Summary
Este protocolo presenta un método de imagen de fluorescencia que utiliza una clase de fluoróforos lipídicos sensibles al pH para monitorear el tráfico de membranas lipídicas durante la exocitosis celular y el ciclo de endocitosis.
Abstract
La exo-/endocitosis es un proceso común que media el intercambio de biomoléculas entre las células y su entorno y entre diferentes células. Las células especializadas utilizan este proceso para ejecutar funciones vitales del cuerpo, como la secreción de insulina de las células β y la liberación de neurotransmisores de las sinapsis químicas. Debido a su importancia fisiológica, la exo-/endocitosis ha sido uno de los temas más estudiados en biología celular. Se han desarrollado muchas herramientas para estudiar este proceso a nivel de genes y proteínas, por lo que se sabe mucho sobre la maquinaria proteica que participa en este proceso. Sin embargo, se han desarrollado muy pocos métodos para medir el recambio lipídico de la membrana, que es la base física de la exocitosis.
Este artículo presenta una clase de nuevos análogos de lípidos fluorescentes que exhiben fluorescencia dependiente del pH y demuestra su uso para rastrear el reciclaje de lípidos entre la membrana plasmática y las vesículas secretoras. Con la ayuda de manipulaciones simples del pH, estos análogos también permiten la cuantificación de la distribución de lípidos a través de la superficie y los compartimentos de la membrana intracelular, así como la medición de la tasa de renovación de lípidos durante la exocitosis/endocitosis. Estos nuevos reporteros lipídicos serán de gran interés para diversos campos de investigación biológica, como la biología celular y la neurociencia.
Introduction
La bicapa lipídica es uno de los ensamblajes de biomoléculas más comunes y es indispensable para todas las células. Fuera de las células, forma la membrana plasmática que interconecta las células y su entorno; Dentro de las células, compartimenta varios orgánulos especializados para funcionalidades designadas. Más dinámicas que quietas, las membranas lipídicas experimentan constantemente fusión y fisión, lo que media el transporte de biomateriales, la reforma de orgánulos, el cambio morfológico y la comunicación celular. Sin duda, la membrana lipídica es la base física de casi todos los procesos celulares, y su disfunción juega un papel crucial en diversos trastornos que van desde el cáncer1 hasta la enfermedad de Alzheimer2. Aunque las moléculas lipídicas son mucho menos diversas que las proteínas, la investigación de membranas hasta ahora se ha centrado principalmente en las proteínas. Por ejemplo, se sabe mucho más sobre la maquinaria proteica que sobre los lípidos en la exocitosis 3,4,5. Además, la organización, distribución, dinámica y homeostasis de los lípidos a través de las membranas superficiales e intracelulares permanecen en gran medida inexploradas en comparación con las proteínas de membrana6.
Esto no es sorprendente, ya que las técnicas modernas de biología molecular, como la mutagénesis, proporcionan una ventaja metodológica para estudiar proteínas en lugar de lípidos. Por ejemplo, el marcaje transgénico de la proteína verde fluorescente sensible al pH (también conocida como pHluorina) a las proteínas vesiculares facilita la medición cuantitativa de la cantidad y la tasa de recambio de proteínas vesiculares durante la exocitosis/endocitosis 7,8,9. Sin embargo, es casi imposible modificar genéticamente los lípidos de membrana in vivo. Además, las manipulaciones cualitativas e incluso cuantitativas de las cantidades y distribuciones de proteínas son mucho más factibles que las de los lípidos10. Sin embargo, se han aislado y desarrollado lípidos fluorescentes nativos y sintéticos para simular lípidos de membrana endógena in vitro e in vivo11. Un grupo de lípidos fluorescentes ampliamente utilizados son los colorantes de estirilo, por ejemplo, FM1-43, que exhiben fluorescencia mejorada por membrana y son una herramienta poderosa en el estudio de la liberación de vesículas sinápticas (SV) en las neuronas12. Últimamente, los colorantes lipídicos sensibles al medio ambiente se han inventado y se han utilizado ampliamente como una nueva clase de reporteros para estudiar varias propiedades de la membrana celular, incluido el potencial de membrana11, el orden de fase13 y la secreción14.
Se desarrolló una nueva clase de miméticos lipídicos cuya fluorescencia es sensible al pH (p. ej., pHluorin) y a la membrana (p. ej., FM1-43) para medir directamente la distribución de lípidos en la membrana plasmática y los endosomas/lisosomas y el tráfico de lípidos durante la exocitosis/endocitosis. Para ello, se seleccionaron los conocidos fluoróforos solvatocrómicos que presentan características push-pull debido a la transferencia de carga intramolecular. Entre los fluoróforos solvatocrómicos existentes, el andamio de 1,8-naftalimida (ND) es relativamente fácil de modificar, versátil para el etiquetado y es único en fotofísica15 y, por lo tanto, se ha utilizado en intercaladores de ADN, diodos emisores de luz orgánicos y sensores de biomoléculas 16,17,18.
La unión de un grupo donante de electrones a la posición C4 del andamio ND genera una estructura push-pull, que conduce a un aumento del momento dipolar mediante la redistribución de la densidad de electrones en el estado excitado19,20. Tal transferencia de carga intramolecular produce grandes rendimientos cuánticos y desplazamientos de Stokes, lo que resulta en una fluorescencia brillante y estable21. Este grupo ha desarrollado recientemente una serie de análogos lipídicos solvatocrómicos basados en el andamio ND y los ha obtenido con buenos rendimientos sintéticos20.
La caracterización espectroscópica muestra que, entre esos productos, el ND6 posee las mejores propiedades de fluorescencia (Figura 1)20. En primer lugar, tiene picos de excitación y emisión bien separados (es decir, ~400 nm y ~520 nm, respectivamente, en la Figura 2A, B) en comparación con los fluoróforos populares como el isotiocianato de fluoresceína, la rodamina o la GFP, lo que lo hace espectralmente separable de ellos y, por lo tanto, útil para la obtención de imágenes multicolor. En segundo lugar, la fluorescencia de ND6 exhibe un aumento de más de ocho veces en su fluorescencia en presencia de micelas (Figura 2C), lo que sugiere una fuerte dependencia de la membrana. Estudios previos de imágenes de fluorescencia de células vivas con diferentes tipos de células mostraron una excelente tinción de membrana por ND620. En tercer lugar, cuando el pH de la solución disminuye de 7,5 (que se encuentra comúnmente en ambientes extracelulares o citosólicos) a 5,5 (que se encuentra comúnmente en endosomas y lisosomas), ND6 muestra un aumento de aproximadamente el doble en la fluorescencia (Figura 2D), lo que muestra su sensibilidad al pH. Además, la simulación de dinámica molecular indica que ND6 se integra fácilmente en la bicapa lipídica con su andamio ND hacia afuera de la membrana y el residuo de piperazina muestra fuertes interacciones con los grupos principales de fosfolípidos (Figura 3). En conjunto, estas características hacen de ND6 un análogo lipídico fluorescente ideal para visualizar y medir el recambio lipídico de la membrana durante la exocitosis/endocitosis.
En este artículo se presenta un método para estudiar la tasa de recambio y la dinámica de los lípidos SV utilizando neuronas del hipocampo de ratón cultivadas. Al estimular las neuronas con soluciones de Tyrode con alto contenido de K+ , los SV y la membrana plasmática se cargaron con ND6 (Figura 4A, B). Posteriormente, las neuronas fueron reestimuladas con diferentes estímulos seguidos de soluciones de Tyrode que contienen NH4Cl y pH 5,5 (Figura 4D). Este protocolo facilita la medición cuantitativa de las tasas de exocitosis y endocitosis ensambladas en diferentes circunstancias (Figura 4C).
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Protocol
El siguiente protocolo incluye (1) un procedimiento simplificado para establecer cultivos corticales y de hipocampo de ratón basado en un protocolo bien establecido22, (2) una breve introducción a una configuración de microscopio de epifluorescencia para neuronas vivas, (3) una descripción detallada de la carga y la obtención de imágenes de ND6 en neuronas de ratón, (4) una discusión sobre la cuantificación del tráfico de membrana por la señal ND6. Todos los procedimientos siguen las pautas de bioseguridad e IACUC en la Universidad Atlántica de Florida. La síntesis de ND6 ha sido descrita previamente20.
1. Preparación de cultivos corticales e hipocampales de ratón
NOTA: Si no se especifica lo contrario, todos los pasos deben realizarse en una campana de flujo laminar de nivel 2 de bioseguridad. Esterilice todas las herramientas y materiales.
- Use pinzas de tamaño 5 para colocar cubreobjetos de vidrio en placas de cultivo de pocillos múltiples.
NOTA: Por ejemplo, una placa de 24 pocillos es ideal para cubreobjetos de 12 mm
. - Añadir el volumen adecuado de matrices extracelulares para recubrir la superficie del cultivo celular (p. ej., 75 μL de solución de matriz de membrana basal por cubreobjetos de 12 mm ; véase la Tabla de Materiales)
- Coloque las placas preparadas en la incubadora de cultivo de tejidos (5% CO2, 100% de humedad y 37 °C) durante 1-4 h para permitir la reticulación de la matriz de la membrana basal.
- Sacrificar a los animales, abrir el cráneo y transferir todo el cerebro a una placa de Petri de 35 mm con 3 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) que contiene un 20% de suero fetal bovino (H+20). Corte el cerebro a lo largo de la línea media y separe las cortezas y el hipocampo en una campana de disección de flujo laminar para reducir la contaminación.
- Use microtijeras para cortar los pañuelos en trozos pequeños (~ 1 mm3). Transfiera esos tejidos a un tubo cónico de 15 mL que contenga 5 mL de H+20.
- Lavar los tejidos tres veces con 5 mL de H+20 y tres veces con 5 mL de HBSS.
- Añadir 1,5 mL de tripsina al 1% con ácido etilendiaminotetraacético e incubar a 37 °C durante 10 min para la digestión enzimática.
- Repita el paso 1.6 y utilice el vacío para aspirar HBSS al final.
- Disociar los tejidos mecánicamente en 1 mL de HBSS que contenga 2,95 g/L de MgSO4•7H2O utilizando una pipeta de vidrio pulido al fuego.
- Centrifugar la suspensión celular a 400 × g, 4 °C durante 5 min.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en un volumen adecuado de medios de cultivo para obtener una concentración de ~10.000.000 de células/ml.
- Coloque las células en placas a ~1.000.000 de células/cm2 y coloque el cultivo en la incubadora (5% de CO2, 100% de humedad y 37 °C) durante 1-4 h para facilitar la fijación de las células a los cubreobjetos de vidrio.
- Agregue un volumen apropiado de medio de cultivo (p. ej., 1 ml por pocillo para una placa de 24 pocillos). Añadir el mismo volumen de medio de cultivo después de 1 semana. Después de 2 semanas, reemplace la mitad del medio de cultivo existente con medios nuevos cada semana.
.2. Configuración del microscopio para la obtención de imágenes de fluorescencia de células vivas
NOTA: Una configuración de imagen ejemplar (Figura 5) incluye al menos un microscopio de fluorescencia invertida (consulte la Tabla de Materiales), una fuente de luz de fluorescencia con obturador automático, juegos de filtros de fluorescencia (por ejemplo, para obtener imágenes de ND6, use 405/10 BP para la excitación, 495 LP para dicroica y 510/20 BP para la emisión) y una cámara de alta sensibilidad (Tabla de Materiales), todos los cuales están controlados por un software de adquisición de imágenes (Tabla de Materiales).
- Prepare una cámara de imágenes que permita el control de la temperatura y la entrada/salida de la solución para la obtención de imágenes de fluorescencia de células vivas.
NOTA: Por ejemplo, en este protocolo se utilizó una cámara de imágenes de baño abierto modificada fijada en una plataforma de calentamiento (Figura 6). - Configure un dispositivo programable para cambiar las soluciones de perfusión y administrar el estímulo eléctrico en puntos de tiempo definidos durante la obtención de imágenes.
NOTA: La sincronización de hardware y software es necesaria para los análisis cuantitativos (Figura 7). Por ejemplo, en este protocolo, se utilizó una salida de disparo de la cámara de imágenes para iniciar un programa informático que controla un dispositivo de conmutación automática, que controla un sistema de perfusión multicanal y un estimulador de pulso cuadrado. - Para obtener imágenes conjuntas de dos o más reporteros fluorescentes, realice imágenes de fluorescencia multicanal, ya sea cambiando secuencialmente los conjuntos de filtros o dividiendo simultáneamente diferentes emisiones de fluorescencia y proyectándolas en la misma cámara.
3. Carga e imagen de ND6 en cultivos neuronales
- Pesar una cantidad adecuada de ND6, disolverlo en dimetilsulfóxido (DMSO) y dejar que se solubilice a temperatura ambiente; Sonicate brevemente (p. ej., 3 min). Filtre la solución madre cruda con un filtro de 0,22 μm para eliminar los agregados de colorante grandes. Después de la filtración, determine la concentración de colorante mediante espectroscopia de absorción a 405 nm utilizando un espectrofotómetro convencional o de microvolumen utilizando ε = 10.700 M-1 cm-1.
- Antes de la aplicación, diluir la solución madre a una concentración de 1 μM utilizando la solución de baño. Mantenga la solución madre a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Marcaje de endosomas y vesículas sinápticas
- Para etiquetar de forma ubicua compartimentos de membrana endocitados, como endosomas, añadir solución madre de ND6 (p. ej., 1 mM en DMSO) al medio de cultivo a la concentración final de 1 μM e incubar al 5 % de CO2, 100 % de humedad y 37 °C durante 30 min. Para reducir el alcance del marcaje SV, suprimir farmacológicamente la actividad neuronal espontánea. Por ejemplo, utilizar la tetrodotoxina para bloquear los potenciales de acción o el ácido 2,3-dioxo-6-nitro-1,2,3,4-tetrahidrobenzo[f]quinoxalina-7-sulfonamida (NBQX) y el ácido D-(-)-2-amino-5-fosfonopentanoico (D-AP5) para inhibir la transmisión excitatoria23.
- Para etiquetar selectivamente los SV, utilice una estimulación breve pero fuerte para evocar la exo/endocitosis presináptica. En primer lugar, transfiera la(s) cubreobjeto(s) de cultivo a una placa de Petri de 35 mm que contenga 2 ml de solución normal de Tyrode a temperatura ambiente. En segundo lugar, diluir la solución madre de ND6 en una solución de Tyrode con alto contenido de K+ (90 mM de KCl) a la concentración final de 1 μM. En tercer lugar, reemplace la solución normal de Tyrode en la placa de Petri con una solución de Tyrode con alto contenido de K+ que contenga ND6 e incube a temperatura ambiente durante 2 minutos.
- Transfiera el cultivo celular marcado con ND6 a la cámara de imágenes llena de solución de Tyrode normal precalentada que contiene 10 μM de NBQX y 10 μM de D-AP5.
- Ajuste la velocidad de perfusión a ~0,2 mL/s (es decir, 1 gota por segundo) e inicie la perfusión de la solución normal precalentada de Tyrode que contiene NBQX y D-AP5 para eliminar el exceso de ND6 en el cultivo.
- Ajuste el enfoque y localice el campo de visión apropiado que contenga neuronas sanas y bien distribuidas que lleven neuritas conectadas. Evite las áreas que contengan coloides de colorante no resueltos.
- Pruebe la obtención de imágenes de células cargadas de ND6 con diferentes tiempos de exposición para identificar los mejores ajustes de imagen.
NOTA: Para obtener el mejor tiempo de exposición, la intensidad de fluorescencia de píxeles más alta en la imagen resultante es aproximadamente la mitad del rango de bits (por ejemplo, para una imagen de 16 bits, el rango de bits es de 0 a 65,535), lo que permitirá un aumento adicional de la fluorescencia cuando se aplique la solución de baño ácido. El tiempo de exposición seleccionado debe utilizarse para todas las imágenes ND6. - Establezca el protocolo de estimulación y perfusión, el intervalo de fotogramas y la duración total. Por ejemplo, en el siguiente protocolo, utilice una línea de base de 30 s, una estimulación de campo eléctrico de 10 s a 30 Hz, una recuperación de 50 s, 120 s 90 mM K+, una recuperación de 60 s, una solución de Tyrode de 60 s con 50 mM deNH 4Cl, una solución de Tyrode de 60 s a pH 5,5 y un intervalo de fotogramas de 3 s.
- Iniciar la adquisición de imágenes acompañada de la estimulación y perfusión sincronizadas. Supervise la simulación y el intercambio de soluciones durante la obtención de imágenes.
- Detenga la perfusión después de que finalicen las imágenes, retire el cubreobjetos y limpie la cámara de imágenes para el siguiente ensayo.
4. Cuantificación del tráfico de membranas mediante un cambio en la fluorescencia de ND6
- Realice una copia de seguridad y/o haga una copia electrónica de todos los archivos de imagen.
- Elija un programa de análisis para la extracción de datos, por ejemplo, un software de análisis de imágenes de código abierto como ImageJ24 y/o FIJI25.
- Abra o importe una pila de imágenes en el programa de análisis.
- Establezca la primera imagen como referencia y alinee el resto con ella utilizando funciones/complementos como Rigid Registration26, que mitigará los artefactos debidos a la deriva xy. Consulte la Figura 8 para ver imágenes de ejemplo.
- Promedie todas las imágenes adquiridas durante los 30 s previos a la línea de base para producir una imagen de referencia. Guarde una copia de esta imagen para futuras consultas.
- Establezca el umbral de intensidad para generar una imagen binaria a partir de la imagen promediada de línea base.
- Utilice Watershed en ImageJ o funciones similares en otro programa para separar las neuritas o células conectadas.
- Utilice la función Analizar partícula con el tamaño de área y la circularidad adecuados para solicitar regiones de interés (ROI) correspondientes a membranas celulares, endosomas, lisosomas o botones sinápticos. Guarde todos los ROI seleccionados.
- Seleccione cuatro ROI de fondo en regiones sin celdas dentro del campo de visión.
- Mida las intensidades medias de píxeles de cada ROI en cada fotograma de la pila de imágenes y exporte los resultados para su análisis estadístico.
- Calcule la intensidad media de las ROI de fondo como el ruido de referencia, que se restará de las intensidades de píxel promedio para cada ROI.
- Promedie las tres intensidades medias más altas para cada ROI seleccionado durante la aplicación de la solución de Tyrode pH 5.5 para obtener la intensidad de fluorescencia máxima, que se define como 100% para la normalización.
- Promedie las tres intensidades medias más bajas para cada ROI seleccionado durante la aplicación de 50 mM NH4Cl para establecer la intensidad de fluorescencia mínima, que se define como 0% para la normalización.
- Calcule los cambios de fluorescencia relativos para cada ROI en función de sus propias intensidades de 0% y 100%. Derive los cambios medios de fluorescencia, la cinética de los cambios y otros valores/gráficos a partir de los datos individuales de ROI.
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Representative Results
Los SV están especializados para la liberación de neurotransmisores a través de exocitosis evocada27. Los SV tienen un lumen muy ácido (es decir, pH 5,5), que es ideal para el ND6. Utilizamos estimulación alta de K+ para evocar exo-/endocitosis SV con el fin de permitir que ND6 accediera a SV. Como era de esperar, aparecieron puntos fluorescentes de color verde brillante a lo largo de los procesos neuronales después de la carga (Figura 9A). El perfil de línea que se muestra en la Figura 4B demostró una fuerte superposición entre ND6 (curva verde) y FM4-64 puncta (curva roja). La fuerte correlación entre las intensidades de fluorescencia de ND6 y FM4-64 también sugiere una tinción SV de ND6 (Figura 9B).
Se utilizó una estimulación eléctrica y una estimulación alta de K+ para evocar la liberación del grupo fácilmente liberable (PVP, es decir, SV con alta probabilidad de liberación) y los SV del grupo de reserva (es decir, SV con baja probabilidad de liberación), respectivamente. Hubo disminuciones en la fluorescencia de ND6 en respuesta a ambos estímulos (Figura 4C y Figura 4E), lo que sugiere que ND6 reside en la membrana de SV y que la luz de SV se neutraliza (reportada por la disminución de la señal de ND6) durante la liberación de SV.
Al final de cada ensayo, se aplicaron 50 mM de NH4Cl para desacidificar SVs28 y una solución de pH 5,5 para aclarar el ND6 de la membrana superficial (Figura 4D y Figura 4F). Las diferencias en fluorescencia nos permiten determinar ND6 en la membrana superficial (~44%) y en la membrana SV (~56%). Estos números coinciden con las fracciones de la superficie y las membranas SV en los terminales del axón29, lo que sugiere que el ND6 se distribuye uniformemente a través de las membranas. Además, las señales de ND6 durante dos estímulos diferentes y dos manipulaciones de pH nos permiten estimar que la ráfaga eléctrica corta movilizó alrededor de ~31% de SVs y la estimulación alta de K+ liberó ~70% de los SVs restantes. Las tasas de disminución de la fluorescencia ND durante las estimulaciones también coinciden con la constante de tiempo para la exocitosis SV evocada previamente reportada30.
El tamaño compacto de ND6 conduce a una perturbación mucho menos estérica de las membranas celulares que el método de marcadoanterior 14 y, por lo tanto, ofrece una medición más precisa del tráfico de SV. Apoyando esa idea, una concentración de carga diez veces mayor no mostró diferencias significativas en la decoloración de FM4-64 durante la estimulación (Figura 10). Sin embargo, se sigue recomendando 1μM dada su tinción moderada en astrocitos.
Dado que la exocitosis o endocitosis del SV afecta al colesterol (un lípido abundante y vital en las membranas neuronales), hemos utilizado imágenes de ND6 para preguntar cómo afecta el colesterol de membrana a la liberación y recuperación del SV. Un tratamiento de 1 mM durante 90 minutos de metil-β-ciclodextrina (MβCD) puede eliminar ~ 10% de colesterol de la membrana de la superficie neuronal31, imitando la disminución del colesterol de membrana asociada al envejecimiento. Bajo una estimulación eléctrica exhaustiva, el tratamiento con MβCD redujo significativamente la liberación y recuperación de SV medida por imágenes de ND6 (Figura 11A), lo que sugiere que el colesterol de membrana facilita la exo/endocitosis de SV32. También evaluamos la contribución del colesterol a la reposición del grupo SV, que es crucial para la fidelidad de la neurotransmisión33. Se aplicaron dos estimulaciones eléctricas con un intervalo de 10 s en presencia de bafilomicicina A1 (BafA1). BafA1 inhibe selectivamente la v-ATPasa que reacidifica los SV. Al bloquear de forma aguda la reacidificación de los SV recuperados, BafA1 impide la recuperación de la fluorescencia de ND6 después de la estimulación (Figura 11B). La disminución de ND6 durante el segundo estímulo solo debería provenir de los SV nacientes que reponen el PVP vacío. En comparación con el control simulado, se observó una respuesta de ND6 significativamente menor al segundo estímulo en las neuronas pretratadas con MβCD (es decir, menor amplitud y decaimiento más rápido de la reducción de la fluorescencia de ND6). Este resultado apoya la idea de que el colesterol desempeña un papel fundamental en el reclutamiento de nuevos SV para la PRR.
Figura 1: Esquema general de síntesis para la sonda ND6. Esta figura ha sido modificada a partir de Thomas et al.20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Propiedades del ND6. (A y B) Propiedades solvatocrómicas del ND6. Espectros de absorbancia (A) y espectros de fluorescencia (B) en varios disolventes excitados a 405 nm. (C) Comparación de la intensidad de fluorescencia de ND6 en agua (rojo) y solución de octilglucósido al 1% a 1 μM. (D) La fluorescencia de ND6 en función del pH en una solución OG al 1% es proporcional al estado de protonación del grupo de cabeza de piperazina (pKa calculado = 7,4). El recuadro muestra el estado de protonación calculado de la fracción de piperazina ND6 (pKa predicho = 8,83). La línea discontinua representa los valores ajustados. Esta figura ha sido modificada a partir de Thomas et al.20. Abreviaturas: DCM = diclorometano; MeCN = acetonitrilo; DMSO = dimetilsulfóxido; EtOH = alcohol etílico; MeOH = alcohol metílico; Abs= absorbancia; Em = emisión; OG = octilglucósido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Instantánea de la trayectoria de la simulación de dinámica molecular. Interacción de la sonda ND6 en la membrana POPC (panel izquierdo). El grupo principal de piperazina interactúa fuertemente con los grupos fosfato (panel derecho) a través de interacciones electrostáticas. La flecha negra (panel derecho) apunta al enlace CN entre el anillo de naftalimida y la piperazina. Los resultados muestran que el grupo piperazina se mueve solo ligeramente con una preferencia por el ángulo diedro (átomos mostrados) entre 90 y 120 grados mientras mantiene su conformación de silla. Esta figura ha sido modificada a partir de Thomas et al.20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: ND6 marca las vesículas sinápticas e informa de su liberación y recuperación en las terminales nerviosas. (A) Imágenes de muestra de FM4-64 (rojo), ND6 (verde) y superposición (amarillo). Las neuritas y el soma de una neurona fueron perfilados con líneas. Las imágenes de línea recta (ancho de 20 píxeles) están junto a las imágenes correspondientes. Las puntas de flecha apuntan a botones sinápticos marcados por FM4-64. Barras de escala = 100 μm. (B) Los perfiles de línea de las intensidades de fluorescencia FM4-64 y ND6 exhiben una semejanza significativa. (C) Trazas de muestra de cambios de fluorescencia de ND6 en botones sinápticos indicados por puntas de flecha en A en respuesta a estímulos. (D) Trazas de muestra de cambios en la fluorescencia de ND6 en respuesta a soluciones de NH4Cl y pH 5.5 Tyrode. (E) La eliminación de la coloración de FM4-64 se acopla temporalmente a los cambios de intensidad de ND6. Los datos se representan como media ± la intensidad de fluorescencia de S.E.M. (F) ND6, pero no la intensidad de FM4-64, disminuyó y aumentó con las aplicaciones de 50 mM de NH4Cl y pH 5,5 de las soluciones de Tyrode, respectivamente. Los datos se representan como media ± S.E.M. Esta figura ha sido modificada a partir de Thomas et al.20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Configuración de imágenes basada en un microscopio invertido Nikon-TiE. Se anotan cuatro componentes necesarios para la obtención de imágenes de fluorescencia de células vivas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Configuración de la estimulación y la imagen. Configuración modificada a partir de una cámara RC-26 de Warner Instruments y una plataforma de calentamiento PH-1 para el control de la temperatura y el intercambio de soluciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Diagrama de configuraciones de dispositivos para la adquisición de imágenes con estimulaciones sincronizadas e intercambios de soluciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Imágenes de muestra que muestran los pasos clave en el análisis de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: ND6 resalta las vesículas sinápticas agrupadas en los terminales presinápticos. (A) Imágenes de muestra FM4-64 (rojo) y ND6 (verde) co-cargando a gran aumento. Barra de escala = 30 μm. (B) Diagrama de dispersión de las intensidades medias de fluorescencia de FM4-64 y ND6 a las mismas ROIs correspondientes a los botones sinápticos y al ajuste de regresión lineal. r = 0,8353; p = 1,7 × 10-8; campos de visión N = 9; ROI n = 450. El umbral para FM4-64 es de 1.200 UA (unidad arbitraria) y de 160 UA para ND6. Esta figura ha sido modificada a partir de Thomas et al.20. Abreviatura: ROIs = regiones de interés. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10: ND6 no interviene con los SV. (A) Recambio de SV representado por ND6 (por estímulo eléctrico) después de una carga de ND6 de 1 o 10 μM. (B) Volumen de negocios SV medido por FM4-64 (con el estímulo eléctrico). Esta figura ha sido modificada a partir de Thomas et al.20. Abreviatura: SVs = vesículas sinápticas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 11: La reducción del colesterol perjudica el recambio del SV. (A) Recambio del SV representado por ND6 por debajo de 10 Hz, estímulo eléctrico de 120 s en neuronas de control y tratadas con MβCD. (B) La bafilomicicina A1 previene la reacidificación de los SV reciclados (es decir, no hay recuperación de fluorescencia de ND6 después de la disminución provocada por la estimulación) y aclara aún más el impacto de MβCD en la reposición de SV. Esta figura ha sido modificada a partir de Thomas et al.20. Abreviatura: SV = vesícula sináptica; MβCD = metil-β-ciclodextrina; BafA1 = bafilomicina A1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los colorantes a base de lípidos, como el 1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3′-tetrametilindocarbocianina (DiI) y el perclorato de 3,3′-dioctadeciloxacarbocianina (DiO), se han utilizado durante mucho tiempo para ilustrar la morfología celular y rastrear procesos celulares como las proyecciones axónicas de las neuronas. Los colorantes de estirilo, como el FM1-43, se han inventado y utilizado con éxito para el estudio de la exocitosis34. Debido a su baja afinidad con la membrana, etiquetan selectivamente las vesículas endocitadas donde quedan atrapadas, mientras que los colorantes que quedan en la membrana plasmática se eliminan por perfusión constante. Como tal, los colorantes de estirilo no son adecuados para el monitoreo continuo del reciclaje de vesículas.
La reciente invención de la GFP sensible al pH (es decir, pHluorin) hizo posible visualizar repetidamente el reciclaje de vesículas cuando se etiquetan a una proteína de membrana vesicular como VAMPII o Synaptophysina35. Siguiendo el mismo principio, el marcaje de un fluoróforo sensible al pH en las moléculas lipídicas permite el seguimiento del reciclaje de la membrana lipídica durante los ciclos de exocitosis/endocitosis14. En este caso, al ser una sola entidad de lípidos, ND6 es más fácil de preparar, más simple de aplicar, más eficiente para marcar las membranas lipídicas, menos disruptivo para las células, más estable para permanecer en las membranas celulares y, por lo tanto, más confiable para la obtención de imágenes de fluorescencia. Su dependencia de la membrana y su sensibilidad al pH inverso permiten una tinción más brillante de orgánulos ácidos como SV y endosomas.
Además, también es factible etiquetar estos orgánulos ácidos o terminales presinápticos en tejidos como las rodajas del hipocampo, ya que el ND6 distribuido de forma inespecífica se apaga por pH neutro en espacios extracelulares o citosólicos. Además, su gran desplazamiento de Stokes hace que ND6 sea ideal para la obtención de imágenes multifotónicas de tejidos profundos. Por lo tanto, el ND6 y otros fluoróforos basados en lípidos sensibles al pH permiten la medición óptica en tiempo real del tráfico de lípidos y membranas celulares entre la membrana plasmática y el aparato intracelular, como los SV y los endosomas, para múltiples rondas de exocitosis o endocitosis. Dado que las sinapsis y los SV son vitales para la neurotransmisión, ND6 es indudablemente útil para estudiar la fisiología sináptica.
Dado el diseño modular de estos análogos lipídicos, es factible conjugar ND con otros lípidos, como fosfolípidos y esfingolípidos, en varios tipos de membranas celulares u orgánulos. Además, los grupos ND pueden sustituirse por otros fluoróforos sensibles al medio ambiente para detectar otros factores ambientales, como la concentración de calcio o zinc dentro o fuera de las células u orgánulos. Además, los fluoróforos con diferentes espectros de emisión se pueden unir a los lípidos de membrana para ampliar la paleta de indicadores lipídicos. Para todas estas modificaciones, el enlazador entre los lípidos y el ND u otros grupos fluorescentes se puede ajustar para lograr mejores propiedades fotográficas y/o sensibilidades deseadas.
Este protocolo describe el uso de ND6 en la visualización del recambio de SV mediante imágenes de células vivas. Los pasos críticos incluyen la carga, las estimulaciones sincronizadas y la cuantificación de fluorescencia, todo lo cual afecta significativamente la calidad de los resultados. Además, los parámetros/ajustes utilizados en esos pasos pueden modificarse según las necesidades del estudio. Por ejemplo, la estimulación durante la carga se puede ajustar (duración más corta o más larga) para permitir el acceso a diferentes grupos de SV (grupos con probabilidades altas o bajas de liberación, respectivamente). Para la obtención de imágenes de fluorescencia de células vivas, es importante lograr un equilibrio entre la salud celular y la intensidad de la fluorescencia, lo que es particularmente importante en este caso. Esto se debe a que la excitación del ND6 es cercana a los rayos UV (es decir, 405 nm), lo que puede causar más fototoxicidad y descomposición del tinte que la luz visible. Por lo tanto, es importante ajustar la potencia de excitación, el tiempo de exposición, la velocidad de fotogramas y la duración de la imagen para minimizar el fotodaño y maximizar la calidad de la señal.
ND6 es una sonda muy interesante. Su gran desplazamiento de Stokes hizo posible su uso simultáneo con otros tintes de membrana como el FM4-6420. Y lo que es más importante, es un candidato donante adecuado para la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) y puede ser excitado por la luz púrpura, lo que será mucho menos probable que coexcite al receptor de FRET. Los colorantes que imitan a los lípidos, como el ND6, permiten estudiar las interacciones entre las proteínas de membrana y los lípidos durante la exocitosis y la endocitosis. La asociación y disociación dependiente del pH entre las proteínas de membrana y los lípidos se magnificará en la luz ácida de los SV o endosomas, lo que facilitará la exploración del papel de los lípidos de membrana en la endocitosis y clasificación mediada por receptores. En resumen, ND6 y sus derivados pueden ampliar significativamente la caja de herramientas para estudiar los lípidos de membrana y su tráfico en células vivas.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la subvención de la Oficina de Investigación e Indagación de Pregrado de la Universidad Atlántica de Florida (M.J.S.), la subvención piloto 20A17 (Q.Z.) del Departamento de Salud de Florida Ed y Ethel Moore (Q.Z.), la subvención de la Asociación de Alzheimer AARG-NTF-19-618710 (Q.Z.) y la subvención NIA R21 AG061656-01A1 (Q.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digidata 1440A Data Acquistion System | Molecular Devices | Digidata 1440A | For synchronized stimulation and solution exchange |
| Dual Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | For live-cell imaging |
| Fetal Bovine Serum | OMEGA Scientific | FB-01 | For making H+20 solution used in dissection and tissue culture |
| Hamamatsu Flash4.0 sCOMS camera | Hamamatsu Inc. | C13440-20CU | high-sensitivity camera |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | For making H+20 solution used in dissection and tissue culture |
| Heated Platform | Warner Instruments | PH-1 | For live-cell imaging |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | For tissue culture |
| Micro-G Vibration Isolation Table | TMC | 63-564 | For live-cell imaging |
| Micro-manager | https://micro-manager.org/ | NA | For image acquisition control |
| Multi-Line In-Line Solution Heater | Warner Instruments | SHM-6 | For live-cell imaging |
| Neurobasal Plus Medium | THermoFisher Scientific | A3582901 | For tissue culture |
| Nikon Ti-E Inverted Microscope | Nikon | Ti-E/B | For live-cell imaging |
| ORCA-Flash4.0 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C1340-20CU | For live-cell imaging |
| Perfusion Chamber | Warner Instruments | RC-26G | For live-cell imaging |
| Six-Channel Valve Control Perfusion System | Warner Instruments | VC-6 | For solution exchange |
| Square Pulse Stimulator | Grass Instrument | SD9 | For electric field stimulation |
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