Cortes pulmonares de corte de precisión como herramienta eficiente para estudios ex vivo de estructura de vasos pulmonares y contractilidad
Summary
Aquí se presenta un protocolo para preservar la contractilidad vascular del tejido pulmonar murino PCLS, lo que resulta en una imagen tridimensional sofisticada de la vasculatura pulmonar y las vías respiratorias, que se puede preservar hasta por 10 días que es susceptible a numerosos procedimientos.
Abstract
La visualización del tejido pulmonar murino proporciona información estructural y celular valiosa sobre la vía aérea subyacente y la vasculatura. Sin embargo, la preservación de los vasos pulmonares que realmente representa las condiciones fisiológicas todavía presenta desafíos. Además, la delicada configuración de los pulmones murinos resulta en desafíos técnicos al preparar muestras para imágenes de alta calidad que preservan tanto la composición celular como la arquitectura. Del mismo modo, se pueden realizar ensayos de contractilidad celular para estudiar el potencial de las células para responder a los vasoconstrictores in vitro,pero estos ensayos no reproducen el entorno complejo del pulmón intacto. En contraste con estos problemas técnicos, el método de corte pulmonar cortado con precisión (PCLS) se puede aplicar como una alternativa eficiente para visualizar el tejido pulmonar en tres dimensiones sin sesgo regional y servir como un modelo de contractilidad sustituto vivo durante hasta 10 días. El tejido preparado mediante PCLS ha conservado la estructura y la orientación espacial, por lo que es ideal para estudiar los procesos de la enfermedad ex vivo. La ubicación de las células endógenas tdTomato-labeladas en PCLS cosechadas de un modelo murino inducible tdTomato reporter se puede visualizar con éxito mediante microscopía confocal. Después de la exposición a vasoconstrictores, PCLS demuestra la preservación tanto de la contractilidad de los vasos como de la estructura pulmonar, que puede ser capturada por un módulo de lapso de tiempo. En combinación con los otros procedimientos, como el análisis de western blot y ARN, PCLS puede contribuir a la comprensión integral de las cascadas de señalización que subyacen a una amplia variedad de trastornos y conducir a una mejor comprensión de la fisiopatología en las enfermedades vasculares pulmonares.
Introduction
Los avances en la preparación e imagen del tejido pulmonar que preserva los componentes celulares sin sacrificar la estructura anatómica proporcionan una comprensión detallada de las enfermedades pulmonares. La capacidad de identificar proteínas, ARN y otros compuestos biológicos mientras se mantiene la estructura fisiológica ofrece información vital sobre la disposición espacial de las células que puede ampliar la comprensión de la fisiopatología en numerosas enfermedades pulmonares. Estas imágenes detalladas pueden conducir a una mejor comprensión de las enfermedades vasculares pulmonares, como la hipertensión arterial pulmonar, cuando se aplican a modelos animales, lo que potencialmente conduce a mejores estrategias terapéuticas.
A pesar de los avances en la tecnología, la obtención de imágenes de alta calidad del tejido pulmonar murino sigue siendo un desafío. El ciclo respiratorio es impulsado por una presión intratorácica negativa generada durante la inhalación1. Cuando tradicionalmente se obtienen biopsias y se preparan muestras de pulmón para la obtención de imágenes, el gradiente de presión negativa se pierde, lo que resulta en el colapso de la vía aérea y la vasculatura, que ya no se representa en su estado actual. Para lograr imágenes realistas que reflejen las condiciones actuales, las vías respiratorias pulmonares deben volver a inflarse y la vasculatura perfundirse, cambiando el pulmón dinámico en un accesorio estático. La aplicación de estas técnicas distintas permite la preservación de la integridad estructural, la vasculatura pulmonar y los componentes celulares, incluidas las células inmunes como los macrófagos, lo que permite que el tejido pulmonar se vea lo más cerca posible de su estado fisiológico.
El corte pulmonar de precisión (PCLS) es una herramienta ideal para estudiar la anatomía y fisiología de la vasculatura pulmonar2. PCLS proporciona imágenes detalladas del tejido pulmonar en tres dimensiones al tiempo que preserva los componentes estructurales y celulares. PCLS se ha utilizado en modelos animales y humanos para permitir imágenes vivas y de alta resolución de las funciones celulares en tres dimensiones, lo que lo convierte en una herramienta ideal para estudiar posibles objetivos terapéuticos, medir la contracción de las vías respiratorias pequeñas y estudiar la fisiopatología de enfermedades pulmonares crónicas como la EPOC, la EPI y el cáncer de pulmón3. Utilizando técnicas similares, la exposición de muestras de PCLS a vasoconstrictores puede preservar la estructura pulmonar y la contractilidad de los vasos, replicando las condiciones in vitro. Además de preservar la contractilidad, las muestras preparadas pueden someterse a análisis adicionales, como la secuenciación de ARN, Western blot y citometría de flujo cuando se preparan correctamente. Finalmente, las células marcadas con tdTomato marcadas con fluorescencia de tdTomato después de la cosecha pulmonar pueden preservar el etiquetado después de preparar microslices, lo que lo hace ideal para estudios de seguimiento celular. La integración de estas técnicas proporciona un modelo sofisticado que preserva la disposición espacial de las células y la contractilidad de los vasos que puede conducir a una comprensión más detallada de las cascadas de señalización y las posibles opciones terapéuticas en la enfermedad de la vasculatura pulmonar.
En este manuscrito, el tejido pulmonar murino PCLS se expone a vasoconstrictores, lo que demuestra la integridad estructural preservada y la contractilidad de los vasos. El estudio demuestra que el tejido preparado y manipulado adecuadamente puede permanecer viable durante 10 días. El estudio también demuestra la preservación de células con fluorescencia endógena (tdTomato), lo que permite a las muestras proporcionar imágenes de alta resolución de la vasculatura pulmonar y la arquitectura. Finalmente, se han descrito formas de manejar y preparar rodajas de tejido para la medición de ARN y Western blot para investigar los mecanismos subyacentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este manuscrito se describe un método mejorado para producir imágenes de alta resolución del tejido pulmonar murino que preserva la estructura vascular y optimiza la flexibilidad experimental, utilizando específicamente la aplicación de PCLS para obtener microslices de tejido pulmonar que se pueden ver en tres dimensiones con contractilidad preservada de la vasculatura. Utilizando el reactivo de viabilidad, el protocolo demuestra que las rodajas cuidadosamente preparadas y conservadas pueden conservar la viabilid…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a los doctores Yuan Hao y Kaifeng Liu por su apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por un NIH 1R01 HL150106-01A1, la Beca Parker B. Francis y el Premio de Investigación Aldrighetti de la Asociación de Hipertensión Pulmonar al Dr. Ke Yuan.
Materials
| 0.5cc of fractionated heparin in syringe | BD | 100 USP units per mL | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CM | |
| 20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation | Cml Supply | 90120050D | |
| 30cc syringe | BD | 309650 | |
| Anti Anti solution | Gibco | 15240096 | |
| Automated vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | |
| Cell Viability Reagent (alamarBlue) | Thermofisher | DAL1025 | |
| Confocal | Zeiss | 880 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep | Gibco | 10569-010 | |
| Endothelin-1 | Sigma | E7764 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | |
| Mortar and Pestle | Amazon | ||
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermoscientific | 89900 | |
| Surgical suture 6/0 | FST | 18020-60 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermofisher | 15596026 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200 S | |
| Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G | BD | 25-30G |
References
- Sparrow, D., Weiss, S. T. Respiratory physiology. Annual Review of Gerontology & Geriatrics. 6, 197-214 (1986).
- Gerckens, M., et al. Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58437 (2019).
- Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).
- Rosales Gerpe, M. C., et al. Use of precision-cut lung slices as an ex vivo tool for evaluating viruses and viral vectors for gene and oncolytic therapy. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 10, 245-256 (2018).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
- Liu, R., et al. Mouse lung slices: An ex vivo model for the evaluation of antiviral and anti-inflammatory agents against influenza viruses. Antiviral Research. 120, 101-111 (2015).
- de Graaf, I. A., et al. Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies. Nature Protocols. 5 (9), 1540-1551 (2010).
- Alsafadi, H. N., et al. Applications and approaches for three-dimensional precision-cut lung slices. Disease modeling and drug discovery. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (6), 681-691 (2020).
- Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
- Springer, J., Fischer, A. Substance P-induced pulmonary vascular remodelling in precision cut lung slices. The European Respiratory Journal. 22 (4), 596-601 (2003).
- Suleiman, S., et al. Argon reduces the pulmonary vascular tone in rats and humans by GABA-receptor activation. Scientific Reports. 9 (1), 1902 (2019).
- Rieg, A. D., et al. Cardiovascular agents affect the tone of pulmonary arteries and veins in precision-cut lung slices. PLoS One. 6 (12), 29698 (2011).
- Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
- Deng, C. Y., et al. Upregulation of 5-hydroxytryptamine receptor signaling in coronary arteries after organ culture. PLoS One. 9 (9), 107128 (2014).
- Sandker, S. C., et al. Adventitial dissection: A simple and effective way to reduce radial artery spasm in coronary bypass surgery. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 17 (5), 784-789 (2013).
- Naik, J. S., et al. Pressure-induced smooth muscle cell depolarization in pulmonary arteries from control and chronically hypoxic rats does not cause myogenic vasoconstriction. Journal of Applied Physiology. 98 (3), 1119-1124 (2005).
- Lopez-Lopez, J. G., et al. Diabetes induces pulmonary artery endothelial dysfunction by NADPH oxidase induction. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (5), 727-732 (2008).
- Gonzalez-Tajuelo, R., et al. Spontaneous pulmonary hypertension associated with systemic sclerosis in P-selectin glycoprotein Ligand 1-deficient mice. Arthritis & Rheumatology. 72 (3), 477-487 (2020).
- Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
- Nishiyama, S. K., et al. Vascular function and endothelin-1: tipping the balance between vasodilation and vasoconstriction. Journal of Applied Physiology. 122 (2), 354-360 (2017).
- Schneider, M. P., Inscho, E. W., Pollock, D. M. Attenuated vasoconstrictor responses to endothelin in afferent arterioles during a high-salt diet. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 292 (4), 1208-1214 (2007).
- Inscho, E. W., Imig, J. D., Cook, A. K. Afferent and efferent arteriolar vasoconstriction to angiotensin II and norepinephrine involves release of Ca2+ from intracellular stores. Hypertension. 29, 222-227 (1997).
- Vecchione, C., et al. Protection from angiotensin II-mediated vasculotoxic and hypertensive response in mice lacking PI3Kgamma. The Journal of Experimental Medicine. 201 (8), 1217-1228 (2005).
