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Bioengineering

Fabricación de una tinta de biomaterial de agarosa incrustada en nanocelulosa cristalina para el cultivo de mastocitos derivados de la médula ósea

Published: May 11, 2021 doi: 10.3791/62519
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Nanotechnology Research Center, National Research Council Canada, 2Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Alberta

Summary

Este protocolo destaca un método para evaluar rápidamente la biocompatibilidad de una tinta de biomaterial de hidrogel compuesto de nanocelulosa cristalina (CNC)/agarosa con mastocitos derivados de la médula ósea de ratón en términos de viabilidad celular y expresión fenotípica de los receptores de la superficie celular, Kit (CD117) y receptor IgE de alta afinidad (FcεRI).

Abstract

La bioimpresión tridimensional (3D) utiliza compuestos a base de hidrogel (o tintas de biomateriales) que se depositan en un patrón, formando un sustrato sobre el que se depositan las células. Debido a que muchas tintas de biomateriales pueden ser potencialmente citotóxicas para las células primarias, es necesario determinar la biocompatibilidad de estos compuestos de hidrogel antes de su utilización en costosos procesos de ingeniería de tejidos 3D. Algunos métodos de cultivo 3D, incluida la bioimpresión, requieren que las células se incrusten en una matriz 3D, lo que dificulta la extracción y el análisis de las células en busca de cambios en la viabilidad y la expresión de biomarcadores sin provocar daños mecánicos. Este protocolo describe como prueba de concepto, un método para evaluar la biocompatibilidad de un compuesto de agarosa incrustado de nanocelulosa cristalina (CNC), fabricado en un sistema de cultivo de 24 pocillos, con mastocitos derivados de médula ósea de ratón (BMMC) utilizando ensayos citométricos de flujo para la viabilidad celular y la expresión de biomarcadores.

Después de 18 h de exposición a la matriz CNC/agarosa/D-manitol, la viabilidad de BMMC no se alteró según lo medido por la permeabilidad del yoduro de propidio (PI). Sin embargo, los BMMC cultivados en el sustrato CNC/agarosa/D-manitol parecieron aumentar ligeramente su expresión del receptor IgE de alta afinidad (FcεRI) y el receptor del factor de células madre (Kit; CD117), aunque esto no parece depender de la cantidad de CNC en el compuesto de biotinta. La viabilidad de los BMMC también se evaluó después de una exposición prolongada a andamios de hidrogel que se fabricaron a partir de una tinta de biomaterial comercial compuesta de nanocelulosa fibrilar (FNC) y alginato de sodio utilizando una bioimpresora de extrusión 3D. Durante un período de 6-48 h, los sustratos FNC/alginato no afectaron negativamente a la viabilidad de los BMMCs según lo determinado por la citometría de flujo y los ensayos de microtituladores (XTT y lactato deshidrogenasa). Este protocolo describe un método eficiente para evaluar rápidamente la compatibilidad bioquímica de las tintas de biomateriales candidatas para su utilidad como andamios 3D para la siembra posterior a la impresión con mastocitos.

Introduction

El reciente interés en los sistemas de cultivo 3D y la bioimpresión 3D ha centrado la atención en los hidrogeles y los compuestos de hidrogel. Estos compuestos sirven como biomiméticos viscosos pero porosos y pueden estar compuestos de hasta un 99% de contenido de agua en peso, lo que es comparable a los tejidos biológicos1,2,3. Estas características de los compuestos de hidrogel permiten el crecimiento de las células sin afectar su viabilidad y función. Uno de estos compuestos es la nanocelulosa cristalina (CNC), que se ha utilizado como material de refuerzo en compuestos de hidrogel, andamios celulares en el desarrollo de implantes de biomateriales y en cultivos celulares bidimensionales (2D) y 3D in vitro4,5. En su mayor parte, las matrices compuestas de CNC no son abiertamente citotóxicas para las células epiteliales corneales humanas6, las células epiteliales intestinales7, las células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea humana8 o las células similares a las neuronas9. Sin embargo, la actividad metabólica y la proliferación de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea humana disminuye en correlación con el aumento de la viscosidad de los compuestos de nanocelulosa a base de madera, lo que sugiere que la composición de la matriz debe probarse cuidadosamente por sus efectos nocivos sobre las funciones celulares8.

Del mismo modo, el CNC puede inducir respuestas inflamatorias en macrófagos tras la internalización, lo que podría tener graves consecuencias en los sistemas de cultivo de células inmunes 3D10,11. De hecho, hay muy pocos datos disponibles sobre cómo el CNC puede influir en otras respuestas de las células inmunes, particularmente las respuestas inflamatorias alérgicas que son iniciadas por los mastocitos. Los mastocitos son leucocitos granulados que expresan el receptor IgE de alta afinidad, FceRI, responsable de activar las respuestas inflamatorias a los alérgenos. Su proliferación y diferenciación dependen del factor de células madre (SCF), que se une al receptor de tirosina, Kit. Los mastocitos se derivan de células progenitoras de la médula ósea que entran en la circulación y posteriormente migran periféricamente para dispersarse ubicuamente en todos los tejidos humanos12. Como los mastocitos funcionan en un entorno de tejido 3D, son un candidato ideal para células inmunes para estudiar procesos inmunológicos en modelos de tejidos 3D in vitro. Sin embargo, hasta la fecha, no existe un modelo de tejido 3D in vitro viable que contenga mastocitos.

Debido a la naturaleza altamente sensible de los mastocitos y su propensión a provocar respuestas proinflamatorias a estímulos externos, se requiere una cuidadosa consideración de los constituyentes de la matriz 3D y el método de bioimpresión para introducir mastocitos en el andamio 3D, como se discutió más adelante. Las construcciones de tejidos pueden ser biofabricadas a partir de dos amplias categorías de biomateriales, es decir, biotintas y tintas de biomateriales. La distinción radica en el hecho de que las biotintas son compuestos de hidrogel cargados de células, mientras que las tintas de biomateriales son compuestos de hidrogel que carecen de células, según lo definido por Groll et al.13,14. Por lo tanto, las construcciones 3D impresas con biotintas contienen células preincrustadas dentro de la matriz de hidrogel, mientras que las construcciones 3D impresas con tintas de biomateriales deben sembrarse con células después de la impresión. La biofabricación de andamios de cultivo a partir de biotintas/tintas de biomateriales a base de hidrogel se realiza más comúnmente utilizando bioimpresoras 3D de extrusión, que extruyen la tinta biotinta/biomaterial a través de una boquilla a microescala bajo presión a través de un pistón accionado neumática o mecánicamente14. Las bioimpresoras de extrusión fabrican andamios 3D depositando la biotinta en patrones de sección transversal 2D que se apilan secuencialmente entre sí en un enfoque de "abajo hacia arriba".

Para ser compatible con la bioimpresión por extrusión, la tinta biotinta/biomaterial a base de hidrogel debe poseer propiedades tixotrópicas (adelgazamiento por cizallamiento), por lo que los polímeros de hidrogel constituyentes de la tinta biotinta/biomaterial fluyen como un fluido a través de una boquilla de microcanal cuando se someten a tensión de cizallamiento, pero vuelven a un estado viscoso similar al gel al eliminar la tensión de corte15 . Debido a su alto contenido de agua, los polímeros de biotintas/biomateriales a base de hidrogel deben estar reticulados, ya sea física o covalentemente, para mantener la arquitectura y la integridad estructural de la estructura bioimpresa en 3D. En el caso de las biotintas cargadas de células, las células se someten directamente a tensiones químicas durante el proceso de reticulación. El proceso de extrusión de células encapsuladas dentro de la matriz de hidrogel biotinta también somete a las células a estrés cortante, lo que puede conducir a una viabilidad reducida y / o la muerte celular. Una vez bioimpreso el modelo tisular 3D, es difícil discriminar entre los niveles de citotoxicidad provocados por la propia matriz de hidrogel y los procesos de extrusión y reticulación, respectivamente. Esto es particularmente desafiante en el contexto de andamios 3D donde las células están preincrustadas dentro de la matriz de hidrogel, lo que dificulta la eliminación de las células para análisis posteriores, lo que sería perjudicial para la viabilidad de los mastocitos.

Un enfoque más suave para generar construcciones de tejido 3D que contienen mastocitos implica sembrar las células en andamios 3D de tinta de biomaterial poroso preimpresos a partir de una suspensión de cultivo celular, lo que aprovecha la capacidad innata de los mastocitos para migrar de la circulación a los tejidos periféricos. Los beneficios de este enfoque de siembra celular son dobles: (i) los mastocitos no están sujetos a tensiones químicas y de corte de los procesos de extrusión y reticulación, respectivamente, y (ii) las células se pueden extraer fácilmente del andamio 3D después de la exposición mediante un lavado suave para su análisis sin afectar negativamente su viabilidad. El beneficio adicional de sembrar y analizar la viabilidad celular de los mastocitos en andamios de hidrogel porosos bioimpresos en 3D en comparación con los discos de hidrogel 2D es que los andamios de hidrogel bioimpresos 3D recapitulan las características topográficas a microescala de los tejidos in vivo , que no están presentes en los discos de hidrogel plano 2D a granel. Este enfoque es un enfoque adecuado, rápido y rentable para determinar los efectos citotóxicos potencialmente catastróficos de las matrices de hidrogel de biotinta candidatas en los mastocitos, así como en otras células inmunológicas, antes de la inversión en costosos experimentos de ingeniería de tejidos en 3D.

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Protocol

NOTA: Este protocolo se compone de cinco secciones: (1) aislamiento de la médula ósea de ratón y diferenciación de mastocitos derivados de la médula ósea de ratón (BMMCs), (2) fabricación de sustratos de hidrogel CNC/agarosa/D-manitol en un sistema de 24 pocillos y cultivo de BMMCs en los sustratos, (3) eliminación de BMMCs de los sustratos de hidrogel CNC/agarosa/D-manitol y análisis de viabilidad y expresión de biomarcadores mediante citometría de flujo, (4) Bioimpresión 3D de andamios de hidrogel a partir de una tinta de biomaterial compuesto de nanocelulosa fibrilar (FNC)/alginato de sodio disponible comercialmente, y (5) cultivo de BMMC en andamios de hidrogel de FNC/alginato de sodio y análisis de viabilidad mediante ensayos de citometría de flujo, XTT y microtitulato deshidrogenasa (LDH).

1. Generación de la cultura BMMC

NOTA: Los ratones fueron sacrificados por asfixia con CO2 después de la anestesia con isoflurano. Se aislaron la tibia y el fémur y se extrajo toda la médula ósea. Todos los estudios en animales se realizaron de acuerdo con las Directrices y Políticas del Consejo Canadiense de Cuidado Animal con la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales de Ciencias de la Salud de la Universidad de Alberta.

  1. Preparar el medio de cultivo RPMI-1640 completo añadiendo los suplementos enumerados en la Tabla 1 a las concentraciones finales indicadas. Ajuste el pH del medio a 7.4-7.6 usando NaOH, filtre y esterilice con un filtro de un solo uso en la parte superior de la botella (tamaño de poro de 0.2 μm) y guárdelo a 4 ° C en la oscuridad durante un máximo de 2 meses.
  2. Obtener fémures de ratones de acuerdo con los protocolos y procedimientos del Comité de Cuidado de Animales de la Universidad local.
    NOTA: En este estudio, los fémures se aislaron de ratones C57BL / 6, pero se puede usar cualquier cepa si es relevante para el estudio.
  3. Usando tijeras, retire la piel y el músculo de la articulación de la cadera, y luego tire suavemente del fémur girando ligeramente fuera de la cavidad de la cadera (Figura 1). Tenga cuidado de no romper la cabeza femoral. Corte la tibia lejos del fémur en la fabella medial con tijeras. Retire la pata cortando justo por encima del calcáneo y deseche.
  4. Con un bisturí, elimine la piel y el cartílago de las piezas de fémur y tibia. Usando tijeras, haga un corte limpio en cada extremo del fémur y la tibia, exponiendo la médula ósea roja en su interior. Si es necesario, retire el peroné en este punto, pero tenga en cuenta que puede ayudar en la manipulación de la tibia durante el enrojecimiento de la médula ósea.
  5. Prepare una aguja de 26 G con una jeringa luer-lock de 5 ml y llénela con aproximadamente 5 ml de medios completos preparados como se describió anteriormente.
    NOTA: En este punto, el RPMI incompleto sin los aditivos también se puede utilizar para ahorrar en reactivos.
  6. Sosteniendo el fémur o la tibia con fórceps, inserte la aguja en un extremo del hueso y presione suavemente la jeringa. Sostenga el hueso sobre un tubo cónico estéril de 50 ml e inyecte suavemente aproximadamente 5 ml de medio en el hueso, aplicando algo de presión. Observe pedazos de médula ósea caerse por el otro extremo del hueso como delgadas cintas rojas y en el tubo cónico.
  7. Gire hacia abajo los aspirados y vuelva a suspenderlos en medio completo, o transfiéralos directamente a un matraz de cultivo de tejido estéril T175 cm2 que contenga 50 ml de medio RPMI-1640 completo. Mantener los aspirados en medio RPMI-1640 completo con interleucina (IL)-3 recombinante de ratón de 30 ng/mL.
  8. Después de 1 día, observe los cultivos bajo un microscopio de luz. El cultivo estará compuesto por una población heterogénea de células de diferentes formas y tamaños e incluso piezas más grandes de médula ósea. Alimente cultivos celulares agregando 15 ml de medio fresco cada 3-5 días utilizando el medio RPMI-1640 completo como se describió anteriormente, y asegúrese de que la densidad celular nunca exceda de 1 × 106 células / ml. Una vez por semana, gire las células a 200 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente, vuelva a suspender en un medio RPMI-1640 completo fresco y divida 1:4 en 50 ml de medio en matraces T175 frescos.
  9. Después de 4 semanas, determinar la pureza celular midiendo la expresión superficial de los receptores CD117 (Kit) y FceRI mediante citometría de flujo como se describe a continuación (sección 3.2).
    NOTA: Después de 4 semanas, el 99% de las células deben ser doblemente positivas para CD117 (Kit) y FcεRI.
  10. A las 4 semanas en adelante, mantenga los MMMC con 20 ng/mL de IL-3 en medio RPMI-1640 completo. Aproximadamente a las 6 semanas, las células dejarán de dividirse y ya no requerirán división. Alimente los cultivos cada 3-5 días, peletice las células por centrifugación una vez por semana y vuelva a sumerivir en un medio RPMI-1640 completo fresco.

2. Fabricación de los sustratos de hidrogel CNC/agarosa/D-manitol y cultivo BMMC

  1. En una botella de vidrio, agregue 0,2 g de polvo de agarosa a solución salina tamponada con fosfato (PBS) (2% p/v) a un volumen final de 10 ml, y hierva durante 1 min a 100 °C para disolverse.
  2. Disolver 2,5 g de polvo CNC en PBS a un volumen final de 10 ml para preparar una mezcla al 25% p/v.
  3. Disolver 2 g de polvo CNC en PBS a un volumen final de 10 ml para preparar una mezcla de 20% p/v, y diluir en serie la mezcla de 20% p/v para preparar mezclas CNC de 10, 5 y 2% p/v.
  4. Calentar las mezclas CNC de 25, 20, 10, 5 y 2% p/v a 37 °C durante 10 min (Figura 2A).
  5. Añadir 0,46 g de D-manitol a la solución de agarosa caliente (4,6% p/v) y disolver.
  6. Mezcle las mezclas CNC-PBS precalentadas de 25, 20, 10, 5 y 2% p/v con la solución caliente de agarosa/D-manitol en tubos cónicos separados en una proporción de 1:1 para producir concentraciones finales de CNC de 12.5, 10, 5, 2.5 y 1% p/v en las mezclas de hidrogel.
  7. Trabajando rápidamente, agregue 500 μL/pozo de las soluciones anteriores preparadas en el paso 2.6 en cuadruplicado a una placa de cultivo de 24 pocillos, y deje reposar durante 30 min a temperatura ambiente para facilitar la polimerización (Figura 2B).
  8. Coloque cuidadosamente 1000 μL de la suspensión BMMC a una densidad de 1.1 × 106 celdas / ml sobre los sustratos de hidrogel con un micropipettor, y evite tocar el gel con la punta de la pipeta, ya que esto dañará la superficie del gel y generará partículas.
  9. Incubar los BMMCs sobre los sustratos de hidrogel en una incubadora estéril (5% co2, atmósfera humidificada) a 37 °C durante 18 h.

3. Análisis citométricos de flujo

  1. Análisis citométrico de flujo de la viabilidad de BMMC mediante exclusión de PI
    1. Retire cuidadosamente el medio de cultivo que contiene BMMC de la parte superior del CNC / agarosa / D-manitol, evitando el gel, y transfiera las células a un tubo de microfuge de 1.5 ml.
    2. Lavar los BMMC dos veces con PBS (pH 7.4) que contenga 0.5% p/v de albúmina sérica bovina a 300 × g durante 5 min a temperatura ambiente, y resuspend en 180 μL de PBS-0.5% p/v BSA a una densidad final de 1.5 × 106 células/mL. Transfiera las células a una placa de fondo redondo de 96 pozos.
      NOTA: Esterilice con filtro todas las soluciones de PBS-0.5% p/v BSA dos veces usando un filtro de jeringa de tamaño de poro de 0.2 μm y guárdela a 4 °C.
    3. Añadir 20 μL de PBS-0,5% p/v BSA, o 10x PI (100 μg/mL) preparado en PBS-0,5% p/v BSA, a las células a una concentración final de 10 μg/mL, e incubar durante 1 h a 4 °C o 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Adquiera datos de fluorescencia utilizando un citómetro de flujo equipado con un láser de iones de argón (488-514 nm) y un filtro de paso de banda para permitir la detección de la emisión de fluorescencia a 578 nm. Adquirir 20.000 eventos por muestra a un caudal de 30 μL/min a temperatura ambiente. Analice los datos como se describe a continuación (secciones 3.2.7-3.2.10).
  2. Análisis citométrico de flujo de BMMCs para Kit (CD117) y expresión del receptor de superficie FcεRI
    1. Retire cuidadosamente el medio de cultivo que contiene BMMC de la parte superior del CNC / agarosa / D-manitol, evitando el gel, y transfiera las células a un tubo de microfuge de 1.5 ml.
    2. Lave los BMMC dos veces con PBS-0.5% BSA filtrado a 300 × g durante 5 min a temperatura ambiente, y resuspenda en 180 μL de PBS que contenga 0.5% p/v BSA (1.5 × 106 células/ml). Transfiera las celdas resuspendidas a una placa de fondo redondo de 96 pocillos.
    3. Añadir 20 μL de 10x soluciones de trabajo de anticuerpos a las células para lograr una concentración final de 0,06 μg/mL de CD117 (c-Kit)-ficoeritrina (PE) y 0,06 μg/mL de FcεRIα-aloficocianina (APC), respectivamente.
      NOTA: Las soluciones de trabajo de anticuerpos 10x deben prepararse en PBS-0.5% p/v BSA esterilizado por filtro.
    4. Agregue 20 μL de soluciones de trabajo de control de isotipo 10x que contengan igG2b κ isotipo de rata control-PE o control de isotipo igG de hámster armenio-APC para separar los pocillos que contengan células que no hayan sido teñidas con ninguno de los conjugados anticuerpo-fluoróforo en el paso 3.2.3.
      NOTA: Los controles de isotipo, rata IgG2b κ isotipo control-PE y control de isotipo IgG de hámster armenio-APC sirven para controlar la unión inespecífica de anticuerpos al BMMC. Como los BMMC no expresan altos niveles de FcR, rara vez se detecta una alta fluorescencia de fondo con anticuerpos de control de isotipos. Prepare las soluciones de trabajo de control de isotipo 10x en PBS-0.5% s/v BSA esterilizado por filtro.
    5. Incubar la placa de fondo redondo de 96 pocillos durante 1 h a 4 °C en la oscuridad.
    6. Lave las células agregando 200 μL de pbS-0.5% p/v tampón BSA fresco a cada pocillo, y centrífuga a 300 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Repita el paso de lavado una vez más. Retire con cuidado el sobrenadante sin tocar el gránulo celular; deje un poco de sobrenadante para asegurarse de que el pellet celular permanezca intacto.
    7. Después del lavado, resuspenda las células en 100 μL de 0.5% p/v BSA, 0.05% p/v azida de sodio en PBS (pH 7.4) que ha sido filtrada estéril dos veces con un filtro de jeringa de tamaño de poro de 0.2 μm. Adquiera datos de fluorescencia en los canales detectores de PE y APC utilizando un citómetro de flujo, como se describe anteriormente en el paso 3.1.3.
    8. Analice datos utilizando un software capaz de ver y analizar archivos de datos citométricos de flujo con la extensión ".fcs".
    9. Comience el análisis trazando la dispersión hacia adelante (FSC) a lo largo del eje x y la dispersión lateral (SSC) a lo largo del eje y, y la puerta para la población celular conservada con un rango FSC de log10 1.5-5.0 y un rango SSC de log10 0.75-3.25 en las células no tratadas y no teñidas como se muestra en la Figura 3A (i), (ii).
      NOTA: Esto sirve para garantizar que los residuos celulares con valores bajos de FSC y SSC se eliminen del análisis. Los mastocitos son normalmente células muy granulares (SSC alto) y grandes (FSC alto) en comparación con otros tipos de células inmunológicas, como monocitos y linfocitos.
    10. A continuación, genere diagramas de puntos FSC vs. SSC y perfiles de histogramas de muestras no tratadas que hayan sido teñidas con los controles de colorante, anticuerpos o isotipo, y obtenga la intensidad media de fluorescencia (IMF) en los canales PE o APC de acuerdo con el espectro de emisión del conjugado o colorante específico anticuerpo-fluoróforo utilizado. Aplicar el mismo conjunto de compuertas y parámetros a todas las muestras de BMMC incubadas con diferentes sustratos CNC/agarosa/D-manitol y teñidas con los controles de isotipo, anticuerpos o colorantes correspondientes; obtener IMF.
      NOTA: Esencialmente, los diagramas de puntos FSC vs SSC de las muestras teñidas no tratadas deben ser indistinguibles de las muestras no tratadas / no teñidas, obtenidas en el paso 3.2.9, para garantizar que el procedimiento de tinción no altere el tamaño celular (medido por FSC) o la granularidad (medido por SSC) (Figura 3A (i), (ii)).
    11. Calcule las IMF promedio y el error estándar de media (SEM) para cada muestra a partir de 4 experimentos independientes seguidos de la generación de gráficos utilizando un paquete de software de análisis estadístico.
    12. Preparar superposiciones de histogramas en el software de análisis de datos citométricos de flujo (Figura 3B, 4A(ii),B(ii)).

4.3D Bioimpresión de sustratos de hidrogel FNC/alginato de sodio

NOTA: La bioimpresora 3D utilizada en este estudio es un sistema de extrusión neumática equipado con dos cabezales de impresión independientes con temperatura controlada. La tinta de biomaterial utilizada para bioimprimir en 3D los andamios de hidrogel está formulada de (a) nanocelulosa fibrilar altamente hidratada (FNC), que es morfológicamente similar al colágeno, (b) alginato de sodio y (c) D-manitol. Se suministra como una suspensión de hidrogel estéril en cartuchos de 3 ml a los que se pueden conectar boquillas de bioimpresión cónica estériles de bloqueo de luer (22, 25 o 27 G).

  1. Utilice este protocolo con los cabezales de impresión y el lecho de impresión a temperatura ambiente, donde la temperatura ambiente es de 20-25 °C.
  2. Almacene los cartuchos de tinta de biomaterial a 4 °C para mantener la estabilidad del compuesto de hidrogel. Antes de comenzar la bioimpresión 3D, retire un cartucho (3 ml) del refrigerador y permita que se equilibre a temperatura ambiente.
  3. Instalación de un cartucho Bioink en la bioimpresora 3D INKREDIBLE+
    1. Retire las tapas del extremo azul del cartucho de tinta de biomaterial de 3 ml (Figura 5B(i)) y coloque una boquilla de bioimpresión cónica estéril de 22 G (azul) en el extremo luer-lock del cartucho Bioink.
      NOTA: Es esencial fijar la boquilla de bioimpresión cónica deseada en el cartucho de biotinta antes de instalar el cartucho y realizar los pasos de calibración posteriores, ya que si no lo hace, se producirá una calibración incorrecta del eje Z de la bioimpresora 3D.
    2. Conecte el tubo de suministro de presión de aire para el cabezal de impresión 1 (PH1, izquierda) al extremo opuesto del cartucho e inserte el cartucho con su boquilla de bioimpresión cónica adjunta en la ranura vertical de PH1 (Figura 5A(ii)).
    3. Coloque firmemente el cartucho en PH1 con la boquilla de bioimpresión cónica que se extiende por debajo del cabezal de impresión. Apriete el tornillo en el sentido de las agujas del reloj PH1 hasta que se apriete con los dedos para bloquear el cartucho Bioink en su lugar. Tenga en cuenta que la bioimpresión 3D se puede realizar con PH2 vacío.
  4. Calibración de los ejes x-y-z de la bioimpresora 3D
    1. Encienda la bioimpresora 3D e inicie el software de la bioimpresora en un PC conectado a la bioimpresora 3D a través de un cable USB 2.0.
    2. En el software, haga clic en el botón CONECTAR para sincronizar el software con la bioimpresora 3D.
      NOTA: La sincronización se realiza correctamente cuando las luces de diodo emisor de luz ultravioleta del cabezal de impresión se encienden y apagan, y el ventilador del filtro HEPA se apaga y se enciende de nuevo. El software debe sincronizarse con la bioimpresora 3D antes de ubicar los ejes de la bioimpresora y la calibración del punto de partida, como se describe en los pasos posteriores.
    3. Observe cuatro opciones en el menú de control principal de la bioimpresora 3D: (i) PREPARAR BIOIMPRESIÓN, (ii) BIOIMPRESIÓN, (iii) MENÚ DE UTILIDADES y (iv) PANTALLA DE ESTADO. Seleccione la opción PREPARAR BIOPRINT y, a continuación, desplácese hacia abajo y seleccione la opción HOME AXES .
      NOTA: La bioimpresora 3D moverá el conjunto del cabezal de impresión hacia atrás y hacia la izquierda para calibrar los ejes y y x, respectivamente. A partir de entonces, con los cabezales de impresión en pausa en la posición del extremo izquierdo, la bioimpresora elevará el lecho de impresión hasta que el interruptor de calibración del eje Z (ubicado en la cama de impresión) haga contacto con la boquilla de bioimpresión cónica instalada en el cabezal de impresión 1
    4. Después de una calibración exitosa de los ejes x-y-z, observe la ligera disminución de la cama de impresión y la reubicación de los cabezales de impresión por encima del punto central de la cama de impresión (Figura 5A (i)).
  5. Calibración del punto de partida de la bioimpresora para bioimpresión en placas de 24 pocillos
    1. Retire una placa de cultivo estéril de 24 pocillos de su envoltura de plástico sellada y marque un punto en el punto central del pozo D1 en la parte inferior de la placa con un marcador permanente. Retire la cubierta de la placa y coloque la placa de cultivo de 24 pocillos en la cama de impresión con el pozo D1 ubicado en la esquina frontal izquierda de la cama de impresión.
    2. En el menú de control principal, seleccione MENÚ UTILIDADES y, a continuación, seleccione MOVER EJE. Mueva los cabezales de impresión en incrementos de 1 mm a lo largo de los ejes X e Y hasta que la boquilla de bioimpresión cónica de PH1 esté directamente sobre el punto marcado debajo del pozo D1. Si es necesario, ajuste la posición de la boquilla de bioimpresión cónica sobre el punto moviendo los cabezales de impresión en incrementos de 0,1 mm.
    3. Registre las coordenadas x e y de la boquilla de bioimpresión cónica cuando esté directamente sobre el centro del pozo D1, como se indica en la pantalla del panel de control de la bioimpresora 3D.
      NOTA: En el caso de la bioimpresora 3D INKREDIBLE+ utilizada aquí, las coordenadas x e y son las siguientes: x : -46.5 e y : -27.5. Estas coordenadas sirven como punto de partida en el centro del pozo D1 para la bioimpresión en una placa de 24 pocillos.
    4. A continuación, eleve el lecho de impresión en incrementos de 1 mm hasta que el fondo del pozo D1 esté casi tocando la boquilla de bioimpresión cónica instalada en el cabezal de impresión 1. Ajuste el movimiento de la cama de impresión en incrementos de 0,1 mm si es necesario (Figura 5A(ii)). A continuación, en el MENÚ UTILIDADES, seleccione la opción CALIBRACIÓN DEL EJE Z y, a continuación, seleccione y confirme la opción CALIBRACIÓN ALMACENAR Z .
    5. Vuelva al menú principal y seleccione la opción PREPARAR BIOPRINT . Desplácese hacia abajo y seleccione la opción CALIBRAR Z .
      NOTA: La bioimpresora 3D ahora bajará el lecho de impresión al ejecutar con éxito la calibración del eje Z (Figura 5A (iii)).
  6. Actualización del archivo de código G de la placa de 24 pocillos con las coordenadas de punto de partida correctas
    1. Abra el archivo de código geométrico de placa (código G) de 24 pocillos proporcionado en el software de bioimpresora (archivo suplementario 1).
      NOTA: Este archivo de código G de 24 pocillos codifica la impresión de construcciones rectilíneas de 2 capas de 5 x 5 x 1 mm en cada pozo (Figura 5C(i),(iii)). Los archivos de código G proporcionados se pueden utilizar con cualquier software de bioimpresión 3D.
    2. Tenga en cuenta que la línea 1 del archivo de código G dice G0 X-50.0 Y-33.5 ; Posición central del pozo D1. Actualice las coordenadas x e y en la línea 1 con los valores obtenidos en el paso 4.5.3, es decir, la línea 1 ahora debe decir G0 X-46.5 Y-27.5 ; Posición central del pozo D1. Guarde el archivo con un nuevo nombre.
      NOTA: Este procedimiento sirve para calibrar el archivo de código G para que la impresión comience en el centro del pozo D1 en función de las coordenadas x,y de la bioimpresora 3D específica que se está utilizando. Este enfoque se puede utilizar para calibrar el archivo de código G de placa de 24 pocillos para imprimir con cualquier bioimpresora 3D de extrusión. Para el propósito de este estudio, solo se imprimió la mitad izquierda de la placa de 24 pocillos, es decir, los pozos A1-3, B1-3, C1-3 y D1-3. También se proporciona un archivo de código G separado que codifica la impresión de construcciones rectilíneas de 2 capas 5 x 5 x 1 mm en una cuadrícula de 3 x 4 (Archivo suplementario 2, Figura 5C (ii)).
  7. Ajuste de la presión de extrusión para el cabezal de impresión 1 (PH1)
    1. Asegúrese de que la bomba neumática esté bien conectada al puerto de admisión de aire trasero de la bioimpresora 3D INKREDIBLE+ y encienda la bomba neumática.
    2. Extraiga la perilla de control delantera ubicada en el lado derecho de la bioimpresora 3D INKREDIBLE+.
      NOTA: La perilla de control delantera ajusta la presión para PH1, mientras que la perilla de control trasera ajusta la presión para PH2.
    3. Observe los manómetros digitales para PH1 y PH2 ubicados en la parte frontal de la bioimpresora, cada uno de los cuales lee cerca de 0 kPa. Gire lentamente la perilla de control hacia adelante en el sentido de las agujas del reloj hasta que la presión indicada en el medidor izquierdo para PH1 alcance los 12 kPa (Figura 5A(iii)).
    4. Coloque un papel de seda doblado o un trozo de película impermeable y sellada debajo de la boquilla de impresión del cartucho instalado, teniendo cuidado de no tocar la boquilla de impresión.
    5. En el menú de control principal de la bioimpresora 3D, seleccione PREPARAR BIOPRINT.
    6. Desplácese hasta ACTIVAR PH1 y selecciónelo. Tenga en cuenta que la tinta del biomaterial comienza a extruirse de la boquilla de impresión. Si es necesario, aumente la presión de extrusión girando la perilla de control en el sentido de las agujas del reloj hasta que la tinta del biomaterial se extruya en un filamento continuo y registre el nuevo ajuste de presión. Trabaje rápidamente para evitar el desperdicio de tinta de biomaterial.
    7. Seleccione TURN OFF PH1 para detener la extrusión de la tinta del biomaterial, retire el papel tisú o la película que contiene la tinta de biomaterial extruido de la cama de impresión y cierre la puerta de la bioimpresora.
      NOTA: La bioimpresora 3D encenderá automáticamente el suministro de presión de aire a PH1 durante la impresión según las instrucciones del archivo de código G.
  8. Bioimpresión 3D de sustratos de hidrogel rectilíneo en formato de placa de 24 pocillos
    1. En el menú de control principal de la bioimpresora 3D, seleccione MENÚ UTILIDADES. Navegue y seleccione DESHABILITAR IMPRESIÓN SD, lo que permitirá que el software de la bioimpresora transmita archivos de código G a la bioimpresora 3D para imprimir.
    2. Haga clic en el botón CARGAR en el software de la bioimpresora y seleccione el archivo de código G de placa de 24 pocillos actualizado guardado en el paso 4.6.2.
    3. En el panel de control de la derecha del software, seleccione la pestaña VISTA PREVIA DE IMPRESIÓN y haga clic en el botón IMPRIMIR para comenzar la bioimpresión en el pozo D1.
      NOTA: Si se utiliza el archivo de código G de la placa de pozo de cuadrícula 3 x 4, la bioimpresión terminará en el pozo A3 de la placa de 24 pocillos (Figura 5C (ii), D), a diferencia del pozo A6 si se imprime una placa completa de 24 pocillos.
    4. Una vez completada la bioimpresión de las construcciones rectilíneas, cubra la placa de 24 pocillos con su tapa y muévala a un gabinete de bioseguridad de clase II.
    5. Sumergir cada construcción rectilínea en dos gotas de solución estéril de CaCl2 de 50 mM (Figura 5B(ii)), e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
      NOTA: Esto sirve para reticular iónicamente las cadenas de polímeros de alginato con los iones Ca2+ y permitir que las construcciones rectilíneas mantengan su integridad estructural.
    6. Aspire cuidadosamente la solución de CaCl2 de cada construcción y enjuague una vez en 1 ml de 1x PBS (pH 7.4) para eliminar el exceso de CaCl2 (Figura 5D).
    7. Para evitar la deshidratación de las construcciones de hidrogel bioimpresas, mantenga las construcciones rectilíneas bioimpresas en 3D en 1x PBS frescos hasta que los BMMC estén listos para ser sembrados en las construcciones (Figura 5D).

5. Incubación de BMMCs en andamios rectilíneos bioimpresos en 3D y pruebas de viabilidad

  1. Incubación de BMMCs en andamios de hidrogel rectilíneo bioimpresos en 3D
    1. Semillas alícuotas de MMEC en los andamios rectilíneos bioimpresos en 3D por triplicado durante cuatro duraciones diferentes, por ejemplo, 6, 18, 24 y 48 h, de modo que todos los tratamientos terminen simultáneamente. Utilice BMMC sembrados en pozos vacíos por triplicado durante las mismas duraciones que los controles no tratados.
    2. Transfiera asépticamente BMMC de un matraz de cultivo T175 cm2 a un tubo cónico estéril de 50 ml y gule los BMMC a 200 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
    3. Resuspender el pellet en 50 mL de medio RPMI completo fresco que contenga 20 ng/mL de IL-3, y calcular la densidad de células vivas contando una alícuota de BMMC teñidos de tripano azul utilizando un hemacitómetro.
    4. Sobre la base de la densidad celular calculada en el paso 5.1.3, preparar una alícuota de 6 ml de la suspensión BMMC a una densidad final de 1 × 106 células/ml.
    5. Para la configuración de incubación de 48 h, aspire PBS de los pozos A1-3 que contienen los andamios de hidrogel rectilíneo bioimpresos en 3D y pipetee 1 ml de suspensión BMMC (1 × 106 células / ml) en cada pozo. Además, pipetee 1 mL de suspensión de BMMC (1 × 106 celdas/ml) en pozos A4-6 sin construcciones bioimpresas para servir como control no tratado. Incubar los pocillos restantes que contengan andamios bioimpresos (B1-3, C1-3, D1-3) en RPMI sin aditivos para prevenir la deshidratación hasta que se alcance el momento adecuado para la siembra con BMMC durante las duraciones de tratamiento de 24, 18 y 6 h. Llene los pozos sin andamios bioimpresos (B4-6, C4-6, D4-6) con 1 ml de PBS hasta que se alcance el momento adecuado para la siembra con los MMEC para los puntos de tiempo de 24, 18 y 6 h.
    6. Incubar la placa de 24 pocillos a 37 °C en una atmósfera humidificada al 5% de CO2 .
    7. Para la configuración de incubación de 24 h, aspire el medio de cultivo / tampón preexistente de los pozos B1-6 y siembre 1 ml de suspensión de BMMC (1 × 106 células / ml) en estos pozos. Devuelva la placa a la incubadora.
    8. Para la configuración de incubación de 18 h, aspire el medio de cultivo preexistente / tampón de los pozos C1-6 y siembre 1 ml de suspensión de BMMC (1 × 106 células / ml) en estos pozos. Devuelva la placa a la incubadora.
    9. Para la configuración de incubación de 6 h, aspire el medio de cultivo / tampón preexistente de los pozos D1-6 y siembre 1 ml de suspensión de BMMC (1 × 106 células / ml) en estos pozos. Devuelva la placa a la incubadora.
    10. Para la terminación de la incubación, dispense muestras de cada pocillo de la placa de 24 pocillos para (i) tinción y análisis de PI por citometría de flujo, (ii) ensayo de viabilidad celular XTT y (iii) ensayo de liberación de LDH. Por lo tanto, asegúrese de que una placa de fondo redondo de 96 pocillos y los tubos de microfugios de 1,5 ml necesarios estén etiquetados mucho antes del punto final de la incubación.
  2. Muestreo celular para el ensayo metabólico XTT
    1. Resuspender completamente los MMMC en el medio de cultivo dentro de cada pozo, teniendo cuidado de no dañar y fragmentar los andamios de hidrogel bioimpresos en 3D.
    2. Transfiera asépticamente 40 μL de la suspensión homogénea de BMMC de cada pozo a tubos estériles de microfugios de 1,5 ml que contengan 760 μL de medio RPMI completo fresco (volumen final = 800 μL) y vórtice brevemente para mezclar.
    3. Dispense 100 μL de las suspensiones diluidas de BMMC por triplicado en una placa de microtitulación plana de 96 pocillos que sea adecuada para registrar mediciones de absorbancia (consulte la Tabla de materiales) en un espectrofotómetro de microplacas.
    4. Dispensar 50 μL de solución de trabajo XTT a cada pozo que contenga la suspensión de células BMMC utilizando una micropipeta multicanal.
      NOTA: Prepare la solución de trabajo XTT mezclando 5 ml de reactivo XTT con 100 μL de reactivo de acoplamiento electrónico. Descongele estos componentes a partir de -20 °C en un baño de agua de 37 °C inmediatamente antes de su uso.
    5. Incubar la placa de 96 pocillos a 37 °C en una atmósfera humidificada al 5% de CO2 durante 24 h.
    6. Al final de la incubación, retire la placa de 96 pocillos de la incubadora y deje que se enfríe a temperatura ambiente. Registre los valores de absorbancia en un espectrofotómetro de microplacas a 450 nm con sustracción de fondo a 650 nm.
  3. Muestreo de sobrenadantes para el ensayo de lactato deshidrogenasa (LDH)
    1. Transfiera las suspensiones BMMC restantes (960 μL) de cada pocillo de la placa de 24 pocillos a los tubos de microfugas y peletee las células a 200 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
    2. Pipetear tres alícuotas de 100 μL del sobrenadante de cultivo celular de cada tubo de microfugio en una placa de fondo plano de microtitulación de 96 pocillos. Deseche los sobrenadantes sobrantes de cada tubo de microfuge y conserve los gránulos de BMMC para seguir tincionándolos con PI en las secciones 5.4.1-5.4.8.
    3. Pipetear 50 μL de la solución de trabajo LDH en cada alícuota de 100 μL de sobrenadante.
      NOTA: Consulte el Archivo Suplementario 3 para la preparación de reactivos de ensayo de LDH.
    4. Incubar durante 1 h en la oscuridad a temperatura ambiente.
    5. Pipetear 50 μL de ácido acético 1 M a cada pocillo para detener la reacción.
    6. Registre los valores de absorbancia en un espectrofotómetro de microplacas a 490 nm con sustracción de fondo a 680 nm.
  4. Análisis citométrico de flujo de la viabilidad de BMMC mediante exclusión de yoduro de propidio (PI)
    1. Vuelva a suspender los gránulos de BMMC en tampón de lavado de flujo (PBS [pH 7.4] que contiene 0.5% p/v BSA) y peletice las células a 300 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
    2. Repita el paso de lavado con el tampón de lavado de flujo una vez más.
    3. Resuspender cada pellet de BMMC en 400 μL de tampón de lavado de flujo.
      NOTA: Habrá 24 muestras de BMMC resuspendidas en total: 12 muestras de BMMC incubadas en sustratos de hidrogel bioimpresos (4 puntos de tiempo en triplicado) y 12 muestras de BMMC incubadas en pozos sin construcciones bioimpresas (4 puntos de tiempo en triplicado).
    4. En una placa de microtitulación de 96 pocillos de fondo redondo, pipetee 20 μL de tampón de lavado de flujo en los pozos A1-12 y B1-12. En la misma placa de microtitulación, pipetee 20 μL de solución de tinción 10x PI (100 μg/mL PI en tampón de lavado de flujo) en los pozos C1-12 y D1-12.
    5. Dispensar 180 μL de las 12 muestras de BMMC incubadas en sustratos de hidrogel bioimpresos en pozos A1-12 (una muestra por pozo). Dispensar 180 μL de las 12 muestras de BMMC incubadas sin sustratos de hidrogel bioimpresos en pozos B1-12 (una muestra por pozo). Utilice las muestras de BMMC dispensadas en los pozos A1-12 y B1-12 como controles no teñidos para cada condición de tratamiento (24 controles en total).
    6. Dispensar 180 μL de las 12 muestras de BMMC incubadas en construcciones bioimpresas en pozos C1-12 (una muestra por pozo). Dispensar 180 μL de las 12 muestras de BMMC incubadas sin construcciones bioimpresas en los pozos D1-12 (una muestra por pozo).
      NOTA: Las muestras de BMMC en los pozos C1-12 y D1-12 se teñirán a una concentración final efectiva de PI de 10 μg/mL (24 muestras teñidas en total).
    7. Incubar la placa durante 1 h a 4 °C o 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
    8. Al final del período de incubación, analice las muestras directamente de la placa de microtitulación en un citómetro de flujo como se describe anteriormente en la sección 3.1.

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Representative Results

Una de las características más cruciales de una tinta de biomaterial o sustrato de cultivo exitoso es la de la biocompatibilidad. Principalmente, el sustrato no debe inducir la muerte celular. Existen varios métodos citométricos de flujo y basados en microtituladores para cuantificar la viabilidad celular y la necrosis; sin embargo, estos métodos no son susceptibles de analizar células incrustadas dentro de una matriz de hidrogel. En este protocolo, la limitación mencionada anteriormente se elude sembrando los MMMC en el sustrato de hidrogel o andamio bioimpreso. Después de un período de incubación específico (6-48 h en este estudio), los BMMC se cosechan fácilmente mediante micropipeteo sin necesidad de interrupción mecánica o hidrólisis del sustrato de hidrogel o andamio bioimpreso, que de otro modo causaría daños físicos a las células. La viabilidad de los BMMC se analiza rápidamente utilizando el método de permeabilidad PI a través de citometría de flujo. PI es un colorante impermeante a la membrana que se excluye de las células viables con membranas celulares intactas y fluorescencias sólo al intercalar entre los pares de bases de ADN16.

Como tal, solo las células con membranas celulares comprometidas son permeables a PI y, por lo tanto, fluorescen. El análisis de permeabilidad de PI no demostró cambios en la viabilidad de BMMC cuando se cultivan en el sustrato CNC/agarosa/D-manitol. De hecho, ninguna de las concentraciones de CNC probadas (hasta un 12,5% p/v) provocó efectos adversos sobre la viabilidad de BMMC en comparación con las BMMC cultivadas en ausencia de sustratos de hidrogel CNC/agarosa/D-manitol (Figura 3B,C). También es vital que la biotinta o sustrato de cultivo no altere la morfología de las células. Sobre la base de las gráficas citométricas de flujo FSC vs. SSC, el sustrato de hidrogel con la mayor concentración de CNC (12,5% p/v) no alteró el tamaño nativo (FSC) o la granularidad (SSC) de los BMMC en comparación con los BMMC cultivados en ausencia de los sustratos de hidrogel CNC/agarosa/D-manitol (Figura 3A(i), (ii)).

Otra característica importante de una tinta de biomaterial o sustrato de cultivo es que debe poseer la capacidad de mantener la diferenciación y el fenotipo de las células que soporta. Dos de los biomarcadores más esenciales de los mastocitos son el receptor IgE de alta afinidad, FcεRI, que facilita las respuestas BMMC a los antígenos y el receptor del factor de células madre, Kit (CD117), que se requiere para la supervivencia y diferenciación de los mastocitos. Los mastocitos maduros se definen por la expresión de estos dos receptores de superficie, y para que un sustrato de biotinta los mantenga en cultivo, no debe modificar significativamente la expresión de estos dos receptores. El sustrato CNC/agarosa/D-manitol pareció aumentar la expresión de FcεRI y Kit a concentraciones de CNC ≥ 2,5% (Figura 4A(iii),B(iii)). Curiosamente, los niveles elevados de expresión de FcεRI y Kit se mantuvieron relativamente consistentes entre 2.5% y 12.5% CNC, lo que es indicativo de un efecto de meseta y sugiere un efecto que no depende de la concentración de CNC, sino de algún otro parámetro del compuesto de hidrogel.

Los andamios de tinta de biomaterial de hidrogel bioimpreso en 3D generados en este estudio consisten en nanocelulosa fibrilar (FNC), en lugar de nanocelulosa cristalina, y alginato de sodio como gelificador, en lugar de agarosa. La nanocelulosa fibrilar exhibe características topográficas distintas a nanoescala en comparación con CNC17 que, además de la arquitectura a microescala de los sustratos de biotinta de hidrogel FNC bioimpresos en 3D, podrían afectar potencialmente la viabilidad de los BMMC. Después de la bioimpresión 3D y la reticulación iónica de los andamios de biotinta FNC/alginato/D-manitol (Figura 6), los BMMC se cultivaron solos o en los andamios de hidrogel bioimpresos 3D durante 6, 18, 24 y 48 h, respectivamente, con el fin de evaluar los cambios dinámicos en la viabilidad de los BMMC en respuesta a los andamios FNC/alginato/D-manitol, en su caso, durante largos períodos de tiempo. El ensayo XTT indicó que la actividad metabólica de los BMMC cultivados en los andamios de hidrogel bioimpresos en 3D se mantuvo relativamente consistente en ~ 100% en todos los puntos de tiempo probados en comparación con los BMMC cultivados solos (Figura 7A). La lisis de las células da como resultado la liberación de LDH en el medio de cultivo celular, que el ensayo de LDH detecta en función de su actividad enzimática oxido-reductora.

Los BMMC cultivados en los andamios de hidrogel bioimpresos en 3D exhibieron un aumento gradual dependiente del tiempo en la liberación de LDH en comparación con los BMMC cultivados solos; sin embargo, esta tendencia tuvo una desviación estándar no significativa de menos del 9% (Figura 7B). La tinción pi de los BMMC cultivados en los andamios de hidrogel bioimpresos en 3D no reveló cambios significativos en la viabilidad en comparación con los BMMC cultivados solos en cada punto de tiempo (Figura 7C). En particular, la IMF de BMMC teñidos con PI cultivados en los andamios de hidrogel bioimpresos en 3D se mantuvo relativamente consistente (PI-MFI de 7000) en todos los puntos de tiempo y fue similar a los BMMC cultivados en los sustratos CNC / agarosa / D-manitol, que exhibieron un PI-MFI consistente de 7000 en todas las concentraciones de CNC (2.5-12.5%). En conjunto, estos datos demuestran que los andamios de hidrogel FNC/alginato/D-manitol no afectan negativamente a la viabilidad de los MMEC.

Figure 1
Figura 1: Anatomía de la pierna del ratón, que representa la tibia y el fémur de los que se aísla la médula ósea. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Preparación del sustrato de hidrogel CNC/agarosa/D-manitol. (A) Esquema del protocolo de preparación de sustrato de hidrogel CNC/agarosa/D-manitol. (B) Las preparaciones CNC/agarosa/D-manitol (0, 1, 2.5, 5, 10 y 12.5% (p/v) CNC en PBS/agarosa/D-manitol) se cargaron en una placa de 24 pocillos en cuadruplicato como se ilustra. Abreviaturas: PBS = solución salina tamponada con fosfato; CNC = nanocelulosa cristalina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Análisis citométrico de flujo de la viabilidad de BMMC a través de la exclusión de yoduro de propidio después de la incubación en sustratos CNC/agarosa/D-manitol. Los BMMC se eliminaron de los sustratos de hidrogel CNC/agarosa/D-manitol, se lavaron dos veces, se resuspendieron en PBS-0,5% p/v BSA, se tiñeron con PI durante 1 h a 4 °C y se analizaron mediante citometría de flujo (n=4). Se adquirieron un total de 20.000 células por muestra, incluida la detección de emisiones de fluorescencia PI en el canal de PE. El análisis de los datos se realizó mediante un software de análisis de citometría de flujo. (A) Análisis de diagrama de puntos de dispersión directa (eje x) versus dispersión lateral (eje y) de la población celular total de (i) BMMC de control no tratado (0% CNC / agarosa / D-manitol) y (ii) BMMC cultivados en 12.5% CNC / agarosa / D-manitol, que representa la población de células cerradas utilizada para el análisis de datos. (B) Perfil de superposición de histograma de células cerradas (no teñidas o teñidas con PI), de BMMC de control no tratadas (0% CNC/agarosa/D-manitol) y BMMC cultivadas en CNC/agarosa/D-manitol al 12,5%. (C) Los BMMC se cultivaron en diferentes sustratos CNC/agarosa/D-manitol (1-12,5% (p/v) CNC) durante 18 h, y la viabilidad celular se determinó mediante análisis citométrico de flujo de células teñidas con PI. Representación gráfica de las IMF de PI para BMMCs incubadas en diferentes sustratos CNC/agarosa/D-manitol (1-12,5% (p/v) CNC) en relación con BMMCs que no fueron tratados y teñidos con PI. Abreviaturas: BMMCs = mastocitos derivados de la médula ósea; CNC = nanocelulosa cristalina; PBS = solución salina tamponada con fosfato; BSA = albúmina sérica bovina; PI = yoduro de propidio; PE = ficoeritrina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Análisis citométrico de flujo de la expresión del receptor de superficie celular FcεRI y Kit (CD117). Los BMMC se cultivaron en ausencia o presencia de sustratos CNC/agarosa/D-manitol durante 18 h, se eliminaron y se analizaron para determinar la expresión del receptor. Los datos son representativos de 4 réplicas. Diagrama de puntos de dispersión hacia adelante (eje x) versus dispersión lateral (eje y) de la población celular total en la muestra BMMC no tratada (0% CNC / agarosa / D-manitol), teñida con (A) (i) el anticuerpo de control de isotipo-APC o (B) (i) el anticuerpo de control de isotipo-PE, y la población de células cerradas utilizada para el análisis de datos. Perfiles superpuestos histogramas de BMMC cerrados (teñidos con anticuerpos de control de isotipos o anticuerpos (A)(ii) anti-FcεRI-APC o anticuerpos (B)(ii) anti-Kit-PE), incubados solos (0% CNC/agarosa/D-manitol) o en sustratos CNC/agarosa/D-manitol al 12,5%. Los BMMC se cultivaron durante 18 h en diferentes sustratos CNC/agarosa/D-manitol (1-12,5% (p/v) CNC) seguidos de análisis de expresión del receptor de superficie FcεRI y Kit, respectivamente, mediante citometría de flujo (n=4). Representación gráfica de las IMF de BMMCs teñidas con anticuerpos (A)(iii) anti-FcεRI-APC o (B)(iii) anti-Kit-PE, respectivamente, después del cultivo en diferentes sustratos CNC/agarosa/D-manitol (1-12,5% (p/v) CNC) en relación con células no tratadas (0% CNC) y teñidas de manera similar. Abreviaturas: CNC = nanocelulosa cristalina; APC = aloficocianina; PE = ficoeritrina; BMMCs = mastocitos derivados de la médula ósea; IMF = intensidades medias de fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Equipo de bioimpresión 3D y consumibles necesarios para bioimprimir andamios de hidrogel de biotinta rectilínea de 5 x 5 x 1 mm de 2 capas en un formato de placa de 24 pocillos. (A)(i) Una bioimpresora 3D de extrusión neumática con la posición de ensamblaje del cabezal de impresión en su posición de reposo al completar el homing de sus ejes x-y-z . (A) ii) Calibración del punto de partida del cabezal de impresión 1 con un cartucho de biotinta instalado y colocación de la boquilla de impresión directamente sobre el centro del pozo D1 en las dimensiones x-y-z . (A) iii) Posición de PH1 después de la calibración del eje Z y la presión de extrusión de PH1 establecida en 12 kPa. (B) i) Cartucho de biotinta (3 ml) que contenga formulación de tinta de biomaterial NFC/Alginato/D-manitol. (B) (ii) Dispensador de gotas de solución de reticulación CaCl2 de 50 mM. (C) i) Representación esquemática de un diseño de impresión a partir de un archivo de código G que codifica la impresión de andamios de hidrogel de biotinta rectilínea de 2 capas de 5 x 5 x 1 mm en todos los pozos de una placa de 24 pocillos. (C) (ii) Representación esquemática de un diseño de impresión a partir de un archivo de código G que codifica la impresión de andamios de hidrogel de biotinta rectilínea de 5 x 5 x 1 mm de 2 capas solo en pozos A1-3, B1-3, C1-3 y D1-3 de una placa de 24 pocillos. (C) (iii) Vista ampliada del patrón de andamio de hidrogel de biotinta rectilínea de 5 x 5 x 1 mm de 2 capas en el programa de corte, Slic3r. (D) Vista superior de andamios de hidrogel de biotinta rectilínea de 2 capas bioimpresos 3D reales de 5 x 5 x 1 mm en un formato de placa de 24 pocillos inmersos en PBS. Abreviaturas: 3D = tridimensional; PH1 = cabezal de impresión 1; NFC = celulosa nanofibrilar; G-code = código geométrico; PBS = solución salina tamponada con fosfato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Diagrama esquemático que representa el flujo de trabajo de la bioimpresión 3D y el cultivo BMMC en andamios de hidrogel FNC/alginato/D-manitol. Bioimpresión 3D de andamios de hidrogel con biotinta FNC/Alginato/D-manitol a partir de un archivo de código G que codifica un patrón de rejilla de 2 capas de 5 x 5 x 5 x 1 mm, reticulación de los andamios de hidrogel con CaCl2 y cultivo de BMMCs en las construcciones de hidrogel FNC/Alginato/D-manitol reticuladas. Abreviaturas: 3D = tridimensional; 2D = bidimensional; G-code = código geométrico; FNC = nanocelulosa fibrilar; BMMCs = mastocitos derivados de la médula ósea. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Ensayos citométricos de flujo (PI) y microtituladores (XTT y LDH) de viabilidad de BMMC después de la incubación en andamios de FNC/alginato/D-manitol. (A) Datos de ensayos metabólicos de proliferación celular (XTT) para BMMC cultivados en sustratos de biotinta FNC/Alginato/D-manitol durante 6, 18, 24 y 48 h, respectivamente. Los valores se presentan como un porcentaje de los datos metabólicos de XTT para BMMC cultivados solos durante 6, 18, 24 y 48 h, respectivamente. Las barras de error indican desviación estándar (n=3). (B) Datos del ensayo de liberación de enzimas LDH para BMMC cultivados en andamios de biotinta FNC/Alginato/D-manitol durante 6, 18, 24 y 48 h, respectivamente. Los valores se presentan como cambios de pliegue en relación con la enzima LDH liberada por BMMC cultivados solos durante 6, 18, 24 y 48 h, respectivamente. Las barras de error indican desviación estándar (n=3). (C) Datos citométricos de flujo de BMMC teñidos con PI que se cultivaron solos o en andamios de biotinta FNC/Alginato/D-manitol durante 6, 18, 24 y 48 h, respectivamente. Las barras de error indican desviación estándar (n=3). Abreviaturas: LDH = lactato deshidrogenasa; BMMCs = mastocitos derivados de la médula ósea; FNC = nanocelulosa fibrilar; PI = yoduro de propidio; IMF = intensidad media de fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1.1.1. Botella de 500 ml de RPMI (HyClone, GE Healthcare, EE. UU.)
1.1.2. 4 mM L-glutamina (Gibco, Waltham Massachusetts, EE.UU.)
1.1.3. 50 mM β-Mercaptoetanol (Fisher Scientific, Hampton, New Hampshire, EE.UU.)
1.1.4. Piruvato de sodio de 1 mM (Gibco)
1.1.5. 100 U/ml de penicilina (Gibco)
1.1.6. Estreptomicina de 100 μg/ml (Gibco)
1.1.7. 0,1 mM de aminoácidos no esenciales MEM (Gibco)
1.1.8. 25 mM HEPES (Pescador)
1.1.9. FBS inactivado por calor al 10% (Gibco)
1.1.10. 30 ng/mL ratón recombinante IL-3 (Peprotech, Rocky Hill, Nueva Jersey, EE.UU.)

Tabla 1: Suplementos completos de medios RPMI-1640.

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Discussion

La fabricación de tejidos biomiméticos 3D requiere la amalgama exitosa de la biotinta, que imita los componentes de la matriz extracelular, con los componentes celulares para crear análogos fisiológicos de los tejidos in vivo . Esto requiere el uso de células primarias, y no células transformadas, al fabricar tejidos biomiméticos fisiológicos. Sin embargo, las células inmunológicas primarias, como los mastocitos, son particularmente susceptibles a los efectos citotóxicos y a los cambios fenotípicos que pueden ser provocados por la propia matriz biotinta, lo cual es indeseable. Por lo tanto, la capacidad de evaluar rápidamente los efectos de la tinta biomaterial candidata sobre la viabilidad y el fenotipo (expresión del receptor de superficie) de los mastocitos es altamente ventajosa, especialmente antes de la bioimpresión 3D de tejidos complejos que contienen diferentes tipos de células incrustadas dentro de la matriz de biotinta, lo que es costoso y requiere mucho tiempo.

El enfoque de este protocolo consiste en el cultivo de BMMCs, un ejemplo de mastocitos primarios, en la superficie de sustratos de biotinta de hidrogel candidatos preformados (1-12.5% CNC incrustado en agarosa), lo que permite la fácil recuperación de los BMMC para el posterior análisis de la viabilidad celular y la expresión del receptor de superficie por citometría de flujo. El aislamiento de la médula ósea del fémur y la tibia del ratón requiere precisión y atención al detalle debido a la fragilidad y el pequeño tamaño de estos huesos. Después del aislamiento exitoso y la deposición de la médula ósea en un medio de cultivo celular, es esencial mantener el cultivo celular con IL-3 recombinante de 30 ng / ml de ratón continuamente durante 4 semanas, lo que garantiza una estimulación sostenida para diferenciar las células progenitoras hematopoyéticas en mastocitos que son doblemente positivos para los receptores de superficie celular Kit (CD117) y FcεRI.

El análisis citométrico de flujo de los mastocitos para la expresión superficial de los receptores Kit (CD117) y FcεRI debe emplear controles de anticuerpos de isotipo para ayudar a diferenciar la señal de fondo no específica de las señales específicas de los anticuerpos utilizados para dirigirse a estos receptores, como se demuestra en la Figura 4A (ii), B (ii). También es esencial controlar una población de mastocitos bien definida para excluir los desechos celulares como se muestra en la Figura 4A (i) y 4B (i), que también pueden unirse no específicamente a los anticuerpos. Se debe utilizar un micropipete suave al recuperar los MMMC de la superficie de los sustratos de hidrogel de biotinta para reducir las fuerzas de cizallamiento ejercidas sobre las células, lo que podría dañar la membrana celular y dar lugar a una tinción artificialmente elevada con PI. Los BMMC teñidos con PI deben analizarse mediante citometría de flujo inmediatamente después de que finalice el período de incubación de tinción, ya que el medio de tinción PI, que se basa en PBS-0.5% p/v BSA, no está destinado a mantener las células durante largos períodos de tiempo fuera del medio de cultivo celular. Debido a que PI solo impregna las células con membranas celulares comprometidas, es capaz de teñir las células necróticas con alta selectividad y sensibilidad. Sin embargo, PI es incapaz de detectar células apoptóticas, que mantienen intactas las membranas celulares.

El ensayo citométrico de flujo de exclusión de PI descrito en este protocolo puede aumentarse con isotiocianato de anexina-V-fluoresceína (FITC), que se une específicamente al fosfolípido, fosfatidilserina, que se transloca a la valva externa de la membrana celular de las células apoptóticas. Sin embargo, la compensación es necesaria para tener en cuenta el sangrado de emisión de fluorescencia de FITC en el canal del detector utilizado para adquirir la emisión de fluorescencia de PI y viceversa. Al preparar la bioimpresora para bioimpresión 3D a partir del código G de la placa de 24 pocillos proporcionado, es esencial que la calibración del punto de partida se realice con precisión, mediante la cual se registren las coordenadas x e y del centro del pozo D1, y el archivo de código G se actualice con estas coordenadas x e y en la línea 1. Si estos pasos de calibración iniciales no se realizan con precisión, los cabezales de impresión no se moverán al punto de partida correcto al comienzo de la impresión. La calibración correcta del eje Z es igualmente importante, ya que si no lo hace, la boquilla del cabezal de impresión choca con la cama de impresión o la placa de 24 pocillos al comienzo de la impresión.

El diagrama esquemático de la construcción de la rejilla rectilínea de 2 capas de 5 x 5 x 1 mm (Figura 5C(iii)), ilustra la presencia de poros entre los filamentos de biotinta extruidos que forman el sustrato. El tamaño de los poros y el diámetro de los filamentos dependen de tres parámetros: (i) la velocidad de desplazamiento de la boquilla de impresión, (ii) la presión de extrusión aplicada a la biotinta dentro del cartucho y (iii) el diámetro de la boquilla de impresión. Los sustratos bioink con grandes diámetros de filamento y poros pequeños se pueden imprimir utilizando una velocidad de boquilla de impresión más lenta, una presión de extrusión más alta (>12 kPa) y una boquilla de impresión de mayor diámetro (22 G). Por el contrario, una velocidad de boquilla de impresión más rápida, una presión de extrusión más baja (<12 kPa) y una boquilla de impresión de diámetro más pequeño (27 G) darán como resultado sustratos con filamentos más finos y poros más grandes. Sin embargo, una presión de extrusión insuficientemente alta dará como resultado que se extruyan grupos inconsistentes de biotinta en lugar de filamentos continuos, lo que afectará negativamente la calidad y la integridad estructural del sustrato bioimpreso en 3D.

La biotinta candidata CNC/agarosa/D-manitol presentada en este protocolo se somete a gelificación térmica cuando la agarosa se enfría a temperatura ambiente. Por el contrario, la biotinta comercial utilizada para la bioimpresión 3D en este protocolo se somete a una reticulación iónica con CaCl2 debido a la inclusión de alginato de sodio en la formulación de la biotinta. Por lo tanto, es necesario sumergir los andamios bioimpresos FNC/alginato/D-manitol en una solución de CaCl2 de 50 mM después de la bioimpresión para facilitar la reticulación (gelificación) del sustrato. La omisión del paso de reticulación iónica con CaCl2 dará lugar a la disolución de los andamios FNC/alginato/D-manitol cuando se sumergen en el medio de cultivo celular. La principal limitación de la formulación de biotinta CNC/agarosa/D-manitol en su aplicación en la bioimpresión 3D real es la temperatura de fusión excepcionalmente alta de la agarosa (90-95 °C). A pesar de que los cabezales de impresión de la bioimpresora 3D utilizada en este estudio pueden alcanzar una temperatura máxima de 130 ° C, los filamentos extruidos de CNC / agarosa / D-manitol probablemente se dispersarán rápidamente a medida que se impriman capas sucesivas para construir el sustrato. Esta limitación de la formulación de biotinta CNC/agarosa/D-manitol se puede eludir imprimiendo la biotinta CNC/agarosa/D-manitol directamente en una cama de impresión enfriada para acelerar la gelificación, o sustituyendo la agarosa con alginato de sodio, que se puede extruir a temperatura ambiente y se somete a una rápida reticulación iónica con 50 mM CaCl2 en 5 min.

Este protocolo ofrece un enfoque confiable para detectar y excluir rápidamente las formulaciones de biotintas que exhiben una compatibilidad bioquímica deficiente con células inmunológicas sensibles, como los mastocitos, que no deben someterse a bioimpresión 3D de extrusión neumática. Además, este protocolo es rentable, ya que requiere cantidades relativamente bajas de células para realizar un ensayo de detección multiplexada. Por el contrario, las mezclas de células biotintadas preformuladas deben bioimprimirse a densidades celulares muy altas (>107 células / ml), lo que puede resultar costoso y lento para realizar un ensayo de detección de biocompatibilidad, especialmente cuando se cultivan células primarias que dependen de costosos factores de crecimiento recombinantes.

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Disclosures

Este trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional de Investigación de Canadá y Alberta Innovates.

Acknowledgments

Agradecemos a Alberta Innovates por proporcionar el CNC y a Ken Harris y Jae-Young Cho por su asesoramiento técnico al preparar la matriz CNC/agarosa/D-manitol. También agradecemos a Ben Hoffman, Heather Winchell y Nicole Diamantides por su asesoramiento técnico y apoyo con la configuración y calibración de la bioimpresora 3D INKREDIBLE+.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A
Acetic Acid (glacial) Sigma Aldrich AX0074-6
Agarose (OmniPur) EMD Millipore Corporation 2125-500GM
Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm) Thermo Fisher Scientific 17-4888-82
B
b-Mercaptoethanol Fisher Scientific O3446I-100
b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD) Sigma Aldrich N0632-5G
BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip) BD 309646
BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in BD 305111
BioLite 24 Well Multidish Thermo Fisher Scientific 930-186
BioLite 96 Well Multidish Thermo Fisher Scientific 130-188
BioLite 175 cm2 Flask Vented Thermo Fisher Scientific 130-191
Biosafety Cabinet Class II Microzone Corp., Canada BK-2-6-B3
BSA, Fraction V (OmniPur) EMD Millipore Corporation 2930-100GM
C
C57BL/6 mice The Jackson Laboratory 000664
CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8) Thermo Fisher Scientific 12-1171-82
CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge) CELLINK LLC IK1020000303
CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent - Sterile Bottle 1 x 60 mL CELLINK LLC CL1010006001
CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps CELLINK LLC CSC0103000102
CELLINK HeartWare for PC CELLINK LLC Version 2.4.1
CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER CELLINK LLC S-10003-001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G CELLINK LLC NZ4220005001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G CELLINK LLC NZ4250005001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G CELLINK LLC NZ4270005001
Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche) Sigma Aldrich 11465015001
Centrifuge (Benchtop) Eppendorf 5804R
Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate Sigma Aldrich CLS3370
CO2 Incubator Binder GmbH, Germany 9040-0113
CytoFLEX Flow Cytometer Beckman Coulter A00-1-1102
D
D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem) Fisher Scientific 44-390-7100GM
F
Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile Corning 352095
Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile Corning 352070
FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1) Thermo Fisher Scientific 17-5898-82
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated Thermo Fisher Scientific 12484028
FlowJo Software Becton Dickinson & Co. USA Version 10.6.2
G
GraphPad Prism GraphPad Software, LLC Version 8.4.3
H
Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy) VWR 15170-208
HEPES Sodium Salt Fisher Scientific BP410-500
I
Iodonitrotetrazolium chloride (INT) Sigma Aldrich I10406-5G
L
L-Glutamine 200 mM (Gibco) Thermo Fisher Scientific 25030-081
Lithium L-lactate Sigma Aldrich L2250-100G
M
MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco) Thermo Fisher Scientific 11140-050
1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS) Sigma Aldrich M8640
Microtubes (1.7 mL clear) Axygen MCT-175-C
Microtubes (2.0 mL clear) Axygen MCT-200-C
MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water) Millipore ZMQS60001
N
Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL) Thermo Fisher Scientific 566-0020
Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm) Thermo Fisher Scientific 725-2520
P
Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco) Thermo Fisher Scientific 15140-122
PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco)  Thermo Fisher Scientific 10010-023
Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen)  Thermo Fisher Scientific P3566
R
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5) Thermo Fisher Scientific 12-4031-82
Recombinant Murine IL-3 PeproTech, Inc.  213-13
RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone) GE Healthcare SH30027.01
S
Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001) Fisher Scientific NC9913213
Sodium Azide, 500 g Fisher Scientific BP922I-500
Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco) Thermo Fisher Scientific 11360-070
T
Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) Sigma Aldrich 252859
Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy) Sigma Aldrich 93595
V
VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020) Thermo Fisher Scientific VLBL00D0

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References

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Bioingeniería Número 171
Fabricación de una tinta de biomaterial de agarosa incrustada en nanocelulosa cristalina para el cultivo de mastocitos derivados de la médula ósea
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Karamchand, L., Wagner, A., Alam, S. … More

Karamchand, L., Wagner, A., Alam, S. B., Kulka, M. Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture. J. Vis. Exp. (171), e62519, doi:10.3791/62519 (2021).

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