Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

قياس معدل دوران الدهون الغشائية باستخدام التناظرية الفلورية الحساسة للأس الهيدروجيني ND6

Published: July 29, 2021 doi: 10.3791/62717
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 3, 3, 1,2
1The Brain Institute at Florida Atlantic University, 2Department of Biomedical Sciences, Florida Atlantic University, 3Department of Chemistry and Biochemistry, Florida Atlantic University

Summary

يقدم هذا البروتوكول طريقة تصوير مضان تستخدم فئة من الفلوروفورات الدهنية الحساسة لدرجة الحموضة لمراقبة الاتجار بالغشاء الدهني أثناء الإخراج الخلوي للخلايا ودورة التداخل الخلوي.

Abstract

Exo- / endocytosis هي عملية شائعة تتوسط في تبادل الجزيئات الحيوية بين الخلايا وبيئتها وبين الخلايا المختلفة. تستخدم الخلايا المتخصصة هذه العملية لتنفيذ وظائف الجسم الحيوية مثل إفراز الأنسولين من الخلايا β وإطلاق الناقل العصبي من المشابك الكيميائية. نظرا لأهميته الفسيولوجية ، كان exo-/ endocytosis أحد أكثر الموضوعات التي تمت دراستها في بيولوجيا الخلية. تم تطوير العديد من الأدوات لدراسة هذه العملية على مستوى الجينات والبروتين ، والتي بسببها يعرف الكثير عن آلية البروتين المشاركة في هذه العملية. ومع ذلك ، فقد تم تطوير عدد قليل جدا من الطرق لقياس معدل دوران الدهون الغشائية ، وهو الأساس المادي للخارج / البطانة الخلوية.

تقدم هذه الورقة فئة من نظائر الدهون الفلورية الجديدة التي تظهر مضان يعتمد على الأس الهيدروجيني وتوضح استخدامها لتتبع إعادة تدوير الدهون بين غشاء البلازما والحويصلات الإفرازية. بمساعدة التلاعب البسيط بالأس الهيدروجيني ، تسمح هذه النظائر أيضا بالقياس الكمي لتوزيع الدهون عبر السطح ومقصورات الغشاء داخل الخلايا ، بالإضافة إلى قياس معدل دوران الدهون أثناء التداخل الخلوي الخارجي. سيكون هؤلاء المراسلون الجدد للدهون موضع اهتمام كبير لمختلف مجالات البحث البيولوجي مثل بيولوجيا الخلية وعلم الأعصاب.

Introduction

الطبقة الثنائية الدهنية هي واحدة من أكثر مجموعات الجزيئات الحيوية شيوعا ولا غنى عنها لجميع الخلايا. الخلايا الخارجية ، فإنه يشكل الخلايا التي تربط غشاء البلازما وبيئتها. داخل الخلايا ، فإنه يقسم عضيات مختلفة متخصصة في وظائف معينة. بدلا من أن تكون الأغشية الدهنية ديناميكية أكثر من كونها ثابتة ، فإنها تشهد باستمرار الاندماج والانشطار ، مما يتوسط في نقل المواد الحيوية ، وإصلاح العضيات ، وتغيير التشكل ، والاتصال الخلوي. مما لا شك فيه أن الغشاء الدهني هو الأساس المادي لجميع العمليات الخلوية تقريبا ، ويلعب اختلاله الوظيفي دورا حاسما في اضطرابات مختلفة تتراوح من السرطان1 إلى مرض الزهايمر2. على الرغم من أن جزيئات الدهون أقل تنوعا بكثير من البروتينات ، إلا أن أبحاث الأغشية حتى الآن كانت تتمحور بشكل أساسي حول البروتين. على سبيل المثال ، يعرف الكثير عن آلات البروتين أكثر من الدهون في الإخراج الخلوي3،4،5. علاوة على ذلك ، فإن تنظيم وتوزيع وديناميكيات وتوازن الدهون عبر الأغشية السطحية وداخل الخلايا لا تزال غير مستكشفة إلى حد كبير مقارنة بالبروتينات الغشائية6.

هذا ليس مفاجئا لأن تقنيات البيولوجيا الجزيئية الحديثة ، مثل الطفرات ، توفر ميزة منهجية لدراسة البروتينات بدلا من الدهون. على سبيل المثال ، يسهل وضع العلامات المعدلة وراثيا للبروتين الفلوري الأخضر الحساس للأس الهيدروجيني (المعروف أيضا باسم pHluorin) إلى البروتينات الحويصلية القياس الكمي لكمية ومعدل دوران البروتين الحويصلي أثناء الإخراج الخلوي / التداخلالخلوي 7،8،9. ومع ذلك ، يكاد يكون من المستحيل تعديل الدهون الغشائية وراثيا في الجسم الحي. علاوة على ذلك ، فإن التلاعب النوعي وحتى الكمي بكميات البروتين وتوزيعاته أكثر جدوى من تلك الموجودة في الدهون10. ومع ذلك ، تم عزل الدهون الفلورية الأصلية والاصطناعية وتطويرها لمحاكاة الدهون الغشائية الداخلية في المختبر وفي الجسم الحي11. مجموعة واحدة من الدهون الفلورية المستخدمة على نطاق واسع هي أصباغ الستيريل ، على سبيل المثال ، FM1-43 ، والتي تظهر مضان معزز بالغشاء وهي أداة قوية في دراسة إطلاق الحويصلة المشبكية (SV) في الخلايا العصبية12. في الآونة الأخيرة ، تم اختراع أصباغ دهنية حساسة للبيئة واستخدامها على نطاق واسع كفئة جديدة من المراسلين لدراسة خصائص غشاء الخلية المختلفة ، بما في ذلك إمكانات الغشاء11 ، وترتيب الطور13 ، والإفراز14.

تم تطوير فئة جديدة من محاكيات الدهون التي يكون مضانها حساسا لدرجة الحموضة (على سبيل المثال ، pHluorin) وحساسا للغشاء (على سبيل المثال ، FM1-43) لقياس توزيع الدهون مباشرة في غشاء البلازما والإندوسومات / الليزوزومات وحركة الدهون أثناء الإخراج الخلوي / البطانة الداخلية. تم اختيار فلوروفورات solvatochromic المعروفة التي تظهر خصائص الدفع والسحب بسبب نقل الشحنة داخل الجزيئات لهذا الغرض. من بين الفلوروفورات الحلفاتوكرومية الموجودة ، فإن سقالة 1،8-naphthalimide (ND) سهلة التعديل نسبيا ، ومتعددة الاستخدامات لوضع العلامات ، وهي فريدة من نوعها في الفيزياء الضوئية15 ، وبالتالي تم استخدامها في مقحمات الحمض النووي ، والثنائيات العضوية الباعثة للضوء ، وأجهزة استشعار الجزيئات الحيوية16،17،18.

يؤدي ربط مجموعة مانحة للإلكترون بموضع C4 لسقالة ND إلى توليد هيكل دفع وسحب ، مما يؤدي إلى زيادة عزم ثنائي القطب عن طريق إعادة توزيع كثافة الإلكترون في الحالة المثارة19,20. ينتج عن نقل الشحنة داخل الجزيئات عوائد كمية كبيرة وتحولات ستوكس ، مما يؤدي إلى مضان ساطع ومستقر21. طورت هذه المجموعة مؤخرا سلسلة من نظائر الدهون المذابة على أساس سقالة ND وحصلت عليها بإنتاجية اصطناعية جيدة20.

يظهر التوصيف الطيفي أنه من بين هذه المنتجات ، يمتلك ND6 أفضل خصائص مضان (الشكل 1)20. أولا ، لديها قمم إثارة وانبعاث منفصلة جيدا (أي ~ 400 نانومتر و ~ 520 نانومتر ، على التوالي ، في الشكل 2A ، B) مقارنة بالفلوروفورات الشائعة مثل الفلوريسئين أيزوثيوسيانات أو رودامين أو GFP ، مما يجعلها قابلة للفصل الطيفي عنها وبالتالي فهي مفيدة للتصوير متعدد الألوان. ثانيا ، يظهر مضان ND6 زيادة بأكثر من ثمانية أضعاف في مضانه في وجود المذيلات (الشكل 2C) ، مما يشير إلى اعتماد قوي على الغشاء. أظهرت دراسات التصوير الفلوري السابقة للخلايا الحية مع أنواع مختلفة من الخلايا تلطيخا غشائيا ممتازا بواسطة ND620. ثالثا ، عندما ينخفض الرقم الهيدروجيني للمحلول من 7.5 (يوجد عادة في البيئات خارج الخلية أو الخلوية) إلى 5.5 (يوجد عادة في الإندوسومات والليزوزومات) ، يظهر ND6 زيادة بمقدار الضعف تقريبا في التألق (الشكل 2 د) ، مما يدل على حساسية الأس الهيدروجيني. علاوة على ذلك ، تشير محاكاة الديناميات الجزيئية إلى أن ND6 يندمج بسهولة في طبقة الدهون المزدوجة مع سقالة ND التي تواجه خارج الغشاء وبقايا البيبيرازين التي تظهر تفاعلات قوية مع مجموعات رأس الفوسفوليبيد (الشكل 3). إجمالا ، تجعل هذه الميزات ND6 نظيرا مثاليا للدهون الفلورية لتصور وقياس معدل دوران الدهون الغشائية أثناء الإخراج الخلوي / التداخل الخلوي.

يقدم هذا البحث طريقة لدراسة معدل دوران وديناميكيات الدهون SV باستخدام الخلايا العصبية الحصين للفأر المستزرعة. من خلال تحفيز الخلايا العصبية باستخدام محاليل K + Tyrode العالية ، تم تحميل SVs وغشاء البلازما ب ND6 (الشكل 4A ، B). بعد ذلك ، تم إعادة تحفيز الخلايا العصبية بمحفزات مختلفة تليها محاليل التيرود المحتوية على NH4Cl و pH 5.5 (الشكل 4D). يسهل هذا البروتوكول القياس الكمي لمعدلات الإخراج الخلوي والخلوي المجمعة في ظل ظروف مختلفة (الشكل 4C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يتضمن البروتوكول التالي (1) إجراء مبسطا لإنشاء حصن فأر وثقافات قشرية بناء على بروتوكول راسخ22 ، (2) مقدمة موجزة لإعداد مجهر التألق للخلايا العصبية الحية ، (3) وصف مفصل لتحميل وتصوير ND6 في الخلايا العصبية للفأر ، (4) مناقشة حول القياس الكمي لتهريب الغشاء بواسطة إشارة ND6. تتبع جميع الإجراءات إرشادات السلامة الأحيائية و IACUC في جامعة فلوريدا أتلانتيك. تم وصف توليف ND6 سابقا20.

1. إعداد الحصين الفأر والثقافات القشرية

ملاحظة: إذا لم يتم تحديد خلاف ذلك ، يجب تنفيذ جميع الخطوات في غطاء التدفق الصفحي من المستوى 2 للسلامة البيولوجية. تعقيم جميع الأدوات والمواد.

  1. استخدم حجم 5 ملقط لوضع أغطية زجاجية في ألواح استزراع متعددة الآبار.
    ملاحظة: على سبيل المثال ، تعتبر اللوحة ذات 24 بئرا مثالية لأغطية الغطاء مقاس 12 مم Equation 1 .
  2. أضف الحجم المناسب من المصفوفات خارج الخلية لتغطية سطح زراعة الخلية (على سبيل المثال ، 75 ميكرولتر من محلول مصفوفة الغشاء القاعدي لكل غطاء 12 مم Equation 1 ؛ انظر جدول المواد)
  3. ضع الألواح المحضرة في حاضنة زراعة الأنسجة (5٪ CO2 ، رطوبة 100٪ ، و 37 درجة مئوية) لمدة 1-4 ساعات للسماح بتشابك مصفوفة الغشاء القاعدي.
  4. التضحية بالحيوانات ، وفتح الجمجمة ، ونقل الدماغ كله إلى طبق بتري 35 مم مع 3 مل من محلول الملح المتوازن هانك (HBSS) الذي يحتوي على 20٪ مصل بقري جنيني (H + 20). قطع الدماغ على طول خط الوسط ، وفصل القشرة والحصين في غطاء تشريح التدفق الصفحي لتقليل التلوث.
  5. استخدم المقص الدقيق لتقطيع الأنسجة إلى قطع صغيرة (~ 1 مم3). انقل هذه الأنسجة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من H + 20.
  6. اغسل المناديل ثلاث مرات باستخدام 5 مل من H + 20 وثلاث مرات باستخدام 5 مل من HBSS.
  7. يضاف 1.5 مل من 1٪ تربسين مع حمض رباعي الخليك إيثيلين ديامين ويحتضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لهضم الإنزيم.
  8. كرر الخطوة 1.6 واستخدم الفراغ لاستنشاق HBSS في النهاية.
  9. فصل الأنسجة ميكانيكيا في 1 مل من HBSS يحتوي على 2.95 جم / لتر MgSO4 • 7H2O باستخدام ماصة زجاجية مصقولة بالنار.
  10. جهاز طرد مركزي تعليق الخلية عند 400 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  11. نضح المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في حجم مناسب من وسائط الاستزراع للحصول على تركيز ~ 10,000,000 خلية / مل.
  12. قم بطلاء الخلايا عند ~ 1,000,000 خلية / سم2 وضع الثقافة في الحاضنة (5٪ CO2 ، رطوبة 100٪ ، و 37 درجة مئوية) لمدة 1-4 ساعات لتسهيل ارتباط الخلية بأغطية الزجاج.
  13. أضف حجما مناسبا من وسط الاستزراع (على سبيل المثال ، 1 مل لكل بئر للوحة 24 بئر). أضف نفس الحجم من وسط الثقافة بعد 1 أسبوع. بعد 2 أسابيع ، استبدل نصف الوسط الثقافي الحالي بوسائط جديدة كل أسبوع.

2. إعداد المجهر لتصوير مضان الخلايا الحية

ملاحظة: يتضمن إعداد التصوير المثالي (الشكل 5) مجهرا مضانا مقلوبا على الأقل (انظر جدول المواد) ، ومصدر ضوء مضان مع مصراع تلقائي ، ومجموعات مرشحات مضان (على سبيل المثال ، للتصوير ND6 ، استخدم 405/10 BP للإثارة ، و 495 LP لثنائي اللون ، و 510/20 BP للانبعاثات) ، وكاميرا عالية الحساسية (جدول المواد) ، وكلها يتم التحكم فيها بواسطة برنامج الحصول على الصور (جدول المواد).

  1. قم بإعداد غرفة تصوير تسمح بالتحكم في درجة الحرارة وإدخال / إخراج المحلول للتصوير الفلوري للخلايا الحية.
    ملاحظة: على سبيل المثال ، تم استخدام غرفة تصوير معدلة في الحمام المفتوح مثبتة على منصة تدفئة في هذا البروتوكول (الشكل 6).
  2. قم بإعداد جهاز قابل للبرمجة لتبديل حلول التروية وتوصيل التحفيز الكهربائي في نقاط زمنية محددة أثناء التصوير.
    ملاحظة: تعد مزامنة الأجهزة والبرامج ضرورية للتحليلات الكمية (الشكل 7). على سبيل المثال ، في هذا البروتوكول ، تم استخدام إخراج الزناد من كاميرا التصوير لبدء برنامج كمبيوتر يتحكم في جهاز تبديل تلقائي ، والذي يتحكم في نظام نضح متعدد القنوات ومحفز نبض مربع.
  3. للمشاركة في تصوير اثنين أو أكثر من مراسلي الفلورسنت ، قم بإجراء تصوير مضان متعدد القنوات إما عن طريق تبديل مجموعات المرشحات بالتتابع أو عن طريق تقسيم انبعاثات مضان مختلفة في نفس الوقت والعرض على نفس الكاميرا.

3. تحميل وتصوير ND6 في الثقافات العصبية

  1. وزن كمية مناسبة من ND6 ، قم بحلها في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، واتركها تذوب في درجة حرارة الغرفة ؛ سونيكات لفترة وجيزة (على سبيل المثال ، 3 دقائق). قم بتصفية محلول المخزون الخام باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر لإزالة مجاميع الأصباغ الكبيرة. بعد الترشيح ، حدد تركيز الصبغة بواسطة التحليل الطيفي للامتصاص عند 405 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي التقليدي أو microvolume باستخدام ε = 10700 M-1 cm-1.
  2. قبل التطبيق ، قم بتخفيف محلول المخزون إلى تركيز 1 ميكرومتر باستخدام محلول الحمام. حافظ على محلول المخزون في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  3. وضع العلامات على الإندوسومات والحويصلات المشبكية
    1. لتسمية مقصورات الغشاء الداخلي في كل مكان مثل الإندوسومات ، أضف محلول مخزون ND6 (على سبيل المثال ، 1 mM في DMSO) إلى وسط الاستزراع عند التركيز النهائي 1 μM ، واحتضان عند 5٪ CO2 ، رطوبة 100٪ ، و 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. لتقليل مدى وضع العلامات على SV ، قم بقمع النشاط العصبي التلقائي دوائيا. على سبيل المثال ، استخدم tetrodotoxin لمنع جهود الفعل أو 2،3-dioxo-6-nitro-1،2،3،4-رباعي هيدروبنزو [f] كينوكسالين -7-سلفوناميد (NBQX) و D- (-) -2-أمينو-5-حمض فوسفونوبنتانويك (D-AP5) لتثبيط انتقال الإثارة23.
    2. لتسمية SVs بشكل انتقائي ، استخدم تحفيزا قصيرا ولكن قويا لاستحضار exo- / endocytosis قبل المشبكي. أولا ، انقل غطاء (سلات) الاستزراع إلى طبق بتري 35 مم Equation 1 يحتوي على 2 مل من محلول Tyrode العادي في درجة حرارة الغرفة. ثانيا ، قم بتخفيف محلول مخزون ND6 في محلول Tyrode عالي K + (90 mM KCl) عند التركيز النهائي البالغ 1 ميكرومتر. ثالثا ، استبدل محلول Tyrode العادي في طبق Petri بمحلول Tyrode عالي K + يحتوي على ND6 واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
  4. انقل ثقافة الخلايا التي تحمل علامة ND6 إلى غرفة التصوير المليئة بمحلول Tyrode العادي المسخن مسبقا الذي يحتوي على 10 μM NBQX و 10 μM D-AP5.
  5. اضبط سرعة التروية على ~ 0.2 مل / ثانية (أي 1 قطرة في الثانية) وابدأ نضح محلول Tyrode العادي المسخن مسبقا الذي يحتوي على NBQX و D-AP5 لإزالة ND6 الزائد في الثقافة.
  6. اضبط التركيز وحدد مجال الرؤية المناسب الذي يحتوي على خلايا عصبية صحية ومنتشرة جيدا تحمل خلايا عصبية متصلة. تجنب المناطق التي تحتوي على غرويات صبغية لم يتم حلها.
  7. جرب تصوير الخلايا المحملة ب ND6 بأوقات تعرض مختلفة لتحديد أفضل إعدادات التصوير.
    ملاحظة: للحصول على أفضل وقت للتعريض ، تكون أعلى كثافة مضان بكسل في الصورة الناتجة حوالي نصف نطاق البت (على سبيل المثال ، بالنسبة لصورة 16 بت ، يكون نطاق البت من 0 إلى 65535) ، مما سيسمح بزيادة أخرى في التألق عند تطبيق محلول الحمام الحمضي. يجب استخدام وقت التعرض المحدد لجميع صور ND6.
  8. قم بإعداد بروتوكول التحفيز والتروية والفاصل الزمني للإطار والمدة الإجمالية. على سبيل المثال ، في البروتوكول التالي ، استخدم خط أساس 30 ثانية ، وتحفيز المجال الكهربائي 10 ثوان 30 هرتز ، واسترداد 50 ثانية ، و 120 ثانية 90 مللي متر K + ، واسترداد 60 ثانية ، ومحلول تيرود 60 ثانية مع 50 مللي متر NH4Cl ، ومحلول Tyrode 60 s عند الرقم الهيدروجيني 5.5 ، وفاصل إطار 3 ثوان.
  9. ابدأ في الحصول على الصورة مصحوبا بالتحفيز والتروية المتزامنين. مراقبة المحاكاة وتبادل الحلول أثناء التصوير.
  10. أوقف التروية بعد انتهاء التصوير ، وقم بإزالة غطاء الغطاء ، ونظف حجرة التصوير للتجربة التالية.

4. القياس الكمي للاتجار بالأغشية عن طريق تغيير مضان ND6

  1. قم بعمل نسخة احتياطية و / أو قم بعمل نسخة إلكترونية من جميع ملفات الصور.
  2. اختر برنامج تحليل لاستخراج البيانات ، على سبيل المثال ، برنامج تحليل صور مفتوح المصدر مثل ImageJ24 و / أو FIJI25.
  3. افتح أو قم باستيراد مكدس صور إلى برنامج التحليل.
  4. قم بتعيين الصورة الأولى كمرجع وقم بمحاذاة الباقي إليها باستخدام وظائف / مكونات إضافية مثل Rigid Registration26 ، والتي ستخفف من القطع الأثرية بسبب الانجراف xy. راجع الشكل 8 على سبيل المثال الصور.
  5. متوسط جميع الصور التي تم الحصول عليها خلال 30-s قبل خط الأساس لإنتاج صورة مرجعية. احفظ نسخة من هذه الصورة للرجوع إليها في المستقبل.
  6. اضبط حد الكثافة لتوليد صورة ثنائية من الصورة ذات المتوسط الأساسي.
  7. استخدم مستجمعات المياه في ImageJ أو وظائف مماثلة في برنامج آخر لفصل الخلايا العصبية أو الخلايا المتصلة.
  8. استخدم وظيفة تحليل الجسيمات مع حجم المنطقة المناسب والدائرية لالتماس مناطق الاهتمام (ROIs) المقابلة لأغشية الخلايا أو الإندوسومات أو الجسيمات الحالة أو العروة المشبكية. احفظ جميع عائد الاستثمار المحدد.
  9. حدد أربعة عائد استثمار في الخلفية في المناطق الخالية من الخلايا داخل مجال الرؤية.
  10. قم بقياس متوسط كثافة البكسل لكل عائد استثمار في كل إطار من مكدس الصور ، وقم بتصدير النتائج للتحليل الإحصائي.
  11. احسب متوسط كثافة عائد الاستثمار في الخلفية كضوضاء خط الأساس ، والتي سيتم طرحها من متوسط كثافة البكسل لكل عائد استثمار.
  12. متوسط أعلى ثلاثة متوسط شدة لكل عائد استثمار محدد أثناء تطبيق محلول الأس الهيدروجيني 5.5 Tyrode للحصول على أقصى شدة مضان ، والتي يتم تعريفها على أنها 100٪ للتطبيع.
  13. متوسط أقل ثلاثة متوسط شدة لكل عائد استثمار محدد أثناء تطبيق 50 mM NH4Cl لتعيين الحد الأدنى من شدة التألق ، والذي يتم تعريفه على أنه 0٪ للتطبيع.
  14. احسب التغيرات النسبية في التألق لكل عائد استثمار بناء على شدته البالغة 0٪ و 100٪. اشتقاق متوسط التغييرات الفلورية ، وتغيير الحركية ، والقيم / المخططات الأخرى من بيانات عائد الاستثمار الفردية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

SVs متخصصة في إطلاق الناقل العصبي عبر exo- / endocytosis27. تحتوي SVs على تجويف شديد الحموضة (أي درجة الحموضة 5.5) ، وهو مثالي ل ND6. استخدمنا تحفيز K + العالي لاستحضار SV exo- / endocytosis من أجل السماح ل ND6 بالوصول إلى SV. من المتوقع ، ظهرت نقطة الفلورسنت الخضراء الزاهية على طول العمليات العصبية بعد التحميل (الشكل 9 أ). أظهر ملف تعريف الخط الموضح في الشكل 4B تداخلا قويا بين ND6 (المنحنى الأخضر) و FM4-64 puncta (المنحنى الأحمر). يشير الارتباط القوي بين شدة مضان ND6 و FM4-64 أيضا إلى تلطيخ SV ل ND6 (الشكل 9B).

تم استخدام التحفيز الكهربائي والتحفيز العالي K + لاستحضار إطلاق التجمع القابل للإطلاق بسهولة (RRP ، أي SVs ذات احتمالية الإطلاق العالية) و SVs للتجمع الاحتياطي (أي SVs ذات احتمالية الإطلاق المنخفضة) ، على التوالي. كانت هناك انخفاضات في مضان ND6 استجابة لكل من المحفزات (الشكل 4C والشكل 4E) ، مما يشير إلى أن ND6 موجود في غشاء SV وأن تجويف SV يتم تحييده (تم الإبلاغ عنه بواسطة انخفاض إشارة ND6) أثناء إطلاق SV.

في نهاية كل تجربة ، تم تطبيق 50 mM NH4Cl لإزالة حموضة محلول SVs28 و pH 5.5 لتفتيح غشاء السطح ND6 (الشكل 4D والشكل 4F). تسمح لنا الاختلافات في التألق بتحديد ND6 في الغشاء السطحي (~ 44٪) وغشاء SV (~ 56٪). يتطابق هذا العدد مع كسور الأغشية السطحية والأغشية SV في النهايات المحورية29 ، مما يشير إلى أن ND6 يوزع بالتساوي عبر الأغشية. علاوة على ذلك ، تسمح لنا إشارات ND6 خلال اثنين من المحفزات المختلفة واثنين من التلاعب في درجة الحموضة بتقدير أن الانفجار الكهربائي القصير حشد حوالي ~ 31٪ SVs وتحفيز K + العالي الذي تم إطلاقه ~ 70٪ من SVs المتبقية. تتطابق معدلات انخفاض مضان ND أثناء التحفيز أيضا مع ثابت الوقت للإخراج الخلوي SV المستحث الذي تم الإبلاغ عنه سابقا30.

يؤدي الحجم الصغير ل ND6 إلى اضطراب أقل بكثير في أغشية الخلايا مقارنة بطريقة وضع العلامات السابقة14 ، وبالتالي يوفر قياسا أكثر دقة للاتجار ب SV. لدعم هذه الفكرة ، لم يظهر تركيز تحميل أعلى عشر مرات أي فرق كبير في إزالة البقع FM4-64 أثناء التحفيز (الشكل 10). ومع ذلك ، لا يزال يوصى باستخدام 1μM نظرا لتلطيخه المعتدل في الخلايا النجمية.

نظرا لأن SV exo- / endocytosis يتضمن الكوليسترول (دهون وفيرة وحيوية في الأغشية العصبية) ، فقد استخدمنا تصوير ND6 لنسأل كيف يؤثر الكوليسترول الغشائي على إطلاق SV واسترجاعه. يمكن أن يؤدي 1 مللي متر لعلاج لمدة 90 دقيقة من ميثيل β سيكلودكسترين (MβCD) إلى إزالة ~ 10٪ من الكوليسترول من غشاء السطح العصبي31 ، مما يحاكي انخفاض الكوليسترول الغشائي المرتبط بالشيخوخة. تحت التحفيز الكهربائي الشامل ، قلل علاج MβCD بشكل كبير من إطلاق SV واسترجاعها الذي تم قياسه بواسطة تصوير ND6 (الشكل 11A) ، مما يشير إلى أن الكوليسترول الغشائي يسهل SV exo- / endocytosis32. قمنا أيضا بتقييم مساهمة الكوليسترول في تجديد تجمع SV ، وهو أمر بالغ الأهمية لإخلاص النقل العصبي33. تم تطبيق اثنين من التحفيز الكهربائي مع فاصل 10 ثوان في وجود بافيلوميسين A1 (BafA1). يمنع BafA1 بشكل انتقائي v-ATPase الذي يعيد تحمض SVs. من خلال منع إعادة تحمض SVs المستردة بشكل حاد ، يمنع BafA1 استعادة مضان ND6 بعد التحفيز (الشكل 11 ب). يجب أن يأتي انخفاض ND6 خلال التحفيز الثاني فقط من SVs الوليدة التي تغذي سعر التجزئة الموصى به الفارغ. بالمقارنة مع التحكم الوهمي ، لوحظت استجابة ND6 أصغر بكثير للحافز الثاني في الخلايا العصبية المعالجة مسبقا باستخدام MβCD (أي سعة أصغر واضمحلال أسرع لتقليل مضان ND6). تدعم هذه النتيجة فكرة أن الكوليسترول يلعب دورا محوريا في تجنيد SVs جديدة إلى RRP.

Figure 1
الشكل 1: مخطط التوليف العام لمسبار ND6. تم تعديل هذا الرقم من Thomas et al.20. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: خواص ND6. (أ و ب) خصائص سولفاتوكروميك ل ND6. أطياف الامتصاص (A) وأطياف التألق (B) في المذيبات المختلفة المثارة عند 405 نانومتر. (ج) مقارنة شدة مضان ND6 في الماء (أحمر) و 1٪ أوكتيل محلول جلوكوزيد عند 1 ميكرومتر. (د) يتناسب مضان ND6 كدالة للأس الهيدروجيني في محلول 1٪ OG مع حالة البروتون لمجموعة رأس البيبيرازين (محسوبة pKa = 7.4). يظهر الجزء الداخلي حالة البروتون المحسوبة ل ND6 piperazine moiety (pKa المتوقع = 8.83). يمثل الخط المتقطع القيم الملائمة. تم تعديل هذا الرقم من Thomas et al.20. الاختصارات: DCM = ثنائي كلورو ميثان. MeCN = الأسيتونيتريل. DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسيد ؛ EtOH = الكحول الإيثيلي ؛ MeOH = كحول الميثيل ؛ القيمة المطلقة = الامتصاص. Em = الانبعاث ؛ OG = أوكتيل جلوكوزيد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: لقطة من مسار محاكاة الديناميات الجزيئية. تفاعل مسبار ND6 في غشاء POPC (اللوحة اليسرى). تتفاعل مجموعة رأس البيبيرازين بقوة مع مجموعات الفوسفات (اللوحة اليمنى) من خلال التفاعلات الكهروستاتيكية. يشير السهم الأسود (اللوحة اليمنى) إلى رابطة C-N بين حلقة النفثاليميد والبيبيرازين. أظهرت النتائج أن مجموعة البيبيرازين تتحرك قليلا فقط مع تفضيل الزاوية ثنائية السطوح (الذرات الموضحة) بين 90 و 120 درجة مع الحفاظ على شكل الكرسي. تم تعديل هذا الرقم من Thomas et al.20. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: يصف ND6 الحويصلات المشبكية ويبلغ عن إطلاقها واسترجاعها في النهايات العصبية. (أ) صور نموذجية ل FM4-64 (أحمر) و ND6 (أخضر) وتراكب (أصفر). تم تحديد ملامح الخلايا العصبية والسوما لخلية عصبية واحدة. توجد صور الخط المستقيم (عرض 20 بكسل) بجوار الصور المقابلة. تشير رؤوس الأسهم إلى عروة متشابكة تحمل علامة FM4-64. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. (B) تظهر الملامح الخطية لشدة مضان FM4-64 و ND6 تشابها كبيرا. (ج) آثار عينة من تغيرات مضان ND6 في العروة المشبكية المشار إليها برؤوس الأسهم في A استجابة للمنبهات. (د) آثار عينة من التغيرات الفلورية ND6 استجابة لمحاليل NH4Cl و pH 5.5 Tyrode. (ه) تقترن إزالة تلطيخ FM4-64 مؤقتا بتغيرات شدة ND6. تم رسم البيانات كمتوسط ± S.E.M. (F) تم تقليل شدة مضان ND6 ولكن ليس شدة FM4-64 وزيادتها من خلال تطبيقات 50 mM NH4Cl و pH 5.5 Tyrode ، على التوالي. يتم رسم البيانات كمتوسط ± S.E.M. تم تعديل هذا الرقم من Thomas et al.20. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: إعداد التصوير على أساس مجهر نيكون-تاي المقلوب. المشروح هي أربعة مكونات مطلوبة للتصوير الفلوري للخلايا الحية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: إعداد التصوير بالتحفيز. تم تعديل الإعداد من غرفة Warner Instruments RC-26 ومنصة تسخين PH-1 للتحكم في درجة الحرارة وتبادل الحلول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: رسم تخطيطي لتكوينات الجهاز للحصول على الصور مع المحفزات المتزامنة وتبادل الحلول. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 8
الشكل 8: عينة من الصور توضح الخطوات الرئيسية في تحليل الصور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 9
الشكل 9: يسلط ND6 الضوء على الحويصلات المشبكية المتجمعة في المحطات قبل المشبكية. (أ) صور نموذجية FM4-64 (أحمر) و ND6 (أخضر) يتم تحميلهما بشكل مشترك عند التكبير العالي. شريط المقياس = 30 ميكرومتر. (B) مخطط التشتت ل FM4-64 و ND6 يعني شدة مضان عند نفس عائد الاستثمار المقابل للعروة المشبكية وتناسب الانحدار الخطي. ص = 0.8353 ؛ ع = 1.7 × 10-8 ؛ مجالات الرؤية N = 9 ؛ عائد الاستثمار n = 450. عتبة FM4-64 هي 1,200 au (وحدة تعسفية) و 160 au ل ND6. تم تعديل هذا الرقم من Thomas et al.20. الاختصار: عائد الاستثمار = مناطق الاهتمام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 10
الشكل 10: ND6 لا يتدخل مع SVs. (A) دوران SV الممثل ND6 (عن طريق التحفيز الكهربائي) بعد تحميل 1 أو 10 μM ND6. (ب) دوران SV المقاس FM4-64 (مع التحفيز الكهربائي). تم تعديل هذا الرقم من Thomas et al.20. اختصار: SVs = حويصلات متشابكة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 11
الشكل 11: خفض الكوليسترول يضعف دوران SV. (أ) دوران SV الممثل ND6 تحت 10 هرتز ، 120 ثانية التحفيز الكهربائي في السيطرة والخلايا العصبية المعالجة ب MβCD. (B) يمنع Bafilomycin A1 إعادة تحمض SVs المعاد تدويرها (أي عدم استعادة مضان ND6 بعد الانخفاض المستثار بالتحفيز) ويوضح بشكل أكبر تأثير MβCD على تجديد SV. تم تعديل هذا الرقم من Thomas et al.20. اختصار: SV = حويصلة متشابكة ؛ MβCD = ميثيل β-سيكلودكسترين ؛ BafA1 = بافيلوميسين A1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

منذ فترة طويلة تستخدم الأصباغ القائمة على الدهون ، مثل 1،1′-dioctadecyl-3،3،3′،3′-tetramethylindocarbocyanine (DiI) و 3،3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) ، لتوضيح مورفولوجيا الخلية وتتبع العمليات الخلوية مثل الإسقاطات المحورية للخلايا العصبية. تم اختراع أصباغ الستيريل ، مثل FM1-43 ، واستخدامها بنجاح لدراسة الإخراجالخلوي 34. نظرا لتقاربها الغشائي المنخفض ، فإنها تقوم بشكل انتقائي بتسمية الحويصلات الداخلية حيث يتم احتجازها بينما يتم غسل الأصباغ المتبقية على غشاء البلازما عن طريق التروية المستمرة. على هذا النحو ، فإن أصباغ الستيريل ليست مناسبة للمراقبة المستمرة لإعادة تدوير الحويصلة.

جعل الاختراع الأخير ل GFP الحساس للأس الهيدروجيني (أي pHluorin) من الممكن تصور إعادة تدوير الحويصلة بشكل متكرر عند وضع علامة على بروتين غشاء حويصلي مثل VAMPII أو Synaptophysin35. باتباع نفس المبدأ ، فإن وضع علامات على الفلوروفور الحساس لدرجة الحموضة لجزيئات الدهون يتيح تتبع إعادة تدوير الغشاء الدهني خلال دورات exo- / endocytosis14. في هذه الحالة ، كونه كيانا واحدا من الدهون ، فإن ND6 أسهل في التحضير ، وأسهل في التطبيق ، وأكثر كفاءة في تسمية الأغشية الدهنية ، وأقل تعطيلا للخلايا ، وأكثر استقرارا في البقاء في أغشية الخلايا ، وبالتالي أكثر موثوقية للتصوير الفلوري. يسمح اعتماده على الغشاء وحساسية الأس الهيدروجيني العكسية بتلطيخ أكثر إشراقا للعضيات الحمضية مثل SVs والإندوسومات.

علاوة على ذلك ، من الممكن أيضا تسمية هذه العضيات الحمضية أو المحطات قبل المشبكية في الأنسجة مثل شرائح الحصين حيث يتم إخماد ND6 الموزع بشكل غير محدد بواسطة درجة حموضة محايدة في المساحات خارج الخلية أو الخلوية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تحول Stokes الكبير يجعل ND6 مثاليا للتصوير متعدد الفوتونات للأنسجة العميقة. لذلك ، يسمح ND6 وغيره من الفلوروفورات القائمة على الدهون الحساسة لدرجة الحموضة بالقياس البصري في الوقت الفعلي لتهريب الدهون وغشاء الخلية بين غشاء البلازما والجهاز داخل الخلايا مثل SVs و endosomes لجولات متعددة من exo- / endocytosis. بالنظر إلى أن نقاط الاشتباك العصبي و SVs حيوية للنقل العصبي ، فإن ND6 مفيد بلا شك لدراسة علم وظائف الأعضاء المشبكي.

بالنظر إلى التصميم المعياري لهذه النظائر الدهنية ، فمن الممكن اقتران ND بالدهون الأخرى ، مثل الفوسفوليبيدات والدهون السفينغوبية ، في أنواع مختلفة من أغشية الخلايا أو العضيات. علاوة على ذلك ، يمكن استبدال مجموعات ND بفلوروفورات أخرى حساسة للبيئة للكشف عن العوامل البيئية الأخرى مثل تركيز الكالسيوم أو الزنك داخل أو خارج الخلايا أو العضيات. علاوة على ذلك ، يمكن ربط الفلوروفورات ذات أطياف الانبعاث المختلفة بالدهون الغشائية لتوسيع لوحة مراسلي الدهون. لكل هذه التعديلات ، يمكن تعديل الرابط بين الدهون و ND أو مجموعات الفلورسنت الأخرى لتحقيق خصائص أفضل للصور و / أو الحساسيات المطلوبة.

يصف هذا البروتوكول استخدام ND6 في تصور دوران SV باستخدام تصوير الخلايا الحية. تشمل الخطوات الحاسمة التحميل والتحفيز المتزامن والقياس الكمي الفلوري ، وكلها تؤثر بشكل كبير على جودة النتائج. علاوة على ذلك ، يمكن تعديل المعلمات / الإعدادات المستخدمة في تلك الخطوات وفقا لاحتياجات الدراسة. على سبيل المثال ، يمكن تعديل التحفيز أثناء التحميل (مدة أقصر أو أطول) للسماح بالوصول إلى مجموعات مختلفة من SVs (تجمعات ذات احتمالات عالية أو منخفضة قابلة للنشر ، على التوالي). بالنسبة للتصوير الفلوري للخلايا الحية ، من المهم تحقيق توازن بين صحة الخلية وشدة التألق ، وهو أمر مهم بشكل خاص هنا. وذلك لأن إثارة ND6 قريبة من الأشعة فوق البنفسجية (أي 405 نانومتر) ، والتي يمكن أن تسبب سمية ضوئية وانهيار صبغة أكثر من الضوء المرئي. وبالتالي ، من المهم ضبط قوة الإثارة ووقت التعرض ومعدل الإطارات ومدة التصوير لتقليل التلف الضوئي وزيادة جودة الإشارة.

ND6 هو مسبار مثير جدا للاهتمام. جعل تحولها الكبير في Stokes من الممكن استخدامه في وقت واحد مع أصباغ الغشاء الأخرى مثل FM4-6420. والأهم من ذلك ، أنه مرشح متبرع مناسب لنقل طاقة الرنين الفلوري (FRET) ويمكن أن يكون متحمسا بالضوء الأرجواني ، والذي سيكون أقل احتمالا بكثير لإثارة متلقي FRET بشكل مشترك. الأصباغ المحاكية للدهون ، مثل ND6 ، تجعل من الممكن دراسة التفاعلات بين البروتينات الغشائية والدهون أثناء الإخراج الخلوي / التداخل الخلوي. سيتم تضخيم الارتباط المعتمد على الأس الهيدروجيني والتفكك بين البروتينات الغشائية والدهون في التجويف الحمضي ل SVs أو endosomes ، مما يسهل استكشاف دور الدهون الغشائية في الفرز الخلوي بوساطة المستقبلات. باختصار ، يمكن ل ND6 ومشتقاته توسيع صندوق الأدوات بشكل كبير لدراسة الدهون الغشائية والاتجار بها في الخلايا الحية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل منحة مكتب جامعة فلوريدا أتلانتيك للأبحاث والاستفسار الجامعي (M.J.S.) ، ومنحة وزارة الصحة في فلوريدا Ed and Ethel Moore Pilot Grant 20A17 (QZ) ، ومنحة جمعية الزهايمر AARG-NTF-19-618710 (QZ) ، ومنحة NIA R21 AG061656-01A1 (Q.Z.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digidata 1440A Data Acquistion System Molecular Devices Digidata 1440A For synchronized stimulation and solution exchange
Dual Channel Temperature Controller Warner Instruments TC-344B For live-cell imaging
Fetal Bovine Serum OMEGA Scientific FB-01 For making H+20 solution used in dissection and tissue culture
Hamamatsu Flash4.0 sCOMS camera Hamamatsu Inc. C13440-20CU high-sensitivity camera
Hank's Balanced Salt Solution Sigma H6648 For making H+20 solution used in dissection and tissue culture
Heated Platform Warner Instruments PH-1 For live-cell imaging
Matrigel BD Biosciences 354234 For tissue culture
Micro-G Vibration Isolation Table TMC 63-564 For live-cell imaging
Micro-manager https://micro-manager.org/ NA For image acquisition control
Multi-Line In-Line Solution Heater Warner Instruments SHM-6 For live-cell imaging
Neurobasal Plus Medium THermoFisher Scientific A3582901 For tissue culture
Nikon Ti-E Inverted Microscope Nikon Ti-E/B For live-cell imaging
ORCA-Flash4.0 Digital CMOS camera Hamamatsu C1340-20CU For live-cell imaging
Perfusion Chamber Warner Instruments RC-26G For live-cell imaging
Six-Channel Valve Control Perfusion System Warner Instruments VC-6 For solution exchange
Square Pulse Stimulator Grass Instrument SD9 For electric field stimulation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Polo, S., Pece, S., Di Fiore, P. P. Endocytosis and cancer. Current Opinion in Cell Biology. 16 (2), 156-161 (2004).
  2. Eckert, G. P., Wood, W. G., Muller, W. E. Lipid membranes and beta-amyloid: a harmful connection. Current Protein and Pept Science. 11 (5), 319-325 (2010).
  3. Augustine, G. J., Burns, M. E., DeBello, W. M., Pettit, D. L., Schweizer, F. E. Exocytosis: proteins and perturbations. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 36, 659-701 (1996).
  4. Ammar, M. R., Kassas, N., Chasserot-Golaz, S., Bader, M. F., Vitale, N. Lipids in regulated exocytosis: what are they doing. Frontiers in Endocrinology. 4, 125 (2013).
  5. Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112 (4), 519-533 (2003).
  6. Chabanon, M., Stachowiak, J. C., Rangamani, P. Systems biology of cellular membranes: a convergence with biophysics. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 9 (5), 1386 (2017).
  7. Prosser, D. C., Wrasman, K., Woodard, T. K., O'Donnell, A. F., Wendland, B. Applications of pHluorin for quantitative, kinetic and high-throughput analysis of endocytosis in budding yeast. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54587 (2016).
  8. Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nature Protocols. 1 (6), 2970-2978 (2006).
  9. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  10. Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  11. Demchenko, A. P., Mély, Y., Duportail, G., Klymchenko, A. S. Monitoring biophysical properties of lipid membranes by environment-sensitive fluorescent probes. Biophysical Journal. 96 (9), 3461-3470 (2009).
  12. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 77-83 (2012).
  13. Gaus, K., Zech, T., Harder, T. Visualizing membrane microdomains by Laurdan 2-photon microscopy. Molecular Membrane Biology. 23 (1), 41-48 (2006).
  14. Kahms, M., Klingauf, J. Novel pH-sensitive lipid based exo-endocytosis tracers reveal fast intermixing of synaptic vesicle pools. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 18 (2018).
  15. Zhou, L., Xie, L., Liu, C., Xiao, Y. New trends of molecular probes based on the fluorophore 4-amino-1,8-naphthalimide. Chinese Chemical Letters. 30 (10), 1799-1808 (2019).
  16. Tomczyk, M. D., Walczak, K. Z. l,8-Naphthalimide based DNA intercalators and anticancer agents. A systematic review from 2007 to 2017. European Journal of Medicinal Chemistry. 159, 393-422 (2018).
  17. Ulla, H., et al. Blue emitting 1,8-naphthalimides with electron transport properties for organic light emitting diode applications. Journal of Molecular Structure. 1143 (5), 344-354 (2017).
  18. Duke, R. M., Veale, E. B., Pfeffer, F. M., Kruger, P. E., Gunnlaugsson, T. Colorimetric and fluorescent anion sensors: An overview of recent developments in the use of 1,8-naphthalimide-based chemosensors. Chemical Society Reviews. 39 (10), 3936-3953 (2010).
  19. Panja, S. K., Dwivedi, N., Saha, S. Tuning the intramolecular charge transfer (ICT) process in push-pull systems: Effect of nitro groups. RSC Advances. 6 (107), 105786-105794 (2016).
  20. Thomas, D., et al. Solvatochromic and pH-sensitive fluorescent membrane probes for imaging of live cells. ACS Chemical Neuroscience. 12 (4), 719-734 (2021).
  21. Leslie, K. G., Jacquemin, D., New, E. J., Jolliffe, K. A. Expanding the breadth of 4-amino-1,8-naphthalimide photophysical properties through substitution of the naphthalimide core. Chemistry - A European Journal. 24 (21), 5569-5573 (2018).
  22. Liu, G. S., Tsien, R. W. Properties of synaptic transmission at single hippocampal synaptic boutons. Nature. 375 (6530), 404-408 (1995).
  23. Zhang, Q., Cao, Y. -Q., Tsien, R. W. Quantum dots provide an optical signal specific to full collapse fusion of synaptic vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 104 (45), 17843-17848 (2007).
  24. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  27. Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle. Annual Review of Neuroscience. 27, 509-547 (2004).
  28. Lazarenko, R. M., DelBove, C. E., Strothman, C. E., Zhang, Q. Ammonium chloride alters neuronal excitability and synaptic vesicle release. Scientific Reports. 7 (1), 5061 (2017).
  29. Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344 (6187), 1023-1028 (2014).
  30. Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nature Reviews. Neuroscience. 6 (1), 57-69 (2005).
  31. DelBove, C. E., et al. Reciprocal modulation between amyloid precursor protein and synaptic membrane cholesterol revealed by live cell imaging. Neurobiology of Disease. 127, 449-461 (2019).
  32. Dason, J. S., Smith, A. J., Marin, L., Charlton, M. P. Vesicular sterols are essential for synaptic vesicle cycling. Journal of Neuroscience. 30 (47), 15856-15865 (2010).
  33. Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms. Journal of Neuroscience. 39 (42), 8209-8216 (2019).
  34. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200 (1992).
  35. Afuwape, O. A., Kavalali, E. T. Imaging synaptic vesicle exocytosis-endocytosis with pH-sensitive fluorescent proteins. Methods in Molecular Biology. 1474, 187-200 (2016).

Tags

دوران الدهون الغشائية ، تناظرية الدهون الفلورية الحساسة لدرجة الحموضة ، ND6Exo- / endocytosis ، تبادل الجزيئات الحيوية ، الخلايا المتخصصة ، إفراز الأنسولين ، إطلاق الناقل العصبي ، أبحاث Exo-/ endocytosis ، مستوى الجينات والبروتين ، إعادة تدوير الدهون الغشائية ، غشاء البلازما ، الحويصلات الإفرازية ، توزيع الدهون ، مقصورات الغشاء داخل الخلايا ، معدل دوران الدهون ، مجالات البحث البيولوجي
قياس معدل دوران الدهون الغشائية باستخدام التناظرية الفلورية الحساسة للأس الهيدروجيني ND6
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alamgir, S., Pelletier, O. B.,… More

Alamgir, S., Pelletier, O. B., Thomas, D., Rubio, V., Stawikowski, M. J., Zhang, Q. Measuring Membrane Lipid Turnover with the pH-sensitive Fluorescent Lipid Analog ND6. J. Vis. Exp. (173), e62717, doi:10.3791/62717 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter