Este protocolo presenta un método de imagen de fluorescencia que utiliza una clase de fluoróforos lipídicos sensibles al pH para monitorear el tráfico de membranas lipídicas durante la exocitosis celular y el ciclo de endocitosis.
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Artículo de método
Medición del recambio de lípidos de membrana con el análogo lipídico fluorescente sensible al pH ND6
En este artículo
Resumen
Resumen
La exo-/endocitosis es un proceso común que media el intercambio de biomoléculas entre las células y su entorno y entre diferentes células. Las células especializadas utilizan este proceso para ejecutar funciones vitales del cuerpo, como la secreción de insulina de las células β y la liberación de neurotransmisores de las sinapsis químicas. Debido a su importancia fisiológica, la exo-/endocitosis ha sido uno de los temas más estudiados en biología celular. Se han desarrollado muchas herramientas para estudiar este proceso a nivel de genes y proteínas, por lo que se sabe mucho sobre la maquinaria proteica que participa en este proceso. Sin embargo, se han desarrollado muy pocos métodos para medir el recambio lipídico de la membrana, que es la base física de la exocitosis.
Este artículo presenta una clase de nuevos análogos de lípidos fluorescentes que exhiben fluorescencia dependiente del pH y demuestra su uso para rastrear el reciclaje de lípidos entre la membrana plasmática y las vesículas secretoras. Con la ayuda de manipulaciones simples del pH, estos análogos también permiten la cuantificación de la distribución de lípidos a través de la superficie y los compartimentos de la membrana intracelular, así como la medición de la tasa de renovación de lípidos durante la exocitosis/endocitosis. Estos nuevos reporteros lipídicos serán de gran interés para diversos campos de investigación biológica, como la biología celular y la neurociencia.
Introducción
La bicapa lipídica es uno de los ensamblajes de biomoléculas más comunes y es indispensable para todas las células. Fuera de las células, forma la membrana plasmática que interconecta las células y su entorno; Dentro de las células, compartimenta varios orgánulos especializados para funcionalidades designadas. Más dinámicas que quietas, las membranas lipídicas experimentan constantemente fusión y fisión, lo que media el transporte de biomateriales, la reforma de orgánulos, el cambio morfológico y la comunicación celular. Sin duda, la membrana lipídica es la base física de casi todos los procesos celulares, y su disfunción juega un papel crucial en diversos trastornos ....
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Protocolo
El siguiente protocolo incluye (1) un procedimiento simplificado para establecer cultivos corticales y de hipocampo de ratón basado en un protocolo bien establecido22, (2) una breve introducción a una configuración de microscopio de epifluorescencia para neuronas vivas, (3) una descripción detallada de la carga y la obtención de imágenes de ND6 en neuronas de ratón, (4) una discusión sobre la cuantificación del tráfico de membrana por la señal ND6. Todos los procedimientos siguen las pautas de bioseguridad e IACUC en la Universidad Atlántica de Florida. La síntesis de ND6 ha sido descrita previamente20.
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Resultados
Los SV están especializados para la liberación de neurotransmisores a través de exocitosis evocada27. Los SV tienen un lumen muy ácido (es decir, pH 5,5), que es ideal para el ND6. Utilizamos estimulación alta de K+ para evocar exo-/endocitosis SV con el fin de permitir que ND6 accediera a SV. Como era de esperar, aparecieron puntos fluorescentes de color verde brillante a lo largo de los procesos neuronales después de la carga (Figura 9A). El perfil de lín.......
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Discusión
Los colorantes a base de lípidos, como el 1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3′-tetrametilindocarbocianina (DiI) y el perclorato de 3,3′-dioctadeciloxacarbocianina (DiO), se han utilizado durante mucho tiempo para ilustrar la morfología celular y rastrear procesos celulares como las proyecciones axónicas de las neuronas. Los colorantes de estirilo, como el FM1-43, se han inventado y utilizado con éxito para el estudio de la exocitosis34. Debido a su baja afinidad con la membrana, etiquetan selectivamente las.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la subvención de la Oficina de Investigación e Indagación de Pregrado de la Universidad Atlántica de Florida (M.J.S.), la subvención piloto 20A17 (Q.Z.) del Departamento de Salud de Florida Ed y Ethel Moore (Q.Z.), la subvención de la Asociación de Alzheimer AARG-NTF-19-618710 (Q.Z.) y la subvención NIA R21 AG061656-01A1 (Q.Z.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Digidata 1440A Sistema de adquisición de datos | Dispositivos moleculares | Digidata 1440A | Para la estimulación sincronizada y el intercambio de soluciones |
| Controlador de temperatura de doble canal | Warner Instruments | TC-344B | Para la adquisición de imágenes de células vivas |
| Suero fetal bovino | OMEGA Scientific FB-01 | Para la fabricación de soluciones de H+20 utilizadas en disección y cultivo | de |
| Hamamatsu Flash4.0 sCOMS cámara | Hamamatsu Inc. | C13440-20CU | Cámara de alta sensibilidad |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | Para la fabricación de soluciones de H+20 utilizadas en la disección y el cultivo de tejidos |
| Plataforma calefactada | Warner Instruments | PH-1 | Para la adquisición de imágenes de células vivas |
| Matrigel | BD Biosciences 354234 | para el cultivo de tejidos | |
| Mesa de aislamiento de vibraciones Micro-G | TMC | 63-564 | Para la adquisición de imágenes de células vivas |
| Micro-manager | https://micro-manager.org/ | NA | Para el control de adquisición |
| de imágenes Multiline Calentador de soluciones en línea | Warner Instruments | SHM-6 | Para la adquisición de imágenes de células vivas |
| Neurobasal Plus Medium | THermoFisher Scientific | A3582901 | Para el cultivo |
| de tejidos Nikon Ti-E Microscopio invertido | Nikon | Ti-E/B | Para la adquisición de imágenes de células vivas |
| Cámara CMOS digital ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu | C1340-20CU | Para la adquisición de imágenes de células vivas |
| Cámara de perfusión | Warner Instruments | RC-26G | Para la adquisición de imágenes de células vivas |
| Sistema de perfusión de control de válvulas de seis canales | Warner Instruments | VC-6 | Para el intercambio de soluciones |
| Estimulador de pulso cuadrado | Grass Instrument | SD9 | Para la estimulación del campo eléctrico |
Referencias
- Polo, S., Pece, S., Di Fiore, P. P. Endocytosis and cancer. Current Opinion in Cell Biology. 16 (2), 156-161 (2004).
- Eckert, G. P., Wood, W. G., Muller, W. E. Lipid membranes and beta-amyloid: a harmful connection. Current Protein and Pept Science. 11 (5), 319-325 (2010....
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Reimpresiones y permisos
