Summary
מוצג כאן פרוטוקול לשימור התכווצות כלי הדם של רקמת הריאה המורינית PCLS, וכתוצאה מכך תמונה תלת ממדית מתוחכמת של כלי הדם הריאתי ודרכי הנשימה, אשר ניתן לשמר עד 10 ימים כי הוא רגיש הליכים רבים.
Abstract
ההדמיה של רקמת ריאה מורינית מספקת מידע מבני ותאי בעל ערך לגבי דרכי הנשימה הבסיסיות ו vasculature. עם זאת, שימור כלי הריאות המייצגים באמת תנאים פיזיולוגיים עדיין מציב אתגרים. בנוסף, התצורה העדינה של ריאות מורינה גורמת לאתגרים טכניים בהכנת דגימות לתמונות באיכות גבוהה המשמרות הן את הרכב התאים והן את הארכיטקטורה. באופן דומה, בדיקות התכווצות הסלולר יכולות להתבצע כדי לחקור את הפוטנציאל של תאים להגיב vasoconstrictors במבחנה, אבל בדיקות אלה אינם לשחזר את הסביבה המורכבת של הריאה שלם. בניגוד לבעיות טכניות אלה, ניתן ליישם את שיטת פרוסת הריאה המדויקת (PCLS) כחלופה יעילה להדמיית רקמת ריאה בשלושה ממדים ללא הטיה אזורית ולשמש מודל קבלנות פונדקאית חיה עד 10 ימים. רקמות מוכנות באמצעות PCLS יש מבנה משומר אוריינטציה מרחבית, מה שהופך אותו אידיאלי ללמוד תהליכי מחלה ex vivo. המיקום של תאים אנדוגניים המסומנים ב- PCLS שנקטפו ממודל מורינה של כתב tdTomato שניתן לתמצית יכול להיות חזותי בהצלחה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. לאחר חשיפה vasoconstrictors, PCLS מדגים את השימור של התכווצות כלי הדם ואת מבנה הריאות, אשר ניתן ללכוד על ידי מודול לשגות זמן. בשילוב עם ההליכים האחרים, כגון כתם מערבי וניתוח RNA, PCLS יכול לתרום להבנה מקיפה של מפלי איתות העומדים בבסיס מגוון רחב של הפרעות ולהוביל להבנה טובה יותר של הפתופיזיולוגיה במחלות כלי דם ריאתיים.
Introduction
ההתקדמות בהכנת והדמיה של רקמת ריאה המשמרת רכיבים תאיים מבלי להקריב מבנה אנטומי מספקת הבנה מפורטת של מחלות ריאות. היכולת לזהות חלבונים, RNA ותרכובות ביולוגיות אחרות תוך שמירה על מבנה פיזיולוגי מציעה מידע חיוני על הסידור המרחבי של תאים שיכולים להרחיב את ההבנה של הפתופיזיולוגיה במחלות ריאות רבות. תמונות מפורטות אלה יכולות להוביל להבנה טובה יותר של מחלות כלי דם ריאתיים, כגון יתר לחץ דם בעורק הריאות, כאשר הם מוחלים על מודלים של בעלי חיים, מה שעלול להוביל לאסטרטגיות טיפוליות משופרות.
למרות ההתקדמות הטכנולוגית, השגת תמונות באיכות גבוהה של רקמת ריאה מורינה נותרה אתגר. מחזור הנשימה מונע על ידי לחץ תוך-אתורי שלילי שנוצר במהלך שאיפה1. כאשר באופן מסורתי להשיג ביופסיות והכנת דגימות ריאות להדמיה, שיפוע הלחץ השלילי הולך לאיבוד וכתוצאה מכך קריסת דרכי הנשימה vasculature, אשר כבר לא מייצג את עצמו במצב הנוכחי שלה. כדי להשיג תמונות מציאותיות המשקפות את התנאים הנוכחיים, יש לנפח מחדש את דרכי הנשימה הריאתיות, ואת כלי השיט, שינוי הריאה הדינמית לתוך מתקן סטטי. היישום של טכניקות ייחודיות אלה מאפשר שימור של שלמות מבנית, כלי דם ריאתי, ורכיבים תאיים, כולל תאים חיסוניים כגון מקרופאגים, המאפשר רקמת ריאה להיות גלוי קרוב ככל האפשר למצבה הפיזיולוגי.
חיתוך ריאות מדויק (PCLS) הוא כלי אידיאלי לחקר האנטומיה והפיזיולוגיה של כלי הריאות2. PCLS מספק הדמיה מפורטת של רקמת הריאה בשלושה ממדים תוך שמירה על רכיבים מבניים ותאיים. PCLS שימש במודלים של בעלי חיים ובני אדם כדי לאפשר תמונות חיות ברזולוציה גבוהה של תפקודים תאיים בשלושה ממדים, מה שהופך אותו לכלי אידיאלי לחקר מטרות טיפוליות פוטנציאליות, למדוד התכווצות דרכי הנשימה הקטנות וללמוד את הפתופיזיקה של מחלות ריאות כרוניות כגון COPD, ILD וסרטןריאות 3. באמצעות טכניקות דומות, החשיפה של דגימות PCLS vasoconstrictors יכול לשמר את מבנה הריאות ואת התכווצות כלי הדם, שכפול בתנאי הפריה. יחד עם שמירה על התכווצות, דגימות מוכנות יכולות לעבור ניתוח נוסף כגון רצף RNA, כתם מערבי, וציטומטריית זרימה כאשר הם מוכנים כראוי. לבסוף, כתב צבע מסומן עם פלואורסצנטיות tdTomato לאחר קציר ריאות יכול לשמר תיוג לאחר הכנת microslices, מה שהופך אותו אידיאלי עבור מחקרי מעקב אחר תאים. השילוב של טכניקות אלה מספק מודל מתוחכם המשמר את הסידור המרחבי של תאים והתכווצות כלי שיכול להוביל להבנה מפורטת יותר של מפלי האיתות ואפשרויות טיפוליות פוטנציאליות במחלת כלי הדם הריאתי.
בכתב יד זה, רקמת הריאה המורינה של PCLS נחשפת ל vasoconstrictors, המדגימה שלמות מבנית שמורה והתכווצות כלי. המחקר מדגים כי הרקמה מוכנה ומטופלת כראוי יכול להישאר קיימא במשך 10 ימים. המחקר מדגים גם את שימור התאים עם פלואורסצנטיות אנדוגני (tdTomato), ומאפשר דגימות לספק תמונות ברזולוציה גבוהה של vasculature ריאתי וארכיטקטורה. לבסוף, תוארו דרכים לטפל ולהכין פרוסות רקמות למדידת RNA וכתם מערבי כדי לחקור מנגנונים הבסיסיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הטיפול בבעלי חיים היה בהתאם להנחיות של בית החולים לילדים בבוסטון וועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית אישרה פרוטוקולים. העכברים המשמשים במחקר זה הם עכברי C57/B6 מסוג בר ו- Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato חצה עכברים.
1. הכנת פתרונות
- הכן פתרון חיץ פוספט (1x PBS) ופתרון אגרוז 2% הנדרש במהלך הניסוי מראש.
- מערבבים 2 גרם אבקת אגרוז ל-100 מ"ל של מים משועבדים אוטומטית. מחממים אותו במיקרוגל כמה שניות בכל פעם עד הפתרון ברור.
- מניחים את הפתרון באמבט מים ב 42 °C (50 °F) עד השימוש.
הערה: ניתן לאחסן הן PBS והן 2% אגרוז בטמפרטורת החדר במשך שבועות.
2. מיצוי של ריאה העכבר
- להרדים את העכבר על ידי מנת יתר איזופלוריין. להשיג מנת יתר איזופלורן על ידי הצבת כמות קטנה של איזופלוראן על נייר טישו במפלס התחתון והצבת העכבר במפלס העליון בחיטוי. העכבר נשאר בחיטוי עד שהוא מחוסר הכרה.
- להבטיח את מותו של העכבר על ידי הפעלת לחץ נחות על הצוואר ומשיכת caudal על הזנב. הבא את העכבר למשטח הניתוח.
- הנח את העכבר בתנוחת העפר והבטח אותו במקום הדבקת כפות רגליים ואף לשולחן עם סרט הדבקה.
- לרסס את פני השטח הגחון של העכבר עם 70% אתנול ולנגב את האתנול עודף.
- הרם את עור הבטן של העכבר עם מלקחיים במיקום של שלפוחית השתן לחתוך בקו האמצע עם מספריים כירורגיים, נע מעולה לאזור צוואר הרחם, חשיפת קנה הנשימה.
- הרם את השכבה הפאשיאלית הבסיסית עם פינצטה וחתוך עם מספריים כירורגיים כדי לחשוף איברים קרביים ותא mediastinal, שוב חיתוך נחות מעולה.
- תחתוך את החזה בקו האמצע כדי לחשוף את הלב והריאה.
- באמצעות ניתוח קהה, לנתק את הסרעפת מן הכבד ותא הבטן.
- אתר את הוועד הנעית הנחות (IVC) מתחת למעיים וחתוך את ה- IVC.
- אתר את החדר הימני.
הערה: החדר הימני יהיה מראה קל יותר בהשוואה לחדר השמאלי ואת המחיצה intraventricular צריך להיות חזותי, הפרדת החדר הימני מן החדר השמאלי. - הזריקו 0.5 מ"ל של הפרין חלקי של 1% לחדר הימני עם מחט פרפר 25-30 גרם ואז שטפו לאט אך בהתמדה עם 10-15 מ"ל של 1x PBS(איור 1A).
- היזהר לא להכניס את המחט דרך הלב ולהזריק הפרין לתוך חלל החציון.
הערה: ההזרקה של 1x PBS הופכת את רקמת הריאה ללבן. נוזל extravasating מאבי העורקים הבטן צריך להיות ברור וחסר צבע הכבד עשוי להיות לבן במראה לאחר שטיפה מוצלחת.
- היזהר לא להכניס את המחט דרך הלב ולהזריק הפרין לתוך חלל החציון.
- אתר את הגרון ונותח את הפאסיה והרקמות שמסביב באמצעות פינצטה קהה.
- מניחים את התבר הכירורגי מתחת קנה הנשימה וקושרים קשר כירורגי באופן רופף.
- מניחים חור קטן בקנה הנשימה עדיף על חוט ו canulate עם 20 G מחט קהה.
- הדקו את התיל סביב המחט ו קנה הנשימה באמצעות קשר כירורגי.
- הזריקו 2.5-4 מ"ל של אגרוז לתוך קנה הנשימה ופקחו על אינפלציית הריאה.
- לאחר אגרוז הוא החדיר, לשפוך קר, מצונן 1x PBS מעל הריאה כדי לחזק את אגרוז.
- חותכים את קנה הנשימה העליון על התפר כירורגי לנתח את הריאה והלב מן mediastinum על ידי הסרת כל הידבקויות fascia.
- לאחר התגבשות, מניחים ב- 1x DMEM (מספיק כדי להטביע רקמה) בצלחת פטרי כדי לשמור על קרח. פרוס מיד אונה אחת באמצעות מכונת ויברטום(איור 1B).
3. פרוסות ריאות חתוכות במדויק
- חבר את המדגם לפלטפורמה באמצעות דבק-על, תוך שמירה על הצד המהודד של המדגם פונה כלפי מעלה.
- מלא את מיכל המדגם עם 1x PBS, להבטיח כי המדגם הוא שקוע לחלוטין.
- מלא את המיכל המקיף את מיכל הדגימה בקרח כדי לשמור על PBS שמסביב לדגום קר.
- הפעל את הוויברטום והסתגל להגדרות הרצויות להלן.
- הגדר את העובי ל 300um.
- הגדר את התדר ל- 100 הרץ.
- הגדר את המשרעת ל 0.6 מ"מ.
- הגדר את המהירות ל 5 מיקרומטר /s.
- בעזרת מפתח ברגים של אלן, הפכו את מחזיק הלהב לתנוחה הבטוחה ופתחו את הלסתות כדי להכניס להב.
- הדקו את הלסתות עם מפתח ברגים של אלן והפכו את מחזיק הלהב לתנוחה המתאימה לתחינה.
- הנח את הדגימה ואת הפלטפורמה על הקופסה והחליק לפני הלהב.
- מלא את התיבה סביב פלטפורמת המדגם ב- 1x PBS עד שהדגימה שקועה.
- מביאים את להב הוויברטום לקצה הבלוק ומנמיכים ידנית את הלהב עד שהוא אפילו עם החלק העליון של הדגימה.
- אשרו את ההגדרות המתאימות והפעילו את הוויברטום(איור 2).
- כאשר פרוסות טריות נחתכות, הסר את הדגימות מן PBS ומניחים אותם לתוך צלחת פטרי סטרילי עם 10 מ"ל של 1x DMEM המכיל 1x אנטי-ממיקוטי אנטישמי.
- בסיום, לסגת הלהב לחלוטין ולאחר מכן להשתמש מפתח ברגים אלן להרים את הלהב למצב בטוח.
- לאחסן את הדגימות ב 1x DMEM באינקובטור ב 37 °C עם הכדאיות נשמר עד 10 ימים (ראה ניסוי קיימא להלן).
4. ניסוי נסוקונסטרי לדוגמה
- הנח פרוסת רטט על שקופית מיקרוסקופ.
- לפני הנחתו על השקופית, השתמש במחיק ניקוי כדי להיפטר מהמדיום העודף (PBS).
- מקם את המדגם תחת מיקרוסקופיה ניגודיות פאזה והשתמש בהגדלה של פי 10-20 כדי לזהות כלי שיט.
- שים 500 μL של vasoconstrictors, כגון 60 mM KCl או 1 μM אנדותלין-1 כדי להטביע לחלוטין את השקופית.
- צפה ולכוד את הווידאו על ידי הקלטה עבור 30 s-60 s(וידאו 1).
5. הכנת הרקמה ל-RNA או לתזה של חלבון ב-PCLS
- לפני תחילת הניסוי, מלאו קופסת קצף פוליסטירן קטנה ב-1 ליטר של חנקן נוזלי.
- מניחים שני צינורות מיקרוצנטריפוגה קטנים (1.5 מ"ל) במיכל עם חנקן נוזלי לפני תחילת.
הערה: חנקן נוזלי צריך להתקרר מחוץ לצינורות, עם זאת, לא להיות בפנים. הקפד לטפל חנקן נוזלי בזהירות ולא לחשוף את העור חנקן נוזלי. השתמש במלקחיים ובכפפות כדי למקם ולהסיר צינורות מהקופסה. - מניחים 4-5 פרוסות רטט טריות בקערת מרגמה.
- יוצקים 5-10 מ"ל של N2 נוזלי על גבי הפרוסות בקערת המרגמה.
- השתמשו במהירות במעלה כדי לטחון את פרוסות ההקפאה של הפלאש לאבקה לפני שהחנקן הנוזלי מתאדה.
הערה: רקמה צריכה לדחוס לאבקה דקה. אם לא, מוסיפים חנקן נוזלי נוסף עד להשגת. - בעזרת כף מדידה של מעבדת פלדה (עם חנקן נוזלי), יש לגרוף את האבקה לתוך שני צינורות המיקרוצנטריפוגה המצוננים.
- Lyse האבקה על ידי הוספת 500 μL של ריאגנט מיצוי RNA להמשיך עם בידוד RNA או 500 μL של מאגר RIPA (מכיל מעכבי פרוטאז 1x) כדי להמשיך עם תמוגת חלבון.
- יש לאחסן את הדגימות ב-80 °C (80 °F) עד לבידוד RNA נוסף, מדידת BCA וכתם מערבי.
6. קביעת הכדאיות
- לאחר הכנת ויברטום, מניחים שתי פרוסות ריאות לתוך צלחת תרבית 24-well עם 450 μL של מדיה DMEM ו 50 μL של ריאגנט הכדאיות התא (להבטיח כי הרקמה שקועה לחלוטין).
- מחזירים את הדגימות ל-5% CO2 באינקובטור 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם חשיפה מינימלית לאור.
- בבוקר, התבונן בפתרון לשינוי צבע. הפתרון הכחול הופך ורוד כאשר הרקמה היא בת קיימא.
7. שימור תיוג תאים
- לטפל Cdh5-CreERT2 מהונדס חצה עם עכבר Ai14 tdTomato עם הזרקת IP של טמוקסיפן (2 מ"ג ליום) במשך סך של 5 ימים (מינון כולל 10 מ"ג טמוקסיפן) כדי לגרום tdTomato תווית Cre תאים חיוביים.
- שבוע לאחר ההזרקה, להכין את הריאות באמצעות השלבים לעיל 1 עד 3.
- לאחר הכנת פרוסת הריאות החתכה במדויק, מניחים את הרקמה על שקופית מיקרוסקופ ומניחים כיסוי על גבי הרקמה.
- השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לזהות כתמי tdTomato (באמצעות אורך גל עירור 555 ננומטר).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאשר נוסף לתאים או רקמה, ריאגנט הכדאיות משתנה על ידי הסביבה המפחיתה של רקמה בת קיימא והופך ורוד / אדום, הופך פלואורסצנטי מאוד. שינויי הצבעים המייצגים שזוהו מהיום 0-1 ומהיום 9-10 מוצגים באיור 3. כאמור, הפתרון התחיל בכחול והפך ורוד בן לילה, והפגין כדאיות. שינוי צבע מתרחש בדרך כלל בתוך 1-4 שעות; עם זאת, ייתכן שיהיה צורך בזמן ארוך יותר. כדי להיערך, נעשה שימוש בקורא לוחות כדי לקבוע את הספיגה של מדגם מוכן רטט ופרוסת ריאות קבועה של PFA 4%, המשמשת כשליטה. פתרונות שבהם דוגרו דגימות נקראו בספיגה של 562 ננומטר ו 630 ננומטר בעקבות המלצת היצרן. ההבדל היומי בין ספיגה ב-562 ננומטר לבין אורך גל של 630 ננומטר לרקמה המוכנה לויברטום לבין השוואה לרקמת הבקרה מוצגים באיור 3.
כדי להדגים התכווצות של רקמת ריאה מוכנה רטט, פיסת רקמה טרייה הונחה תחת מיקרוסקופ השדה הבהיר ב 400x וטופלה באמצעות KCL או אנדותל-1 עד שהרקמה שקעה. וידאו שצולם מעל 30-60 שניות של הרקמה חושף התכווצות של כלי ההשחת (וידאו 1).
כדי להדגים שימור של תיוג תאים שבוע לאחר הזרקת טמוקסיפן, פרוסות הריאות שהושגו לאחר חתך ויברטום באמצעות הפרוטוקול לעיל נצפו תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. תיוג tdTomato בפרוסות הריאה מוצג באיור 4.
איור 1: הכנת רקמת ריאה מורינית לחתך ויברטום. (A)הקרוואן הוא cannulated עם מחט פרפר 30G כדי להקל על החלפת פתרונות מן הפרין ל- PBS. (ב)כל אונות הריאות לאחר אינפלציית אגרוז אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: פרוסות ריאה באמצעות חתך ויברטום. עובי: 300 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניסוי כדאיות לפרוסות PCLS מהיום הראשון ועד היום העשירי. (A)תמונות מייצגות של שינוי צבע ריאגנט של רקמה מוכנה PCLS לעומת 4% PFA קבוע רקמה. רקמת PCLS טרי ורקמת PFA קבועה 4% הוכנסו 450 μL של מדיה רקמה ו 50 μL של ריאגנט הכדאיות. צבע הפתרון בתחילה סגול, כפי שניתן לראות ביום 0 ויום 9. לאחר הדגירה בן לילה, הפתרון המכיל רקמות PCLS שהוכנו טרי השתנה לצבע סגול / ורוד (יום 1 ויום 10) בשל הסביבה המצטמצמת של רקמות חיות. (B)כימות הכדאיות של PCLS מיום 1 עד יום 10 על ידי היחס בין הספיגה ב 562 ננומטר ו 630 ננומטר עם קורא לוחות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הדגמה של תאים חיוביים tdTomato משומרים תיוג לאחר הקציר. הכנת PCLS היא מעכבר מהונדס Cdh5-tdT. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
וידאו 1: התכווצות של כלי באמצעות אנדותלין-1 ב- PCLS. עכברי Wildtype C57/B6 מנופחים עם 1.5 מ"ל של 1.5% אגרוז ומדורגים ל-130 מיקרומטר באמצעות ויברטום. פיסת רקמה טרייה הונחה מתחת למיקרוסקופ השדה הבהיר ב-400x וטופלה באמצעות KCL או אנדותל-1. הגדלה: 400x. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בכתב יד זה, שיטה משופרת לייצר תמונות ברזולוציה גבוהה של רקמת ריאה מורינה המשמרת את מבנה כלי הדם ומייעלת את הגמישות הניסיונית מתוארת, במיוחד באמצעות היישום של PCLS כדי להשיג microslices של רקמת ריאה שניתן לראות בשלושה ממדים עם התכווצות השתמרה של כלי הדם. באמצעות ריאגנט הכדאיות, הפרוטוקול מדגים כי פרוסות מוכנות בקפידה ונשמר יכול לשמור על הכדאיות במשך יותר משבוע. הכדאיות המשומרת של microslices מאפשרת את האפשרות לניסויים מרובים וממושכים להתבצע על vasculature ומבני דרכי הנשימה, מה שהופך אותו מדגם אידיאלי כדי לבדוק את התגובה ex vivo של תרופות מרובות, להעריך מנגנונים מולקולריים הבסיסיים, ולבדוק ריאגנטים. זה עושה דגימות מוכנות הפלטפורמה האידיאלית ללמוד השפעות טיפוליות פוטנציאליות על טון כלי הדם לפני בניסויים vivo 4. שימור דרכי הנשימה הריאות ו vasculature מאפשר דגימות מוכנות להיות מטופלים עם טכניקות נוספות כגון בדיקות חוזים המתוארות במאמר זה מסוכמות בטבלה 1. זה מאפשר את ההזדמנות לספק תמונות ברזולוציה גבוהה המפרט את הסידור המרחבי של vasculature ריאתי ומפל איתות, תורם פתוגנזה של מחלות כלי דם ריאתיים.
הכנת מיקרו-רקמות לניסויים היא טכניקה המשתמשת בוויברטום, או להב רוטט, כדי לייצר פרוסות אורגנוטיפיות מדויקות. זה מאפשר דיוק מוגבר ושחזור בהשוואה לטכניקות מסורתיות5. מיקרו-ריסים של הריאות המתקבלות עם PCLS שומרים על המבנה הפיזיולוגי של רקמת הריאה לרמה התאית, מה שהופך אותו לכלי שימושי לחקר מגוון מחלות כלי דם ריאתיים. הטכנולוגיה שימשה הן במודלים של בעלי חיים והן במודלים אנושיים כדי לחקור את אנטומיה הריאות המורכבת ואת פתולוגיה ריאתית, עם דגש ספציפי על חשיפות רעילות, מחלות זיהומיות, ומחקרים אימונולוגיים6,7,8. בהתאם לפתופיזיולוגיה הבסיסית, מיקרו-ריסים ניתן להשיג של אונות ספציפיות של עניין או אחת /כל האונות להשוות הטרוגניות המחלה. פרוסות דקות מדי גורמות לקושי בשמירה על שלמות מבנית, בעוד פרוסות עבות יותר עשויות להיות קשות יותר לביצוע כתמים נוספים או עמוק בהדמיית רקמות.
ספציפי למחלות כלי דם, PCLS נוצל כדי ללמוד יתר לחץ דם בעורק הריאות (PAH), המאפשר מודל מתוחכם לנתח את ההשפעות של טיפולים פוטנציאליים9,10,11. שימור התכווצות כלי הדם בדגימות ריאות מורין יש יתרונות טיפוליים וחקירה רבים. על ידי שילוב טכניקה המשמרת הן את המבנה והן את ההתכווצות של כלי הדם הריאתי, דגימות מוכנות יכולות לדגמן מחלת כלי דם ריאתית ex vivo. זה הוכח בעבר על ידי Rieg et al., אשר עם דגימות PCLS הצליחו להוכיח כי ורידים ריאתיים היו רגישים יותר עם agonists-agonists ו b2-אגוניסטים, מציע את השימוש בתרופות אלה באי ספיקת לב שמאל עלול לגרום בצקת ריאות מוגברת12. באמצעות מודל זה כדי לחקור את ההשפעות של תרופות, ex vivo מסייע לזהות את הסוכנים הטיפוליים הפוטנציאליים לניסויים קליניים אפשריים. בכתב יד זה, הפרוטוקול מתאר שיטות לטפל ולאחסן את הרקמה עם כדאיות שנשמרה במשך 10 ימים, ומאפשר ניטור של רקמות לאחר התערבויות פוטנציאליות ומציע גמישות ניסיונית גדולה יותר. מחקרים קודמים יישמו שיטות דומות כדי לשמר התכווצות דרכי הנשימה במודלים של אסתמה, כאשר אפקט IL-13 נמשך עד 15 ימים3. רנ"א וציטוקינים חיסוניים יכולים להוביל להבנה טובה יותר של הפתוגנזה הבסיסית האחראית על התקדמות המחלה והתפתחותן במחלות כלי דם שונות. הדגימות המוכנות יכולות לשמור על תיוג תאים לאחר ההכנה, המודגם בכתב יד זה עם שימור של תאי אנדותל Cdh5+ tdTomato שכותרתו Cdh5+ . שימור תיוג כזה בדגימות מוכנות ויברטום מאפשר לשמור על המבנה יחד עם תיוג תאים, מה שהופך אותו לכלי אידיאלי לביצוע ניסויים במעקב אחר תאים. לבסוף, הדגימות המוכנות רגישות לחקירה נוספת כגון תמוגת RNA או כתם מערבי המתואר בפרוטוקול זה כדי להמשיך לחקור את הפתופיזיולוגיה הבסיסית ומנגנונים הגורמים להתקדמות המחלה.
למרות היתרונות שלה לטכניקות אחרות, יש מגבלות לרקמה מוכנה PCLS. ביצוע PCLS הופך את הריאה הדינמית לאביזר סטטי, ומספק תמונת מצב בזמן של התאים והמולקולות הקיימים ברקמת הריאה בזמן הביופסיה. אלא אם כן מתקבלות דגימות רבות, זה לא מסביר את ההטרוגניות העצומה הנפוצה במחלות ריאות רבות כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD). רקמות שהוכנו עם PCLS מוגבלות בעיקר למחלות דרכי הנשימה וכלי הדם הקטנים. זאת בשל האתגרים הטכניים עם קצירת רקמות, כמו קנה הנשימה הוא בדרך כלל חרות לאינפלציית ריאות וזיהוי ובידוד סימפונות גדולות הוא מאתגר. מגבלות טכניות אלה הופכות את השימוש ברקמת PCLS לתת-אופטימלי כדי לחקור סימפונות גדולות יותר ואת דרכי הנשימה הניצלות. בדיקות דינמיות מוגבלות גם, מה שהופך אותו לפלטפורמה פחות אידיאלית לחקר מחלת ריאות וברוטרומה הקשורים למכונת הנשמה. לבסוף, היישום של PCLS לתחום הריאות התמקד בעיקר ברקמת ריאה מורינה, ויש צורך בבדיקות ופרוטוקולים נוספים לפני החלת רקמה אנושית בתרחיש רלוונטי מבחינה קלינית.
לסיכום, כתב היד מספק שיטה משלימה לשמירה על התכווצות כלי הדם של רקמת הריאה המורינית PCLS, וכתוצאה מכך תמונות ברזולוציה גבוהה של vasculature ריאתי עד 10 ימים המכיל תאים פלואורסצנטי אנדוגניים ונהלים רבים אחרים.
טבלה 1: מאפיין ושימושים של vasoconstrictors שונים. (*בשימוש במחקר זה) נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לד"ר יואן האו וקייפנג ליו על התמיכה הטכנית שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי NIH 1R01 HL150106-01A1, מלגת פארקר ב פרנסיס, ואת פרס מחקר אלדריגטי האגודה ליתר לחץ דם ריאתי לד"ר Ke יואן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5cc of fractionated heparin in syringe | BD | 100 USP units per mL | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CM | |
| 20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation | Cml Supply | 90120050D | |
| 30cc syringe | BD | 309650 | |
| Anti Anti solution | Gibco | 15240096 | |
| Automated vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | |
| Cell Viability Reagent (alamarBlue) | Thermofisher | DAL1025 | |
| Confocal | Zeiss | 880 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep | Gibco | 10569-010 | |
| Endothelin-1 | Sigma | E7764 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | |
| Mortar and Pestle | Amazon | ||
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermoscientific | 89900 | |
| Surgical suture 6/0 | FST | 18020-60 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermofisher | 15596026 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200 S | |
| Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G | BD | 25-30G |
References
- Sparrow, D., Weiss, S. T.
- Gerckens, M., et al. Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58437 (2019).
- Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).
- Rosales Gerpe, M. C., et al. Use of precision-cut lung slices as an ex vivo tool for evaluating viruses and viral vectors for gene and oncolytic therapy. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 10, 245-256 (2018).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
- Liu, R., et al. Mouse lung slices: An ex vivo model for the evaluation of antiviral and anti-inflammatory agents against influenza viruses. Antiviral Research. 120, 101-111 (2015).
- de Graaf, I. A., et al. Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies. Nature Protocols. 5 (9), 1540-1551 (2010).
- Alsafadi, H. N., et al. Applications and approaches for three-dimensional precision-cut lung slices. Disease modeling and drug discovery. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (6), 681-691 (2020).
- Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
- Springer, J., Fischer, A. Substance P-induced pulmonary vascular remodelling in precision cut lung slices. The European Respiratory Journal. 22 (4), 596-601 (2003).
- Suleiman, S., et al. Argon reduces the pulmonary vascular tone in rats and humans by GABA-receptor activation. Scientific Reports. 9 (1), 1902 (2019).
- Rieg, A. D., et al. Cardiovascular agents affect the tone of pulmonary arteries and veins in precision-cut lung slices. PLoS One. 6 (12), 29698 (2011).
- Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
- Deng, C. Y., et al. Upregulation of 5-hydroxytryptamine receptor signaling in coronary arteries after organ culture. PLoS One. 9 (9), 107128 (2014).
- Sandker, S. C., et al. Adventitial dissection: A simple and effective way to reduce radial artery spasm in coronary bypass surgery. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 17 (5), 784-789 (2013).
- Naik, J. S., et al. Pressure-induced smooth muscle cell depolarization in pulmonary arteries from control and chronically hypoxic rats does not cause myogenic vasoconstriction. Journal of Applied Physiology. 98 (3), Bethesda, Md. 1119-1124 (2005).
- Lopez-Lopez, J. G., et al. Diabetes induces pulmonary artery endothelial dysfunction by NADPH oxidase induction. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (5), 727-732 (2008).
- Gonzalez-Tajuelo, R., et al. Spontaneous pulmonary hypertension associated with systemic sclerosis in P-selectin glycoprotein Ligand 1-deficient mice. Arthritis & Rheumatology. 72 (3), Hoboken, N.J. 477-487 (2020).
- Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
- Nishiyama, S. K., et al. Vascular function and endothelin-1: tipping the balance between vasodilation and vasoconstriction. Journal of Applied Physiology. 122 (2), Bethesda, Md. 354-360 (2017).
- Schneider, M. P., Inscho, E. W., Pollock, D. M. Attenuated vasoconstrictor responses to endothelin in afferent arterioles during a high-salt diet. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 292 (4), 1208-1214 (2007).
- Inscho, E. W., Imig, J. D., Cook, A. K. Afferent and efferent arteriolar vasoconstriction to angiotensin II and norepinephrine involves release of Ca2+ from intracellular stores. Hypertension. 29, Dallas, Tex. 222-227 (1997).
- Vecchione, C., et al. Protection from angiotensin II-mediated vasculotoxic and hypertensive response in mice lacking PI3Kgamma. The Journal of Experimental Medicine. 201 (8), 1217-1228 (2005).
