पूर्व वीवो पल्मोनरी वेसल स्ट्रक्चर और कॉन्ट्रैक्टिलिटी स्टडीज के लिए एक कुशल उपकरण के रूप में सटीक कट लंग स्लाइस
Summary
यहां प्रस्तुत पीसीएलएस मुरीन फेफड़ों के ऊतकों की संवहनी संकुचन के संरक्षण के लिए एक प्रोटोकॉल है, जिसके परिणामस्वरूप फेफड़े के संवहनी और वायुमार्ग की एक परिष्कृत त्रि-आयामी छवि होती है, जिसे 10 दिनों तक संरक्षित किया जा सकता है जो कई प्रक्रियाओं के लिए अतिसंवेदनशील है।
Abstract
मुरीन फेफड़ों के ऊतकों का दृश्य अंतर्निहित वायुमार्ग और वाक्यूलेचर के बारे में मूल्यवान संरचनात्मक और सेलुलर जानकारी प्रदान करता है। हालांकि, फेफड़े के जहाजों का संरक्षण जो वास्तव में शारीरिक स्थितियों का प्रतिनिधित्व करता है, अभी भी चुनौतियां प्रस्तुत करता है। इसके अलावा, मुरीन फेफड़ों के नाजुक विन्यास के परिणामस्वरूप तकनीकी चुनौतियां उच्च गुणवत्ता वाली छवियों के लिए नमूने तैयार कर रही हैं जो सेलुलर संरचना और वास्तुकला दोनों को संरक्षित करते हैं। इसी तरह, सेलुलर संकुचन परख को विट्रो मेंवासोकॉन्स्ट्रिकर्स का जवाब देने के लिए कोशिकाओं की क्षमता का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन ये परख बरकरार फेफड़ों के जटिल वातावरण को पुन: पेश नहीं करते हैं। इन तकनीकी मुद्दों के विपरीत, सटीक-कट फेफड़ों का टुकड़ा (पीसीएलएस) विधि क्षेत्रीय पूर्वाग्रह के बिना तीन आयामों में फेफड़ों के ऊतकों की कल्पना करने के लिए एक कुशल विकल्प के रूप में लागू किया जा सकता है और 10 दिनों तक के लिए एक लाइव सरोगेट संकुचन मॉडल के रूप में सेवा करते हैं। पीसीएलएस का उपयोग करके तैयार ऊतकों ने संरचना और स्थानिक अभिविन्यास को संरक्षित किया है, जिससे यह रोग प्रक्रियाओं पूर्व वीवोका अध्ययन करने के लिए आदर्श बन गया है। एक प्रेरक tdTomato रिपोर्टर मुरीन मॉडल से काटा पीसीएलएस में अंतर्जात tdTomato लेबल कोशिकाओं के स्थान को सफलतापूर्वक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना की जा सकती है। वासोकॉन्ट्रिकर्स के संपर्क में आने के बाद, पीसीएलएस पोत संकुचन और फेफड़ों की संरचना दोनों के संरक्षण को दर्शाता है, जिसे समय-चूक मॉड्यूल द्वारा कैप्चर किया जा सकता है। पश्चिमी दाग और आरएनए विश्लेषण जैसी अन्य प्रक्रियाओं के संयोजन में, पीसीएलएस विभिन्न प्रकार के विकारों को रेखांकित करने वाले झरने को संकेत देने की व्यापक समझ में योगदान दे सकता है और फेफड़े के संवहनी रोगों में रोगविज्ञान की बेहतर समझ पैदा कर सकता है।
Introduction
शारीरिक संरचना का त्याग किए बिना सेलुलर घटकों को संरक्षित करने वाले फेफड़ों के ऊतकों की तैयारी और इमेजिंग में प्रगति फेफड़े की बीमारियों की विस्तृत समझ प्रदान करती है। शारीरिक संरचना को बनाए रखते हुए प्रोटीन, आरएनए और अन्य जैविक यौगिकों की पहचान करने की क्षमता कोशिकाओं की स्थानिक व्यवस्था के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करती है जो कई फेफड़े के रोगों में रोगविज्ञान की समझ को व्यापक बना सकती है। इन विस्तृत छवियों को फेफड़े की संवहनी रोगों की बेहतर समझ हो सकती है, जैसे फेफड़े की धमनी उच्च रक्तचाप, जब पशु मॉडल पर लागू होता है, संभावित रूप से बेहतर चिकित्सीय रणनीतियों के लिए अग्रणी होता है।
प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में प्रगति के बावजूद, मुरीन फेफड़ों के ऊतकों की उच्च गुणवत्ता वाली छवियों को प्राप्त करना एक चुनौती बनी हुई है । श्वसन चक्र साँस लेने के दौरान उत्पन्न नकारात्मक इंट्राथोरेसिक दबाव से प्रेरित होता है1. जब परंपरागत रूप से बायोप्सी प्राप्त करने और इमेजिंग के लिए फेफड़ों के नमूने तैयार करने, नकारात्मक दबाव ढाल वायुमार्ग और vasculature, जो अब अपने वर्तमान राज्य में ही प्रतिनिधित्व करता है के पतन में जिसके परिणामस्वरूप खो दिया है । वर्तमान परिस्थितियों को प्रतिबिंबित यथार्थवादी छवियों को प्राप्त करने के लिए, फेफड़े के वायुमार्ग को फिर से फुलाया जाना चाहिए, और वाक्यूलेचर एक स्थिर स्थिरता में गतिशील फेफड़ों को बदल दिया जाना चाहिए। इन विशिष्ट तकनीकों का अनुप्रयोग संरचनात्मक अखंडता, फेफड़े के वास्कुलेचर और सेलुलर घटकों के संरक्षण की अनुमति देता है, जिसमें मैक्रोफेज जैसी प्रतिरक्षा कोशिकाएं शामिल हैं, जिससे फेफड़ों के ऊतकों को यथासंभव अपनी शारीरिक स्थिति के करीब देखा जा सकता है।
सटीक कट फेफड़ों की टुकड़ा करने की क्रिया (पीसीएलएस) पल्मोनरी वैक्यूलेचर2के शरीर रचना विज्ञान और शरीर विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श उपकरण है। पीसीएलएस संरचनात्मक और सेलुलर घटकों को संरक्षित करते हुए तीन आयामों में फेफड़ों के ऊतकों की विस्तृत इमेजिंग प्रदान करता है। पीसीएलएस का उपयोग पशु और मानव मॉडल में तीन आयामों में सेलुलर कार्यों के लाइव, उच्च-संकल्प छवियों के लिए अनुमति देने के लिए किया गया है, जिससे यह संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों का अध्ययन करने, छोटे वायुमार्ग संकुचन को मापने और सीओपीडी, आईएलडी और फेफड़ों के कैंसर जैसे पुराने फेफड़ों के रोगों के रोगविज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श उपकरण बनगयाहै। इसी तरह की तकनीकों का उपयोग करना, वासोकॉन्ट्रिकर्स के लिए पीसीएलएस नमूनों के जोखिम फेफड़ों की संरचना और पोत संकुचन को संरक्षित कर सकते हैं, विट्रो स्थितियों में नकल । संकुचन के संरक्षण के साथ, तैयार नमूने आरएनए अनुक्रमण, पश्चिमी दाग, और प्रवाह साइटोमेट्री जैसे अतिरिक्त विश्लेषण से गुजरना कर सकते हैं जब सही ढंग से तैयार किया जाता है। अंत में, फेफड़ों की फसल के बाद tdTomato फ्लोरेसेंस के साथ चिह्नित रिपोर्टर रंग लेबल कोशिकाओं माइक्रोस्लिक्स तैयार करने के बाद लेबलिंग की रक्षा कर सकते हैं, यह सेल ट्रैकिंग अध्ययन के लिए आदर्श बना रही है । इन तकनीकों का एकीकरण कोशिकाओं और पोत संकुचन की स्थानिक व्यवस्था को संरक्षित करने वाला एक परिष्कृत मॉडल प्रदान करता है जो फेफड़े के वास्कुलेचर रोग में सिग्नलिंग कैस्केड और संभावित चिकित्सीय विकल्पों की अधिक विस्तृत समझ का कारण बन सकता है।
इस पांडुलिपि में, पीसीएलएस मुरीन फेफड़ों के ऊतक वासोकॉन्ट्रिकर्स के संपर्क में हैं, जो संरक्षित संरचनात्मक अखंडता और पोत संकुचन का प्रदर्शन करते हैं। अध्ययन दर्शाता है कि तैयार और उचित रूप से संभाला ऊतक 10 दिनों के लिए व्यवहार्य रह सकते हैं । अध्ययन भी अंतर्जात फ्लोरेसेंस (tdTomato) के साथ कोशिकाओं के संरक्षण को दर्शाता है, नमूनों फेफड़े के वास्कुलेचर और वास्तुकला के उच्च संकल्प छवियों को प्रदान करने के लिए अनुमति देता है । अंत में, अंतर्निहित तंत्र की जांच करने के लिए आरएनए माप और पश्चिमी दाग के लिए ऊतक स्लाइस को संभालने और तैयार करने के तरीके बताए गए हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पांडुलिपि में, संवहनी संरचना को संरक्षित करने और प्रयोगात्मक लचीलेपन को अनुकूलित करने वाले मुरीन फेफड़ों के ऊतकों की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों का उत्पादन करने के लिए एक बढ़ी हुई विधि का वर्णन किया ग?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक डीआरएस युआन हाओ और कैफेंग लियू को उनकी तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहेंगे । इस काम को एक NIH 1R01 HL150106-01A1, पार्कर बी फ्रांसिस फैलोशिप, और पल्मोनरी उच्च रक्तचाप एसोसिएशन Aldrighetti अनुसंधान पुरस्कार डॉ के युआन को समर्थन दिया गया था ।
Materials
| 0.5cc of fractionated heparin in syringe | BD | 100 USP units per mL | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CM | |
| 20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation | Cml Supply | 90120050D | |
| 30cc syringe | BD | 309650 | |
| Anti Anti solution | Gibco | 15240096 | |
| Automated vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | |
| Cell Viability Reagent (alamarBlue) | Thermofisher | DAL1025 | |
| Confocal | Zeiss | 880 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep | Gibco | 10569-010 | |
| Endothelin-1 | Sigma | E7764 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | |
| Mortar and Pestle | Amazon | ||
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermoscientific | 89900 | |
| Surgical suture 6/0 | FST | 18020-60 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermofisher | 15596026 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200 S | |
| Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G | BD | 25-30G |
References
- Sparrow, D., Weiss, S. T. Respiratory physiology. Annual Review of Gerontology & Geriatrics. 6, 197-214 (1986).
- Gerckens, M., et al. Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58437 (2019).
- Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).
- Rosales Gerpe, M. C., et al. Use of precision-cut lung slices as an ex vivo tool for evaluating viruses and viral vectors for gene and oncolytic therapy. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 10, 245-256 (2018).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
- Liu, R., et al. Mouse lung slices: An ex vivo model for the evaluation of antiviral and anti-inflammatory agents against influenza viruses. Antiviral Research. 120, 101-111 (2015).
- de Graaf, I. A., et al. Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies. Nature Protocols. 5 (9), 1540-1551 (2010).
- Alsafadi, H. N., et al. Applications and approaches for three-dimensional precision-cut lung slices. Disease modeling and drug discovery. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (6), 681-691 (2020).
- Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
- Springer, J., Fischer, A. Substance P-induced pulmonary vascular remodelling in precision cut lung slices. The European Respiratory Journal. 22 (4), 596-601 (2003).
- Suleiman, S., et al. Argon reduces the pulmonary vascular tone in rats and humans by GABA-receptor activation. Scientific Reports. 9 (1), 1902 (2019).
- Rieg, A. D., et al. Cardiovascular agents affect the tone of pulmonary arteries and veins in precision-cut lung slices. PLoS One. 6 (12), 29698 (2011).
- Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
- Deng, C. Y., et al. Upregulation of 5-hydroxytryptamine receptor signaling in coronary arteries after organ culture. PLoS One. 9 (9), 107128 (2014).
- Sandker, S. C., et al. Adventitial dissection: A simple and effective way to reduce radial artery spasm in coronary bypass surgery. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 17 (5), 784-789 (2013).
- Naik, J. S., et al. Pressure-induced smooth muscle cell depolarization in pulmonary arteries from control and chronically hypoxic rats does not cause myogenic vasoconstriction. Journal of Applied Physiology. 98 (3), 1119-1124 (2005).
- Lopez-Lopez, J. G., et al. Diabetes induces pulmonary artery endothelial dysfunction by NADPH oxidase induction. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (5), 727-732 (2008).
- Gonzalez-Tajuelo, R., et al. Spontaneous pulmonary hypertension associated with systemic sclerosis in P-selectin glycoprotein Ligand 1-deficient mice. Arthritis & Rheumatology. 72 (3), 477-487 (2020).
- Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
- Nishiyama, S. K., et al. Vascular function and endothelin-1: tipping the balance between vasodilation and vasoconstriction. Journal of Applied Physiology. 122 (2), 354-360 (2017).
- Schneider, M. P., Inscho, E. W., Pollock, D. M. Attenuated vasoconstrictor responses to endothelin in afferent arterioles during a high-salt diet. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 292 (4), 1208-1214 (2007).
- Inscho, E. W., Imig, J. D., Cook, A. K. Afferent and efferent arteriolar vasoconstriction to angiotensin II and norepinephrine involves release of Ca2+ from intracellular stores. Hypertension. 29, 222-227 (1997).
- Vecchione, C., et al. Protection from angiotensin II-mediated vasculotoxic and hypertensive response in mice lacking PI3Kgamma. The Journal of Experimental Medicine. 201 (8), 1217-1228 (2005).
