Fette polmonari tagliate con precisione come strumento efficiente per studi ex vivo sulla struttura dei vasi polmonari e sulla contrattilità
Summary
Qui viene presentato un protocollo per preservare la contrattilità vascolare del tessuto polmonare murino PCLS, risultante in una sofisticata immagine tridimensionale della vascolarizzazione polmonare e delle vie aeree, che può essere conservata fino a 10 giorni che è suscettibile di numerose procedure.
Abstract
La visualizzazione del tessuto polmonare murino fornisce preziose informazioni strutturali e cellulari riguardanti le vie aeree e la vascolarizzazione sottostanti. Tuttavia, la conservazione dei vasi polmonari che rappresenta veramente le condizioni fisiologiche presenta ancora delle sfide. Inoltre, la delicata configurazione dei polmoni murini comporta sfide tecniche nella preparazione di campioni per immagini di alta qualità che preservano sia la composizione cellulare che l’architettura. Allo stesso modo, i saggi di contrattilità cellulare possono essere eseguiti per studiare il potenziale delle cellule di rispondere ai vasocostrittori in vitro, ma questi saggi non riproducono l’ambiente complesso del polmone intatto. In contrasto con questi problemi tecnici, il metodo PCLS (Precision-Cut Lung Slice) può essere applicato come alternativa efficiente per visualizzare il tessuto polmonare in tre dimensioni senza pregiudizi regionali e fungere da modello di contrattilità surrogata dal vivo per un massimo di 10 giorni. Il tessuto preparato utilizzando PCLS ha conservato la struttura e l’orientamento spaziale, rendendolo ideale per studiare i processi patologici ex vivo. La posizione delle cellule endogene tdTomato-labeled in PCLS raccolte da un modello murino tdTomato reporter inducibile può essere visualizzata con successo mediante microscopia confocale. Dopo l’esposizione a vasocostrittori, PCLS dimostra la conservazione sia della contrattilità dei vasi che della struttura polmonare, che può essere catturata da un modulo time-lapse. In combinazione con le altre procedure, come western blot e analisi dell’RNA, PCLS può contribuire alla comprensione completa delle cascate di segnalazione che sono alla base di un’ampia varietà di disturbi e portano a una migliore comprensione della fisiopatologia nelle malattie vascolari polmonari.
Introduction
I progressi nella preparazione e nell’imaging del tessuto polmonare che preserva i componenti cellulari senza sacrificare la struttura anatomica forniscono una comprensione dettagliata delle malattie polmonari. La capacità di identificare proteine, RNA e altri composti biologici mantenendo la struttura fisiologica offre informazioni vitali sulla disposizione spaziale delle cellule che possono ampliare la comprensione della fisiopatologia in numerose malattie polmonari. Queste immagini dettagliate possono portare a una migliore comprensione delle malattie vascolari polmonari, come l’ipertensione dell’arteria polmonare, se applicate a modelli animali, portando potenzialmente a migliori strategie terapeutiche.
Nonostante i progressi della tecnologia, ottenere immagini di alta qualità del tessuto polmonare murino rimane una sfida. Il ciclo respiratorio è guidato da una pressione intratoracica negativa generata durante l’inalazione1. Quando tradizionalmente si ottengono biopsie e si preparano campioni polmonari per l’imaging, il gradiente di pressione negativa viene perso con conseguente collasso delle vie aeree e della vascolarizzazione, che non si presenta più nel suo stato attuale. Per ottenere immagini realistiche che riflettano le condizioni attuali, le vie aeree polmonari devono essere rigonfiate e la vascolarizzazione perfusa, trasformando il polmone dinamico in un dispositivo statico. L’applicazione di queste tecniche distinte consente la conservazione dell’integrità strutturale, della vascolarizzazione polmonare e dei componenti cellulari, comprese le cellule immunitarie come i macrofagi, consentendo al tessuto polmonare di essere visto il più vicino possibile al suo stato fisiologico.
Precision cut lung slicing (PCLS) è uno strumento ideale per studiare l’anatomia e la fisiologia della vascolarizzazione polmonare2. PCLS fornisce immagini dettagliate del tessuto polmonare in tre dimensioni, preservando i componenti strutturali e cellulari. PCLS è stato utilizzato in modelli animali e umani per consentire immagini vive ad alta risoluzione delle funzioni cellulari in tre dimensioni, rendendolo uno strumento ideale per studiare potenziali bersagli terapeutici, misurare la contrazione delle piccole vie aeree e studiare la fisiopatologia delle malattie polmonari croniche come BPCO, ILD e cancro del polmone3. Utilizzando tecniche simili, l’esposizione di campioni PCLS a vasocostrittori può preservare la struttura polmonare e la contrattilità dei vasi, replicando le condizioni in vitro. Oltre a preservare la contrattilità, i campioni preparati possono essere sottoposti a ulteriori analisi come il sequenziamento dell’RNA, il Western blot e la citometria a flusso se preparati correttamente. Infine, le cellule marcate con colore reporter contrassegnate con fluorescenza tdTomato dopo la raccolta polmonare possono preservare l’etichettatura dopo aver preparato le microslice, rendendolo ideale per gli studi di tracciamento cellulare. L’integrazione di queste tecniche fornisce un modello sofisticato che preserva la disposizione spaziale delle cellule e la contrattilità dei vasi che può portare a una comprensione più dettagliata delle cascate di segnalazione e delle potenziali opzioni terapeutiche nella malattia vascolare polmonare.
In questo manoscritto, il tessuto polmonare murino PCLS è esposto a vasocostrittori, dimostrando l’integrità strutturale preservata e la contrattilità dei vasi. Lo studio dimostra che il tessuto preparato e maneggiato in modo appropriato può rimanere vitale per 10 giorni. Lo studio dimostra anche la conservazione delle cellule con fluorescenza endogena (tdTomato), consentendo ai campioni di fornire immagini ad alta risoluzione della vascolarizzazione polmonare e dell’architettura. Infine, sono stati descritti modi per gestire e preparare fette di tessuto per la misurazione dell’RNA e Western blot per studiare i meccanismi sottostanti.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo manoscritto, viene descritto un metodo avanzato per produrre immagini ad alta risoluzione del tessuto polmonare murino che preserva la struttura vascolare e ottimizza la flessibilità sperimentale, in particolare utilizzando l’applicazione di PCLS per ottenere microslice di tessuto polmonare che possono essere visualizzate in tre dimensioni con contrattilità preservata della vascolarizzazione. Utilizzando il reagente di vitalità, il protocollo dimostra che le fette accuratamente preparate e conservate possono…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare i dottori Yuan Hao e Kaifeng Liu per il loro supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato da un NIH 1R01 HL150106-01A1, dalla Parker B. Francis Fellowship e dal Pulmonary Hypertension Association Aldrighetti Research Award al Dr. Ke Yuan.
Materials
| 0.5cc of fractionated heparin in syringe | BD | 100 USP units per mL | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CM | |
| 20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation | Cml Supply | 90120050D | |
| 30cc syringe | BD | 309650 | |
| Anti Anti solution | Gibco | 15240096 | |
| Automated vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | |
| Cell Viability Reagent (alamarBlue) | Thermofisher | DAL1025 | |
| Confocal | Zeiss | 880 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep | Gibco | 10569-010 | |
| Endothelin-1 | Sigma | E7764 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | |
| Mortar and Pestle | Amazon | ||
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermoscientific | 89900 | |
| Surgical suture 6/0 | FST | 18020-60 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermofisher | 15596026 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200 S | |
| Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G | BD | 25-30G |
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