Summary
Detta protokoll presenterar en fluorescensavbildningsmetod som använder en klass av pH-känsliga lipidfluoroforer för att övervaka lipidmembrantrafik under cellexocytos och endocytoscykeln.
Abstract
Exo-/endocytos är en vanlig process som förmedlar utbytet av biomolekyler mellan celler och deras omgivning och mellan olika celler. Specialiserade celler använder denna process för att utföra vitala kroppsfunktioner som insulinutsöndring från β celler och frisättning av neurotransmittorer från kemiska synapser. På grund av dess fysiologiska betydelse har exo-/endocytos varit ett av de mest studerade ämnena inom cellbiologin. Många verktyg har utvecklats för att studera denna process på gen- och proteinnivå, vilket gör att mycket är känt om det proteinmaskineri som deltar i denna process. Mycket få metoder har dock utvecklats för att mäta membranlipidomsättningen, som är den fysikaliska grunden för exo-/endocytos.
Denna artikel introducerar en klass av nya fluorescerande lipidanaloger som uppvisar pH-beroende fluorescens och demonstrerar deras användning för att spåra lipidåtervinning mellan plasmamembranet och de sekretoriska vesiklarna. Med hjälp av enkla pH-manipulationer möjliggör dessa analoger också kvantifiering av lipidfördelningen över ytan och de intracellulära membranfacken, samt mätning av lipidomsättningshastigheten under exo-/endocytos. Dessa nya lipidrapportörer kommer att vara av stort intresse för olika biologiska forskningsområden som cellbiologi och neurovetenskap.
Introduction
Lipiddubbelskiktet är en av de vanligaste biomolekylsammansättningarna och är oumbärlig för alla celler. Utanför celler bildar det plasmamembranets gränssnittsceller och deras miljö; Inuti cellerna delar den upp olika organeller som är specialiserade för utsedda funktioner. Lipidmembran är mer dynamiska än stilla, men upplever ständigt fusion och fission, vilket förmedlar transport av biomaterial, organellreform, morfologiförändring och cellulär kommunikation. Utan tvekan är lipidmembranet den fysiska grunden för nästan alla cellulära processer, och dess dysfunktion spelar en avgörande roll i olika sjukdomar som sträcker sig från cancer1 till Alzheimers sjukdom2. Även om lipidmolekyler är mycket mindre varierade än proteiner, har membranforskningen hittills huvudsakligen varit proteincentrerad. Till exempel vet man mycket mer om proteinmaskineri än om lipider i exocytos 3,4,5. Dessutom är organisationen, distributionen, dynamiken och homeostasen av lipider över yt- och intracellulära membran i stort sett outforskad i jämförelse med membranproteiner6.
Detta är inte förvånande eftersom moderna molekylärbiologiska tekniker, såsom mutagenes, ger en metodologisk fördel för att studera proteiner snarare än lipider. Till exempel underlättar transgen taggning av pH-känsligt grönt fluorescerande protein (även kallat pHluorin) till vesikulära proteiner kvantitativ mätning av mängden och hastigheten på vesikulär proteinomsättning under exo-/endocytos 7,8,9. Det är dock nästan omöjligt att genetiskt modifiera membranlipider in vivo. Dessutom är kvalitativa och till och med kvantitativa manipulationer av proteinmängder och fördelningar mycket mer genomförbara än för lipider10. Icke desto mindre har nativa och syntetiska fluorescerande lipider isolerats och utvecklats för att simulera endogena membranlipider in vitro och in vivo11. En grupp av allmänt använda fluorescerande lipider är styrylfärgämnen, t.ex. FM1-43, som uppvisar membranförstärkt fluorescens och är ett kraftfullt verktyg för att studera frisättning av synaptiska vesiklar (SV) i neuroner12. På senare tid har miljökänsliga lipidfärgämnen uppfunnits och använts i stor utsträckning som en ny klass av rapportörer för att studera olika cellmembranegenskaper, inklusive membranpotential11, fasordning13 och sekretion14.
En ny klass av lipidmimetika vars fluorescens är både pH-känslig (t.ex. pHluorin) och membrankänslig (t.ex. FM1-43) utvecklades för att direkt mäta lipidfördelningen i plasmamembranet och endosomer/lysosomer och lipidtrafiken under exo-/endocytos. De välkända solvatokroma fluoroforerna som uppvisar push-pull-egenskaper på grund av intramolekylär laddningsöverföring valdes ut för detta ändamål. Bland befintliga solvatokroma fluoroforer är 1,8-naftalimid (ND) relativt lätt att modifiera, mångsidig för märkning och är unik inom fotofysik15 och har därför använts i DNA-interkalatorer, organiska lysdioder och biomolekylsensorer 16,17,18.
Att fästa en elektrondonerande grupp till C4-positionen på ND-ställningen genererar en push-pull-struktur, vilket leder till ett ökat dipolmoment genom att omfördela elektrondensiteten i det exciterade tillståndet19,20. En sådan intramolekylär laddningsöverföring ger stora kvantutbyten och Stokes-skiftningar, vilket resulterar i ljus och stabil fluorescens21. Denna grupp har nyligen utvecklat en serie solvatokroma lipidanaloger baserade på ND-ställningen och erhållit dem med goda syntetiska utbyten20.
Spektroskopisk karakterisering visar att bland dessa produkter har ND6 de bästa fluorescensegenskaperna (Figur 1)20. För det första har den väl separerade excitations- och emissionstoppar (dvs. ~400 nm respektive ~520 nm i figur 2A,B) jämfört med populära fluoroforer som fluoresceinisotiocyanat, rodamin eller GFP, vilket gör den spektralt separerbar från dem och därmed användbar för flerfärgsavbildning. För det andra uppvisar ND6-fluorescens en mer än åttafaldig ökning av dess fluorescens i närvaro av miceller (figur 2C), vilket tyder på ett starkt membranberoende. Tidigare fluorescensavbildningsstudier med levande celler med olika typer av celler visade utmärkt membranfärgning av ND620. För det tredje, när lösningens pH sänks från 7,5 (vanligt förekommande i extracellulära eller cytosoliska miljöer) till 5,5 (vanligt förekommande i endosomer och lysosomer), visar ND6 en ungefär tvåfaldig ökning av fluorescens (figur 2D), vilket visar dess pH-känslighet. Dessutom indikerar molekyldynamiksimulering att ND6 lätt integreras i lipiddubbelskiktet med dess ND-ställning vänd ut ur membranet och piperazinrester som visar starka interaktioner med fosfolipidhuvudgrupper (figur 3). Sammantaget gör dessa egenskaper ND6 till en idealisk fluorescerande lipidanalog för att visualisera och mäta membranlipidomsättning under exo-/endocytos.
Denna artikel presenterar en metod för att studera omsättningshastigheten och dynamiken hos SV-lipider med hjälp av odlade hippocampusneuroner från möss. Genom att stimulera neuroner med höga K+ Tyrodes lösningar laddades SV och plasmamembranet med ND6 (Figur 4A,B). Därefter stimulerades neuroner med olika stimuli följt av NH4Cl-innehållande och pH 5,5 Tyrodes lösningar (Figur 4D). Detta protokoll underlättar kvantitativ mätning av den sammansatta exocytos- och endocytoshastigheten under olika omständigheter (figur 4C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande protokoll innehåller (1) en förenklad procedur för att etablera hippocampus och kortikala kulturer hos möss baserat på ett väletablerat protokoll22, (2) en kort introduktion till ett epifluorescensmikroskop för levande nervceller, (3) en detaljerad beskrivning av laddning och avbildning av ND6 i musneuroner, (4) en diskussion om kvantifiering av membrantrafik med ND6-signal. Alla procedurer följer riktlinjerna för biosäkerhet och IACUC vid Florida Atlantic University. Syntesen av ND6 har beskrivits tidigare20.
1. Beredning av mus hippocampus och kortikala kulturer
OBS: Om inget annat anges måste alla steg utföras i en huv med laminärt flöde på biosäkerhetsnivå 2. Sterilisera alla verktyg och material.
- Använd en pincett i storlek 5 för att placera täckglas i odlingsplattor med flera brunnar.
OBS: Till exempel är en 24-hålsplatta idealisk för 12 mm
täckglas. - Tillsätt lämplig volym extracellulära matriser för att belägga cellodlingens yta (t.ex. 75 μl basalmembranmatrislösning per 12 mm täckglas, se materialtabellen)
- Placera de förberedda plattorna i vävnadskulturinkubatorn (5 % CO2, 100 % luftfuktighet och 37 ° C) i 1-4 timmar för att tillåta tvärbindning av basalmembranmatrisen.
- Offra djuren, öppna skallen och överför hela hjärnan till en 35 mm petriskål med 3 ml Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) som innehåller 20 % fetalt bovint serum (H+20). Skär hjärnan längs mittlinjen och separera hjärnbarken och hippocampi i en laminär flödesdissektionshuva för att minska kontamineringen.
- Använd en mikrosax för att klippa vävnaderna i små bitar (~1 mm3). Överför dessa vävnader till ett 15 ml koniskt rör som innehåller 5 ml H+20.
- Tvätta servetterna tre gånger med 5 ml H+20 och tre gånger med 5 ml HBSS.
- Tillsätt 1,5 ml 1 % trypsin med etylendiamintetraättiksyra och inkubera vid 37 °C i 10 minuter för enzymnedbrytning.
- Upprepa steg 1.6 och använd vakuum för att aspirera HBSS i slutet.
- Separera vävnaderna mekaniskt i 1 ml HBSS innehållande 2,95 g/L MgSO4•7H2O med hjälp av en eldpolerad glaspipett.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 400 × g, 4 °C i 5 min.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i en lämplig volym odlingssubstrat för att uppnå en koncentration på ~10 000 000 celler/ml.
- Platta cellerna vid ~1 000 000 celler/cm2 och placera kulturen i inkubatorn (5 % CO2, 100 % luftfuktighet och 37 ° C) i 1-4 timmar för att underlätta cellens fastsättning på glasglasen.
- Tillsätt en lämplig volym odlingsmedium (t.ex. 1 ml per brunn för en platta med 24 brunnar). Tillsätt samma mängd odlingsmedium efter 1 vecka. Efter 2 veckor, byt ut hälften av det befintliga odlingsmediet mot nya medier varje vecka.
täckglas.2. Mikroskopinställning för fluorescensavbildning av levande celler
OBS: En exemplifierande bilduppställning (Figur 5) inkluderar åtminstone ett inverterat fluorescensmikroskop (se materialtabellen), fluorescensljuskälla med automatisk slutare, fluorescensfilteruppsättningar (t.ex. för avbildning ND6, använd 405/10 BP för excitation, 495 LP för dikroik och 510/20 BP för emission) och en högkänslig kamera (Materialförteckning), som alla styrs av bildinsamlingsprogram (Materialförteckning).
- Förbered en avbildningskammare som möjliggör temperaturkontroll och in- och utmatning av lösningen för fluorescensavbildning av levande celler.
OBS: Till exempel användes en modifierad bildkammare med öppet bad fixerad på en värmeplattform i detta protokoll (figur 6). - Ställ in en programmerbar enhet för att byta perfusionslösningar och leverera den elektriska stimulansen vid definierade tidpunkter under avbildningen.
OBS: Synkronisering av hårdvara och mjukvara är nödvändig för kvantitativa analyser (Figur 7). Till exempel, i detta protokoll, användes en triggerutgång från bildkameran för att starta ett datorprogram som styr en automatisk omkopplare, som styr ett flerkanaligt perfusionssystem och en fyrkantspulsstimulator. - För att avbilda två eller flera fluorescerande rapportörer samtidigt, utför flerkanalig fluorescensavbildning antingen genom att sekventiellt byta filteruppsättningar eller genom att samtidigt dela upp olika fluorescensemissioner och projicera till samma kamera.
3. Laddning och avbildning av ND6 i neuronala kulturer
- Väg upp en lämplig mängd ND6, lös upp den i dimetylsulfoxid (DMSO) och låt den solubilisera vid rumstemperatur; ultraljudsbehandling kort (t.ex. 3 min). Filtrera råstamlösningen med ett 0,22 μm filter för att avlägsna stora färgämnen. Efter filtrering bestäms färgämneskoncentrationen genom absorptionsspektroskopi vid 405 nm med hjälp av en konventionell spektrofotometer eller mikrovolymsspektrofotometer med ε = 10 700 M-1 cm-1.
- Före applicering, späd stamlösningen till en koncentration av 1 μM med hjälp av badlösningen. Förvara stamlösningen i rumstemperatur i mörker.
- Märkning av endosomer och synaptiska vesiklar
- För att allmänt märka endocytoserade membranfack såsom endosomer, tillsätt ND6-stamlösning (t.ex. 1 mM i DMSO) till odlingsmediet vid den slutliga koncentrationen av 1 μM och inkubera vid 5 % CO2, 100 % luftfuktighet och 37 °C i 30 min. För att minska omfattningen av SV-märkning, undertryck den spontana neuronala aktiviteten farmakologiskt. Använd t.ex. tetrodotoxin för att blockera aktionspotentialer eller 2,3-dioxo-6-nitro-1,2,3,4-tetrahydrobenso[f]quinoxalin-7-sulfonamid (NBQX) och D-(-)-2-amino-5-fosfonopentansyra (D-AP5) för att hämma excitatorisk transmission23.
- För att selektivt märka SV, använd kort men stark stimulering för att framkalla presynaptisk exo-/endocytos. Överför först täckglaset till en 35 mm petriskål som innehåller 2 ml normal Tyrode-lösning vid rumstemperatur. För det andra, späd stamlösningen av ND6 i lösning med hög K+ Tyrode (90 mM KCl) vid den slutliga koncentrationen av 1 μM. För det tredje, byt ut den vanliga tyrodlösningen i petriskålen mot ND6-innehållande tyrodlösning med hög K+ -halt och inkubera i rumstemperatur i 2 minuter.
- Överför den ND6-märkta cellkulturen till avbildningskammaren fylld med förvärmd normal tyrodlösning innehållande 10 μM NBQX och 10 μM D-AP5.
- Justera perfusionshastigheten till ~0,2 ml/s (d.v.s. 1 droppe per sekund) och starta perfusionen av förvärmd normal tyrodlösning innehållande NBQX och D-AP5 för att avlägsna överskott av ND6 i kulturen.
- Justera fokus och hitta lämpligt synfält som innehåller friska och väl spridda neuroner med anslutna neuriter. Undvik områden som innehåller olösta färgkolloider.
- Prova att avbilda ND6-laddade celler med olika exponeringstider för att identifiera de bästa bildinställningarna.
OBS: För bästa exponeringstid är den högsta pixelfluorescensintensiteten i den resulterande bilden ungefär hälften av bitintervallet (t.ex. för en 16-bitarsbild är bitintervallet från 0 till 65 535), vilket möjliggör en ytterligare ökning av fluorescensen när den sura badlösningen appliceras. Den valda exponeringstiden bör användas för all ND6-avbildning. - Ställ in stimulerings- och perfusionsprotokollet, bildintervallet och den totala varaktigheten. Till exempelample, i följande protokoll, använd en 30 s baslinje, en 10 s 30 Hz elektrisk fältstimulering, 50 s återhämtning, 120 s 90 mM K+, 60 s återhämtning, 60 s Tyrodes lösning med 50 mM NH4Cl, 60 s Tyrodes lösning vid pH 5.5 och ett ramintervall på 3 s.
- Starta bildinsamlingen tillsammans med synkroniserad stimulering och perfusion. Övervaka simuleringen och lösningsutbytet under avbildningen.
- Stoppa perfusionen efter att avbildningen är klar, ta bort täckglaset och rengör avbildningskammaren för nästa försök.
4. Kvantifiering av membrantrafik genom en förändring i ND6-fluorescens
- Säkerhetskopiera och/eller gör en elektronisk kopia av alla bildfiler.
- Välj ett analysprogram för dataextraktion, t.ex. ett bildanalysprogram med öppen källkod som ImageJ24 och/eller FIJI25.
- Öppna eller importera en bildstapel till analysprogrammet.
- Ställ in den första bilden som referens och justera resten till den med hjälp av funktioner/plugins som Rigid Registration26, vilket kommer att mildra artefakter på grund av xy-drifting. Se figur 8 för exempelbilder.
- Beräkna medelvärdet för alla bilder som tagits under 30-talet före baslinjen för att skapa en referensbild. Spara en kopia av den här bilden för framtida referens.
- Ange tröskelvärdet för intensitet för att generera en binär bild från den genomsnittliga baslinjebilden.
- Använd Watershed i ImageJ eller liknande funktioner i ett annat program för att separera anslutande neuriter eller celler.
- Använd funktionen Analysera partikel med lämplig områdesstorlek och cirkularitet för att be om intressanta regioner (ROI) som motsvarar cellmembran, endosomer, lysosomer eller synaptiska boutoner. Spara alla valda ROI:er.
- Välj fyra bakgrunds-ROI i cellfria regioner inom synfältet.
- Mät den genomsnittliga pixelintensiteten för varje ROI i varje bildruta i bildstapeln och exportera resultaten för statistisk analys.
- Beräkna den genomsnittliga intensiteten för bakgrunds-ROI som baslinjebrus, som kommer att subtraheras från de genomsnittliga pixelintensiteterna för varje ROI.
- Medelvärdet av de tre högsta medelintensiteterna för varje vald ROI under appliceringen av pH 5,5 Tyrodes lösning för att erhålla den maximala fluorescensintensiteten, som definieras som 100 % för normalisering.
- Medelvärdet av de tre lägsta medelintensiteterna för varje vald ROI under appliceringen av 50 mM NH4Cl för att ställa in den minimala fluorescensintensiteten, som definieras som 0 % för normalisering.
- Beräkna de relativa fluorescensförändringarna för varje ROI baserat på dess egna intensiteter på 0 % och 100 %. Härled genomsnittliga fluorescensförändringar, förändringskinetik och andra värden/diagram från individuella ROI-data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SV är specialiserade för frisättning av neurotransmittorer via framkallad exo-/endocytos27. SV har mycket sura lumen (dvs. pH 5,5), vilket är idealiskt för ND6. Vi använde hög K+ -stimulering för att framkalla SV exo-/endocytos för att tillåta ND6 att få tillgång till SV. Som väntat dök ljusgröna fluorescerande puncta längs neuronala utskott upp efter laddning (Figur 9A). Linjeprofilen som visas i figur 4B visade en stark överlappning mellan ND6 (grön kurva) och FM4-64 puncta (röd kurva). Den starka korrelationen mellan ND6 och FM4-64 fluorescensintensiteter tyder också på en SV-färgning av ND6 (Figur 9B).
En elektrisk stimulering och en hög K+ -stimulering användes för att framkalla frisättningen av den lätt frigörande poolen (RRP, dvs. SV med hög frisättningssannolikhet) respektive reservpoolens SV (dvs. SV med låg frisättningssannolikhet). Det fanns minskningar i ND6-fluorescens som svar på båda stimuli (Figur 4C och Figur 4E), vilket tyder på att ND6 finns i SV-membranet och att SV-lumen neutraliseras (rapporterat av ND6-signalminskning) under SV-frisättningen.
I slutet av varje försök applicerades 50 mM NH4Cl för att avsyra SVs28 och pH 5,5-lösning för att göra ytmembranet ND6 ljusare (Figur 4D och Figur 4F). Skillnaderna i fluorescens gör att vi kan bestämma ND6 i ytmembranet (~44%) och SV-membranet (~56%). Dessa siffror matchar fraktionerna av yt- och SV-membran vid axonterminalerna29, vilket tyder på att ND6 fördelar sig jämnt över membranen. Dessutom tillåter ND6-signaler under två olika stimuli och två pH-manipulationer oss att uppskatta att den korta elektriska skuren mobiliserade cirka ~31 % SV och hög K+ -stimulering frigjorde ~70 % av de återstående SV. Hastigheten för ND-fluorescensminskning under stimuleringarna matchar också tidskonstanten för den framkallade SV-exocytosen som tidigare rapporterats30.
ND6:s kompakta storlek leder till mycket mindre sterisk störning av cellmembran än tidigare märkningsmetod14 och ger därmed en mer exakt mätning av SV-trafik. Som stöd för den idén visade en tio gånger högre belastningskoncentration ingen signifikant skillnad i FM4-64-avfärgning under stimulering (Figur 10). 1μM rekommenderas dock fortfarande med tanke på dess måttliga färgning i astrocyter.
Eftersom SV exo-/endocytos involverar kolesterol (en riklig och vital lipid i nervcellernas membran) har vi använt ND6-avbildning för att fråga hur membrankolesterol påverkar frisättning och hämtning av SV. En 1-mM för 90-minuters behandling av metyl-β-cyklodextrin (MβCD) kan ta bort ~10 % kolesterol från neuronalt ytmembran31, vilket efterliknar åldrandeassocierat membrankolesterol. Under en omfattande elektrisk stimulering minskade MβCD-behandlingen signifikant frisättning och hämtning av SV mätt med ND6-avbildning (Figur 11A), vilket tyder på att membrankolesterol underlättar SV exo-/endocytos32. Vi utvärderade också kolesterolets bidrag till SV-poolpåfyllning, vilket är avgörande för troheten av neurotransmission33. Två elektriska stimuleringar med ett 10-s-intervall applicerades i närvaro av Bafilomycin A1 (BafA1). BafA1 hämmar selektivt v-ATPas som syrar SV. Genom att akut blockera återsyrningen av uttagna SV förhindrar BafA1 återhämtning av ND6-fluorescens efter stimulering (Figur 11B). ND6-minskningen under den andra stimulansen bör endast komma från begynnande SV som fyller på tom RRP. I jämförelse med skenkontrollen observerades ett signifikant mindre ND6-svar på den andra stimulus i de neuroner som förbehandlats med MβCD (dvs. mindre amplitud och snabbare sönderfall av ND6-fluorescensreduktion). Detta resultat stöder uppfattningen att kolesterol spelar en avgörande roll för att rekrytera nya SV till RRP.
Figur 1: Allmänt syntesschema för ND6-sond. Denna siffra har modifierats från Thomas et al.20. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Egenskaper hos ND6. (A och B) Solvatokroma egenskaper hos ND6. Absorbansspektra (A) och fluorescensspektra (B) i olika lösningsmedel exciterade vid 405 nm. (C) Jämförelse av fluorescensintensiteten för ND6 i vatten (rött) och 1 % oktylglukosidlösning vid 1 μM. (D) ND6-fluorescens som en funktion av pH i 1 % OG-lösning är proportionell mot protoneringstillståndet för piperazinhuvudgruppen (beräknat pKa = 7,4). Infälld visar beräknat protoneringstillstånd för ND6-piperazindelen (förutspådd pKa = 8,83). Den streckade linjen representerar anpassade värden. Denna siffra har modifierats från Thomas et al.20. Förkortningar: DCM = diklormetan; MeCN = acetonitril; DMSO = dimetylsulfoxid, EtOH = etylalkohol; MeOH = metylalkohol; Abs= absorbans; Em = utsläpp, OG = oktylglukosid. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Ögonblicksbild från simulering av molekyldynamik . Interaktion mellan ND6-sond i POPC-membran (vänster panel). Piperazinhuvudgruppen interagerar starkt med fosfatgrupper (höger panel) genom elektrostatiska interaktioner. Den svarta pilen (höger panel) pekar på C-N-bindningen mellan naftalimidringen och piperazin. Resultaten visar att piperazingruppen endast rör sig något med en preferens för den dihedrala vinkeln (atomer visade) mellan 90 och 120 grader samtidigt som den bibehåller sin stolkonformation. Denna siffra har modifierats från Thomas et al.20. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: ND6 märker synaptiska vesiklar och rapporterar deras frisättning och hämtning i nervterminalerna. (A) Exempelbilder av FM4-64 (röd), ND6 (grön) och överlagring (gul). Neuriterna och soma i en neuron var linjeprofilerade. De upprätade linjebilderna (20 pixlars bredd) visas bredvid motsvarande bilder. Pilspetsar pekar på synaptiska boutoner markerade med FM4-64. Skalstreck = 100 μm. (B) Linjeprofiler för FM4-64 och ND6 fluorescensintensiteter uppvisar betydande likheter. (C) Provspår av ND6-fluorescensförändringar vid synaptiska boutoner indikerade av pilspetsar i A som svar på stimuli. (D) Provspår av ND6-fluorescensförändringar som svar på NH4Cl och pH 5,5 tyrods lösningar. (E) Avfärgningen av FM4-64 är tillfälligt kopplad till ND6-intensitetsförändringar. Data plottas som medelvärdet ± S.E.M. (F) ND6 fluorescensintensitet men inte FM4-64-intensitet minskades och ökades genom applicering av 50 mM NH4Cl respektive pH 5,5 Tyrodes lösningar. Data plottas som medelvärde ± S.E.M. Denna siffra har modifierats från Thomas et al.20. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Bildinställning baserad på ett inverterat Nikon-TiE-mikroskop. Annoterat är fyra komponenter som krävs för fluorescensavbildning av levande celler. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Inställning av stimuleringsavbildning. Installationen modifierad från en Warner Instruments RC-26-kammare och PH-1-värmeplattform för temperaturkontroll och lösningsutbyte. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Diagram över enhetskonfigurationer för bildtagning med synkroniserade stimuleringar och lösningsutbyten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Exempelbilder som visar de viktigaste stegen i bildanalys. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9: ND6 visar synaptiska vesiklar grupperade vid presynaptiska terminaler. (A) Exempelbilder FM4-64 (röd) och ND6 (grön) samladdning vid hög förstoring. Skalstapel = 30 μm. (B) Spridningsdiagram för FM4-64 och ND6 medelfluorescensintensiteter vid samma ROI motsvarande synaptiska boutoner och linjär regressionsanpassning. r = 0,8353; p = 1,7 × 10-8; synfält N = 9; ROI n = 450. Tröskelvärdet för FM4-64 är 1 200 au (godtycklig enhet) och 160 au för ND6. Denna siffra har modifierats från Thomas et al.20. Förkortning: ROI = intressanta regioner. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 10: ND6 ingriper inte med SV. (A) ND6-representerad SV-omsättning (genom elektrisk stimulans) efter 1 eller 10 μM ND6-belastning. (B) FM4-64-uppmätt SV-omsättning (med den elektriska stimulansen). Denna siffra har modifierats från Thomas et al.20. Förkortning: SV = synaptiska vesiklar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 11: Kolesterolreduktion försämrar SV-omsättningen. (A) ND6-representerad SV-omsättning under 10 Hz, 120 s elektrisk stimulus i kontroll och MβCD-behandlade neuroner. (B) Bafilomycin A1 förhindrar återsyrning av återvunna SV (dvs. ingen ND6-fluorescensåtervinning efter stimuleringsframkallad minskning) och belyser ytterligare MβCD:s inverkan på SV-påfyllning. Denna siffra har modifierats från Thomas et al.20. Förkortning: SV = synaptisk vesikel; MβCD = metyl-β-cyklodextrin; BafA1 = Bafilomycin A1. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lipidbaserade färgämnen, såsom 1,1′-dioktadecyl-3,3,3,3′,3′-tetrametylindokarbocyanin (DiI) och 3,3′-dioktadecyloxakarbocyaninperklorat (DiO), har länge använts för att illustrera cellmorfologi och spåra cellulära processer såsom neuronernas axonprojektioner. Styrylfärgämnen, såsom FM1-43, har uppfunnits och använts framgångsrikt för studier av exocytos34. På grund av deras låga membranaffinitet märker de selektivt endocytoserade vesiklar där de är fångade medan färgämnen som finns kvar på plasmamembranet tvättas bort genom konstant perfusion. Som sådana är styrylfärgämnen inte lämpliga för kontinuerlig övervakning av vesikelåtervinning.
Den senaste uppfinningen av pH-känslig GFP (dvs. pHluorin) gjorde det möjligt att upprepade gånger visualisera vesikelåtervinning när den märktes till ett vesikulärt membranprotein som VAMPII eller Synaptophysin35. Enligt samma princip möjliggör taggning av en pH-känslig fluorofor till lipidmolekyler spårning av lipidmembranåtervinning under cykler av exo-/endocytos14. I det här fallet, eftersom ND6 är en enda enhet av lipid, är lättare att framställa, enklare att applicera, effektivare för att märka lipidmembran, mindre störande för celler, mer stabil i att stanna i cellmembran och därmed mer tillförlitlig för fluorescensavbildning. Dess membranberoende och omvända pH-känslighet möjliggör ljusare färgning av sura organeller som SV och endosomer.
Dessutom är det också möjligt att märka sådana sura organeller eller presynaptiska terminaler i vävnader såsom hippocampusskivor som ospecifikt fördelade ND6 släcks av neutralt pH i extracellulära eller cytosoliska utrymmen. Dessutom gör dess stora Stokes-skift ND6 idealisk för multifotonavbildning av djupa vävnader. Därför möjliggör ND6 och andra pH-känsliga lipidbaserade fluoroforer optisk mätning i realtid av lipid- och cellmembrantrafik mellan plasmamembranet och intracellulära apparater såsom SV och endosomer för flera omgångar av exo-/endocytos. Med tanke på att synapser och SV är avgörande för neurotransmission är ND6 utan tvekan användbart för att studera synaptisk fysiologi.
Med tanke på den modulära designen av dessa lipidanaloger är det möjligt att konjugera ND till andra lipider, såsom fosfolipider och sfingolipider, i olika typer av cellmembran eller organeller. Dessutom kan ND-grupperna ersättas med andra miljökänsliga fluoroforer för att upptäcka andra miljöfaktorer såsom kalcium- eller zinkkoncentration inuti eller utanför celler eller organeller. Dessutom kan fluoroforer med olika emissionsspektra kopplas till membranlipider för att utöka paletten av lipidrapportörer. För alla dessa modifieringar kan länkaren mellan lipider och ND eller andra fluorescerande grupper justeras för att uppnå bättre fotoegenskaper och/eller önskad känslighet.
Detta protokoll beskriver användningen av ND6 för att visualisera SV-omsättning med hjälp av live-cell-imaging. Kritiska steg inkluderar laddning, synkroniserade stimuleringar och fluorescenskvantifiering, som alla avsevärt påverkar kvaliteten på resultaten. Dessutom kan de parametrar/inställningar som används i dessa steg ändras i enlighet med studiens behov. Till exempel kan stimuleringen under laddningen justeras (kortare eller längre varaktighet) för att tillåta åtkomst till olika pooler av SV (pooler med höga respektive låga frisläppbara sannolikheter). För fluorescensavbildning av levande celler är det viktigt att hitta en balans mellan cellhälsa och fluorescensintensitet, vilket är särskilt viktigt här. Detta beror på att excitationen för ND6 är nära UV (dvs. 405 nm), vilket kan orsaka mer fototoxicitet och nedbrytning av färgämnen än synligt ljus. Därför är det viktigt att justera excitationseffekten, exponeringstiden, bildhastigheten och bildvaraktigheten för att minimera fotoskador och maximera signalkvaliteten.
ND6 är en mycket intressant sond. Dess stora Stokes-skift gjorde det möjligt att använda den samtidigt med andra membranfärger som FM4-6420. Ännu viktigare är att det är en lämplig donatorkandidat för fluorescensresonansenergiöverföring (FRET) och kan exciteras av lila ljus, vilket kommer att vara mycket mindre sannolikt att samexcitera FRET-mottagaren. Lipidliknande färgämnen, som ND6, gör det möjligt att studera interaktionerna mellan membranproteiner och lipider under exo-/endocytos. Den pH-beroende associationen och dissociationen mellan membranproteiner och lipider kommer att förstoras i den sura lumen hos SV eller endosomer, vilket underlättar utforskningen av membranlipiders roll i receptormedierad endocytos och sortering. Sammanfattningsvis kan ND6 och dess derivat avsevärt utöka verktygslådan för att studera membranlipider och deras handel i levande celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Florida Atlantic University Office of Undergraduate Research and Inquiry grant (M.J.S.), Florida Department of Health Ed och Ethel Moore Pilot Grant 20A17 (Q.Z.), Alzheimer's Association grant AARG-NTF-19-618710 (Q.Z.) och NIA R21 grant AG061656-01A1 (Q.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digidata 1440A Data Acquistion System | Molecular Devices | Digidata 1440A | For synchronized stimulation and solution exchange |
| Dual Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | For live-cell imaging |
| Fetal Bovine Serum | OMEGA Scientific | FB-01 | For making H+20 solution used in dissection and tissue culture |
| Hamamatsu Flash4.0 sCOMS camera | Hamamatsu Inc. | C13440-20CU | high-sensitivity camera |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | For making H+20 solution used in dissection and tissue culture |
| Heated Platform | Warner Instruments | PH-1 | For live-cell imaging |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | For tissue culture |
| Micro-G Vibration Isolation Table | TMC | 63-564 | For live-cell imaging |
| Micro-manager | https://micro-manager.org/ | NA | For image acquisition control |
| Multi-Line In-Line Solution Heater | Warner Instruments | SHM-6 | For live-cell imaging |
| Neurobasal Plus Medium | THermoFisher Scientific | A3582901 | For tissue culture |
| Nikon Ti-E Inverted Microscope | Nikon | Ti-E/B | For live-cell imaging |
| ORCA-Flash4.0 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C1340-20CU | For live-cell imaging |
| Perfusion Chamber | Warner Instruments | RC-26G | For live-cell imaging |
| Six-Channel Valve Control Perfusion System | Warner Instruments | VC-6 | For solution exchange |
| Square Pulse Stimulator | Grass Instrument | SD9 | For electric field stimulation |
References
- Polo, S., Pece, S., Di Fiore, P. P.
- Eckert, G. P., Wood, W. G., Muller, W. E. Lipid membranes and beta-amyloid: a harmful connection. Current Protein and Pept Science. 11 (5), 319-325 (2010).
- Augustine, G. J., Burns, M. E., DeBello, W. M., Pettit, D. L., Schweizer, F. E.
- Ammar, M. R., Kassas, N., Chasserot-Golaz, S., Bader, M. F., Vitale, N. Lipids in regulated exocytosis: what are they doing. Frontiers in Endocrinology. 4, 125 (2013).
- Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C.
- Chabanon, M., Stachowiak, J. C., Rangamani, P. Systems biology of cellular membranes: a convergence with biophysics. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 9 (5), 1386 (2017).
- Prosser, D. C., Wrasman, K., Woodard, T. K., O'Donnell, A. F., Wendland, B. Applications of pHluorin for quantitative, kinetic and high-throughput analysis of endocytosis in budding yeast. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54587 (2016).
- Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nature Protocols. 1 (6), 2970-2978 (2006).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
- Demchenko, A. P., Mély, Y., Duportail, G., Klymchenko, A. S. Monitoring biophysical properties of lipid membranes by environment-sensitive fluorescent probes. Biophysical Journal. 96 (9), 3461-3470 (2009).
- Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 77-83 (2012).
- Gaus, K., Zech, T., Harder, T. Visualizing membrane microdomains by Laurdan 2-photon microscopy. Molecular Membrane Biology. 23 (1), 41-48 (2006).
- Kahms, M., Klingauf, J. Novel pH-sensitive lipid based exo-endocytosis tracers reveal fast intermixing of synaptic vesicle pools. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 18 (2018).
- Zhou, L., Xie, L., Liu, C., Xiao, Y. New trends of molecular probes based on the fluorophore 4-amino-1,8-naphthalimide. Chinese Chemical Letters. 30 (10), 1799-1808 (2019).
- Tomczyk, M. D., Walczak, K. Z. l,8-Naphthalimide based DNA intercalators and anticancer agents. A systematic review from 2007 to 2017. European Journal of Medicinal Chemistry. 159, 393-422 (2018).
- Ulla, H., et al. Blue emitting 1,8-naphthalimides with electron transport properties for organic light emitting diode applications. Journal of Molecular Structure. 1143 (5), 344-354 (2017).
- Duke, R. M., Veale, E. B., Pfeffer, F. M., Kruger, P. E., Gunnlaugsson, T. Colorimetric and fluorescent anion sensors: An overview of recent developments in the use of 1,8-naphthalimide-based chemosensors. Chemical Society Reviews. 39 (10), 3936-3953 (2010).
- Panja, S. K., Dwivedi, N., Saha, S. Tuning the intramolecular charge transfer (ICT) process in push-pull systems: Effect of nitro groups. RSC Advances. 6 (107), 105786-105794 (2016).
- Thomas, D., et al. Solvatochromic and pH-sensitive fluorescent membrane probes for imaging of live cells. ACS Chemical Neuroscience. 12 (4), 719-734 (2021).
- Leslie, K. G., Jacquemin, D., New, E. J., Jolliffe, K. A. Expanding the breadth of 4-amino-1,8-naphthalimide photophysical properties through substitution of the naphthalimide core. Chemistry - A European Journal. 24 (21), 5569-5573 (2018).
- Liu, G. S., Tsien, R. W. Properties of synaptic transmission at single hippocampal synaptic boutons. Nature. 375 (6530), 404-408 (1995).
- Zhang, Q., Cao, Y. -Q., Tsien, R. W. Quantum dots provide an optical signal specific to full collapse fusion of synaptic vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 104 (45), 17843-17848 (2007).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Sudhof, T. C.
- Lazarenko, R. M., DelBove, C. E., Strothman, C. E., Zhang, Q. Ammonium chloride alters neuronal excitability and synaptic vesicle release. Scientific Reports. 7 (1), 5061 (2017).
- Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344 (6187), 1023-1028 (2014).
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J.
- DelBove, C. E., et al. Reciprocal modulation between amyloid precursor protein and synaptic membrane cholesterol revealed by live cell imaging. Neurobiology of Disease. 127, 449-461 (2019).
- Dason, J. S., Smith, A. J., Marin, L., Charlton, M. P. Vesicular sterols are essential for synaptic vesicle cycling. Journal of Neuroscience. 30 (47), 15856-15865 (2010).
- Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms. Journal of Neuroscience. 39 (42), 8209-8216 (2019).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200 (1992).
- Afuwape, O. A., Kavalali, E. T. Imaging synaptic vesicle exocytosis-endocytosis with pH-sensitive fluorescent proteins. Methods in Molecular Biology. 1474, 187-200 (2016).
