Summary
Burada sunulan PCLS murine akciğer dokusunun damar kontrititesini korumak için bir protokoldür, bu da pulmoner vaskülat ve hava yolunun sofistike bir üç boyutlu görüntüsü ile sonuçlanır, bu da çok sayıda prosedüre duyarlı 10 güne kadar korunabilir.
Abstract
Murine akciğer dokusunun görselleştirilmesi, alttaki hava yolu ve vaskülat ile ilgili değerli yapısal ve hücresel bilgiler sağlar. Bununla birlikte, fizyolojik koşulları gerçekten temsil eden pulmoner damarların korunması hala zorluklar ortaya koyuyor. Ek olarak, murine akciğerlerinin hassas konfigürasyonu, hem hücresel kompozisyonu hem de mimariyi koruyan yüksek kaliteli görüntüler için numuneler hazırlamakta teknik zorluklarla sonuçlanır. Benzer şekilde, hücresel kontritite tahlilleri, hücrelerin vazokonstriktörlere in vitroyanıt verme potansiyelini incelemek için yapılabilir, ancak bu tahliller sağlam akciğerin karmaşık ortamını yeniden üretmez. Bu teknik konuların aksine hassas kesimli akciğer dilimi (PCLS) yöntemi, akciğer dokusunu bölgesel önyargı olmadan üç boyutlu olarak görselleştirmek için etkili bir alternatif olarak uygulanabilir ve 10 güne kadar canlı vekil kontritite modeli olarak hizmet vermektedir. PCLS kullanılarak hazırlanan doku, yapıyı ve mekansal yönelimi korumuştur, bu da hastalık süreçlerinin eks vivoincelenmesini ideal hale getirir. Endojen tdTomato etiketli hücrelerin, indüklenebilir bir tdTomato muhabir murine modelinden elde edilen PCLS'deki konumu konfokal mikroskopi ile başarıyla görselleştirilebilir. Vazokonstriktörlere maruz kalındıktan sonra PCLS, hem damar kontrititesinin hem de zaman atlamalı bir modül tarafından yakalanabilen akciğer yapısının korunmasını gösterir. Batı blot ve RNA analizi gibi diğer prosedürlerle birlikte PCLS, çok çeşitli bozuklukların altında yatan ve pulmoner vasküler hastalıklarda patofizyolojinin daha iyi anlaşılmasına yol açan sinyal basamaklarının kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına katkıda bulunabilir.
Introduction
Anatomik yapıdan ödün vermeden hücresel bileşenleri koruyan akciğer dokusunun hazırlanması ve görüntülenmesinde meydana gelen gelişmeler pulmoner hastalıkların ayrıntılı bir şekilde anlaşılmasını sağlar. Fizyolojik yapıyı korurken proteinleri, RNA'yı ve diğer biyolojik bileşikleri tanımlama yeteneği, çok sayıda pulmoner hastalıkta patofizyolojinin anlaşılmasını genişletebilecek hücrelerin mekansal düzeni hakkında hayati bilgiler sunar. Bu ayrıntılı görüntüler, hayvan modellerine uygulandığında pulmoner arter hipertansiyonu gibi pulmoner vasküler hastalıkların daha iyi anlaşılmasına yol açabilir ve potansiyel olarak iyileştirilmiş terapötik stratejilere yol açabilir.
Teknolojideki gelişmelere rağmen, murine akciğer dokusunun yüksek kaliteli görüntülerini elde etmek zor olmaya devam ediyor. Solunum döngüsü, inhalasyon sırasında oluşan negatif intratorasik basınç tarafından tahrik edilir1. Geleneksel olarak biyopsiler elde edilirken ve akciğer örnekleri görüntüleme için hazırlanırken, negatif basınç gradyanı kaybolur ve bu da artık mevcut durumunda kendini temsil eden hava yolu ve vaskülatın çökmesine neden olabilir. Mevcut koşulları yansıtan gerçekçi görüntüler elde etmek için, pulmoner hava yolları yeniden şişirilmeli ve vaskülat perfüzyona maruz kalarak dinamik akciğeri statik bir fikstüre dönüştürmelidir. Bu farklı tekniklerin uygulanması, makrofajlar gibi bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere yapısal bütünlüğün, pulmoner vaskülatın ve hücresel bileşenlerin korunmasına izin vererek akciğer dokusunun fizyolojik durumuna mümkün olduğunca yakın görülmesini sağlar.
Hassas kesim akciğer dilimleme (PCLS), pulmoner vaskülat2anatomisini ve fizyolojisini incelemek için ideal bir araçtır. PCLS, yapısal ve hücresel bileşenleri korurken akciğer dokusunun üç boyutlu olarak ayrıntılı görüntülenmesini sağlar. PCLS, hayvan ve insan modellerinde hücresel fonksiyonların canlı, yüksek çözünürlüklü görüntülerinin üç boyutta kullanılmasına izin vermek için kullanılmıştır, bu da potansiyel terapötik hedefleri incelemek, küçük hava yolu kasılmalarını ölçmek ve KOAH, ILD ve akciğer kanseri gibi kronik akciğer hastalıklarının patofizyolojisini incelemek için ideal biraraçtır 3. Benzer teknikler kullanılarak, PCLS örneklerinin vazokonstriktörlere maruz kalması akciğer yapısını ve damar kontrititesini koruyarak in vitro durumları çoğaltabilir. Sözleşmenin korunmasının yanı sıra, hazırlanan numuneler doğru hazırlandığında RNA dizilimi, Batı lekesi ve akış sitometrisi gibi ek analizlerden geçirilebilir. Son olarak, akciğer hasadından sonra tdTomato floresan ile işaretlenmiş muhabir renk etiketli hücreler, mikroslikler hazırladıktan sonra etiketlemeyi koruyabilir ve bu da hücre izleme çalışmaları için idealdir. Bu tekniklerin entegrasyonu, pulmoner vaskülür hastalığında sinyal basamaklarının ve potansiyel terapötik seçeneklerin daha ayrıntılı anlaşılmasına yol açabilecek hücrelerin mekansal düzenini ve damar kontrtinazlığını koruyan sofistike bir model sağlar.
Bu yazıda PCLS murine akciğer dokusu vasokonstriktörlere maruz kalarak korunmuş yapısal bütünlük ve damar kontrititesini ortaya koymuştur. Çalışma, uygun şekilde hazırlanan ve ele alınabilen dokunun 10 gün boyunca canlı kalabileceğini göstermektedir. Çalışma ayrıca endojen floresan (tdTomato) ile hücrelerin korunmasını göstererek, örneklerin pulmoner vaskülat ve mimarinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini sağlamasına izin vermektedir. Son olarak, doku dilimlerini RNA ölçümü için ve Batı lekesini alttaki mekanizmaları araştırmak için ele almanın ve hazırlamanın yolları açıklanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan bakımı Boston Çocuk Hastanesi'nin yönergelerine uygundu ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi onaylı protokoller. Bu çalışmada kullanılan fareler vahşi tip C57 /B6 fareler ve Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato çapraz farelerdir.
1. Çözümlerin hazırlanması
- Deney sırasında gerekli olan fosfat tampon çözeltisini (1x PBS) ve% 2 agarose çözeltisini önceden hazırlayın.
- 2 g agarose tozunun 100 mL otomatik kapatılmış suya karıştırılması. Çözelti net olana kadar mikrodalga fırında birkaç saniye ısıtın.
- Çözeltiyi kullanıma kadar 42 °C'de bir su banyosuna yerleştirin.
NOT: Hem PBS hem de %2 agarose haftalarca oda sıcaklığında saklanabilir.
2. Fare akciğerinin çıkarılması
- Fareyi aşırı dozda izofluran ile ötenazi. Alt seviyedeki kağıt mendile az miktarda izofluran yerleştirerek ve fareyi bir kurutucuda üst seviyeye yerleştirerek izofluran aşırı doz elde edin. Fare, bilinçsiz olana kadar kurutucuda kalır.
- Boyuna düşük basınç uygulayarak ve kuyruğa kaudal çekerek farenin ölümünü sağlayın. Fareyi diseksiyon yüzeyine getirin.
- Fareyi supine konumuna getirin ve yapışkan bantla masaya bantlama pençeleri ve burun yerine sabitleyin.
- Farenin ventral yüzeyine% 70 etanol püskürtün ve fazla etanolleri silin.
- Farenin karın derisini mesanenin bulunduğu yerde tokmaklarla kaldırın ve orta çizgide cerrahi makasla kesin, servikal bölgeye üstün hareket ederek nefes borusuna maruz kalın.
- Alttaki fasyal tabakayı cımbızla kaldırın ve visseral organları ve mediastinal bölmeyi ortaya çıkarmak için cerrahi makasla kesin, yine üstünden daha düşük bir şekilde kesin.
- Kalbi ve akciğeri açığa çıkarmak için orta çizgideki sternumu kesin.
- Künt diseksiyon kullanarak diyaframı karaciğer ve karın bölmesinden ayırın.
- Bağırsakların altındaki alt vena kavayı (IVC) bulun ve IVC'yi kesin.
- Sağ ventrikülü bulun.
NOT: Sağ ventrikül sol ventriküle göre daha hafif bir görünüme sahip olacak ve sağ ventrikülü sol ventrikülden ayırarak intraventriküler septum görselleştirilmelidir. - 25-30 G kelebek iğnesi ile sağ ventrile 0,5 mL%1 fraksiyone heparin enjekte edin ve ardından 1x PBS'nin 10-15 mL'si ile yavaşça ama istikrarlı bir şekilde yıkayın (Şekil 1A).
- İğneyi kalpten geçirmemek ve kantinanik boşluğa heparin enjekte etmemek için dikkatli olun.
NOT: 1x PBS enjeksiyonu akciğer dokusunu beyaza çevirir. Karın aortundan ekstravaze olan sıvı berrak ve renksiz olmalı ve başarılı kızarma sonrası karaciğer görünüşte beyazlaşabilir.
- İğneyi kalpten geçirmemek ve kantinanik boşluğa heparin enjekte etmemek için dikkatli olun.
- Gırtlak bulun ve künt uç cımbız kullanarak çevredeki fasya ve dokuyu parçalara ayrıştırın.
- Cerrahi dikişi nefes borusunun altına yerleştirin ve gevşek bir şekilde cerrahi bir düğüm bağlayın.
- Nefes borusuna ip ve 20 G künt uçlu iğne ile kanüleden daha üstün küçük bir delik yerleştirin.
- Cerrahi bir düğüm kullanarak iğne ve trakea etrafındaki dikişi sıkın.
- Nefes borusuna 2,5-4 mL agarose enjekte edin ve akciğerin şişirmesini izleyin.
- Agarose aşılandıktan sonra, agarose katılaştırmak için akciğerin üzerine soğuk, soğutulmuş 1x PBS dökün.
- Ameliyat dikişinden daha üstün trakeayı kesin ve herhangi bir yapışıklığı ve fasyayı çıkararak akciğeri ve kalbi mediastinyumdan kesin.
- Katılaşmadan sonra, buzda tutmak için bir Petri kabına 1x DMEM 'e (dokuyu batırmaya yetecek kadar) yerleştirin. Vibratom makinesi kullanarak hemen bir lob dilimleyin(Şekil 1B).
3. Hassas kesilmiş akciğer dilimleri
- Numuneyi platforma süperglue ile takın ve numunenin medial tarafını yukarı bakacak şekilde tutun.
- Numune kabını 1x PBS ile doldurun ve numunenin tamamen suya batırılmasını sağlayın.
- PBS'yi ve numuneyi soğuk tutmak için numune kabını çevreleyen kabı buzla doldurun.
- Vibratomu açın ve aşağıdaki istenen ayarlara ayarlayın.
- Kalınlığı 300um olarak ayarlayın.
- Frekansı 100 Hz olarak ayarlayın.
- Genliği 0,6 mm olarak ayarlayın.
- Hızı 5 μm/s'ye ayarlayın.
- Bir Allen anahtarı kullanarak, bıçak tutucuyu güvenli konuma getirin ve bir bıçak yerleştirmek için çeneleri açın.
- Çeneleri bir Allen anahtarı ile sıkın ve bıçak tutucuyu dilimleme için uygun konuma getirin.
- Örneği ve platformu kutunun üzerine yerleştirin ve bıçağın önüne kaydırın.
- Örnek platformunun etrafındaki kutuyu, numune suya gömülene kadar 1x PBS ile doldurun.
- Vibratom bıçağını bloğun kenarına getirin ve bıçağı numunenin üst kısmına gelene kadar manuel olarak diraye diri diri dürt.
- Uygun ayarları onaylayın ve vibratomu çalıştırın (Şekil 2).
- Taze dilimler kesildikçe, örnekleri PBS'den çıkarın ve 1x antibiyotik-antimycotic içeren 10 mL 1x DMEM ile steril bir Petri kabına yerleştirin.
- İşiniz bittiğinde bıçağı tamamen geri çekin ve ardından bıçağı güvenli bir konuma getirmek için Allen anahtarını kullanın.
- Numuneleri 1x DMEM'de 37 °C'de bir inkübatörde 10 güne kadar korunmuş canlılık ile saklayın (aşağıdaki canlılık deneyine bakın).
4. Örnek vazokonstriktör deneyi
- Mikroskop slaydına vibratom dilimi yerleştirin.
- Slayda yerleştirmeden önce, fazla ortamdan (PBS) kurtulmak için bir temizleme mendili kullanın.
- Numuneyi faz kontrastlı mikroskopinin altına yerleştirin ve bir damarı tanımlamak için 10-20x büyütme kullanın.
- Slaydı tamamen batırmak için 60 mM KCl veya 1 μM Endothelin-1 gibi 500 μL vazokonstriktör koyun.
- 30 s-60 sn(Video 1)için kayıt larak videoyu gözlemleyin ve yakalayın.
5. PCLS'de dokuyu RNA veya protein lizizine hazırlamak
- Deneye başlamadan önce, küçük bir polistiren köpük kutusunu 1 L sıvı azotla doldurun.
- Başlamadan önce sıvı azotlu kabın içine iki küçük mikrosantrifüj tüpü (1,5 mL) yerleştirin.
NOT: Sıvı nitrojen tüplerin dışında soğumalı, ancak içeride olmamalıdır. Sıvı nitrojeni dikkatli bir şekilde işlediğinizden ve cildi sıvı nitrojene maruz bırakmadığınızdan emin olun. Kutudan tüpleri yerleştirmek ve çıkarmak için tokmaklar ve eldivenler kullanın. - Bir harç kabına 4-5 taze vibratom dilimi yerleştirin.
- Harç kabındaki dilimlerin üzerine 5-10 mL sıvı N2 dökün.
- Sıvı azot buharlaşmadan önce flaş dondurma dilimlerini toz haline getirmek için pestle'ı hızla kullanın.
NOT: Doku ince bir toz halinde yoğunlaşmalıdır. Değilse, elde edilene kadar ek sıvı azot ekleyin. - Çelik laboratuvar kepçesi (sıvı nitrojen ile önseçimli) kullanarak, tozu iki soğutulmuş mikrosantrifüj tüpüne kepçeleyin.
- Protein lizizine devam etmek için RNA izolasyonu veya 500 μL RIPA tamponu (1x proteaz inhibitörleri içerir) ile devam etmek için 500 μL RNA ekstraksiyon reaktifi ekleyerek tozu lyse edin.
- Ek RNA yalıtımı, BCA ölçümü ve batı lekesi olana kadar numuneleri -80 °C'de saklayın.
6. Canlılığın belirlenmesi
- Vibratom hazırlığından sonra, iki akciğer dilimini 450 μL DMEM ortamlı ve 50 μL hücre canlılığı reaktifli 24 kuyulu bir kültür plakasına yerleştirin (dokunun tamamen batırıldığından emin olun).
- Numuneleri ışığa minimum maruz kalarak gece boyunca 37 °C inkübatörde %5 CO2'ye geri yerleştirin.
- Sabahları, renk değişimi için çözümü gözlemleyin. Doku uygun olduğunda mavi çözelti pembeye döner.
7. Hücre etiketlemesinin korunması
- TdTomato etiketi Cre pozitif hücrelerini indük etmek için toplam 5 gün boyunca (toplam doz 10 mg Tamoxifen) TAMOXIFEN (2 mg / gün) IP enjeksiyonu ile Ai14 tdTomato faresi ile çapraz transgenik bir Cdh5-CreERT2 tedavi edin.
- Enjeksiyondan bir hafta sonra, yukarıdaki 1 ila 3 adımlarını kullanarak akciğerleri hazırlayın.
- Hassas kesilmiş akciğer diliminin hazırlanmasından sonra, dokuyu bir mikroskop kaydırağı üzerine yerleştirin ve dokunun üzerine bir kapak parçası yerleştirin.
- TdTomato boyamasını tespit etmek için bir konfokal mikroskop kullanın (eksitasyon dalga boyu 555 nm kullanarak).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hücrelere veya dokuya eklendiğinde, canlılık reaktifi, canlı dokunun azaltıcı ortamı tarafından değiştirilir ve pembe / kırmızıya döner ve yüksek floresan haline gelir. 0-1 ve 9-10. günden itibaren tespit edilen temsili renk değişiklikleri Şekil 3'tegösterilmiştir. Belirtildiği gibi, çözüm maviye başladı ve bir gecede pembeye döndü ve canlılık gösterdi. Renk değişimi genellikle 1-4 saat içinde gerçekleşir; ancak, daha uzun bir süre gerekebilir. Canlılığı test etmek için, vibratomla hazırlanmış bir numunenin ve kontrol görevi gören% 4 PFA sabit akciğer diliminin emiciliğini belirlemek için bir plaka okuyucu kullanıldı. Numunelerin kuluçkaya yatırıldığı çözeltiler, üreticinin tavsiyesi üzerine 562 nm ve 630 nm absorbansta okundu. Vibratomla hazırlanan doku için 562 nm ve 630 nm dalga boyundaki absorbans ile kontrol dokusuna kıyasla günlük fark Şekil 3'tegösterilmiştir.
Vibratomla hazırlanan akciğer dokusunun kontrtinaklığını göstermek için, parlak alan mikroskobu altına 400x'te taze bir doku parçası yerleştirildi ve doku suya batırılana kadar KCL veya Endothelian-1 kullanılarak tedavi edildi. Dokunun 30-60 sn üzerinde çekilen bir video, vaskülatın daralmasını ortaya koymaktadır (Video 1).
Tamoksifen enjeksiyonundan 1 hafta sonra hücre etiketlemesinin korunmasını göstermek için yukarıdaki protokol kullanılarak vibratom kesitinden sonra elde edilen akciğer dilimleri konfokal mikroskop altında gözlenmiştir. Akciğer dilimlerindeki tdTomato etiketlemesi Şekil 4'te gösterilmiştir.
Şekil 1: Vibratom kesiti için murine akciğer dokusu hazırlığı. (A) RV, Çözümleri Heparin'den PBS'ye geçişi kolaylaştırmak için 30G kelebek iğnesi ile kanüle edilir. (B) Agarose enflasyonundan sonra tüm akciğer lobları Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Vibratom kesiti kullanan akciğer dilimleri. Kalınlık: 300 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: 1. Günden 10. Güne kadar PCLS dilimleri için canlılık deneyi. (A) PCLS tarafından hazırlanan dokunun reaktif renk değişiminin % 4 PFA-sabit dokuya karşı temsili görüntüleri. Taze PCLS dokusu ve %4 sabit PFA dokusu 450 μL doku ortamına ve 50 μL canlılık reaktifine yerleştirildi. Çözelti rengi başlangıçta mor, Gün 0 ve Gün 9'da görülebileceği gibi. Bir gecede inkübasyon yaptıktan sonra canlı dokuların azalan ortamı nedeniyle taze hazırlanmış PCLS dokularını içeren çözelti mor/pembe renge (1. gün ve 10. gün) dönüştü. (B) PCLS canlılığının 1. günden 10. güne kadar ölçülmesi, emiciliğin plaka okuyucusu ile 562 nm ve 630 nm'deki oranı ile ölçülmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Hasat sonrası etiketlemede korunmuş tdTomato pozitif hücrelerin gösterimi. PCLS hazırlığı Cdh5-tdT transgenik bir faredendir. Ölçek çubuğu = 20 μm Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: PCLS'de Endothelin-1 kullanan damarların daralması. Wildtype C57/B6 fareler% 1.5 agarose 1.5 mL ile şişirilir ve bir vibratom kullanılarak 130 μm'ye bölümlenir. Parlak alan mikroskobu altına 400x'te taze bir doku parçası yerleştirildi ve KCL veya Endotelian-1 kullanılarak tedavi edildi. Büyütme: 400x. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda, özellikle vasküler yapının korunmuş kontrititesi ile üç boyutlu olarak görülebilen akciğer dokusunun mikrosliklerini elde etmek için PCLS uygulaması kullanılarak, vasküler yapıyı koruyan ve deneysel esnekliği optimize eden yüksek çözünürlüklü murine akciğer dokusu görüntüleri üretmek için geliştirilmiş bir yöntem açıklanmıştır. Uygulanabilirlik reaktifini kullanarak, protokol özenle hazırlanmış ve korunmuş dilimlerin bir haftadan fazla yaşayabilirliği koruyabileceğini göstermektedir. Mikrosliklerin korunmuş canlılığı, vaskülat ve hava yolu yapıları üzerinde birden fazla ve uzun süreli deneyler yapılmasına olanak tanıyarak, birden fazla ilacın ex vivo yanıtını test etmek, alttaki moleküler mekanizmaları değerlendirmek ve reaktifleri test etmek için ideal bir örnektir. Bu, hazırlanan örnekleri in vivo denemelerden önce vasküler ton üzerindeki potansiyel terapötik etkileri incelemek için ideal bir platform haline getirir4. Pulmoner hava yolu ve vaskülatın korunması, hazırlanan örneklerin bu makalede açıklanan ve Tablo 1'deözetlenen kontrtinas testi gibi ek tekniklerle tedavi edilmesine izin verir. Bu, pulmoner vaskülatın mekansal düzenini ve sinyal basamaklarını detaylandıran, pulmoner vasküler hastalıkların patogenezine katkıda bulunan yüksek çözünürlüklü görüntüler sağlama fırsatı sağlar.
Doku mikrosliklerinin deney için hazırlanması, hassas kesimli organotipik dilimler üretmek için vibratom veya titreşimli bıçak kullanan bir tekniktir. Bu, geleneksel tekniklere kıyasla daha fazla doğruluk ve tekrarlanabilirlik sağlar5. PCLS ile elde edilen akciğerlerin mikrosisi, akciğer dokusunun fizyolojik yapısını hücresel düzeyde korur ve çeşitli pulmoner vasküler hastalıkları incelemek için yararlı bir araç haline getirir. Teknoloji, karmaşık akciğer anatomisini ve pulmoner patolojiyi incelemek için hem hayvan hem de insan modellerinde, toksik maruziyetlere, bulaşıcı hastalıklara ve immünolojikçalışmalaraözel olarak odaklanarak kullanılmıştır 6,7,8. Alttaki patofizyolojiye bağlı olarak, hastalık heterojenliğini karşılaştırmak için belirli ilgi loblarından veya bir/tüm loblardan mikroslikler elde edilebilir. Çok ince dilimler yapısal bütünlüğü korumakta güçlük çekerken, daha kalın dilimlerin doku görüntülemede ek boyama veya derinlerde yapılması daha zor olabilir.
Vasküler hastalığa özgü PCLS, pulmoner arter hipertansiyonu (PAH) incelemek için kullanılmıştır ve sofistike bir modelin potansiyel tedavilerin etkilerini analiz etmesine izin verir9,10,11. Murine akciğer örneklerinde damar kontrititesinin korunmasının çok sayıda terapötik ve araştırma yararı vardır. Pulmoner vaskülatın hem yapısını hem de kontrtinazlığını koruyan bir teknik ekleyerek, hazırlanan örnekler pulmoner vasküler hastalık ex vivomodelleyebilir. Bu geçmişte Rieg ve arkadaşları tarafından gösterilmiştir. İlaçların etkilerini incelemek için bu modeli kullanan ex vivo, olası klinik çalışmalar için potansiyel terapötik ajanların belirlenmesine yardımcı olur. Bu makalede, protokol, 10 gün boyunca korunmuş canlılık ile dokuyu ele alma ve saklama yöntemlerini açıklar, potansiyel müdahalelerden sonra dokuların izlenmesine izin verir ve daha fazla deneysel esneklik sunar. Önceki çalışmalar astım modellerinde hava yolu kontrtinaklığını korumak için benzer yöntemler uygulamıştır, IL-13 etkisi 15 güne kadar devam etmektedir3. İmmünostaining RNA ve sitokinler, çeşitli vasküler hastalıklarda hastalığın ilerlemesinden ve gelişmesinden sorumlu altta kalan patogenezin daha iyi anlaşılmasına yol açabilir. Hazırlanan örnekler, bu yazıda Cdh5+ endotel hücrelerinin etiketli tdTomato ile korunduğunda gösterilen, hazırlandıktan sonra hücre etiketlemesini koruyabilir. Vibratomla hazırlanan örneklerde bu tür etiketlemelerin korunması, yapının hücre etiketlemesi ile birlikte korunmasını sağlayarak hücre izleme deneyleri yapmak için ideal bir araç haline getirir. Son olarak, hazırlanan örnekler, alttaki patofizyolojiyi ve hastalığın ilerlemesine neden olan mekanizmaları daha fazla incelemek için bu protokolde açıklanan RNA lizisi veya batı lekesi gibi daha fazla araştırmaya duyarlıdır.
Diğer tekniklere sağladığı avantajlara rağmen, PCLS tarafından hazırlanan dokularda sınırlamalar vardır. PCLS yapmak dinamik akciğeri statik bir fikstüre dönüştürür ve biyopsi sırasında akciğer dokusunda bulunan hücrelerin ve moleküllerin zamanında bir anlık görüntü sağlar. Çok sayıda örnek elde edilmediği sürece, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) gibi birçok akciğer hastalığında yaygın olarak görülen geniş heterojenliği hesaba katmaz. PCLS ile hazırlanan dokular esas olarak küçük hava yolu ve damar hastalığı ile sınırlıdır. Bu, doku hasadı ile ilgili teknik zorluklardan kaynaklanmaktadır, çünkü trakea tipik olarak akciğer enflasyonu için kesilir ve büyük bronşların tanımlanması ve izole edilmesi zordur. Bu teknik sınırlamalar, daha büyük bronşları ve iletken hava yollarını incelemek için PCLS dokusunun yetersiz kullanılmasını sağlar. Dinamik test de sınırlıdır, bu da ventilatörle ilişkili akciğer hastalığı ve barotrauma'yı incelemek için ideal bir platformdan daha azdır. Son olarak, PCLS'nin pulmonoloji alanına uygulanması öncelikle murine akciğer dokusuna odaklanmıştır ve klinik olarak ilgili bir senaryoda insan dokusuna uygulanmadan önce daha fazla test ve protokole ihtiyaç vardır.
Özetle, makale PCLS murine akciğer dokusunun damar kontrititesini koruyan tamamlayıcı bir yöntem sağlar ve 10 güne kadar akciğer damarının endojen floresan hücreler ve çok sayıda başka prosedür içeren yüksek çözünürlüklü görüntüleri ile sonuçlanır.
Tablo 1: Çeşitli vazokonstriktörlerin karakteristik ve kullanımları. (*bu çalışmada kullanılır) Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar Teknik destekleri için Dr. Yuan Hao ve Kaifeng Liu'ya teşekkür eder. Bu çalışma NIH 1R01 HL150106-01A1, Parker B. Francis Bursu ve Dr. Ke Yuan'a Pulmoner Hipertansiyon Derneği Aldrighetti Araştırma Ödülü ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5cc of fractionated heparin in syringe | BD | 100 USP units per mL | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CM | |
| 20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation | Cml Supply | 90120050D | |
| 30cc syringe | BD | 309650 | |
| Anti Anti solution | Gibco | 15240096 | |
| Automated vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | |
| Cell Viability Reagent (alamarBlue) | Thermofisher | DAL1025 | |
| Confocal | Zeiss | 880 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep | Gibco | 10569-010 | |
| Endothelin-1 | Sigma | E7764 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | |
| Mortar and Pestle | Amazon | ||
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermoscientific | 89900 | |
| Surgical suture 6/0 | FST | 18020-60 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermofisher | 15596026 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200 S | |
| Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G | BD | 25-30G |
References
- Sparrow, D., Weiss, S. T.
- Gerckens, M., et al. Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58437 (2019).
- Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).
- Rosales Gerpe, M. C., et al. Use of precision-cut lung slices as an ex vivo tool for evaluating viruses and viral vectors for gene and oncolytic therapy. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 10, 245-256 (2018).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
- Liu, R., et al. Mouse lung slices: An ex vivo model for the evaluation of antiviral and anti-inflammatory agents against influenza viruses. Antiviral Research. 120, 101-111 (2015).
- de Graaf, I. A., et al. Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies. Nature Protocols. 5 (9), 1540-1551 (2010).
- Alsafadi, H. N., et al. Applications and approaches for three-dimensional precision-cut lung slices. Disease modeling and drug discovery. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (6), 681-691 (2020).
- Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
- Springer, J., Fischer, A. Substance P-induced pulmonary vascular remodelling in precision cut lung slices. The European Respiratory Journal. 22 (4), 596-601 (2003).
- Suleiman, S., et al. Argon reduces the pulmonary vascular tone in rats and humans by GABA-receptor activation. Scientific Reports. 9 (1), 1902 (2019).
- Rieg, A. D., et al. Cardiovascular agents affect the tone of pulmonary arteries and veins in precision-cut lung slices. PLoS One. 6 (12), 29698 (2011).
- Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
- Deng, C. Y., et al. Upregulation of 5-hydroxytryptamine receptor signaling in coronary arteries after organ culture. PLoS One. 9 (9), 107128 (2014).
- Sandker, S. C., et al. Adventitial dissection: A simple and effective way to reduce radial artery spasm in coronary bypass surgery. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 17 (5), 784-789 (2013).
- Naik, J. S., et al. Pressure-induced smooth muscle cell depolarization in pulmonary arteries from control and chronically hypoxic rats does not cause myogenic vasoconstriction. Journal of Applied Physiology. 98 (3), Bethesda, Md. 1119-1124 (2005).
- Lopez-Lopez, J. G., et al. Diabetes induces pulmonary artery endothelial dysfunction by NADPH oxidase induction. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (5), 727-732 (2008).
- Gonzalez-Tajuelo, R., et al. Spontaneous pulmonary hypertension associated with systemic sclerosis in P-selectin glycoprotein Ligand 1-deficient mice. Arthritis & Rheumatology. 72 (3), Hoboken, N.J. 477-487 (2020).
- Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
- Nishiyama, S. K., et al. Vascular function and endothelin-1: tipping the balance between vasodilation and vasoconstriction. Journal of Applied Physiology. 122 (2), Bethesda, Md. 354-360 (2017).
- Schneider, M. P., Inscho, E. W., Pollock, D. M. Attenuated vasoconstrictor responses to endothelin in afferent arterioles during a high-salt diet. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 292 (4), 1208-1214 (2007).
- Inscho, E. W., Imig, J. D., Cook, A. K. Afferent and efferent arteriolar vasoconstriction to angiotensin II and norepinephrine involves release of Ca2+ from intracellular stores. Hypertension. 29, Dallas, Tex. 222-227 (1997).
- Vecchione, C., et al. Protection from angiotensin II-mediated vasculotoxic and hypertensive response in mice lacking PI3Kgamma. The Journal of Experimental Medicine. 201 (8), 1217-1228 (2005).
