNA和其他生物化合物的能力提供了有关细胞空间排列的重要信息，可以拓宽对许多肺部疾病的病理生理学的理解。当应用于动物模型时，这些详细的图像可以导致对肺血管疾病（如肺动脉高血压）的更好理解，从而可能导致治疗策略的改进。
尽管技术进步，但获得小鼠肺组织的高质量图像仍然是一个挑战。呼吸周期由吸入期间产生的负胸内压驱动1。传统上，当获得活检并准备肺部样本进行成像时，负压梯度丢失，导致气道和脉管系统塌陷，不再代表自身的当前状态。为了获得反映当前状况的真实图像，必须重新充气肺气道，并灌注脉管系统，将动态肺变成静态夹具。这些不同技术的应用可以保持结构完整性，肺脉管系统和细胞成分，包括免疫细胞，如巨噬细胞，允许将肺组织视为尽可能接近其生理状态。
精密切肺切片（PCLS）是研究肺血管系统解剖学和生理学的理想工具2。PCLS提供三维肺组织的详细成像，同时保留结构和细胞成分。PCLS已被用于动物和人类模型中，以允许在三维空间中提供细胞功能的实时高分辨率图像，使其成为研究潜在治疗靶点，测量小气道收缩和研究慢性肺部疾病（如COPD，ILD和肺癌）的病理生理学的理想工具3。使用类似的技术，PCLS样品暴露于血管收缩剂可以保持肺结构和血管收缩性，复制 体外 条件。除了保持收缩性外，制备的样品在正确制备时还可以进行额外的分析，例如RNA测序，蛋白质印迹和流式细胞术。最后，在肺部收获后用tdTomato荧光标记的报告色标记细胞可以在制备微切片后保留标记，使其成为细胞追踪研究的理想选择。这些技术的整合提供了一个复杂的模型，保留了细胞的空间排列和血管收缩力，可以更详细地了解肺脉管系统疾病的信号级联反应和潜在的治疗方案。
在这份手稿中，PCLS小鼠肺组织暴露于血管收缩剂，显示出保留的结构完整性和血管收缩性。该研究表明，适当准备和处理的组织可以保持活力10天。该研究还证明了用内源性荧光（tdTomato）保存细胞，允许样品提供肺脉管系统和结构的高分辨率图像。最后，已经描述了处理和制备用于RNA测量的组织切片和蛋白质印迹以研究潜在机制的方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这份手稿中，描述了一种增强的方法，以产生高分辨率的小鼠肺组织图像，该图像保留了血管结构并优化了实验灵活性，特别是使用PCLS的应用来获得可以在三维空间中观察的肺组织微切片，并保留脉管系统的收缩力。使用活性试剂，该方案表明，精心准备和保存的切片可以保持活力超过一周。微切片的存活力得以在脉管系统和气道结构上进行多次和长时间的实验，使其成为测试多种药物 的?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢袁昊博士和刘开峰博士的技术支持。这项工作得到了NIH 1R01 HL150106-01A1，Parker B. Francis奖学金和肺动脉高压协会Aldrighetti研究奖的支持。
Materials
| 0.5cc of fractionated heparin in syringe | BD | 100 USP units per mL | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CM | |
| 20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation | Cml Supply | 90120050D | |
| 30cc syringe | BD | 309650 | |
| Anti Anti solution | Gibco | 15240096 | |
| Automated vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | |
| Cell Viability Reagent (alamarBlue) | Thermofisher | DAL1025 | |
| Confocal | Zeiss | 880 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep | Gibco | 10569-010 | |
| Endothelin-1 | Sigma | E7764 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | |
| Mortar and Pestle | Amazon | ||
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermoscientific | 89900 | |
| Surgical suture 6/0 | FST | 18020-60 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermofisher | 15596026 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200 S | |
| Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G | BD | 25-30G |
References
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