Summary
Dit protocol presenteert een fluorescentiebeeldvormingsmethode die een klasse van pH-gevoelige lipidefluoroforen gebruikt om het transport van lipidemembranen tijdens celexocytose en de endocytosecyclus te volgen.
Abstract
Exo-/endocytose is een veelvoorkomend proces dat de uitwisseling van biomoleculen tussen cellen en hun omgeving en tussen verschillende cellen bemiddelt. Gespecialiseerde cellen gebruiken dit proces om vitale lichaamsfuncties uit te voeren, zoals insulinesecretie uit β cellen en het vrijkomen van neurotransmitters uit chemische synapsen. Vanwege zijn fysiologische betekenis is exo-/endocytose een van de meest bestudeerde onderwerpen in de celbiologie. Er zijn veel tools ontwikkeld om dit proces op gen- en eiwitniveau te bestuderen, waardoor er veel bekend is over de eiwitmachinerie die aan dit proces deelneemt. Er zijn echter zeer weinig methoden ontwikkeld om de membraanlipideomzet te meten, die de fysieke basis is van exo-/endocytose.
Dit artikel introduceert een klasse van nieuwe fluorescerende lipide-analogen die pH-afhankelijke fluorescentie vertonen en demonstreert hun gebruik om lipiderecycling tussen het plasmamembraan en de secretoire blaasjes te traceren. Met behulp van eenvoudige pH-manipulaties maken deze analogen ook de kwantificering van de lipidenverdeling over het oppervlak en de intracellulaire membraancompartimenten mogelijk, evenals de meting van de lipidenomloopsnelheid tijdens exo-/endocytose. Deze nieuwe lipidenreporters zullen van groot belang zijn voor verschillende biologische onderzoeksgebieden zoals celbiologie en neurowetenschappen.
Introduction
De lipide dubbellaag is een van de meest voorkomende biomolecuulassemblages en is onmisbaar voor alle cellen. Buiten de cellen vormt het het plasmamembraan dat de cellen en hun omgeving met elkaar verbindt; In cellen compartimenteert het verschillende organellen die gespecialiseerd zijn voor aangewezen functionaliteiten. In plaats van stilstaand, ervaren lipidemembranen voortdurend fusie en splijting, wat het transport van biomateriaal, organelhervorming, morfologische verandering en cellulaire communicatie bemiddelt. Ongetwijfeld is het lipidemembraan de fysieke basis voor bijna alle cellulaire processen, en de disfunctie ervan speelt een cruciale rol bij verschillende aandoeningen, variërend van kanker1 tot de ziekte van Alzheimer2. Hoewel lipidemoleculen veel minder divers zijn dan eiwitten, is membraanonderzoek tot nu toe vooral gericht geweest op eiwitten. Er is bijvoorbeeld veel meer bekend over eiwitmachines dan over lipiden in exocytose 3,4,5. Bovendien blijven de organisatie, distributie, dynamiek en homeostase van lipiden over oppervlakte- en intracellulaire membranen grotendeels onontgonnen in vergelijking met membraaneiwitten6.
Dit is niet verwonderlijk, aangezien moderne moleculair-biologische technieken, zoals mutagenese, een methodologisch voordeel bieden voor het bestuderen van eiwitten in plaats van lipiden. Transgene tagging van pH-gevoelig groen fluorescerend eiwit (ook bekend als pHluorin) naar vesiculaire eiwitten vergemakkelijkt bijvoorbeeld de kwantitatieve meting van de hoeveelheid en snelheid van vesiculaire eiwitomzet tijdens exo-/endocytose 7,8,9. Het is echter bijna onmogelijk om membraanlipiden in vivo genetisch te modificeren. Bovendien zijn kwalitatieve en zelfs kwantitatieve manipulaties van eiwithoeveelheden en -verdelingen veel haalbaarder dan die van lipiden10. Niettemin zijn native en synthetische fluorescerende lipiden geïsoleerd en ontwikkeld om endogene membraanlipiden in vitro en in vivo te simuleren11. Een groep veelgebruikte fluorescerende lipiden zijn styrylkleurstoffen, bijvoorbeeld FM1-43, die membraanversterkte fluorescentie vertonen en een krachtig hulpmiddel zijn bij het bestuderen van de afgifte van synaptische blaasjes (SV) in neuronen12. De laatste tijd zijn omgevingsgevoelige lipidekleurstoffen uitgevonden en op grote schaal gebruikt als een nieuwe klasse van verslaggevers om verschillende celmembraaneigenschappen te bestuderen, waaronder membraanpotentiaal11, fasevolgorde13 en secretie14.
Een nieuwe klasse van lipide-mimetica waarvan de fluorescentie zowel pH-gevoelig (bijv. pHluorin) als membraangevoelig (bijv. FM1-43) is, werd ontwikkeld om de lipideverdeling in het plasmamembraan en endosomen/lysosomen en het lipidenverkeer tijdens exo-/endocytose direct te meten. Hiervoor werden de bekende solvatochrome fluoroforen geselecteerd die push-pull-eigenschappen vertonen als gevolg van intramoleculaire ladingsoverdracht. Van de bestaande solvatochrome fluoroforen is de 1,8-naftalimide (ND)-steiger relatief eenvoudig aan te passen, veelzijdig voor tagging, en is uniek in de fotofysica15 en is daarom gebruikt in DNA-intercalatoren, organische lichtgevende diodes en biomolecuulsensoren 16,17,18.
Het bevestigen van een elektronendonerende groep aan de C4-positie van de ND-steiger genereert een push-pull-structuur, die leidt tot een verhoogd dipoolmoment door de elektronendichtheid in de aangeslagen toestand19,20 te herverdelen. Zo'n intramoleculaire ladingsoverdracht produceert grote kwantumopbrengsten en Stokes-verschuivingen, wat resulteert in heldere en stabiele fluorescentie21. Deze groep heeft onlangs een reeks solvatochrome lipide-analogen ontwikkeld op basis van de ND-steiger en deze verkregen met goede synthetische opbrengsten20.
Spectroscopische karakterisering toont aan dat ND6 van deze producten de beste fluorescentie-eigenschappen bezit (Figuur 1)20. Ten eerste heeft het goed gescheiden excitatie- en emissiepieken (d.w.z. respectievelijk ~400 nm en ~520 nm in figuur 2A,B) in vergelijking met populaire fluoroforen zoals fluoresceïne-isothiocyanaat, rodamine of GFP, waardoor het spectraal van hen kan worden gescheiden en dus nuttig is voor meerkleurige beeldvorming. Ten tweede vertoont ND6-fluorescentie een meer dan achtvoudige toename van de fluorescentie in aanwezigheid van micellen (Figuur 2C), wat wijst op een sterke membraanafhankelijkheid. Eerdere fluorescentiebeeldvormingsonderzoeken met levende cellen met verschillende soorten cellen toonden een uitstekende membraankleuring door ND620. Ten derde, wanneer de pH van de oplossing wordt verlaagd van 7,5 (vaak aangetroffen in extracellulaire of cytosolische omgevingen) tot 5,5 (vaak aangetroffen in endosomen en lysosomen), vertoont ND6 een ongeveer tweevoudige toename van de fluorescentie (Figuur 2D), wat de pH-gevoeligheid aangeeft. Bovendien geeft simulatie van de moleculaire dynamica aan dat ND6 gemakkelijk integreert in de lipidedubbellaag met zijn ND-steiger naar buiten gericht naar het membraan en piperazineresidu dat sterke interacties vertoont met fosfolipidekopgroepen (Figuur 3). Al met al maken deze eigenschappen ND6 tot een ideale fluorescerende lipide-analoog om de membraanlipideomzetting tijdens exo-/endocytose te visualiseren en te meten.
Dit artikel presenteert een methode om de omloopsnelheid en dynamiek van SV-lipiden te bestuderen met behulp van gekweekte hippocampusneuronen van muizen. Door neuronen te stimuleren met hoge K+ Tyrode-oplossingen, werden SV's en het plasmamembraan geladen met ND6 (Figuur 4A,B). Vervolgens werden neuronen opnieuw gestimuleerd met verschillende stimuli, gevolgd door NH4Cl-bevattende en pH 5,5 Tyrode-oplossingen (Figuur 4D). Dit protocol vergemakkelijkt de kwantitatieve meting van de geassembleerde exocytose- en endocytosepercentages onder verschillende omstandigheden (Figuur 4C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het volgende protocol omvat (1) een vereenvoudigde procedure voor het vaststellen van hippocampus- en corticale culturen van muizen op basis van een beproefd protocol22, (2) een korte inleiding tot een epifluorescentiemicroscoopopstelling voor levende neuronen, (3) een gedetailleerde beschrijving van het laden en afbeelden van ND6 in muizenneuronen, (4) een discussie over de kwantificering van membraantransport door ND6-signaal. Alle procedures volgen de bioveiligheids- en IACUC-richtlijnen van de Florida Atlantic University. De synthese van ND6 is eerder beschreven20.
1. Bereiding van hippocampus- en corticale culturen van muizen
NOTITIE: Tenzij anders aangegeven, moeten alle stappen worden uitgevoerd in een laminaire doorstromingskap van bioveiligheidsniveau 2. Steriliseer alle gereedschappen en materialen.
- Gebruik een pincet maat 5 om glazen dekglaasjes in multiwell-kweekplaten te plaatsen.
OPMERKING: Een plaat met 24 putjes is bijvoorbeeld ideaal voor dekglaasjes van 12 mm
. - Voeg het juiste volume extracellulaire matrices toe om het celkweekoppervlak te coaten (bijv. 75 μL basaalmembraanmatrixoplossing per dekglaasje van 12 mm ; zie de materiaaltabel)
- Plaats de voorbereide platen gedurende 1-4 uur in de weefselkweekincubator (5% CO2, 100% vochtigheid en 37 °C) om verknoping van de keldermembraanmatrix mogelijk te maken.
- Offer de dieren, open de schedel en breng de hele hersenen over in een petrischaal van 35 mm met 3 ml Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) met 20% foetaal runderserum (H+20). Snijd de hersenen langs de middellijn en scheid de cortex en hippocampi in een laminaire flow-dissectiekap om besmetting te verminderen.
- Gebruik een microschaar om de weefsels in kleine stukjes te knippen (~1mm3). Breng die weefsels over in een conische buis van 15 ml met 5 ml H+20.
- Was de tissues drie keer met 5 ml H+20 en drie keer met 5 ml HBSS.
- Voeg 1,5 ml 1% trypsine met ethyleendiaminetetra-azijnzuur toe en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C voor enzymvertering.
- Herhaal stap 1.6 en gebruik vacuüm om HBSS uiteindelijk op te zuigen.
- Dissocieer de weefsels mechanisch in 1 ml HBSS met 2,95 g/l MgSO4•7H2O met behulp van een vuurgepolijste glazen pipet.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 400 × g, 4 °C gedurende 5 min.
- Zuig het supernatans op en resuspendeer de cellen in een geschikte hoeveelheid kweekmedia om een concentratie van ~10.000.000 cellen/ml te verkrijgen.
- Plaat de cellen op ~1.000.000 cellen/cm2 en plaats de kweek gedurende 1-4 uur in de incubator (5% CO2, 100% vochtigheid en 37 °C) om de celbevestiging aan de glazen dekglaasjes te vergemakkelijken.
- Voeg een geschikte hoeveelheid kweekmedium toe (bijv. 1 ml per putje voor een plaat met 24 putjes). Voeg na 1 week hetzelfde volume kweekmedium toe. Vervang na 2 weken elke week de helft van het bestaande kweekmedium door verse media.
.2. Microscoopopstelling voor beeldvorming van fluorescentie met levende cellen
OPMERKING: Een voorbeeldige beeldvormingsopstelling (Afbeelding 5) omvat ten minste een omgekeerde fluorescentiemicroscoop (zie de Materiaaltabel), fluorescentielichtbron met automatische sluiter, fluorescentiefiltersets (bijv. voor beeldvorming ND6, gebruik 405/10 BP voor excitatie, 495 LP voor dichroïsch en 510/20 BP voor emissie) en een zeer gevoelige camera (Materiaaltabel), die allemaal worden bestuurd door beeldacquisitiesoftware (Materiaaltabel).
- Bereid een beeldvormingskamer voor die temperatuurregeling en in-/uitvoer van de oplossing mogelijk maakt voor fluorescentiebeeldvorming met levende cellen.
OPMERKING: In dit protocol werd bijvoorbeeld een aangepaste beeldvormingskamer met open bad gebruikt die op een verwarmingsplatform was bevestigd (Afbeelding 6). - Stel een programmeerbaar apparaat in om de perfusieoplossingen te schakelen en de elektrische stimulus op gedefinieerde tijdstippen tijdens de beeldvorming af te geven.
OPMERKING: Hardware- en softwaresynchronisatie is noodzakelijk voor kwantitatieve analyses (Afbeelding 7). In dit protocol werd bijvoorbeeld een trigger-uitgang van de beeldcamera gebruikt om een computerprogramma te starten dat een automatisch schakelapparaat bestuurt, dat een meerkanaals perfusiesysteem en een vierkante pulsstimulator bestuurt. - Om twee of meer fluorescerende reporters samen in beeld te brengen, voert u meerkanaals fluorescentiebeeldvorming uit door achtereenvolgens van filterset te wisselen of door tegelijkertijd verschillende fluorescentie-emissies te splitsen en op dezelfde camera te projecteren.
3. Laden en beeldvorming van ND6 in neuronale culturen
- Weeg een geschikte hoeveelheid ND6 af, los het op in dimethylsulfoxide (DMSO) en laat het bij kamertemperatuur oplossen; Kort soneren (bijv. 3 min). Filtreer de ruwe stockoplossing met een filter van 0,22 μm om grote kleurstofaggregaten te verwijderen. Bepaal na filtratie de kleurstofconcentratie door middel van absorptiespectroscopie bij 405 nm met behulp van een conventionele of microvolumespectrofotometer met behulp van ε = 10.700 M-1 cm-1.
- Verdun de stockoplossing vóór het aanbrengen met behulp van de badoplossing tot een concentratie van 1 μM. Bewaar de bouillonoplossing in het donker op kamertemperatuur.
- Etikettering van endosomen en synaptische blaasjes
- Om endosommen met endosomen alomtegenwoordig te labelen, voegt u ND6-voorraadoplossing (bijv. 1 mM in DMSO) toe aan het kweekmedium met een eindconcentratie van 1 μM en incubeert u bij 5% CO2, 100% vochtigheid en 37 °C gedurende 30 minuten. Om de mate van SV-etikettering te verminderen, moet u de spontane neuronale activiteit farmacologisch onderdrukken. Gebruik bijvoorbeeld tetrodotoxine om actiepotentialen te blokkeren of 2,3-dioxo-6-nitro-1,2,3,4-tetrahydrobenzo[f]quinoxaline-7-sulfonamide (NBQX) en D-(-)-2-amino-5-fosfonopentaanzuur (D-AP5) om excitatoire transmissie te remmen23.
- Om SV's selectief te labelen, gebruikt u korte maar krachtige stimulatie om presynaptische exo-/endocytose op te roepen. Breng eerst het (de) kweekdekglaasje(s) over in een petrischaal van 35 mm met 2 ml normale tyrode-oplossing bij kamertemperatuur. Ten tweede, verdun de ND6-stockoplossing in de oplossing van hoge-K+ Tyrode (90 mM KCl) in de eindconcentratie van 1 μM. Ten derde, vervang de normale Tyrode-oplossing in de petrischaal door ND6-bevattende high-K+ Tyrode-oplossing en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Breng de ND6-gelabelde celkweek over naar de beeldvormingskamer gevuld met voorverwarmde normale Tyrode-oplossing die 10 μM NBQX en 10 μM D-AP5 bevat.
- Pas de perfusiesnelheid aan tot ~0.2 ml/s (d.w.z. 1 druppel per seconde) en start de perfusie van voorverwarmde normale Tyrode-oplossing die NBQX en D-AP5 bevat om overmatig ND6 in de kweek te verwijderen.
- Pas de scherpstelling aan en zoek het juiste gezichtsveld met gezonde en goed verspreide neuronen met verbonden neurieten. Vermijd gebieden die onopgeloste kleurstofcolloïden bevatten.
- Probeer ND6-geladen cellen met verschillende belichtingstijden in beeld te brengen om de beste beeldvormingsinstellingen te bepalen.
OPMERKING: Voor de beste belichtingstijd is de hoogste pixelfluorescentie-intensiteit in het resulterende beeld ongeveer de helft van het bitbereik (bijv. voor een 16-bits afbeelding is het bitbereik van 0 tot 65.535), wat een verdere toename van de fluorescentie mogelijk maakt wanneer de zure badoplossing wordt toegepast. De geselecteerde belichtingstijd moet worden gebruikt voor alle ND6-beeldvorming. - Stel het stimulatie- en perfusieprotocol, het frame-interval en de totale duur in. Gebruik in het volgende protocol bijvoorbeeld een basislijn van 30 s, een elektrische veldstimulatie van 10 s 30 Hz, 50 s herstel, 120 s 90 mM K+, 60 s herstel, 60 s Tyrode-oplossing met 50 mM NH4Cl, 60 s Tyrode-oplossing bij pH 5.5 en een frame-interval van 3 s.
- Start de beeldacquisitie vergezeld van de gesynchroniseerde stimulatie en perfusie. Bewaak de simulatie en de uitwisseling van oplossingen tijdens de beeldvorming.
- Stop de perfusie nadat de beeldvorming is beëindigd, verwijder het dekglaasje en reinig de beeldvormingskamer voor de volgende proef.
4. Kwantificering van membraantransport door een verandering in ND6-fluorescentie
- Maak een back-up en/of maak een elektronische kopie van alle afbeeldingsbestanden.
- Kies een analyseprogramma voor data-extractie, bijvoorbeeld een open-source beeldanalysesoftware zoals ImageJ24 en/of FIJI25.
- Open of importeer een afbeeldingsstapel in het analyseprogramma.
- Stel de eerste afbeelding in als referentie en lijn de rest erop uit met behulp van functies/plug-ins zoals Rigid Registration26, die artefacten als gevolg van xy-drifting zullen verminderen. Zie afbeelding 8 voor bijvoorbeeld afbeeldingen.
- Bereken het gemiddelde van alle beelden die zijn verkregen tijdens de 30 seconden pre-baseline om een referentiebeeld te produceren. Bewaar een kopie van deze afbeelding voor toekomstig gebruik.
- Stel de intensiteitsdrempel in om een binair beeld te genereren op basis van het basislijngemiddelde beeld.
- Gebruik Watershed in ImageJ of vergelijkbare functies in een ander programma om verbindende neurieten of cellen te scheiden.
- Gebruik de functie Deeltje analyseren met de juiste gebiedsgrootte en circulariteit om interessegebieden (ROI's) te vragen die overeenkomen met celmembranen, endosomen, lysosomen of synaptische boutons. Sla alle geselecteerde ROI's op.
- Selecteer vier achtergrond-ROI's in celvrije gebieden binnen het gezichtsveld.
- Meet de gemiddelde pixelintensiteiten voor elke ROI in elk frame van de afbeeldingsstapel en exporteer de resultaten voor statistische analyse.
- Bereken de gemiddelde intensiteit van de achtergrond-ROI's als de basisruis, die wordt afgetrokken van de gemiddelde pixelintensiteiten voor elke ROI.
- Bereken het gemiddelde van de drie hoogste gemiddelde intensiteiten voor elke geselecteerde ROI tijdens de toepassing van pH 5.5 Tyrode-oplossing om de maximale fluorescentie-intensiteit te verkrijgen, die wordt gedefinieerd als 100% voor normalisatie.
- Gemiddeld de drie laagste gemiddelde intensiteiten voor elke geselecteerde ROI tijdens de toepassing van 50 mM NH4Cl om de minimale fluorescentie-intensiteit in te stellen, die wordt gedefinieerd als 0% voor normalisatie.
- Bereken de relatieve fluorescentieveranderingen voor elke ROI op basis van zijn eigen 0% en 100% intensiteiten. Leid gemiddelde fluorescentieveranderingen, veranderingskinetiek en andere waarden/grafieken af uit individuele ROI-gegevens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SV's zijn gespecialiseerd in het vrijkomen van neurotransmitters via evoked exo-/endocytose27. SV's hebben een zeer zuur lumen (d.w.z. pH 5,5), wat ideaal is voor ND6. We gebruikten hoge K+ stimulatie om SV exo-/endocytose op te roepen om ND6 toegang te geven tot SV. Naar verwachting verschenen na het laden felgroene fluorescerende puncta langs neuronale processen (Figuur 9A). Het lijnprofiel in figuur 4B vertoonde een sterke overlap tussen ND6 (groene curve) en FM4-64 puncta (rode curve). De sterke correlatie tussen ND6 en FM4-64 fluorescentie-intensiteiten suggereert ook een SV-kleuring van ND6 (Figuur 9B).
Een elektrische stimulatie en een hoge K+ stimulatie werden gebruikt om respectievelijk de release van de gemakkelijk loslaatbare pool (RRP, d.w.z. SV's met een hoge vrijgavekans) en de reservepool SV's (d.w.z. SV's met een lage vrijgavekans) op te roepen. Er waren dalingen in ND6-fluorescentie als reactie op beide stimuli (Figuur 4C en Figuur 4E), wat suggereert dat ND6 zich in het SV-membraan bevindt en dat het SV-lumen wordt geneutraliseerd (gerapporteerd door ND6-signaalafname) tijdens de SV-afgifte.
Aan het einde van elke proef werd 50 mM NH4Cl toegepast om SV's28 en pH 5,5-oplossing te ontzuren om oppervlaktemembraan ND6 helderder te maken (Figuur 4D en Figuur 4F). De verschillen in fluorescentie stellen ons in staat om ND6 in het oppervlaktemembraan (~44%) en SV-membraan (~56%) te bepalen. Deze aantallen komen overeen met de fracties van oppervlakte- en SV-membranen aan de axonuiteinden29, wat suggereert dat ND6 gelijkmatig over membranen verdeelt. Bovendien stellen ND6-signalen tijdens twee verschillende stimuli en twee pH-manipulaties ons in staat om te schatten dat de korte elektrische uitbarsting ongeveer ~31% SV's mobiliseerde en hoge K+- stimulatie ~70% van de resterende SV's vrijgaf. De snelheid van ND-fluorescentie neemt af tijdens de stimulaties en komt ook overeen met de tijdconstante voor de eerder gerapporteerde opgewekte SV-exocytose30.
Het compacte formaat van ND6 leidt tot veel minder sterische verstoring van celmembranen dan eerdere tagging-methode14 en biedt dus een nauwkeurigere meting van SV-transport. Ter ondersteuning van dat idee vertoonde een tien keer hogere belastingsconcentratie geen significant verschil in FM4-64-kleuring tijdens stimulatie (Figuur 10). 1 μM wordt echter nog steeds aanbevolen gezien de matige kleuring in astrocyten.
Aangezien SV exo-/endocytose cholesterol omvat (een overvloedig en vitaal lipide in de neuronale membranen), hebben we ND6-beeldvorming gebruikt om te vragen hoe membraancholesterol de afgifte en het ophalen van SV beïnvloedt. Een behandeling van 1 mM voor 90 minuten met methyl-β-cyclodextrine (MβCD) kan ~10% cholesterol verwijderen uit neuronaal oppervlaktemembraan31, waardoor verouderingsgeassocieerde membraancholesterolverlaging wordt nagebootst. Onder een uitputtende elektrische stimulatie verminderde de MβCD-behandeling de afgifte en het ophalen van SV aanzienlijk, gemeten door ND6-beeldvorming (Figuur 11A), wat suggereert dat membraancholesterol SV exo-/endocytosevergemakkelijkt 32. We evalueerden ook de bijdrage van cholesterol aan de aanvulling van de SV-pool, wat cruciaal is voor de getrouwheid van neurotransmissie33. Twee elektrische stimulaties met een interval van 10 seconden werden toegepast in aanwezigheid van Bafilomycine A1 (BafA1). BafA1 remt selectief v-ATPase dat SV's verzuurt. Door de herverzuring van opgehaalde SV's acuut te blokkeren, voorkomt BafA1 het herstel van ND6-fluorescentie na stimulatie (Figuur 11B). De ND6-afname tijdens de tweede stimulus zou alleen moeten komen van ontluikende SV's die lege RRP's aanvullen. In vergelijking met de schijncontrole werd een significant kleinere ND6-respons op de tweede stimulus waargenomen in de neuronen die waren voorbehandeld met MβCD (d.w.z. kleinere amplitude en sneller verval van ND6-fluorescentiereductie). Dit resultaat ondersteunt het idee dat cholesterol een cruciale rol speelt bij het werven van nieuwe SV's voor RRP.
Figuur 1: Algemeen syntheseschema voor ND6-sonde. Dit cijfer is aangepast ten opzichte van Thomas et al.20. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Eigenschappen van ND6. (A en B) Solvatochrome eigenschappen van ND6. Absorptiespectra (A) en fluorescentiespectra (B) in verschillende oplosmiddelen geëxciteerd bij 405 nm. (C) Vergelijking van de fluorescentie-intensiteit van ND6 in water (rood) en 1% octylglucoside-oplossing bij 1 μM. (D) ND6-fluorescentie als functie van de pH in 1% OG-oplossing is evenredig met de protoneringstoestand van de piperazinekopgroep (berekend pKa = 7,4). Inzet toont de berekende protonatietoestand van ND6 piperazinegroep (voorspelde pKa = 8,83). De stippellijn geeft passende waarden weer. Dit cijfer is aangepast ten opzichte van Thomas et al.20. Afkortingen: DCM = dichloormethaan; MeCN = acetonitril; DMSO = dimethylsulfoxide; EtOH = ethylalcohol; MeOH = methylalcohol; Abs = absorptie; Em = emissie; OG = octylglucoside. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Momentopname van het simulatietraject van de moleculaire dynamica. Interactie van ND6-sonde in POPC-membraan (linkerpaneel). De piperazinekopgroep interageert sterk met fosfaatgroepen (rechterpaneel) door middel van elektrostatische interacties. De zwarte pijl (rechterpaneel) wijst naar de C-N-binding tussen de naftalimidering en piperazine. De resultaten tonen aan dat de piperazinegroep slechts licht beweegt met een voorkeur voor de dihedrale hoek (atomen getoond) tussen 90 en 120 graden met behoud van de stoelconformatie. Dit cijfer is aangepast ten opzichte van Thomas et al.20. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: ND6 labelt synaptische blaasjes en rapporteert hun afgifte en herstel in de zenuwuiteinden. (A) Voorbeeldbeelden van FM4-64 (rood), ND6 (groen) en overlay (geel). De neurieten en soma van één neuron waren lijngeprofileerd. De afbeeldingen met een rechte lijn (breedte van 20 pixels) staan naast de bijbehorende afbeeldingen. Pijlpunten wijzen naar synaptische boutons gemarkeerd door FM4-64. Schaalbalken = 100 μm. (B) Lijnprofielen van FM4-64 en ND6 fluorescentie-intensiteiten vertonen significante gelijkenis. (C) Monstersporen van ND6-fluorescentieveranderingen bij synaptische boutons, aangegeven door pijlpunten in A als reactie op stimuli. (D) Monstersporen van ND6-fluorescentieveranderingen als reactie op de oplossingen van NH4Cl en pH 5,5 Tyrode. (E) Het verwijderen van de kleuring van FM4-64 wordt tijdelijk gekoppeld aan veranderingen in de intensiteit van ND6. De gegevens worden uitgezet als gemiddelde ± S.E.M. (F) ND6 fluorescentie-intensiteit, maar niet de FM4-64-intensiteit werd verlaagd en verhoogd door de toepassingen van respectievelijk 50 mM NH4Cl en pH 5,5 Tyrode-oplossingen. Gegevens worden uitgezet als gemiddelde ± S.E.M. Dit cijfer is aangepast ten opzichte van Thomas et al.20. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 5: Beeldvormingsopstelling op basis van een omgekeerde Nikon-TiE-microscoop. Geannoteerd zijn vier componenten die nodig zijn voor fluorescentiebeeldvorming met levende cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 6: Stimulatie-beeldvormingsopstelling. Setup aangepast van een Warner Instruments RC-26 kamer en PH-1 verwarmingsplatform voor temperatuurregeling en oplossingsuitwisseling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Diagram van apparaatconfiguraties voor beeldacquisitie met gesynchroniseerde stimulaties en oplossingsuitwisselingen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Afbeelding 8: Voorbeeldafbeeldingen die de belangrijkste stappen in beeldanalyse demonstreren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 9: ND6 markeert synaptische blaasjes geclusterd op presynaptische terminals. (A) Voorbeeldbeelden FM4-64 (rood) en ND6 (groen) co-loading bij sterke vergroting. Schaalbalk = 30 μm. (B) Spreidingsdiagram van FM4-64 en ND6 gemiddelde fluorescentie-intensiteiten bij dezelfde ROI's die overeenkomen met synaptische boutons en lineaire regressie-fit. r = 0,8353; p = 1,7 × 10-8; gezichtsvelden N = 9; ROI's n = 450. De drempel voor FM4-64 is 1.200 au (willekeurige eenheid) en 160 au voor ND6. Dit cijfer is aangepast ten opzichte van Thomas et al.20. Afkorting: ROI's = regio's van belang. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10: ND6 grijpt niet in bij SV's. (A) ND6-vertegenwoordigde SV-omzet (door elektrische stimulus) na 1 of 10 μM ND6-belasting. (B) FM4-64-gemeten SV-omzet (met de elektrische stimulus). Dit cijfer is aangepast ten opzichte van Thomas et al.20. Afkorting: SVs = synaptische blaasjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 11: Cholesterolverlaging schaadt de SV-omzet. (A) ND6-vertegenwoordigde SV-omzet onder 10 Hz, 120 s elektrische stimulus in controle en met MβCD behandelde neuronen. (B) Bafilomycine A1 voorkomt de herverzuring van gerecycleerde SV's (d.w.z. geen herstel van de ND6-fluorescentie na een door stimulatie opgewekte afname) en verduidelijkt verder de impact van MβCD op de SV-aanvulling. Dit cijfer is aangepast ten opzichte van Thomas et al.20. Afkorting: SV = synaptisch blaasje; MβCD = methyl-β-cyclodextrine; BafA1 = Bafilomycine A1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Op lipiden gebaseerde kleurstoffen, zoals 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine (DiI) en 3,3′-dioctadecyloxacarbocyanineperchloraat (DiO), worden al lang gebruikt om de celmorfologie te illustreren en cellulaire processen te volgen, zoals de axonprojecties van neuronen. Styrylkleurstoffen, zoals FM1-43, zijn uitgevonden en met succes gebruikt voor de studie van exocytose34. Vanwege hun lage membraanaffiniteit labelen ze selectief endocytose-blaasjes waar ze worden opgesloten, terwijl kleurstoffen die op het plasmamembraan achterblijven, worden weggespoeld door constante perfusie. Als zodanig zijn styrylkleurstoffen niet geschikt voor continue monitoring van de recycling van blaasjes.
De recente uitvinding van pH-gevoelige GFP (d.w.z. pHluorin) maakte het mogelijk om herhaaldelijk de recycling van blaasjes te visualiseren wanneer deze werd getagd met een vesiculair membraaneiwit zoals VAMPII of Synaptofysine35. Volgens hetzelfde principe maakt het labelen van een pH-gevoelige fluorofoor aan lipidemoleculen het mogelijk om de recycling van lipidemembranen te volgen tijdens cycli van exo-/endocytose14. In dit geval, omdat het een enkele entiteit van lipiden is, is ND6 gemakkelijker te bereiden, eenvoudiger toe te passen, efficiënter om lipidemembranen te labelen, minder storend voor cellen, stabieler in het blijven in celmembranen en dus betrouwbaarder voor fluorescentiebeeldvorming. De membraanafhankelijkheid en inverse pH-gevoeligheid zorgen voor een helderdere kleuring van zure organellen zoals SV's en endosomen.
Bovendien is het ook mogelijk om dergelijke zure organellen of presynaptische terminals in weefsels zoals hippocampusplakjes te labelen als niet-specifiek gedistribueerd ND6 wordt gedoofd door neutrale pH in extracellulaire of cytosolische ruimtes. Bovendien maakt de grote Stokes-verschuiving ND6 ideaal voor multifotonbeeldvorming van diepe weefsels. Daarom maken ND6 en andere pH-gevoelige fluoroforen op basis van lipiden de real-time optische meting mogelijk van het transport van lipiden en celmembranen tussen het plasmamembraan en intracellulaire apparaten zoals SV's en endosomen voor meerdere rondes van exo-/endocytose. Gezien het feit dat synapsen en SV's van vitaal belang zijn voor neurotransmissie, is ND6 ongetwijfeld nuttig voor het bestuderen van synaptische fysiologie.
Gezien het modulaire ontwerp van deze lipide-analogen, is het mogelijk om ND te conjugeren met andere lipiden, zoals fosfolipiden en sfingolipiden, in verschillende soorten celmembranen of organellen. Bovendien kunnen de ND-groepen worden vervangen door andere omgevingsgevoelige fluoroforen om andere omgevingsfactoren te detecteren, zoals calcium- of zinkconcentratie binnen of buiten cellen of organellen. Bovendien kunnen fluoroforen met verschillende emissiespectra worden gekoppeld aan membraanlipiden om het palet van lipidenreporters uit te breiden. Voor al die modificaties kan de linker tussen lipiden en ND of andere fluorescerende groepen worden aangepast om betere foto-eigenschappen en/of gewenste gevoeligheden te bereiken.
Dit protocol beschrijft het gebruik van ND6 bij het visualiseren van SV-omzet met behulp van live-cell imaging. Kritieke stappen zijn onder meer laden, gesynchroniseerde stimulaties en fluorescentiekwantificering, die allemaal de kwaliteit van de resultaten aanzienlijk beïnvloeden. Bovendien kunnen de parameters/instellingen die in die stappen worden gebruikt, worden aangepast aan de behoeften van het onderzoek. De stimulatie tijdens de belasting kan bijvoorbeeld worden aangepast (kortere of langere duur) om de toegang van verschillende pools van SV's mogelijk te maken (pools met respectievelijk hoge of lage loslaatbare kansen). Voor de beeldvorming van de fluorescentie van levende cellen is het belangrijk om een evenwicht te vinden tussen de gezondheid van de cellen en de fluorescentie-intensiteit, wat hier bijzonder belangrijk is. Dit komt omdat de excitatie voor ND6 bijna-UV is (d.w.z. 405 nm), wat meer fototoxiciteit en kleurstofafbraak kan veroorzaken dan zichtbaar licht. Het is dus belangrijk om het opwindingsvermogen, de belichtingstijd, de framesnelheid en de beeldvormingsduur aan te passen om fotoschade te minimaliseren en de signaalkwaliteit te maximaliseren.
ND6 is een zeer interessante sonde. De grote Stokes-verschuiving maakte het mogelijk om het gelijktijdig te gebruiken met andere membraankleurstoffen zoals FM4-6420. Wat nog belangrijker is, het is een geschikte donorkandidaat voor fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET) en kan worden opgewekt door paars licht, dat de FRET-ontvanger veel minder snel zal prikkelen. Lipide-nabootsende kleurstoffen, zoals ND6, maken het mogelijk om de interacties tussen membraaneiwitten en lipiden tijdens exo-/endocytose te bestuderen. De pH-afhankelijke associatie en dissociatie tussen membraaneiwitten en lipiden zal worden vergroot in het zure lumen van SV's of endosomen, wat de verkenning van de rol van membraanlipiden in receptor-gemedieerde endocytose en sortering vergemakkelijkt. Samenvattend kunnen ND6 en zijn derivaten de gereedschapskist voor het bestuderen van membraanlipiden en hun handel in levende cellen aanzienlijk uitbreiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige financiële belangen zijn.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Florida Atlantic University Office of Undergraduate Research and Inquiry-subsidie (M.J.S.), Florida Department of Health Ed en Ethel Moore Pilot Grant 20A17 (Q.Z.), Alzheimer's Association-subsidie AARG-NTF-19-618710 (Q.Z.) en NIA R21-subsidie AG061656-01A1 (Q.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digidata 1440A Data Acquistion System | Molecular Devices | Digidata 1440A | For synchronized stimulation and solution exchange |
| Dual Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | For live-cell imaging |
| Fetal Bovine Serum | OMEGA Scientific | FB-01 | For making H+20 solution used in dissection and tissue culture |
| Hamamatsu Flash4.0 sCOMS camera | Hamamatsu Inc. | C13440-20CU | high-sensitivity camera |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | For making H+20 solution used in dissection and tissue culture |
| Heated Platform | Warner Instruments | PH-1 | For live-cell imaging |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | For tissue culture |
| Micro-G Vibration Isolation Table | TMC | 63-564 | For live-cell imaging |
| Micro-manager | https://micro-manager.org/ | NA | For image acquisition control |
| Multi-Line In-Line Solution Heater | Warner Instruments | SHM-6 | For live-cell imaging |
| Neurobasal Plus Medium | THermoFisher Scientific | A3582901 | For tissue culture |
| Nikon Ti-E Inverted Microscope | Nikon | Ti-E/B | For live-cell imaging |
| ORCA-Flash4.0 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C1340-20CU | For live-cell imaging |
| Perfusion Chamber | Warner Instruments | RC-26G | For live-cell imaging |
| Six-Channel Valve Control Perfusion System | Warner Instruments | VC-6 | For solution exchange |
| Square Pulse Stimulator | Grass Instrument | SD9 | For electric field stimulation |
References
- Polo, S., Pece, S., Di Fiore, P. P.
- Eckert, G. P., Wood, W. G., Muller, W. E. Lipid membranes and beta-amyloid: a harmful connection. Current Protein and Pept Science. 11 (5), 319-325 (2010).
- Augustine, G. J., Burns, M. E., DeBello, W. M., Pettit, D. L., Schweizer, F. E.
- Ammar, M. R., Kassas, N., Chasserot-Golaz, S., Bader, M. F., Vitale, N. Lipids in regulated exocytosis: what are they doing. Frontiers in Endocrinology. 4, 125 (2013).
- Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C.
- Chabanon, M., Stachowiak, J. C., Rangamani, P. Systems biology of cellular membranes: a convergence with biophysics. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 9 (5), 1386 (2017).
- Prosser, D. C., Wrasman, K., Woodard, T. K., O'Donnell, A. F., Wendland, B. Applications of pHluorin for quantitative, kinetic and high-throughput analysis of endocytosis in budding yeast. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54587 (2016).
- Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nature Protocols. 1 (6), 2970-2978 (2006).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
- Demchenko, A. P., Mély, Y., Duportail, G., Klymchenko, A. S. Monitoring biophysical properties of lipid membranes by environment-sensitive fluorescent probes. Biophysical Journal. 96 (9), 3461-3470 (2009).
- Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 77-83 (2012).
- Gaus, K., Zech, T., Harder, T. Visualizing membrane microdomains by Laurdan 2-photon microscopy. Molecular Membrane Biology. 23 (1), 41-48 (2006).
- Kahms, M., Klingauf, J. Novel pH-sensitive lipid based exo-endocytosis tracers reveal fast intermixing of synaptic vesicle pools. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 18 (2018).
- Zhou, L., Xie, L., Liu, C., Xiao, Y. New trends of molecular probes based on the fluorophore 4-amino-1,8-naphthalimide. Chinese Chemical Letters. 30 (10), 1799-1808 (2019).
- Tomczyk, M. D., Walczak, K. Z. l,8-Naphthalimide based DNA intercalators and anticancer agents. A systematic review from 2007 to 2017. European Journal of Medicinal Chemistry. 159, 393-422 (2018).
- Ulla, H., et al. Blue emitting 1,8-naphthalimides with electron transport properties for organic light emitting diode applications. Journal of Molecular Structure. 1143 (5), 344-354 (2017).
- Duke, R. M., Veale, E. B., Pfeffer, F. M., Kruger, P. E., Gunnlaugsson, T. Colorimetric and fluorescent anion sensors: An overview of recent developments in the use of 1,8-naphthalimide-based chemosensors. Chemical Society Reviews. 39 (10), 3936-3953 (2010).
- Panja, S. K., Dwivedi, N., Saha, S. Tuning the intramolecular charge transfer (ICT) process in push-pull systems: Effect of nitro groups. RSC Advances. 6 (107), 105786-105794 (2016).
- Thomas, D., et al. Solvatochromic and pH-sensitive fluorescent membrane probes for imaging of live cells. ACS Chemical Neuroscience. 12 (4), 719-734 (2021).
- Leslie, K. G., Jacquemin, D., New, E. J., Jolliffe, K. A. Expanding the breadth of 4-amino-1,8-naphthalimide photophysical properties through substitution of the naphthalimide core. Chemistry - A European Journal. 24 (21), 5569-5573 (2018).
- Liu, G. S., Tsien, R. W. Properties of synaptic transmission at single hippocampal synaptic boutons. Nature. 375 (6530), 404-408 (1995).
- Zhang, Q., Cao, Y. -Q., Tsien, R. W. Quantum dots provide an optical signal specific to full collapse fusion of synaptic vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 104 (45), 17843-17848 (2007).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Sudhof, T. C.
- Lazarenko, R. M., DelBove, C. E., Strothman, C. E., Zhang, Q. Ammonium chloride alters neuronal excitability and synaptic vesicle release. Scientific Reports. 7 (1), 5061 (2017).
- Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344 (6187), 1023-1028 (2014).
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J.
- DelBove, C. E., et al. Reciprocal modulation between amyloid precursor protein and synaptic membrane cholesterol revealed by live cell imaging. Neurobiology of Disease. 127, 449-461 (2019).
- Dason, J. S., Smith, A. J., Marin, L., Charlton, M. P. Vesicular sterols are essential for synaptic vesicle cycling. Journal of Neuroscience. 30 (47), 15856-15865 (2010).
- Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms. Journal of Neuroscience. 39 (42), 8209-8216 (2019).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200 (1992).
- Afuwape, O. A., Kavalali, E. T. Imaging synaptic vesicle exocytosis-endocytosis with pH-sensitive fluorescent proteins. Methods in Molecular Biology. 1474, 187-200 (2016).
