Presentert her er en protokoll for å bevare vaskulær kontraktilitet av PCLS murin lungevev, noe som resulterer i et sofistikert tredimensjonalt bilde av lungevaskulaturen og luftveiene, som kan bevares i opptil 10 dager som er utsatt for mange prosedyrer.
Visualiseringen av murin lungevev gir verdifull strukturell og cellulær informasjon om underliggende luftvei og vaskulatur. Bevaring av lungefartøy som virkelig representerer fysiologiske forhold gir imidlertid fortsatt utfordringer. I tillegg resulterer den delikate konfigurasjonen av murin lunger i tekniske utfordringer med å forberede prøver for bilder av høy kvalitet som bevarer både cellulær sammensetning og arkitektur. På samme måte kan cellulære kontraktilitetsanalyser utføres for å studere potensialet til celler for å reagere på vasokonstriktorer in vitro, men disse analysene reproduserer ikke det komplekse miljøet i den intakte lungen. I motsetning til disse tekniske problemene kan den presisjonskuttede lungeskiven (PCLS) brukes som et effektivt alternativ til å visualisere lungevev i tre dimensjoner uten regional skjevhet og tjene som en live surrogatkontraktilitetsmodell i opptil 10 dager. Vev tilberedt ved hjelp av PCLS har bevart struktur og romlig orientering, noe som gjør det ideelt å studere sykdomsprosesser ex vivo. Plasseringen av endogene tdTomato-merkede celler i PCLS høstet fra en induserbar tdTomato reporter murine modell kan vellykket visualiseres ved konfikal mikroskopi. Etter eksponering for vasokonstriktorer demonstrerer PCLS bevaring av både karkontraktilitet og lungestruktur, som kan fanges opp av en tidsforløpmodul. I kombinasjon med de andre prosedyrene, som vestlig blot- og RNA-analyse, kan PCLS bidra til den omfattende forståelsen av signalkaskader som ligger til grunn for et bredt spekter av lidelser og fører til en bedre forståelse av patofysiologien i lungevaskulære sykdommer.
Fremskritt i fremstilling og avbildning av lungevev som bevarer cellulære komponenter uten å ofre anatomisk struktur gir en detaljert forståelse av lungesykdommer. Evnen til å identifisere proteiner, RNA og andre biologiske forbindelser samtidig som man opprettholder fysiologisk struktur, gir viktig informasjon om det romlige arrangementet av celler som kan utvide forståelsen av patofysiologien i mange lungesykdommer. Disse detaljerte bildene kan føre til en bedre forståelse av lungevaskulære sykdommer, som pulmonal arterie hypertensjon, når de brukes på dyremodeller, noe som potensielt fører til forbedrede terapeutiske strategier.
Til tross for fremskritt innen teknologi, er det fortsatt en utfordring å skaffe bilder av murin lungevev av høy kvalitet. Åndedrettssyklusen drives av et negativt intrathoracic trykk generert under innånding1. Når du tradisjonelt skaffer biopsier og forbereder lungeprøver for avbildning, går den negative trykkgradienten tapt, noe som resulterer i sammenbrudd av luftveiene og vaskulaturen, som ikke lenger representerer seg selv i sin nåværende tilstand. For å oppnå realistiske bilder som reflekterer dagens forhold, må lungeveiene fylles opp igjen, og vaskulaturen perfunderes, og endrer den dynamiske lungen til en statisk armatur. Anvendelsen av disse distinkte teknikkene gjør det mulig å bevare strukturell integritet, lungevaskulatur og cellulære komponenter, inkludert immunceller som makrofager, slik at lungevev kan ses så nær sin fysiologiske tilstand som mulig.
Presisjonskuttet lungeslicing (PCLS) er et ideelt verktøy for å studere anatomien og fysiologien til lungevaskulatur2. PCLS gir detaljert bildebehandling av lungevevet i tre dimensjoner samtidig som strukturelle og cellulære komponenter bevares. PCLS har blitt brukt i dyre- og menneskelige modeller for å tillate levende bilder med høy oppløsning av cellulære funksjoner i tre dimensjoner, noe som gjør det til et ideelt verktøy for å studere potensielle terapeutiske mål, måle liten luftveiskontraksjon og studere patofysiologien til kroniske lungesykdommer som KOLS, ILD og lungekreft3. Ved hjelp av lignende teknikker kan eksponeringen av PCLS-prøver til vasokonstriktorer bevare lungestruktur og karkontraktilitet, og gjenskape in vitro-forhold. Sammen med å bevare kontraktilitet, kan forberedte prøver gjennomgå ytterligere analyse som RNA-sekvensering, vestlig blotten og strømningscytometri når de er forberedt riktig. Til slutt kan reporterfargemerkede celler merket med tdTomato-fluorescens etter lungehøst bevare merking etter å ha forberedt mikroslikvier, noe som gjør den ideell for cellesporingsstudier. Integreringen av disse teknikkene gir en sofistikert modell som bevarer det romlige arrangementet av celler og karkontraktilitet som kan føre til en mer detaljert forståelse av signalkaskadene og potensielle terapeutiske alternativer ved lungevaskulatursykdom.
I dette manuskriptet er PCLS murin lungevev utsatt for vasokonstriktorer, som demonstrerer bevart strukturell integritet og karkontraktilitet. Studien viser at vevet som er tilberedt og håndtert på riktig måte, kan forbli levedyktig i 10 dager. Studien viser også bevaring av celler med endogen fluorescens (tdTomato), slik at prøver kan gi høyoppløselige bilder av lungevaskulaturen og arkitekturen. Til slutt er det beskrevet måter å håndtere og klargjøre vevsskiver for RNA-måling og vestlig flekk for å undersøke underliggende mekanismer.
I dette manuskriptet beskrives en forbedret metode for å produsere høyoppløselige bilder av murin lungevev som bevarer den vaskulære strukturen og optimaliserer eksperimentell fleksibilitet, spesielt ved bruk av PCLS for å oppnå mikroslikvier av lungevev som kan ses i tre dimensjoner med bevart kontraktilitet av vaskulaturen. Ved hjelp av levedyktighetsreagensen viser protokollen at nøye forberedte og bevarte skiver kan beholde levedyktigheten i mer enn en uke. Bevart levedyktighet av mikroslikviene gjør det muli…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil takke Dr. Yuan Hao og Kaifeng Liu for deres tekniske støtte. Dette arbeidet ble støttet av en NIH 1R01 HL150106-01A1, Parker B. Francis Fellowship, og Pulmonary Hypertension Association Aldrighetti Research Award til Dr. Ke Yuan.
0.5cc of fractionated heparin in syringe | BD | 100 USP units per mL | |
1X PBS | Corning | 21-040-CM | |
20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation | Cml Supply | 90120050D | |
30cc syringe | BD | 309650 | |
Anti Anti solution | Gibco | 15240096 | |
Automated vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | |
Cell Viability Reagent (alamarBlue) | Thermofisher | DAL1025 | |
Confocal | Zeiss | 880 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep | Gibco | 10569-010 | |
Endothelin-1 | Sigma | E7764 | |
KCl | Sigma | 7447-40-7 | |
Mortar and Pestle | Amazon | ||
RIPA lysis and extraction buffer | Thermoscientific | 89900 | |
Surgical suture 6/0 | FST | 18020-60 | |
TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermofisher | 15596026 | |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
Vibratome | Leica Biosystems | VT1200 S | |
Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G | BD | 25-30G |