Summary
ここに提示されるPCLSマウス肺組織の血管収縮性を維持するためのプロトコルは、多数の手順に影響を受けやすい最大10日間保存することができる肺血管構造および気道の洗練された3次元画像をもたらす。
Abstract
ネズミ肺組織の可視化は、基礎となる気道と脈管構造に関する貴重な構造および細胞情報を提供する。しかし、生理学的状態を真に表す肺血管の保存は依然として課題を提示する。さらに、マウスの肺の繊細な構成は、細胞の組成とアーキテクチャの両方を保持する高品質の画像のサンプルを準備する技術的な課題をもたらす。同様に、細胞収縮アッセイは 、細胞がインビトロで血管収縮剤に応答する可能性を研究するために行うことができるが、これらのアッセイは、無傷の肺の複雑な環境を再現しない。これらの技術的な問題とは対照的に、精密切断肺スライス(PCLS)法は、地域的バイアスなしで3次元で肺組織を可視化し、最大10日間の生きた代理収縮モデルとして機能する効率的な代替手段として適用することができる。PCLSを用いて作製された組織は、構造と空間的指向を保存しており、疾患プロセス ex vivoを研究するのに理想的です。誘導可能なtdTomatoレポーターマウスモデルから採取したPCLS中の内因性tdTomato標識細胞の位置を、共焦点顕微鏡でうまく可視化することができます。血管収縮剤に曝された後、PCLSは、血管収縮性と肺構造の両方の保存を示し、これはタイムラプスモジュールによって捕捉することができる。ウェスタンブロットやRNA解析などの他の手順と組み合わせて、PCLSは、多種多様な障害の根本となるシグナル伝達カスケードの包括的な理解に貢献し、肺血管疾患における病態生理学のより良い理解につながります。
Introduction
解剖学的構造を犠牲にすることなく細胞成分を保存する肺組織の調製およびイメージングの進歩は、肺疾患の詳細な理解を提供する。生理学的構造を維持しながらタンパク質、RNA、およびその他の生物学的化合物を同定する能力は、多数の肺疾患における病態生理学の理解を広げることができる細胞の空間的配置に関する重要な情報を提供する。これらの詳細な画像は、肺動脈高血圧症などの肺血管疾患を動物モデルに適用すると、より良い理解を導き、治療戦略の改善につながる可能性がある。
技術の進歩にもかかわらず、ネズミ肺組織の高品質の画像を得ることが課題です。呼吸周期は、吸入時に発生する負の胸腔内圧によって駆動される1.従来、生検を取得し、イメージング用の肺サンプルを準備すると、負圧勾配が失われ、気道と脈管構造が崩壊し、現在の状態ではもはや現像されません。現在の状態を反映した現実的な画像を実現するには、肺気道を再膨張させ、脈管構造を浸透させ、動的肺を静的な固定具に変える必要があります。これらの異なる技術の適用は、構造的完全性、肺血管系、およびマクロファージなどの免疫細胞を含む細胞成分の保存を可能にし、肺組織を可能な限り生理学的状態に近い状態で見ることができます。
精密切断肺スライス(PCLS)は、肺血管構造2の解剖学と生理学を研究するための理想的なツールです。PCLSは、構造および細胞成分を維持しながら、3次元で肺組織の詳細なイメージングを提供する。PCLSは、動物およびヒトモデルで使用され、細胞機能の生きた高解像度画像を3次元で撮影し、潜在的な治療目標を研究し、小さな気道収縮を測定し、COPD、ILD、肺がんなどの慢性肺疾患の病態生理学を研究するための理想的なツールとなっています3。同様の技術を使用して、PCLSサンプルを血管収縮剤に曝露することで、肺構造と血管収縮を維持し、 体外状態で 複製することができます。収縮性の維持に加えて、調製されたサンプルは、RNAシーケンシング、ウェスタンブロット、フローサイトメトリーなどの追加の分析を正しく調製する場合に行うことができます。最後に、レポーターカラー標識細胞は、肺の収穫後にtdTomato蛍光でマークされ、マイクロスライスを調製した後に標識を保存することができ、細胞追跡研究に最適です。これらの技術の統合は、シグナル伝達カスケードのより詳細な理解と肺血管系疾患における潜在的な治療選択肢につながる細胞および血管収縮の空間的配置を維持する洗練されたモデルを提供する。
本稿では、PCLSマウス肺組織が血管収縮剤に曝され、保存された構造的完全性および血管収縮性を示す。この研究は、適切に調製され、処理された組織が10日間生存可能であり続けることができることを示している。この研究はまた、内因性蛍光(tdTomato)を有する細胞の保存を実証し、サンプルが肺血管構造および建築の高解像度画像を提供することを可能にする。最後に、RNA測定用の組織スライスを処理し、調製する方法と、基礎となるメカニズムを調査するためのウェスタンブロットについて説明した。
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Protocol
すべての動物ケアは、ボストン小児病院と制度動物ケアと使用委員会が承認したプロトコルのガイドラインに従っていました。本研究で使用されたマウスは、野生型C57/B6マウスとCdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato交差マウスである。
1. ソリューションの準備
- 事前に実験中に必要なリン酸緩衝液(1x PBS)および2%アガロース溶液を調製する。
- 100mLのオートクレーブ水に2gのアガロース粉末を混ぜます。溶液が透明になるまで、電子レンジで数秒間加熱します。
- 水浴中に溶液を42°Cで入れ、使用するまで入れます。
注:PBSと2%アガロースの両方を室温で数週間保存することができます。
2. マウス肺の抽出
- イオブルランの過剰摂取によってマウスを安楽死させる。少量のイオブルランを下のレベルのティッシュペーパーに置き、乾燥剤で上のレベルにマウスを置くことによって、イオブルランの過剰摂取を達成する。マウスは無意識になるまでデシケーターに残ります。
- 首に劣った圧力をかけ、尾に尾を引っ張って、マウスの死を確実にします。マウスを解剖面に持って行きます。
- マウスをスピーフィンの位置に置き、テープでテーブルにテーピング足と鼻を所定の位置に固定します。
- 70%エタノールでマウスの腹側表面をスプレーし、余分なエタノールを拭き取ります。
- 膀胱の位置で鉗子でマウスの腹部の皮膚を持ち上げ、外科的はさみで中線で切断し、子宮頸部に優れた移動を行い、気管を露出させる。
- ピンセットで下層のファシアル層を持ち上げ、外科的はさみで切断して内臓や経帯を露出させ、再び優れた部分に劣った切断を行います。
- 心臓と肺を露出させるために正中線で胸骨をカットします。
- 鈍い解剖を使用して、肝臓と腹部のコンパートメントから横隔膜を取り外す。
- 腸の下にある下の静脈(IVC)を見つけ、IVCを切断します。
- 右心室を見つけます。
注:右心室は左心室と比較して明るい外観を持ち、心室中隔は左心室から右心室を分離して視覚化する必要があります。 - 25-30 Gの蝶の針で右心室に1%分画ヘパリンの0.5 mLを注入し、1x PBSの10-15 mLでゆっくりと安定して洗い流す(図1A)。
- 心臓を通して針を挿入し、仲介腔にヘパリンを注入しないように注意してください。
注:1x PBSの注入は肺組織を白くします。腹部大動脈から外れて体液は透明で無色にする必要があり、肝臓は正常にフラッシュした後に外観が白くなることがあります。
- 心臓を通して針を挿入し、仲介腔にヘパリンを注入しないように注意してください。
- 喉頭を見つけ、鈍い先端ピンセットを使用して周囲の筋膜および組織を解剖する。
- 手術用縫合糸を気管の下に置き、外科的結び目をゆるやかに結ぶ。
- 弦よりも優れた気管に小さな穴を開け、20Gの鈍い針でカヌレートします。
- 外科的結び目を使用して針と気管の周りの縫合線を締めます。
- 気管に2.5〜4mLのアガロースを注入し、肺の膨張を監視します。
- アガロースを植えた後、肺の上に冷たい、冷やした1x PBSを注ぎ、アガロースを固める。
- 外科的縫合糸よりも優れた気管を切り、密着性および筋膜を取り除くことによって、肺と心臓を隔てから解剖する。
- 固化後、ペトリ皿に1x DMEM(組織を沈めるのに十分)に入れて氷の上に置きます。ビブラート式機を使って、すぐに1つのローブをスライスします(図1B)。
3. 精密切断肺スライス
- サンプルをスーパーグルーでプラットフォームに取り付け、サンプルの内側側を上に向けておきます。
- サンプル容器に1x PBSを充填し、サンプルが完全に沈み込むよう確認します。
- PBSとサンプルを冷たく保つために氷でサンプル容器を囲む容器を満たします。
- ビブラートをオンにし、以下の設定に合わせて調整します。
- 厚さを 300um に設定します。
- 周波数を100 Hzに設定します。
- 振幅を0.6mmに設定します。
- 速度を5μm/sに設定します。
- アレンレンチを使用して、ブレードホルダーを安全な位置に回し、顎を開いてブレードを挿入します。
- アレンレンチで顎を締め、ブレードホルダーをスライスするための適切な位置に回します。
- サンプルとプラットフォームをボックスの上に置き、ブレードの前にスライドします。
- サンプルが水没するまで、サンプルプラットフォームの周りのボックスに1x PBSを入力します。
- ビブラートメブレードをブロックの端まで持ち上げ、サンプルの上部に収まるまで手動でブレードを下げます。
- 適切な設定を確認し、ビブラートを実行します(図2)。
- 新鮮なスライスをカットすると、PBSからサンプルを取り出し、1x抗生物質抗ミコティックを含む1x DMEMの10 mLで無菌ペトリ皿に入れます。
- 完了したら、ブレードを完全に引っ込め、アレンレンチを使用してブレードを安全な位置に上げます。
- サンプルを37°Cのインキュベーターに1x DMEMで保存し、生存率を最大10日間保存します(下記の実行可能性実験を参照)。
4. 血管収縮試験例
- ビブラートメのスライスを顕微鏡スライドに置きます。
- スライドに置く前に、クリーニングワイプを使用して余分な媒体(PBS)を取り除きます。
- サンプルを位相対比顕微鏡下に置き、10~20倍の倍率で容器を特定します。
- 60 mM KCl や 1 μM の Endothelin-1 などの 500 μL のバソコンストリクターを入れて、スライドを完全に水没させます。
- 30 s-60 s (ビデオ1)の録画でビデオを観察し、キャプチャします。
5. PCLS上でRNAまたはタンパク質のリシスのための組織を準備する
- 実験を開始する前に、液体窒素の1 Lで小さなポリスチレンフォームボックスを充填します。
- 開始する前に、液体窒素で容器に小さなマイクロ遠心チューブ(1.5 mL)を2つ入れます。
注:液体窒素は、チューブの外側に冷却する必要がありますが、内部ではありません。液体窒素は慎重に扱い、皮膚を液体窒素にさらさないようにしてください。鉗子と手袋を使用して、箱からチューブを配置したり取り外したりします。 - モルタルボウルに4-5新鮮なビブラートメスライスを入れます。
- モルタルボウルのスライスの上に5〜10 mLの液体N2を注ぎます。
- 液体窒素が蒸発する前に、フラッシュフリーズスライスを粉末に粉砕するために害虫を素早く使用してください。
メモ:組織は細かい粉末に凝縮する必要があります。ない場合は、達成されるまで、追加の液体窒素を追加します。 - スチール製の実験室用スクーパー(液体窒素でプレチル)を使用して、粉末を2つの冷却されたマイクロ遠心分離チューブにすくいます。
- 500μLのRNA抽出試薬を添加して粉末をライスし、RNA単離または500μLのRIPA緩衝液(1xプロテアーゼ阻害剤を含む)を進め、タンパク質のリシスを進める。
- RNAの分離、BCA測定、ウェスタンブロットまで、サンプルを-80 °Cで保管してください。
6. 生存率の決定
- ビブラートメの調製後、2つの肺スライスを450 μLのDMEM培地と50 μLの細胞生存率試薬を備えた24ウェル培養プレートに入れ(組織が完全に水没していることを確認)
- サンプルを光への暴露を最小限に抑えて、37°Cインキュベーターで一晩5%CO2に戻します。
- 朝、色の変化の解決策を観察します。青い溶液は、組織が生存可能な場合にピンク色に変わります。
7. 細胞標識の保存
- TdTomatoラベルCre陽性細胞を誘導するために、タモキシフェン(2mg/日)のIP注入でAi14 tdTomatoマウスと交差したトランスジェニックCdh5-CreERT2を治療する(総用量10mgタモキシフェン)。
- 注射後1週間、上記のステップ1〜3を用いて肺を準備する。
- 精密切り出された肺スライスを作製した後、組織を顕微鏡スライドに置き、組織の上にカバースリップを置きます。
- 共焦点顕微鏡を使用してtdTomato染色を検出します(励起波長555nmを使用)。
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Representative Results
細胞や組織に添加すると、生存率試薬は、生き生きとしている組織の還元環境によって修飾され、ピンク/赤色に変わり、蛍光性が高くなります。0-1 日と 9-10 日から検出された代表的な色の変化を 図 3に示します。前述のように、溶液は青色で始まり、一晩でピンク色になり、生存率を示しました。色の変化は通常 1 ~ 4 時間以内に発生します。ただし、時間が長くなる場合があります。生存率のアッセイのために、プレートリーダーを使用して、ビブラートメ調製サンプルと4%PFA固定肺スライスの吸光度を決定し、コントロールとして機能した。サンプルをインキュベートしたソリューションは、メーカーの推奨に従って562 nmおよび630 nmの吸光度で読み取られました。ビブラートムで調製した組織の562nmと630nm波長の吸光度と対照組織との比較の間の日次差を 図3に示す。
ビブラートメが調製した肺組織の収縮性を示すために、新鮮な組織を400xで明視野顕微鏡の下に置き、組織が水没するまでKCLまたはEndothelian-1を使用して処理した。組織の30-60 s以上を撮影したビデオは、血管系の収縮を明らかにする (ビデオ1).
タモキシフェン注射後1週間の細胞標識の保存を実証するために、上記のプロトコルを用いてビブラートーム切片後に得られた肺スライスを共焦点顕微鏡下で観察した。肺スライスのtdTomatoラベリングを 図4に示します。
図1:ビブラートメの切片に対するマウス肺組織の調製 (A) RVは、ヘパリンからPBSへの切り替え溶液を容易にするために、30Gバタフライ針でカニューレートされる。(B) アガロースインフレ後の肺葉全体は 、ここをクリックしてこの図の大きなバージョンを表示してください。
図2:ビブラートメ断片を用いた肺切片 厚さ:300 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:1日目から10日目までのPCLSスライスの生存率実験(A)PCLS調製組織の試薬色変化の代表的な画像と4%PFA固定組織。新鮮なPCLS組織および4%固定PFA組織を450μLの組織培地と50μLの生存率試薬に入れた。0 日目と 9 日目に見られるように、最初は紫色のソリューションの色。一晩インキュベートした後、生きた組織の環境が低下するため、作りたてのPCLS組織を含む溶液が紫/ピンク色(1日目と10日目)に変化しました。(B)プレートリーダーによる562 nmおよび630nmの吸光度比による1日目から10日目までのPCLS生存率の定量化。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:収穫後にラベリングした保存されたtdTomato陽性細胞の実演 PCLS製剤は、Cdh5-tdTトランスジェニックマウスからである。スケールバー= 20 μm この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:PCLS上の内分1を使用した血管の収縮。 ワイルドタイプC57/B6マウスは、1.5mLのアガロース1.5%で膨らませ、ビブラートを使用して130μmに分けた。新鮮な組織を400xで明視野顕微鏡の下に置き、KCLまたは内テリアン-1を使用して処理した。倍率:400x. このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本稿では、血管構造を維持し、実験の柔軟性を最適化するマウス肺組織の高解像度画像を生成する強化された方法が記載されており、特にPCLSの適用を用いて、血管系の収縮を3次元で見ることができる肺組織の微小スライスを得る。生存率試薬を使用して、プロトコルは慎重に調製され、保存されたスライスが1週間以上生存率を保持できることを実証する。マイクロスライスの生存率を維持することで、血管構造と気道構造で複数の長期実験を行う可能性があり、複数の薬物の ex vivo 応答をテストし、基礎となる分子メカニズムを評価し、試薬をテストするのに理想的なサンプルとなります。これにより、準備されたサンプルは 、インビボ 試験4の前に血管の緊張に対する潜在的な治療効果を研究するのに理想的なプラットフォームになります。肺気道と脈管構造の保存により、準備されたサンプルを、本項で説明した収縮性検査などの追加技術で処理し、 表1にまとめることができる。これにより、肺血管構造とシグナル伝達カスケードの空間的配置を詳述した高解像度画像を提供する機会が得られ、肺血管疾患の病因に寄与する。
実験のための組織マイクロスライスの調製は、ビブラートメ、または振動ブレードを使用して、精密カットのオルガノティピックスライスを生成する技術です。これは、従来の技術5と比較して精度と再現性を向上させることができます。PCLSで得られた肺のマイクロスライスは、肺組織の生理構造を細胞レベルに維持し、様々な肺血管疾患を研究するのに役立つツールとなっています。この技術は、動物とヒトの両方のモデルで、毒性暴露、感染症、および免疫学的研究6、7、8に特異的に焦点を当てて、複雑な肺解剖学および肺病理を研究するために使用されてきた。基礎となる病態生理学に応じて、マイクロスライスは、対象となる特定のローブまたは1/allローブから得られ、疾患の不均一性を比較することができる。薄すぎるスライスは構造的完全性を維持するのが難しい結果となり、厚いスライスは組織イメージングで追加の染色や深部を行うことがより困難になる可能性があります。
血管疾患に特異的な、PCLSは肺動脈高血圧症(PAH)を研究するために利用され、潜在的な治療法9、10、11の効果を分析する高度なモデルを可能にする。マウス肺サンプルにおける血管収縮の保存は、多くの治療および調査上の利点を有する。肺血管系の構造と収縮性の両方を維持する技術を組み込むことにより、調製されたサンプルは、肺血管疾患ex vivoをモデル化することができる。これは、PCLSサンプルを用いて、肺静脈がa1アゴニストおよびb2-アゴニストとより敏感であることを実証することができたRiegらによって過去に実証されており、左心不全におけるこれらの薬物の使用が肺水腫12の増加を引き起こす可能性があることを示唆している。このモデルを使用して薬物の効果を研究し、ex vivoは可能な臨床試験のための潜在的な治療薬を特定するのに役立ちます。本稿では、このプロトコルは、生存率を有する組織を10日間保存して処理し、保存する方法を記述し、潜在的介入後の組織のモニタリングを可能にし、より大きな実験的柔軟性を提供する。これまでの研究では、喘息モデルの気道収縮性を維持するために同様の方法を適用しており、IL-13効果は最大15日間持続する3.免疫染色RNAおよびサイトカインは、様々な血管疾患における疾患の進行および発症を担う基礎となる病態をよりよく理解する可能性がある。調製されたサンプルは、調製後の細胞標識を保持することができ、この原稿では、Cdh5+内皮細胞とラベル付けされたtdTomatoの保存と共に示した。ビブラートムで調製されたサンプルでこのようなラベリングを保存することで、細胞標識と共に構造を保存することができ、細胞追跡実験を行うのに理想的なツールです。最後に、調製されたサンプルは、疾患進行を引き起こす基礎的な病態生理学およびメカニズムをさらに研究するために、このプロトコルに記載されているRNAライシスまたはウェスタンブロットなどのさらなる調査の影響を受けやすい。
他の技術に対する利点にもかかわらず、PCLSで調製された組織には制限がある。PCLSを行うことは、動的肺を静的な固定具に変え、生検時に肺組織内に存在する細胞および分子の時間のスナップショットを提供する。多数のサンプルが得られない限り、慢性閉塞性肺疾患(COPD)のような多くの肺疾患で一般的に見られる膨大な不均一性を考慮していない。PCLSで調製された組織は、主に小さな気道や血管疾患に限定されています。これは、気管が通常肺膨張のために切開され、大きな気管支を同定して単離することは困難であるため、組織収穫に関する技術的な課題によるものです。これらの技術的な制限は、PCLS組織を使用して、より大きな気管支と伝導気道を研究するのに最適ではない。動的検査も限られており、人工呼吸器関連肺疾患やバロ外傷を研究する理想的なプラットフォームではありません。最後に、肺科学分野へのPCLSの適用は主にマウス肺組織に焦点を当てており、臨床的に関連するシナリオでヒト組織に適用される前にさらなる検査とプロトコルが必要である。
要約すると、原稿はPCLSマウス肺組織の血管収縮性を維持する相補的な方法を提供し、内因性蛍光細胞および他の多数の手順を含む最大10日間の肺血管系の高解像度画像をもたらす。
表1: 様々な血管収縮剤の特徴と用途(*本研究で使用)このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Disclosures
著者らは開示する利益相反はない。
Acknowledgments
著者らは、元ハオ博士と劉英博士の技術支援に感謝したいと考えています。この研究は、NIH 1R01 HL150106-01A1、パーカーB.フランシスフェローシップ、およびケ・ユアン博士に対する肺高血圧協会アルドリゲッティ研究賞によって支えられていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5cc of fractionated heparin in syringe | BD | 100 USP units per mL | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CM | |
| 20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation | Cml Supply | 90120050D | |
| 30cc syringe | BD | 309650 | |
| Anti Anti solution | Gibco | 15240096 | |
| Automated vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | |
| Cell Viability Reagent (alamarBlue) | Thermofisher | DAL1025 | |
| Confocal | Zeiss | 880 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep | Gibco | 10569-010 | |
| Endothelin-1 | Sigma | E7764 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | |
| Mortar and Pestle | Amazon | ||
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermoscientific | 89900 | |
| Surgical suture 6/0 | FST | 18020-60 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermofisher | 15596026 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200 S | |
| Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G | BD | 25-30G |
References
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