Method Article

정밀 절단 폐 슬라이스는 전 생체 폐 혈관 구조 및 수축 연구를위한 효율적인 도구로

DOI:

10.3791/62392

⸱

May 24th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Divisions of Pulmonary Medicine, Boston Children's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 제시된 PCLS 뮤린 폐 조직의 혈관 수축을 보존하기 위한 프로토콜이 있으며, 그 결과 수많은 절차에 취약한 최대 10일 동안 보존될 수 있는 폐 혈관 및 기도의 정교한 입체 이미지가 생성된다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

뮤린 폐 조직의 시각화는 기본 기도 및 혈관에 관한 귀중한 구조 및 세포 정보를 제공합니다. 그러나, 진정으로 생리 조건을 나타내는 폐 혈관의 보존은 여전히 도전을 제시한다. 또한, 뮤린 폐의 섬세한 구성은 세포 구성과 아키텍처를 모두 보존하는 고품질 이미지에 대한 샘플을 준비하는 기술적 과제를 초래합니다. 유사하게, 세포 수축성 검사는 체외에서혈관 수축에 반응하는 세포의 잠재력을 연구하기 위하여 수행될 수 있습니다, 그러나 이 소약은 그대로 폐의 복잡한 환경을 재현하지 않습니다. 이러한 기술적 문제와는 달리, 정밀 절단 폐 슬라이스(PCLS) 방법은 지역적 편견 없이 폐 조직을 3차원으로 시각화하고 최대 10일 동안 살아있는 대리 수축 모델로 작용할 수 있는 효율적인 대안으로 적용될 수 있다. PCLS를 사용하여 제조된 조직은 구조와 공간 방향을 보존하여 질병 과정을연구하는 것이 이상적입니다. 유도성 tdTomato 리포터 뮤린 모델에서 수확한 PCLS내 내인성 tdTomato 표지 세포의 위치는 공초점 현미경 검사법에 의해 성공적으로 시각화될 수 있다. 혈관 수축에 노출 된 후, PCLS는 시간 경과 모듈에 의해 포착 될 수있는 혈관 수축과 폐 구조 모두의 보존을 보여줍니다. 서부 블롯 및 RNA 분석과 같은 다른 절차와 함께 PCLS는 다양한 장애의 근간을 겪고 폐 혈관 질환의 병리생리학에 대한 더 나은 이해로 이어지는 신호 캐스케이드의 포괄적 인 이해에 기여할 수 있습니다.

Introduction

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해부학 구조를 희생하지 않고 세포 구성 요소를 보존하는 폐 조직의 준비 및 이미징의 발전은 폐 질환에 대한 상세한 이해를 제공합니다. 생리구조를 유지하면서 단백질, RNA 및 기타 생물학적 화합물을 식별하는 능력은 수많은 폐 질환에서 병리학의 이해를 넓힐 수 있는 세포의 공간 적 배치에 대한 중요한 정보를 제공한다. 이 상세한 심상은 폐 동맥 고혈압과 같은 폐 혈관 질병의 더 나은 이해로 이끌어 낼 수 있습니다, 동물 모형에 적용될 때, 잠재적으로 향상한 치료 전략으로 이끌어 냅니다.

기술의 진보에도 불구하고, 뮤린 폐 조직의 고품질 이미지를 얻는 것은 여전히 도전남아있다. 호흡 주기는 흡입1도중 생성된 음성 내측 압력에 의해 구동됩니다. 전통적으로 생검을 얻고 화상 진찰을 위한 폐 견본을 준비하는 때, 음성 압력 그라데이션은 기도와 혈관의 붕괴의 결과로 손실됩니다, 이는 더 이상 현재 상태에서 자신을 나타내지 않습니다. 현재 상태를 반영하는 사실적인 이미지를 얻으려면 폐기도를 다시 팽창해야 하며, 혈관이 침투하여 동적 폐를 정적 설비로 변경해야 합니다. 이러한 뚜렷한 기술의 적용은 대식세포와 같은 면역 세포를 포함하여 구조적 무결성, 폐 혈관 및 세포 성분을 보존할 수 있게 하여 폐 조직이 가능한 ....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 동물 치료는 보스턴 아동 병원과 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인 프로토콜의 지침에 따라했다. 이 연구에서 사용되는 마우스는 야생 형 C57/B6 마우스와 Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato 교차 마우스입니다.

1. 솔루션 준비

  1. 실험 중에 필요한 인산염 완충액(1x PBS) 및 2% 아가로즈 용액을 미리 준비한다.
    1. 아가로즈 파우더 2g을 100mL의 오토클레이브 워터에 섞습니다. 용액이 명확해질 때까지 전자레인지에서 몇 초 만에 가열합니다.
    2. 사용 전까지 42°C의 수조에 용액을 놓습니다.
      참고: PBS와 2% 아가로즈는 몇 주 동안 실온에서 보관할 수 있습니다.

2. 마우스 폐 추출

  1. 이소플루란 과다 복용에 의해 마우스를 안락사. 낮은 수준에서 티슈 페이퍼에 소량의 이소플루란을 배치하고 건조기의 상부 수준에 마우스를 배치하여 이소플루란 과다 복용을 달성. 마우스는 의식이 없는 때까지 건조기에 남아 있습니다.
  2. 목에 열등한 압력을 가하고 꼬리에 코달을 당겨 마우스의 죽음을 보장합니다. 마우스를 해부 표면에 가져옵니다.
  3. 마우스를 su....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포 또는 조직에 추가될 때, 생존성 시약은 실행 가능한 조직의 감소 환경에 의해 수정되고 분홍색/빨갛게 되어 높은 형광이 됩니다. 0-1일 및 9-10일째부터 감지된 대표적인 색상 변화는 도 3에서입증된다. 언급했듯이, 솔루션은 파란색으로 시작하여 하룻밤 사이에 분홍색으로 변하여 생존가능성을 보여주었습니다. 색상 변경은 일반적으로 1-4 시간 이내에 발생합니다. 그러나 더 긴 시간이 필요할 수 있습니다. 생존가능성을 분석하기 위해, 플레이트 판독기가 진동성 제조 시료의 흡광도와 4% PFA 고정 폐 슬라이스의 흡수성을 결정하는 데 사용되어 대조군역할을 하였다. 시료를 배양한 솔루션은 제조업체의 권고에 따라 562nm 및 630 nm의 흡광도에서 판독되었습니다. 진동체 제조 조직에 대한 562 nm 및 630 nm 파장의 흡광도 및 대조군 조직과 비교하여 도 3에도시된다.

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 원고에서, 혈관 구조를 보존하고 실험적 유연성을 최적화하는 뮤린 폐 조직의 고해상도 이미지를 생성하는 향상된 방법이 설명되고, 특히 PCLS의 적용을 사용하여 혈관의 수축도 보존된 3차원에서 볼 수 있는 폐 조직의 미세 슬라이스를 얻을 수 있다. 이 프로토콜은 생존 가능성 시약을 사용하여 신중하게 준비되고 보존된 슬라이스가 1주일 이상 생존력을 유지할 수 있음을 보여줍니다. 마이크로슬라이스의 보존된 생존능력은 혈관 및 기도 구조물에서 다중 및 장기간 실험이 수행될 수 있게 해주며, 여러 약물의 생체 내 반응을 테스트하고, 기본 분자 메커니즘을 평가하고, 시약을 테스트하는 이상적인 샘플입니다. 이것은 준비된 견본이 생체 내시험 4에앞서 혈관 톤에 잠재적인 치료 효력을 공부하기 위하여 이상적인 플랫폼입니다. 폐기도및 혈관의 보존은 준비된 샘플을 이 문서에 기재된 수축 테스트와 같은 추가 기술로 처리하고 표 1에요약할 수 있게.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자들은 위안하오 박사와 카이펑 리우 박사의 기술 지원에 감사드립니다. 이 작품은 NIH 1R01 HL150106-01A1, 파커 B. 프랜시스 펠로우십, 그리고 폐 고혈압 협회 Aldrighetti 연구 상 박사 케위안에 의해 지원되었다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
주사기 내 분획 헤파린 0.5ccBDmL
1X PBSCorning  21-040-CM
20 1/2 인치 게이지 무딘 끝 바늘 기관 캐뉼레이션Cml 공급90120050D
30cc 주사기BD309650
안티 안티 솔루션Gibco15240096
자동 진동 블레이드 마이크로 톰LeicaVT1200S
세포 생존 시약 (alamarBlue)ThermofisherDAL1025
컨포칼자이스880
둘베코' s Modified Eagle Medium 및 GLutaMAX, 10% FBS, 1% Pen/StrepGibco10569-010
Endothelin-1SigmaE7764
KClSigma7447-40-7
모르타르 및 유봉틀Amazon
RIPA 용해 및 추출 버퍼Thermoscientific89900
외과용 봉합사 6/0FST18020-60
TRIzol 시약Invitrogen, Thermofisher15596026
UltraPure Low Melting Point AgaroseInvitrogen16520050
VibratomeLeica BiosystemsVT1200 S
날개 달린 혈액 채취 세트(나비 바늘) 25-30GBD25-30G
당 100 USP 단위

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sparrow, D., Weiss, S. T. Respiratory physiology. Annual Review of Gerontology & Geriatrics. 6, 197-214 (1986).
  2. Gerckens, M., et al. Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling. Journal of Visualized Experimen....

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