Summary
Presenteras här är ett protokoll för att bevara vaskulär kontraktiliteten av PCLS murine lung vävnad, vilket resulterar i en sofistikerad tredimensionell bild av pulmonell vaskulatur och luftvägarna, som kan bevaras i upp till 10 dagar som är mottagliga för många förfaranden.
Abstract
Visualisering av murine lungvävnad ger värdefull strukturell och cellulär information om underliggande luftvägarna och vaskulatur. Bevarandet av lungkärl som verkligen representerar fysiologiska förhållanden innebär dock fortfarande utmaningar. Dessutom resulterar den känsliga konfigurationen av murin lungor i tekniska utmaningar att förbereda prover för högkvalitativa bilder som bevarar både cellulär sammansättning och arkitektur. På samma sätt kan cellulära kontraktilitetsanalyser utföras för att studera cellernas potential att svara på vasoconstrictors in vitro, men dessa analyser reproducerar inte den komplexa miljön i den intakta lungan. I motsats till dessa tekniska problem kan precisionsskuren lungskiva (PCLS) användas som ett effektivt alternativ för att visualisera lungvävnad i tre dimensioner utan regional partiskhet och fungera som en levande surrogatkontraktilitetsmodell i upp till 10 dagar. Vävnad som framställs med PCLS har bevarat struktur och rumslig orientering, vilket gör det idealiskt att studera sjukdomsprocesser ex vivo. Placeringen av endogena tdTomato-märkta celler i PCLS skördas från en inducible tdTomato reporter murine modell kan framgångsrikt visualiseras av confocal mikroskopi. Efter exponering för vasoconstrictors visar PCLS bevarandet av både fartygets kontraktilitet och lungstruktur, som kan fångas upp av en tidsfördröjningsmodul. I kombination med andra procedurer, såsom western blot och RNA-analys, kan PCLS bidra till den omfattande förståelsen av signalkaskader som ligger till grund för en mängd olika sjukdomar och leda till en bättre förståelse för patofysiologin vid lungvaskulära sjukdomar.
Introduction
Framsteg i beredning och avbildning av lungvävnad som bevarar cellulära komponenter utan att offra anatomisk struktur ger en detaljerad förståelse av lungsjukdomar. Förmågan att identifiera proteiner, RNA och andra biologiska föreningar samtidigt som fysiologisk struktur upprätthålls erbjuder viktig information om cellernas rumsliga arrangemang som kan bredda förståelsen av patofysiologin vid många lungsjukdomar. Dessa detaljerade bilder kan leda till en bättre förståelse av pulmonell vaskulär sjukdomar, såsom pulmonell gatan hypertoni, när tillämpas på djurmodeller, vilket potentiellt leder till förbättrade terapeutiska strategier.
Trots tekniska framsteg är det fortfarande en utmaning att få högkvalitativa bilder av murin lungvävnad. Andningscykeln drivs av ett negativt intratroriskt tryck som genereras vid inandning1. När man traditionellt erhåller tarmbiopsier och förbereder lungprover för avbildning går den negativa tryckgradienten förlorad vilket resulterar i att luftvägarna och vaskulaturen kollapsar, vilket inte längre representerar sig självt i sitt nuvarande tillstånd. För att uppnå realistiska bilder som återspeglar nuvarande förhållanden måste lung luftvägarna återfvämmas och vaskulaturen perfunderas, ändra den dynamiska lungan till en statisk fixtur. Tillämpningen av dessa distinkta tekniker gör det möjligt att bevara strukturell integritet, lungvaskulatur och cellulära komponenter, inklusive immunceller som makrofager, så att lungvävnad kan ses så nära sitt fysiologiska tillstånd som möjligt.
Precisionsskuren lungslicing (PCLS) är ett idealiskt verktyg för att studera anatomin och fysiologin hos lungvaskulatur2. PCLS ger detaljerad avbildning av lungvävnaden i tre dimensioner samtidigt som strukturella och cellulära komponenter bevaras. PCLS har använts i djur- och mänskliga modeller för att möjliggöra levande, högupplösta bilder av cellulära funktioner i tre dimensioner, vilket gör det till ett idealiskt verktyg för att studera potentiella terapeutiska mål, mäta liten luftvägskontraktion och studera patofysiologi av kroniska lungsjukdomar som KOL, ILD och lungcancer3. Med hjälp av liknande tekniker kan exponeringen av PCLS-prover för vasoconstrictors bevara lungstruktur och kärlkontraktilitet, replikera in vitro-förhållanden. Tillsammans med att bevara kontraktilitet kan beredda prover genomgå ytterligare analys som RNA-sekvensering, västerländsk blot och flödescytometri när de bereds korrekt. Slutligen kan reporter färgmärkta celler märkta med tdTomato fluorescence efter lungskörd bevara märkning efter att ha förberett mikroslices, vilket gör den idealisk för cellspårningsstudier. Integrationen av dessa tekniker ger en sofistikerad modell bevara det rumsliga arrangemanget av celler och fartyg contractility som kan leda till en mer detaljerad förståelse av signalering kaskader och potentiella terapeutiska alternativ i pulmonell vaskulatur sjukdom.
I detta manuskript utsätts PCLS murin lungvävnad för vasoconstrictors, vilket visar bevarad strukturell integritet och fartyg kontraktilitet. Studien visar att den vävnad som beretts och hanteras på lämpligt sätt kan förbli livskraftig i 10 dagar. Studien visar också bevarandet av celler med endogen fluorescens (tdTomato), vilket gör det möjligt för prover att ge högupplösta bilder av lungvaskulaturen och arkitekturen. Slutligen har sätt att hantera och förbereda vävnadsskivor för RNA-mätning och western blot för att undersöka underliggande mekanismer beskrivits.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All djurvård var i enlighet med riktlinjerna från Boston Children's Hospital och Institutional Animal Care and Use Committee godkända protokoll. Mössen som används i denna studie är vilda typ C57/B6 möss och Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato korsade möss.
1. Utarbetande av lösningar
- Förbered fosfatbuffertlösning (1x PBS) och 2% agaroslösning som krävs under försöket i förväg.
- Blanda 2 g agarospulver i 100 ml autoklaverat vatten. Värm den i mikrovågsugnen några sekunder i taget tills lösningen är klar.
- Placera lösningen i ett vattenbad vid 42 °C tills den används.
OBS: Både PBS och 2% agaros kan förvaras i rumstemperatur i veckor.
2. Extraktion av muslungan
- Avliva musen genom isofluranöverdos. Uppnå isofluranöverdosering genom att placera en liten mängd isofluran på vävnadspapper i den nedre nivån och placera musen i den övre nivån i en desiccator. Musen förblir i desiccatorn tills den är medvetslös.
- Se till att musen dör genom att applicera understående tryck på nacken och dra caudal på svansen. Ta musen till dissekeringsytan.
- Placera musen i det bakre läget och fäst den på plats tejpa tassar och näsa till bord med tejp.
- Spraya musens ventrala yta med 70% etanol och torka av överskottet av etanol.
- Lyft musens bukhud med tång på urinblåsans plats och skär vid mitten av linjen med kirurgisk sax, rör sig överlägset till livmoderhalsregionen och exponerar luftstrupen.
- Lyft det underliggande fasciala lagret med pincett och skär med kirurgisk sax för att exponera viscerala organ och mediastinal fack, återigen skära sämre än överlägsen.
- Skär bröstbenet vid mittlinjen för att exponera hjärtat och lungan.
- Använd trubbig dissekering, lossa membranet från levern och bukfacket.
- Hitta den sämre vena cava (IVC) under tarmarna och skär IVC.
- Leta reda på höger kammare.
OBS: Den högra ventrikeln kommer att ha ett lättare utseende jämfört med vänster ventrikel och intraventricular septum bör visualiseras, separera höger ventrikel från vänster ventrikel. - Injicera 0,5 ml 1% fraktionerad heparin till höger ventrikel med en 25-30 G fjärilsnål och spola sedan långsamt men stadigt med 10-15 ml 1x PBS (figur 1A).
- Var försiktig så att du inte för in nålen genom hjärtat och injicera heparin i mediastinalhålan.
OBS: Injektionen av 1x PBS gör lungvävnaden vit. Vätskan som extravaserar från bukaortan ska vara klar och färglös och levern kan bli vit i utseende efter framgångsrik rodnad.
- Var försiktig så att du inte för in nålen genom hjärtat och injicera heparin i mediastinalhålan.
- Lokalisera struphuvudet och dissekera den omgivande fascian och vävnaden med trubbiga spets pincett.
- Placera den kirurgiska suturen under luftstrupen och bind löst en kirurgisk knut.
- Placera ett litet hål i luftstrupen som är överlägsen sträng och kanula med 20 G trubbig nål.
- Dra åt suturen runt nålen och luftstrupen med hjälp av en kirurgisk knut.
- Injicera 2,5-4 ml agaros i luftstrupen och övervaka för uppblåsning av lungan.
- Efter agaros ingjuts, häll kallt, kylt 1x PBS över lungan för att stelna agaros.
- Skär luftstrupen överlägsen kirurgisk sutur och dissekera lungan och hjärtat från mediastinum genom att ta bort eventuella vidhäftningar och fascia.
- Efter stelning, placera i 1x DMEM (tillräckligt för att dränka vävnad) i en Petri-maträtt för att hålla på is. Skiva omedelbart en lob med en vibratommaskin (bild 1B).
3. Precisionsskurna lungskivor
- Fäst provet på plattformen med superlim, håll den mediala sidan av provet vänd uppåt.
- Fyll provbehållaren med 1x PBS, så att provet är helt nedsänkt.
- Fyll behållaren som omger provbehållaren med is för att hålla omgivande PBS och provkalla.
- Slå på vibratomen och justera till önskade inställningar nedan.
- Ställ in tjockleken på 300um.
- Ställ in frekvensen på 100 Hz.
- Ställ in amplituden på 0,6 mm.
- Ställ in hastigheten på 5 μm/s.
- Använd en insexnyckel och vrid bladhållaren i säkert läge och öppna käftarna för att sätta in ett blad.
- Dra åt käftarna med en insexnyckel och vrid bladhållaren till lämpligt läge för skivning.
- Placera provet och plattformen på lådan och skjut framför bladet.
- Fyll rutan runt provplattformen med 1x PBS tills provet är nedsänkt.
- För upp vibratombladet till blockets kant och sänk bladet manuellt tills det är jämnt med toppen av provet.
- Bekräfta lämpliga inställningar och kör vibratomen (bild 2).
- När färska skivor skärs, ta bort proverna från PBS och placera dem i en steril Petri-skål med 10 ml 1x DMEM som innehåller 1x antibiotika-antimykotiskt.
- När du är klar drar du tillbaka bladet helt och använd sedan insexnyckeln för att höja bladet till ett säkert läge.
- Förvara proverna i 1x DMEM i en inkubator vid 37 °C med livskraft bevarad i upp till 10 dagar (se genomförbarhetsexperiment nedan).
4. Exempel vasoconstrictor experiment
- Placera en vibratomskiva på en mikroskopbild.
- Innan du placerar den på bilden, använd en rengöringsservett för att bli av med överskottsmediet (PBS).
- Placera provet under faskontrastmikroskopi och använd 10-20x förstoring för att identifiera ett kärl.
- Sätt 500 μL vasoconstrictors, såsom 60 mM KCl eller 1 μM Endothelin-1 för att helt sänka bilden.
- Observera och fånga videon genom att spela in i 30 s-60 s (Video 1).
5. Förbereda vävnaden för RNA eller proteinlys på PCLS
- Innan du börjar experimentet, fyll en liten polystyrenskumlåda med 1 L flytande kväve.
- Placera två små mikrocentrifugerör (1,5 ml) i behållaren med flytande kväve innan du börjar.
OBS: Flytande kväve bör svalna utanför rören, men inte vara inuti. Var noga med att hantera flytande kväve med försiktighet och utsätt inte huden för flytande kväve. Använd tång och handskar för att placera och ta bort rör från lådan. - Lägg 4-5 färska vibratomskivor i en mortelskål.
- Häll 5-10 ml flytande N2 ovanpå skivorna i murbruksskålen.
- Använd snabbt morlet för att mala blixtfrysskivorna till pulver innan flytande kväve avdunstar.
OBS: Vävnaden ska kondenseras till ett fint pulver. Om inte, tillsätt ytterligare flytande kväve tills det uppnås. - Använd en stållaborator (förkuppdelad med flytande kväve), skopa pulvret i de två kylda mikrocentrifugerören.
- Lyse pulvret genom att tillsätta 500 μL RNA-extraktionsreagens för att fortsätta med RNA-isolering eller 500 μL RIPA-buffert (innehåller 1x proteashämmare) för att fortsätta med proteinlys.
- Förvara proverna vid -80 °C tills ytterligare RNA-isolering, BCA-mätning och western blot.
6. Fastställande av lönsamheten
- Efter vibratompreparatet, placera två lungskivor i en 24-väl odlingsplatta med 450 μL DMEM-media och 50 μL reagens för cellviabilitet (se till att vävnaden är helt nedsänkt).
- Placera tillbaka proverna i 5% CO2 vid 37 °C inkubator över natten med minimal exponering för ljus.
- På morgonen observerar du lösningen för färgförändring. Den blå lösningen blir rosa när vävnaden är livskraftig.
7. Bevarande av cellmärkning
- Behandla en transgen Cdh5-CreERT2 korsad med Ai14 tdTomato mus med en IP-injektion av Tamoxifen (2 mg/dag) i totalt 5 dagar (total dos 10 mg Tamoxifen) för att inducera tdTomato etikett Cre positiva celler.
- En vecka efter injektionen, förbered lungorna med ovanstående steg 1 till 3.
- Efter beredning av den precisionsskurna lungskivan placerar du vävnaden på en mikroskopbild och placerar ett täckslip ovanpå vävnaden.
- Använd ett konfokalmikroskop för att detektera tdTomato-färgning (med excitationsvåglängd 555 nm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När det tillsätts till celler eller vävnad modifieras livskraftreagenset genom den reducerande miljön för livskraftig vävnad och blir rosa/röd och blir mycket fluorescerande. De representativa färgförändringar som detekteras från dag 0-1 och dag 9-10 visas i figur 3. Som nämnts började lösningen blått och blev rosa över natten, vilket visade livskraft. Färgförändring sker vanligtvis inom 1-4 h; En längre tid kan dock bli nödvändig. För att analysera livsduglighet användes en plattläsare för att bestämma absorbansen av ett vibratomberedd prov och en 4% PFA fast lungskiva, som fungerar som en kontroll. Lösningar där prover inkuberades lästes vid en absorbans på 562 nm och 630 nm enligt tillverkarens rekommendation. Den dagliga skillnaden mellan absorbans vid 562 nm och 630 nm våglängd för den vibratompreberade vävnaden och jämförelsen med kontrollvävnaden visas i figur 3.
För att påvisa kontraktilitet av vibratom-beredd lungvävnad placerades en ny bit vävnad under det ljusa fältmikroskopet vid 400x och behandlades med KCL eller Endothelian-1 tills vävnaden var nedsänkt. En video tagen över 30-60 s av vävnaden avslöjar förträngning av vaskulaturen (Video 1).
För att påvisa bevarande av cellmärkning 1 vecka efter tamoxifeninjektion observerades de lungskivor som erhållits efter vibratomsektion med ovanstående protokoll under ett konfokalt mikroskop. TdTomato-märkningen i lungskivorna visas i figur 4.
Figur 1: Murine lungvävnadsberedning för vibratomsektionering. (A) Husbilen kanyleras med en 30G fjärilsnål för att underlätta byteslösningar från Heparin till PBS. (B) Hela lungloberna efter agarose inflation Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2:Lungskivor med vibratomsektion. Tjocklek: 300 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Viabilitetsexperiment för PCLS-segment från dag 1 till dag 10. (A) Representativa bilder av reagens färgförändring av PCLS-förberedd vävnad jämfört med 4% PFA-fast vävnad. Färsk PCLS vävnad och 4% fast PFA vävnad placerades i 450 μL vävnadsmediet och 50 μL av livskraft reagens. Lösningsfärg initialt lila, som kan ses på dag 0 och dag 9. Efter inkubation över natten ändrades lösningen som innehåller nyberedd PCLS-vävnader till lila / rosa färg (dag 1 och dag 10) på grund av den reducerande miljön av levande vävnader. (B)Kvantifiering av PCLS-livskraft från dag 1 till dag 10 med förhållandet mellan absorbansen vid 562 nm och 630 nm med en plattläsare. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Demonstration av konserverade tdTomato-positiva celler som märks efter skörd. PCLS-preparatet är från en Cdh5-tdT transgen mus. Skalningslist = 20 μm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: Förträngning av fartyg som använder Endothelin-1 på PCLS. Möss av typen C57/B6 blåses upp med 1,5 ml 1,5 % agaros och delas upp i 130 μm med hjälp av en vibratom. En färsk bit vävnad placerades under det ljusa fältmikroskopet vid 400x och behandlades med KCL eller Endothelian-1. Förstoring: 400x. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta manuskript beskrivs en förbättrad metod för att producera högupplösta bilder av murin lungvävnad som bevarar kärlstrukturen och optimerar experimentell flexibilitet, särskilt med hjälp av PCLS för att erhålla mikroslices av lungvävnad som kan ses i tre dimensioner med bevarad kontraktilitet av vaskulaturen. Med hjälp av reagenset visar protokollet att noggrant förberedda och konserverade skivor kan behålla livskraften i mer än en vecka. Bevarad livskraft hos mikroslices gör det möjligt för flera och långvariga experiment att utföras på vaskulatur och luftvägarna strukturer, vilket gör det till ett idealiskt prov för att testa ex vivo svar av flera läkemedel, utvärdera underliggande molekylära mekanismer och testa reagenser. Detta gör förberedda prover till den perfekta plattformen för att studera potentiella terapeutiska effekter på vaskulär ton före in vivo-studier 4. Bevarandet av lungluften och vaskulaturen gör det möjligt att behandla beredda prover med ytterligare tekniker såsom kontraktilitetstestning som beskrivs i denna artikel och sammanfattas i tabell 1. Detta ger möjlighet att tillhandahålla högupplösta bilder som beskriver det rumsliga arrangemanget av lungvaskulaturen och signalerande kaskader, vilket bidrar till patogenesen vid lung kärlsjukdomar.
Beredningen av vävnadsmikral för experiment är en teknik som använder en vibratom, eller vibrerande blad, för att producera precisionsskurna organotypiska skivor. Detta möjliggör ökad noggrannhet och reproducerbarhet jämfört med traditionella tekniker5. Mikroslices av lungorna som erhålls med PCLS upprätthåller den fysiologiska strukturen hos lungvävnad till en cellulär nivå, vilket gör det till ett användbart verktyg för att studera en mängd olika lung kärlsjukdomar. Tekniken har använts i både djur- och människomodeller för att studera den komplexa lunganatomin och lungpatologin, med särskilt fokus på toxiska exponeringar, infektionssjukdomar och immunologiska studier6,7,8. Beroende på den underliggande patofysiologin kan mikroslices erhållas av de specifika lober av intresse eller en / alla lober för att jämföra sjukdom heterogenitet. För tunna skivor leder till svårigheter att bevara strukturell integritet, medan tjockare skivor kan vara svårare att utföra ytterligare färgning eller djupt i vävnadsavbildning.
Specifikt för kärlsjukdom har PCLS använts för att studera pulmonell arteriell hypertoni (PAH), vilket gör det möjligt för en sofistikerad modell att analysera effekterna av potentiella terapier9,10,11. Bevarandet av vaskulär kontraktilitet i murine lung prover har många terapeutiska och prövningsmässiga fördelar. Genom att införliva en teknik som bevarar både lungvaskulaturens struktur och kontraktilitet kan beredda prover modellera lungkärlssjukdom ex vivo. Detta har tidigare visats av Rieg et al., som med PCLS-prover kunde visa att lungvenerna var känsligare med a1-agonister och b2-agonister, vilket tyder på att användningen av dessa läkemedel i vänster hjärtsvikt kan orsaka ökat lungödem12. Med hjälp av denna modell för att studera effekterna av läkemedel hjälper ex vivo till att identifiera potentiella terapeutiska medel för möjliga kliniska prövningar. I detta manuskript beskriver protokollet metoder för att hantera och lagra vävnaden med livskraft bevarad i 10 dagar, vilket möjliggör övervakning av vävnader efter potentiella ingrepp och erbjuder större experimentell flexibilitet. Tidigare studier har tillämpat liknande metoder för att bevara luftvägarna kontraktilitet i astmamodeller, med IL-13-effekten kvarstår i upp till 15 dagar3. Immunostaining RNA och cytokiner kan leda till en bättre förståelse för den underliggande patogenesen som ansvarar för sjukdomsprogression och utveckling vid olika kärlsjukdomar. De beredda proverna kan behålla cellmärkning efter beredning, vilket framgår av detta manuskript med bevarandet av tdTomato märkta Cdh5 + endotelceller. Bevarandet av sådan märkning i vibratomberedade prover gör att strukturen kan bevaras tillsammans med cellmärkning, vilket gör den till ett idealiskt verktyg för att utföra cellspårningsexperiment. Slutligen är de beredda proverna mottagliga för ytterligare undersökning såsom RNA-lys eller western blot som beskrivs i detta protokoll för att ytterligare studera den underliggande patofysiologin och mekanismer som orsakar sjukdomsprogression.
Trots dess fördelar med andra tekniker finns det begränsningar för PCLS-förberedd vävnad. Att utföra PCLS förvandlar den dynamiska lungan till en statisk fixtur, vilket ger en ögonblicksbild i tid av de celler och molekyler som finns i lungvävnad vid tidpunkten för biopsi. Om inte många prover erhålls, det inte tar hänsyn till den stora heterogenitet som vanligtvis ses i många lungsjukdomar såsom kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL). Vävnader som framställs med PCLS är huvudsakligen begränsade till små luftvägs- och kärlsjukdomar. Detta beror på de tekniska utmaningarna med vävnadsskörd, eftersom luftstrupen vanligtvis är incised för lunginflation och att identifiera och isolera stora bronkier är utmanande. Dessa tekniska begränsningar gör att använda PCLS vävnad suboptimal för att studera större bronkier och de ledande luftvägarna. Dynamisk testning är också begränsad, vilket gör det till en mindre än idealisk plattform för att studera ventilatorassocierad lungsjukdom och barotrauma. Slutligen har tillämpningen av PCLS på området pulmonologi främst fokuserat på murin lungvävnad, och ytterligare testning och protokoll behövs innan de tillämpas på mänsklig vävnad i ett kliniskt relevant scenario.
Sammanfattningsvis ger manuskriptet en kompletterande metod som bevarar den vaskulär kontraktiliteten hos PCLS murin lungvävnad, vilket resulterar i högupplösta bilder av lungvaskulaturen i upp till 10 dagar som innehåller endogena fluorescerande celler och många andra förfaranden.
Tabell 1: Egenskaper och användning av olika vasoconstriker. (*används i denna studie) Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Drs. Yuan Hao och Kaifeng Liu för deras tekniska support. Detta arbete stöddes av en NIH 1R01 HL150106-01A1, Parker B. Francis Fellowship och Pulmonary Hypertension Association Aldrighetti Research Award till Dr. Ke Yuan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5cc of fractionated heparin in syringe | BD | 100 USP units per mL | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CM | |
| 20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation | Cml Supply | 90120050D | |
| 30cc syringe | BD | 309650 | |
| Anti Anti solution | Gibco | 15240096 | |
| Automated vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | |
| Cell Viability Reagent (alamarBlue) | Thermofisher | DAL1025 | |
| Confocal | Zeiss | 880 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep | Gibco | 10569-010 | |
| Endothelin-1 | Sigma | E7764 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | |
| Mortar and Pestle | Amazon | ||
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermoscientific | 89900 | |
| Surgical suture 6/0 | FST | 18020-60 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermofisher | 15596026 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200 S | |
| Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G | BD | 25-30G |
References
- Sparrow, D., Weiss, S. T.
- Gerckens, M., et al. Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58437 (2019).
- Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).
- Rosales Gerpe, M. C., et al. Use of precision-cut lung slices as an ex vivo tool for evaluating viruses and viral vectors for gene and oncolytic therapy. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 10, 245-256 (2018).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
- Liu, R., et al. Mouse lung slices: An ex vivo model for the evaluation of antiviral and anti-inflammatory agents against influenza viruses. Antiviral Research. 120, 101-111 (2015).
- de Graaf, I. A., et al. Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies. Nature Protocols. 5 (9), 1540-1551 (2010).
- Alsafadi, H. N., et al. Applications and approaches for three-dimensional precision-cut lung slices. Disease modeling and drug discovery. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (6), 681-691 (2020).
- Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
- Springer, J., Fischer, A. Substance P-induced pulmonary vascular remodelling in precision cut lung slices. The European Respiratory Journal. 22 (4), 596-601 (2003).
- Suleiman, S., et al. Argon reduces the pulmonary vascular tone in rats and humans by GABA-receptor activation. Scientific Reports. 9 (1), 1902 (2019).
- Rieg, A. D., et al. Cardiovascular agents affect the tone of pulmonary arteries and veins in precision-cut lung slices. PLoS One. 6 (12), 29698 (2011).
- Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
- Deng, C. Y., et al. Upregulation of 5-hydroxytryptamine receptor signaling in coronary arteries after organ culture. PLoS One. 9 (9), 107128 (2014).
- Sandker, S. C., et al. Adventitial dissection: A simple and effective way to reduce radial artery spasm in coronary bypass surgery. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 17 (5), 784-789 (2013).
- Naik, J. S., et al. Pressure-induced smooth muscle cell depolarization in pulmonary arteries from control and chronically hypoxic rats does not cause myogenic vasoconstriction. Journal of Applied Physiology. 98 (3), Bethesda, Md. 1119-1124 (2005).
- Lopez-Lopez, J. G., et al. Diabetes induces pulmonary artery endothelial dysfunction by NADPH oxidase induction. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (5), 727-732 (2008).
- Gonzalez-Tajuelo, R., et al. Spontaneous pulmonary hypertension associated with systemic sclerosis in P-selectin glycoprotein Ligand 1-deficient mice. Arthritis & Rheumatology. 72 (3), Hoboken, N.J. 477-487 (2020).
- Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
- Nishiyama, S. K., et al. Vascular function and endothelin-1: tipping the balance between vasodilation and vasoconstriction. Journal of Applied Physiology. 122 (2), Bethesda, Md. 354-360 (2017).
- Schneider, M. P., Inscho, E. W., Pollock, D. M. Attenuated vasoconstrictor responses to endothelin in afferent arterioles during a high-salt diet. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 292 (4), 1208-1214 (2007).
- Inscho, E. W., Imig, J. D., Cook, A. K. Afferent and efferent arteriolar vasoconstriction to angiotensin II and norepinephrine involves release of Ca2+ from intracellular stores. Hypertension. 29, Dallas, Tex. 222-227 (1997).
- Vecchione, C., et al. Protection from angiotensin II-mediated vasculotoxic and hypertensive response in mice lacking PI3Kgamma. The Journal of Experimental Medicine. 201 (8), 1217-1228 (2005).
