Präzisionsschnitt-Lungenschnitte als effizientes Werkzeug für Ex-vivo-Studien zur Struktur und Kontraktilität von Lungengefäßen
Summary
Hier wird ein Protokoll zur Erhaltung der vaskulären Kontraktilität von PCLS-murinem Lungengewebe vorgestellt, was zu einem anspruchsvollen dreidimensionalen Bild des Lungengefäßsystems und der Atemwege führt, das bis zu 10 Tage konserviert werden kann und für zahlreiche Verfahren anfällig ist.
Abstract
Die Visualisierung des murinen Lungengewebes liefert wertvolle strukturelle und zelluläre Informationen über die darunter liegenden Atemwege und das Gefäßsystem. Die Erhaltung der Lungengefäße, die wirklich physiologische Bedingungen darstellt, stellt jedoch immer noch Herausforderungen dar. Darüber hinaus führt die empfindliche Konfiguration der murinen Lunge zu technischen Herausforderungen bei der Vorbereitung von Proben für qualitativ hochwertige Bilder, die sowohl die zelluläre Zusammensetzung als auch die Architektur bewahren. In ähnlicher Weise können zelluläre Kontraktilitätsassays durchgeführt werden, um das Potenzial von Zellen zu untersuchen, auf Vasokonstriktoren in vitrozu reagieren, aber diese Assays reproduzieren nicht die komplexe Umgebung der intakten Lunge. Im Gegensatz zu diesen technischen Fragestellungen kann die Precision-Cut Lung Slice (PCLS)-Methode als effiziente Alternative zur dreidimensionalen Visualisierung von Lungengewebe in drei Dimensionen ohne regionale Verzerrung eingesetzt werden und als Live-Surrogat-Kontraktilitätsmodell für bis zu 10 Tage dienen. Gewebe, das mit PCLS hergestellt wurde, hat Struktur und räumliche Orientierung bewahrt, was es ideal macht, um Krankheitsprozesse ex vivo zu untersuchen. Die Position von endogenen tdTomato-markierten Zellen in PCLS, die aus einem induzierbaren tdTomato-Reporter-Murinenmodell gewonnen wurden, kann durch konfokale Mikroskopie erfolgreich visualisiert werden. Nach der Exposition gegenüber Vasokonstriktoren zeigt PCLS die Erhaltung sowohl der Gefäßkontraktilität als auch der Lungenstruktur, die durch ein Zeitraffermodul erfasst werden kann. In Kombination mit den anderen Verfahren, wie der Western-Blot- und RNA-Analyse, kann PCLS zum umfassenden Verständnis von Signalkaskaden beitragen, die einer Vielzahl von Erkrankungen zugrunde liegen und zu einem besseren Verständnis der Pathophysiologie bei pulmonalen Gefäßerkrankungen führen.
Introduction
Fortschritte in der Präparation und Bildgebung von Lungengewebe, das zelluläre Komponenten bewahrt, ohne die anatomische Struktur zu beeinträchtigen, liefern ein detailliertes Verständnis von Lungenerkrankungen. Die Fähigkeit, Proteine, RNA und andere biologische Verbindungen unter Beibehaltung der physiologischen Struktur zu identifizieren, bietet wichtige Informationen über die räumliche Anordnung von Zellen, die das Verständnis der Pathophysiologie bei zahlreichen Lungenerkrankungen erweitern können. Diese detaillierten Bilder können zu einem besseren Verständnis von pulmonalen Gefäßerkrankungen wie der pulmonalen Arterienhypertonie führen, wenn sie auf Tiermodelle angewendet werden, was möglicherweise zu verbesserten therapeutischen Strategien führt.
Trotz technologischer Fortschritte bleibt es eine Herausforderung, qualitativ hochwertige Bilder von murinem Lungengewebe zu erhalten. Der Atemzyklus wird durch einen negativen intrathorakalen Druck angetrieben, der während der Inhalation erzeugt wird1. Bei der traditionellen Gewinnung von Biopsien und der Vorbereitung von Lungenproben für die Bildgebung geht der Unterdruckgradient verloren, was zum Kollaps der Atemwege und des Gefäßsystems führt, das sich nicht mehr in seinem gegenwärtigen Zustand darstellt. Um realistische Bilder zu erhalten, die die aktuellen Bedingungen widerspiegeln, müssen die Lungenatemwege wieder aufgepumpt und das Gefäßsystem perfundiert werden, wodurch die dynamische Lunge in eine statische Vorrichtung umgewandelt wird. Die Anwendung dieser unterschiedlichen Techniken ermöglicht die Erhaltung der strukturellen Integrität, des Lungengefäßsystems und der zellulären Komponenten, einschließlich Immunzellen wie Makrophagen, so dass das Lungengewebe so nah wie möglich an seinem physiologischen Zustand betrachtet werden kann.
Precision Cut Lung Slicing (PCLS) ist ein ideales Werkzeug zur Untersuchung der Anatomie und Physiologie des Lungengefäßsystems2. PCLS ermöglicht eine detaillierte Bildgebung des Lungengewebes in drei Dimensionen unter Beibehaltung struktureller und zellulärer Komponenten. PCLS wurde in Tier- und Humanmodellen verwendet, um hochauflösende Live-Bilder von Zellfunktionen in drei Dimensionen zu ermöglichen, was es zu einem idealen Werkzeug macht, um potenzielle therapeutische Ziele zu untersuchen, kleine Atemwegskontraktionen zu messen und die Pathophysiologie chronischer Lungenerkrankungen wie COPD, ILD und Lungenkrebs zu untersuchen3. Mit ähnlichen Techniken kann die Exposition von PCLS-Proben gegenüber Vasokonstriktoren die Lungenstruktur und die Gefäßkontraktilität erhalten und In-vitro-Bedingungen replizieren. Neben der Erhaltung der Kontraktilität können vorbereitete Proben bei korrekter Vorbereitung zusätzlichen Analysen wie RNA-Sequenzierung, Western Blot und Durchflusszytometrie unterzogen werden. Schließlich können reporterfarben markierte Zellen, die nach der Lungenernte mit tdTomato-Fluoreszenz markiert sind, die Markierung nach der Herstellung von Mikroläusen beibehalten, was sie ideal für Zell-Tracking-Studien macht. Die Integration dieser Techniken liefert ein ausgeklügeltes Modell, das die räumliche Anordnung von Zellen und Gefäßkontraktilität bewahrt und zu einem detaillierteren Verständnis der Signalkaskaden und möglichen therapeutischen Optionen bei pulmonalen Gefäßerkrankungen führen kann.
In diesem Manuskript wird PCLS murines Lungengewebe Vasokonstriktoren ausgesetzt, was eine erhaltene strukturelle Integrität und Gefäßkontraktilität zeigt. Die Studie zeigt, dass das entsprechend zubereitete und behandelte Gewebe 10 Tage lang lebensfähig bleiben kann. Die Studie zeigt auch die Erhaltung von Zellen mit endogener Fluoreszenz (tdTomato), so dass Proben hochauflösende Bilder des Lungengefäßsystems und der Architektur liefern können. Schließlich wurden Möglichkeiten zur Handhabung und Vorbereitung von Gewebeschnitten für die RNA-Messung und Western Blot zur Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Manuskript wird eine verbesserte Methode zur Herstellung hochauflösender Bilder von murinem Lungengewebe beschrieben, die die Gefäßstruktur bewahrt und die experimentelle Flexibilität optimiert, insbesondere unter Verwendung der Anwendung von PCLS, um Mikroläuse aus Lungengewebe zu erhalten, die dreidimensional mit erhaltener Kontraktilität des Gefäßsystems betrachtet werden können. Unter Verwendung des Lebensfähigkeitsreagenzes zeigt das Protokoll, dass sorgfältig vorbereitete und konservierte Schei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Yuan Hao und Dr. Kaifeng Liu für ihre technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch ein NIH 1R01 HL150106-01A1, das Parker B. Francis Fellowship und den Aldrighetti Research Award der Pulmonary Hypertension Association an Dr. Ke Yuan unterstützt.
Materials
| 0.5cc of fractionated heparin in syringe | BD | 100 USP units per mL | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CM | |
| 20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation | Cml Supply | 90120050D | |
| 30cc syringe | BD | 309650 | |
| Anti Anti solution | Gibco | 15240096 | |
| Automated vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | |
| Cell Viability Reagent (alamarBlue) | Thermofisher | DAL1025 | |
| Confocal | Zeiss | 880 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep | Gibco | 10569-010 | |
| Endothelin-1 | Sigma | E7764 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | |
| Mortar and Pestle | Amazon | ||
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermoscientific | 89900 | |
| Surgical suture 6/0 | FST | 18020-60 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermofisher | 15596026 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200 S | |
| Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G | BD | 25-30G |
References
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