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Neuroscience

पीएच-संवेदनशील फ्लोरोसेंट लिपिड एनालॉग ND6 के साथ झिल्ली लिपिड टर्नओवर को मापना

Published: July 29, 2021 doi: 10.3791/62717
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 3, 3, 1,2
1The Brain Institute at Florida Atlantic University, 2Department of Biomedical Sciences, Florida Atlantic University, 3Department of Chemistry and Biochemistry, Florida Atlantic University

Summary

यह प्रोटोकॉल एक प्रतिदीप्ति इमेजिंग विधि प्रस्तुत करता है जो सेल एक्सोसाइटोसिस और एंडोसाइटोसिस चक्र के दौरान लिपिड झिल्ली तस्करी की निगरानी के लिए पीएच-संवेदनशील लिपिड फ्लोरोफोर्स के एक वर्ग का उपयोग करता है।

Abstract

एक्सो-/एंडोसाइटोसिस एक सामान्य प्रक्रिया है जो कोशिकाओं और उनके पर्यावरण के बीच और विभिन्न कोशिकाओं के बीच बायोमोलेक्यूल्स के आदान-प्रदान की मध्यस्थता करती है। विशिष्ट कोशिकाएं इस प्रक्रिया का उपयोग शरीर के महत्वपूर्ण कार्यों को निष्पादित करने के लिए करती हैं जैसे कि β कोशिकाओं से इंसुलिन स्राव और रासायनिक सिनेप्स से न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज। इसके शारीरिक महत्व के कारण, एक्सो- / एंडोसाइटोसिस कोशिका जीव विज्ञान में सबसे अधिक अध्ययन किए गए विषयों में से एक रहा है। जीन और प्रोटीन स्तर पर इस प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए कई उपकरण विकसित किए गए हैं, जिसके कारण इस प्रक्रिया में भाग लेने वाली प्रोटीन मशीनरी के बारे में बहुत कुछ जाना जाता है। हालांकि, झिल्ली लिपिड कारोबार को मापने के लिए बहुत कम तरीके विकसित किए गए हैं, जो एक्सो- / एंडोसाइटोसिस का भौतिक आधार है।

यह पत्र पीएच-निर्भर प्रतिदीप्ति का प्रदर्शन करने वाले नए फ्लोरोसेंट लिपिड एनालॉग्स का एक वर्ग पेश करता है और प्लाज्मा झिल्ली और स्रावी पुटिकाओं के बीच लिपिड रीसाइक्लिंग का पता लगाने के लिए उनके उपयोग को प्रदर्शित करता है। सरल पीएच जोड़तोड़ द्वारा सहायता प्राप्त, वे एनालॉग सतह और इंट्रासेल्युलर झिल्ली डिब्बों में लिपिड वितरण की मात्रा का ठहराव करने की अनुमति देते हैं, साथ ही एक्सो- / एंडोसाइटोसिस के दौरान लिपिड टर्नओवर दर की माप भी करते हैं। ये उपन्यास लिपिड रिपोर्टर कोशिका जीव विज्ञान और तंत्रिका विज्ञान जैसे विभिन्न जैविक अनुसंधान क्षेत्रों के लिए बहुत रुचि रखते होंगे।

Introduction

लिपिड बाइलेयर सबसे आम बायोमोलेक्यूल असेंबली में से एक है और सभी कोशिकाओं के लिए अपरिहार्य है। कोशिकाओं के बाहर, यह प्लाज्मा झिल्ली बनाता है जो कोशिकाओं और उनके पर्यावरण को आपस में जोड़ता है; कोशिकाओं के अंदर, यह निर्दिष्ट कार्यात्मकताओं के लिए विशेष विभिन्न जीवों को कम्पार्टमेंट करता है। अभी भी गतिशील होने के बजाय, लिपिड झिल्ली लगातार संलयन और विखंडन का अनुभव करती है, जो बायोमटेरियल परिवहन, ऑर्गेनेल सुधार, आकृति विज्ञान परिवर्तन और सेलुलर संचार की मध्यस्थता करती है। निस्संदेह, लिपिड झिल्ली लगभग सभी सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए भौतिक आधार है, और इसकी शिथिलता कैंसर1 से अल्जाइमर रोग2 तक के विभिन्न विकारों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। हालांकि लिपिड अणु प्रोटीन की तुलना में बहुत कम विविध हैं, झिल्ली अनुसंधान अब तक मुख्य रूप से प्रोटीन-केंद्रित रहा है। उदाहरण के लिए, एक्सोसाइटोसिस 3,4,5 में लिपिड के बारे में प्रोटीन मशीनरी के बारे में बहुत कुछ जाना जाता है। इसके अलावा, संगठन, वितरण, गतिशीलता, और सतह और intracellular झिल्ली भर में लिपिड के homeostasis काफी हद तक झिल्ली प्रोटीन6 की तुलना में बेरोज़गार रहते हैं.

यह आश्चर्य की बात नहीं है क्योंकि आधुनिक आणविक जीव विज्ञान तकनीक, जैसे कि उत्परिवर्तन, लिपिड के बजाय प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए एक पद्धतिगत लाभ प्रदान करते हैं। उदाहरण के लिए, वेसिकुलर प्रोटीन के लिए पीएच-संवेदनशील हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (उर्फ, पीएचलुओरिन) की ट्रांसजेनिक टैगिंग एक्सो-/ एंडोसाइटोसिस 7,8,9के दौरान वेसिकुलर प्रोटीन टर्नओवर की मात्रा और दर के मात्रात्मक माप की सुविधा प्रदान करती है। हालांकि, विवो में आनुवंशिक रूप से झिल्ली लिपिड को संशोधित करना लगभग असंभव है। इसके अलावा, प्रोटीन मात्रा और वितरण के गुणात्मक और यहां तक कि मात्रात्मक जोड़तोड़ लिपिड10 की तुलना में बहुत अधिक संभव हैं. फिर भी, देशी और सिंथेटिक फ्लोरोसेंट लिपिड को अलग किया गया है और इन विट्रो में और विवो11 में अंतर्जात झिल्ली लिपिड अनुकरण करने के लिए विकसित किया गया है। व्यापक रूप से इस्तेमाल फ्लोरोसेंट लिपिड का एक समूह स्टाइलिल रंजक, उदाहरण के लिए, एफएम 1-43, जो झिल्ली बढ़ाया प्रतिदीप्ति प्रदर्शन और न्यूरॉन्स12 में synaptic पुटिका (एसवी) रिलीज का अध्ययन करने में एक शक्तिशाली उपकरण हैं. हाल ही में, पर्यावरण के प्रति संवेदनशील लिपिड रंगों का आविष्कार किया गया है और व्यापक रूप से झिल्ली क्षमता11, चरण आदेश13, और स्राव14 सहित विभिन्न सेल झिल्ली गुणों का अध्ययन करने के लिए संवाददाताओं की एक नई श्रेणी के रूप में इस्तेमाल किया गया है.

लिपिड मिमेटिक्स का एक नया वर्ग जिसका प्रतिदीप्ति पीएच-संवेदनशील (जैसे, पीएचलुओरिन) और झिल्ली-संवेदनशील (जैसे, एफएम 1-43) दोनों है, प्लाज्मा झिल्ली और एंडोसोम / लाइसोसोम में लिपिड वितरण और एक्सो- / एंडोसाइटोसिस के दौरान लिपिड यातायात को सीधे मापने के लिए विकसित किया गया था। इंट्रामोल्युलर चार्ज ट्रांसफर के कारण पुश-पुल विशेषताओं का प्रदर्शन करने वाले प्रसिद्ध सॉल्वेटोक्रोमिक फ्लोरोफोर्स को इस उद्देश्य के लिए चुना गया था। मौजूदा solvatochromic fluorophores के बीच, 1,8-नेफ्थालिमाइड (एन डी) पाड़ टैगिंग के लिए बहुमुखी, संशोधित करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है, और फोटो भौतिकी15 में अद्वितीय है और इसलिए डीएनए intercalators, कार्बनिक प्रकाश उत्सर्जक डायोड, और biomolecule सेंसर 16,17,18में इस्तेमाल किया गया है.

एन डी पाड़ की सी 4 स्थिति के लिए एक इलेक्ट्रॉन-दान समूह संलग्न एक धक्का पुल संरचना, जो उत्तेजित राज्य19,20 में इलेक्ट्रॉन घनत्व पुनर्वितरण द्वारा एक वृद्धि हुई द्विध्रुवीय पल की ओर जाता है उत्पन्न करता है. इस तरह के एक इंट्रामोल्युलर चार्ज ट्रांसफर बड़ी क्वांटम पैदावार और स्टोक्स शिफ्ट पैदा करता है, जिसके परिणामस्वरूप उज्ज्वल और स्थिर प्रतिदीप्ति21. इस समूह ने हाल ही में एनडी मचान के आधार पर सॉल्वेटोक्रोमिक लिपिड एनालॉग्स की एक श्रृंखला विकसित की है और उन्हें अच्छी सिंथेटिक पैदावार20 के साथ प्राप्त किया है।

स्पेक्ट्रोस्कोपिक लक्षण वर्णन से पता चलता है कि उन उत्पादों के बीच, एनडी 6 में सबसे अच्छा प्रतिदीप्ति गुण (चित्रा 1)20है। सबसे पहले, इसमें फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट, रोडामाइन, या जीएफपी जैसे लोकप्रिय फ्लोरोफोर्स की तुलना में अच्छी तरह से अलग उत्तेजना और उत्सर्जन चोटियों (यानी, ~ 400 एनएम और ~ 520 एनएम, क्रमशः चित्रा 2 ए, बी में) है, जिससे यह वर्णक्रमीय रूप से अलग हो जाता है और इस प्रकार बहुरंगा इमेजिंग के लिए उपयोगी है। दूसरा, एनडी 6 प्रतिदीप्ति एक मजबूत झिल्ली-निर्भरता का सुझाव देते हुए, मिसेल(चित्रा 2सी)की उपस्थिति में इसकी प्रतिदीप्ति में आठ गुना से अधिक वृद्धि प्रदर्शित करता है। विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के साथ पूर्व लाइव-सेल प्रतिदीप्ति इमेजिंग अध्ययनों ने एनडी 620 द्वारा उत्कृष्ट झिल्ली धुंधला दिखाया। तीसरा, जब समाधान का पीएच 7.5 (आमतौर पर बाह्य या साइटोसोलिक वातावरण में पाया जाता है) से 5.5 (आमतौर पर एंडोसोम और लाइसोसोम में पाया जाता है) से कम हो जाता है, तो एनडी 6 प्रतिदीप्ति (चित्रा 2 डी) में लगभग दो गुना वृद्धि दिखाता है, इसकी पीएच-संवेदनशीलता दिखा रहा है। इसके अलावा, आणविक गतिशीलता सिमुलेशन इंगित करता है कि एनडी 6 आसानी से लिपिड बाइलेयर में एकीकृत होता है, जिसमें झिल्ली से बाहर का सामना करना पड़ता है और पाइपरज़ीन अवशेष फॉस्फोलिपिड सिर समूहों(चित्रा 3)के साथ मजबूत बातचीत दिखाते हैं। कुल मिलाकर, ये विशेषताएं एनडी 6 को एक्सो-/ एंडोसाइटोसिस के दौरान झिल्ली लिपिड टर्नओवर की कल्पना और मापने के लिए एक आदर्श फ्लोरोसेंट लिपिड एनालॉग बनाती हैं।

यह पत्र सुसंस्कृत माउस हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स का उपयोग करके एसवी लिपिड की टर्नओवर दर और गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। उच्च कश्मीर + टायरोड के समाधान के साथ न्यूरॉन्स उत्तेजक द्वारा, एसवी और प्लाज्मा झिल्ली एनडी 6 (चित्रा 4 ए, बी) के साथ लोड किए गए थे। इसके बाद, एनएच4सीएल युक्त और पीएच 5.5 टायरोड के समाधान(चित्रा 4डी)के बाद विभिन्न उत्तेजनाओं के साथ न्यूरॉन्स को फिर से उत्तेजित किया गया। यह प्रोटोकॉल विभिन्न परिस्थितियों में इकट्ठे एक्सोसाइटोसिस और एंडोसाइटोसिस दरों के मात्रात्मक माप की सुविधा प्रदान करता है (चित्र 4सी)।

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Protocol

निम्नलिखित प्रोटोकॉल में (1) एक अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल22 के आधार पर माउस हिप्पोकैम्पस और कॉर्टिकल संस्कृतियों की स्थापना के लिए एक सरलीकृत प्रक्रिया शामिल है, (2) लाइव न्यूरॉन्स के लिए एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप सेटअप का संक्षिप्त परिचय, (3) माउस न्यूरॉन्स में एनडी 6 लोडिंग और इमेजिंग का विस्तृत विवरण, (4) एनडी 6 सिग्नल द्वारा झिल्ली तस्करी की मात्रा का ठहराव के बारे में चर्चा। सभी प्रक्रियाएं फ्लोरिडा अटलांटिक विश्वविद्यालय में जैव सुरक्षा और IACUC दिशानिर्देशों का पालन करती हैं। ND6 के संश्लेषण पहले20 वर्णित किया गया है.

1. माउस हिप्पोकैम्पस और cortical संस्कृतियों की तैयारी

नोट: यदि अन्यथा निर्दिष्ट नहीं है, तो सभी चरणों को जैव सुरक्षा स्तर 2 लामिना का प्रवाह हुड में किया जाना चाहिए। सभी उपकरणों और सामग्रियों को स्टरलाइज़ करें।

  1. मल्टीवेल संस्कृति प्लेटों में ग्लास coverslips जगह करने के लिए आकार 5 संदंश का प्रयोग करें.
    नोट: उदाहरण के लिए, एक 24 अच्छी तरह से थाली 12 मिमी Equation 1 coverslips के लिए आदर्श है.
  2. सेल संस्कृति सतह को कोट करने के लिए बाह्य मैट्रिसेस की उचित मात्रा जोड़ें (उदाहरण के लिए, 12 मिमी Equation 1 कवरस्लिप प्रति तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स समाधान के 75 माइक्रोन; सामग्री की तालिकादेखें)
  3. बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स क्रॉसलिंकिंग की अनुमति देने के लिए 1-4 घंटे के लिए टिशू कल्चर इनक्यूबेटर (5% सीओ2, 100% आर्द्रता, और 37 डिग्री सेल्सियस) में तैयार प्लेटें रखें।
  4. जानवरों की बलि, खोपड़ी खुला, और हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) के 3 एमएल के साथ एक 35 मिमी पेट्री पकवान के लिए पूरे मस्तिष्क 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (एच + 20) शामिल. midline के साथ मस्तिष्क में कटौती, और एक लामिना का प्रवाह विच्छेदन हुड में cortices और हिप्पोकैम्पी अलग संदूषण को कम करने के लिए.
  5. छोटे टुकड़ों (~ 1 मिमी3) में ऊतकों को काटने के लिए microscissors का प्रयोग करें. उन ऊतकों को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें एच + 20 के 5 एमएल हों।
  6. एच + 20 के 5 एमएल के साथ तीन बार और एचबीएसएस के 5 एमएल के साथ तीन बार ऊतकों को धोएं।
  7. एथिलीनडायमाइन टेट्राएसेटिक एसिड के साथ 1% ट्रिप्सिन के 1.5 एमएल जोड़ें और एंजाइम पाचन के लिए 10 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  8. चरण 1.6 दोहराएं और अंत में एचबीएसएस को महाप्राण करने के लिए वैक्यूम का उपयोग करें।
  9. अग्नि-पॉलिश ग्लास विंदुक का उपयोग करके 2.95 ग्राम/एल एमजीएसओ4•7एच2ओ युक्त एचबीएसएस के 1 एमएल में यांत्रिक रूप से ऊतकों को अलग करें।
  10. 400 × ग्राम पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस।
  11. सतह पर तैरनेवाला महाप्राण और ~ 10,000,000 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए संस्कृति मीडिया की एक उचित मात्रा में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  12. ~ 1,000,000 कोशिकाओं/सेमी2 पर कोशिकाओं को प्लेट करें और ग्लास कवरस्लिप के लिए सेल लगाव की सुविधा के लिए 1-4 घंटे के लिए इनक्यूबेटर (5% सीओ2, 100% आर्द्रता, और 37 डिग्री सेल्सियस) में संस्कृति रखें।
  13. संस्कृति माध्यम की एक उचित मात्रा जोड़ें (उदाहरण के लिए, 24-अच्छी प्लेट के लिए प्रति अच्छी तरह से 1 एमएल)। 1 सप्ताह के बाद संस्कृति माध्यम की समान मात्रा जोड़ें। 2 सप्ताह के बाद, मौजूदा संस्कृति माध्यम के आधे हिस्से को हर हफ्ते ताजा मीडिया से बदलें।

2. लाइव-सेल प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप सेटअप

नोट: एक अनुकरणीय इमेजिंग सेटअप (चित्रा 5) में कम से कम एक उलटा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप ( सामग्री की तालिकादेखें), स्वचालित शटर के साथ प्रतिदीप्ति प्रकाश स्रोत, प्रतिदीप्ति फिल्टर सेट (उदाहरण के लिए, इमेजिंग एनडी 6 के लिए, उत्तेजना के लिए 405/10 बीपी का उपयोग करें, डाइक्रोइक के लिए 495 एलपी, और उत्सर्जन के लिए 510/20 बीपी), और एक उच्च संवेदनशीलता कैमरा (सामग्री की तालिका), जिनमें से सभी छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका) द्वारा नियंत्रित होते हैं।

  1. एक इमेजिंग कक्ष तैयार करें जो लाइव-सेल प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए तापमान नियंत्रण और समाधान इनपुट / आउटपुट की अनुमति देता है।
    नोट: उदाहरण के लिए, एक हीटिंग प्लेटफॉर्म पर तय एक संशोधित खुले स्नान इमेजिंग कक्ष इस प्रोटोकॉल (चित्रा 6) में इस्तेमाल किया गया था.
  2. छिड़काव समाधान स्विच और इमेजिंग के दौरान निर्धारित समय अंक पर बिजली उत्तेजना देने के लिए एक प्रोग्राम डिवाइस सेट करें.
    नोट: मात्रात्मक विश्लेषण (चित्रा 7) के लिए हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर सिंक्रनाइज़ेशन आवश्यक है। उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल में, इमेजिंग कैमरे से एक ट्रिगर आउटपुट का उपयोग एक कंप्यूटर प्रोग्राम शुरू करने के लिए किया गया था जो एक स्वचालित स्विच डिवाइस को नियंत्रित करता है, जो एक मल्टीचैनल परफ्यूजन सिस्टम और एक स्क्वायर-पल्स उत्तेजक को नियंत्रित करता है।
  3. दो या दो से अधिक फ्लोरोसेंट पत्रकारों सह छवि करने के लिए, क्रमिक रूप से फिल्टर सेट स्विचन या एक साथ अलग प्रतिदीप्ति उत्सर्जन विभाजन और एक ही कैमरे के लिए पेश द्वारा या तो multichannel प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रदर्शन.

3. लोड हो रहा है और इमेजिंग न्यूरोनल संस्कृतियों में ND6

  1. एनडी 6 की उचित मात्रा का वजन करें, इसे डाइमिथाइलसल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में भंग कर दें, और इसे कमरे के तापमान पर घुलनशील करने की अनुमति दें; संक्षेप में सोनिकेट (जैसे, 3 मिनट)। बड़े डाई समुच्चय को हटाने के लिए 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके कच्चे स्टॉक समाधान को फ़िल्टर करें। निस्पंदन के बाद, ε = 10,700 एम -1 सेमी -1 का उपयोग करके पारंपरिक या माइक्रोवॉल्यूम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 405 एनएम पर अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा डाई एकाग्रता निर्धारित करें।
  2. आवेदन से पहले, स्नान समाधान का उपयोग करके 1 माइक्रोन की एकाग्रता के लिए स्टॉक समाधान को पतला करें। अंधेरे में कमरे के तापमान पर स्टॉक समाधान रखें।
  3. एंडोसोम और सिनैप्टिक पुटिकाओं की लेबलिंग
    1. एंडोसोम जैसे एंडोसाइटोस्ड झिल्ली डिब्बों को सर्वव्यापी रूप से लेबल करने के लिए, 1 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता पर संस्कृति माध्यम में एनडी 6 स्टॉक समाधान (जैसे, डीएमएसओ में 1 मिमी) जोड़ें, और 5% सीओ2, 100% आर्द्रता, और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एसवी लेबलिंग की सीमा को कम करने के लिए, सहज न्यूरोनल गतिविधि को औषधीय रूप से दबाएं। उदाहरण के लिए, एक्शन पोटेंशिअल या 2,3-डाइऑक्सो-6-नाइट्रो-1,2,3,4-टेट्राहाइड्रोबेंजो [एफ] क्विनोक्सालाइन-7-सल्फोनामाइड (एनबीक्यूएक्स) और डी- (-) -2-एमिनो-5-फॉस्फोनोपेंटानोइक एसिड (डी-एपी 5) को अवरुद्ध करने के लिए टेट्रोडोटॉक्सिन का उपयोग उत्तेजक संचरण23 को बाधित करने के लिए करें।
    2. चुनिंदा एसवी लेबल करने के लिए, प्रीसानेप्टिक एक्सो-/ एंडोसाइटोसिस को विकसित करने के लिए संक्षिप्त लेकिन मजबूत उत्तेजना का उपयोग करें। सबसे पहले, संस्कृति coverslip (ओं) कमरे के तापमान पर सामान्य Tyrode के समाधान के 2 एमएल युक्त एक 35 मिमी Equation 1 पेट्री डिश के लिए हस्तांतरण. दूसरा, 1 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता पर उच्च-के + टायरोड के समाधान (90 एमएम केसीएल) में एनडी 6 स्टॉक समाधान को पतला करें। तीसरा, एनडी 6 युक्त उच्च कश्मीर + टायरोड समाधान के साथ पेट्री डिश में सामान्य टायरोड के समाधान की जगह और 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  4. ND6-लेबल सेल संस्कृति को 10 माइक्रोन NBQX और 10 माइक्रोन डी-एपी5 युक्त सामान्य टायरोड के समाधान से भरे इमेजिंग कक्ष में स्थानांतरित करें।
  5. छिड़काव गति को ~ 0.2 एमएल / एस (यानी, प्रति सेकंड 1 ड्रॉप) समायोजित करें और संस्कृति में अत्यधिक एनडी 6 को हटाने के लिए एनबीक्यूएक्स और डी-एपी 5 युक्त सामान्य टायरोड के समाधान के छिड़काव को शुरू करें।
  6. फोकस समायोजित करें और स्वस्थ और अच्छी तरह से फैले न्यूरॉन्स युक्त देखने के उपयुक्त क्षेत्र का पता लगाएं, जो जुड़े न्यूराइट्स को प्रभावित करते हैं। अनसुलझे डाई कोलाइड वाले क्षेत्रों से बचें।
  7. सबसे अच्छा इमेजिंग सेटिंग्स की पहचान करने के लिए अलग जोखिम समय के साथ ND6 लोड कोशिकाओं इमेजिंग का प्रयास करें.
    नोट: सबसे अच्छा जोखिम समय के लिए, जिसके परिणामस्वरूप छवि में उच्चतम पिक्सेल प्रतिदीप्ति तीव्रता बिट रेंज के बारे में आधा है (उदाहरण के लिए, एक 16 बिट छवि के लिए, बिट रेंज 0 से 65,535 है), जो एक और वृद्धि की अनुमति देगा अम्लीय स्नान समाधान लागू किया जाता है जब प्रतिदीप्ति में वृद्धि. चयनित एक्सपोज़र समय का उपयोग सभी ND6 इमेजिंग के लिए किया जाना चाहिए।
  8. उत्तेजना और छिड़काव प्रोटोकॉल, फ्रेम अंतराल, और कुल अवधि सेट करें। उदाहरण के लिए, निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, 30 s बेसलाइन, 10 s 30 हर्ट्ज इलेक्ट्रिक फील्ड उत्तेजना, 50 s रिकवरी, 120 s 90 mM K+, 60 s रिकवरी, 50-mm NH4Cl के साथ 60 s टायरोड का समाधान, पीएच 5.5 पर 60 s टायरोड का समाधान, और 3 s का फ्रेम अंतराल का उपयोग करें।
  9. सिंक्रनाइज़ उत्तेजना और छिड़काव के साथ छवि अधिग्रहण शुरू करें। इमेजिंग के दौरान सिमुलेशन और समाधान विनिमय की निगरानी करें।
  10. इमेजिंग समाप्त होने के बाद छिड़काव बंद करो, coverslip को हटा दें, और अगले परीक्षण के लिए इमेजिंग कक्ष साफ.

4. ND6 प्रतिदीप्ति में परिवर्तन द्वारा झिल्ली तस्करी की मात्रा का ठहराव

  1. बैक अप लें और/या सभी छवि फ़ाइलों की एक इलेक्ट्रॉनिक प्रतिलिपि बनाएं।
  2. डेटा निष्कर्षण के लिए एक विश्लेषण कार्यक्रम चुनें, उदाहरण के लिए, एक ओपन-सोर्स छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर जैसे कि इमेजजे24 और /
  3. विश्लेषण कार्यक्रम में एक छवि स्टैक खोलें या आयात करें।
  4. पहली छवि को संदर्भ के रूप में सेट करें और कठोर पंजीकरण26 जैसे फ़ंक्शंस/प्लगइन्स का उपयोग करके बाकी को संरेखित करें, जो xy-drifting के कारण कलाकृतियों को कम करेगा। उदाहरण के लिए चित्र 8 देखें।
  5. संदर्भ छवि बनाने के लिए 30-s पूर्व-आधार रेखा के दौरान प्राप्त सभी छवियों का औसत। भविष्य के संदर्भ के लिए इस छवि की एक प्रति सहेजें।
  6. बेसलाइन-औसत छवि से बाइनरी छवि उत्पन्न करने के लिए तीव्रता सीमा निर्धारित करें।
  7. कनेक्टिंग न्यूराइट्स या कोशिकाओं को अलग करने के लिए इमेजजे या किसी अन्य प्रोग्राम में इसी तरह के कार्यों में वाटरशेड का उपयोग करें।
  8. कोशिका झिल्ली, एंडोसोम, लाइसोसोम, या सिनैप्टिक बुटन के अनुरूप ब्याज के क्षेत्रों (आरओआई) की मांग करने के लिए उपयुक्त क्षेत्र आकार और परिपत्र के साथ विश्लेषण कण फ़ंक्शन का उपयोग करें। सभी चयनित ROI सहेजें।
  9. देखने के क्षेत्र के भीतर सेल मुक्त क्षेत्रों में चार पृष्ठभूमि आरओआई का चयन करें।
  10. छवि स्टैक के प्रत्येक फ्रेम में प्रत्येक आरओआई के लिए औसत पिक्सेल तीव्रता को मापें, और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए परिणाम निर्यात करें।
  11. आधारभूत शोर के रूप में पृष्ठभूमि आरओआई की औसत तीव्रता की गणना करें, जिसे प्रत्येक आरओआई के लिए औसत पिक्सेल तीव्रता से घटाया जाएगा।
  12. अधिकतम प्रतिदीप्ति तीव्रता प्राप्त करने के लिए पीएच 5.5 टायरोड के समाधान के आवेदन के दौरान प्रत्येक चयनित आरओआई के लिए तीन उच्चतम औसत तीव्रता का औसत, जिसे सामान्यीकरण के लिए 100% के रूप में परिभाषित किया गया है।
  13. न्यूनतम प्रतिदीप्ति तीव्रता निर्धारित करने के लिए 50 एमएम एनएच4सीएल के आवेदन के दौरान प्रत्येक चयनित आरओआई के लिए तीन सबसे कम औसत तीव्रता, जिसे सामान्यीकरण के लिए 0% के रूप में परिभाषित किया गया है।
  14. अपने स्वयं के 0% और 100% तीव्रता के आधार पर प्रत्येक आरओआई के लिए सापेक्ष प्रतिदीप्ति परिवर्तन की गणना करें। व्यक्तिगत आरओआई डेटा से माध्य प्रतिदीप्ति परिवर्तन, कैनेटीक्स और अन्य मूल्यों /

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Representative Results

एसवी विकसित एक्सो-/एंडोसाइटोसिस27 के माध्यम से न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज के लिए विशिष्ट हैं। एसवी में अत्यधिक अम्लीय लुमेन (यानी, पीएच 5.5) होता है, जो एनडी 6 के लिए आदर्श है। हमने एसवी एक्सो-/एंडोसाइटोसिस को विकसित करने के लिए उच्च के + उत्तेजना का उपयोग किया ताकि एनडी 6 को एसवी तक पहुंचने की अनुमति मिल सके। अपेक्षित रूप से, न्यूरोनल प्रक्रियाओं के साथ उज्ज्वल हरे फ्लोरोसेंट पंचर लोड हो रहा है (चित्रा 9 ए) के बाद दिखाया। चित्रा 4 बी में दिखाया लाइन प्रोफाइल एनडी 6 (हरा वक्र) और एफएम 4-64 puncta (लाल वक्र) के बीच एक मजबूत ओवरलैप का प्रदर्शन किया. एनडी 6 और एफएम 4-64 प्रतिदीप्ति तीव्रता के बीच मजबूत सहसंबंध भी एनडी 6 (चित्रा 9 बी) के एसवी-धुंधला होने का सुझाव देता है।

एक विद्युत उत्तेजना और एक उच्च K + उत्तेजना का उपयोग क्रमशः आसानी से जारी करने योग्य पूल (RRP, यानी, उच्च रिलीज संभावना वाले SVs) और रिजर्व पूल SVs (यानी, कम रिलीज संभावना वाले SVs) की रिहाई को विकसित करने के लिए किया गया था। दोनों उत्तेजनाओं (चित्रा 4सी और चित्रा 4ई)के जवाब में एनडी6 प्रतिदीप्ति में कमी आई थी, जो बताती है कि एनडी 6 एसवी झिल्ली में रहता है और एसवी लुमेन को बेअसर कर दिया जाता है (एनडी 6 सिग्नल कमी द्वारा रिपोर्ट) एसवी रिलीज के दौरान।

हर परीक्षण के अंत में, 50 एमएम एनएच4सीएल एसवी28 और पीएच 5.5 समाधान को सतह झिल्ली एनडी 6 (चित्रा 4 डी और चित्रा 4 एफ) को उज्ज्वल करने के लिए लागू किया गया था। प्रतिदीप्ति में अंतर हमें सतह झिल्ली (~ 44%) और एसवी झिल्ली (~ 56%) में एनडी 6 निर्धारित करने की अनुमति देता है। ये संख्या अक्षतंतु टर्मिनलों29 पर सतह और एसवी झिल्ली के अंशों से मेल खाती है, यह सुझाव देते हुए कि एनडी 6 समान रूप से झिल्ली में वितरित करता है। इसके अलावा, दो अलग-अलग उत्तेजनाओं और दो पीएच जोड़तोड़ के दौरान एनडी 6 सिग्नल हमें यह अनुमान लगाने की अनुमति देते हैं कि शॉर्ट इलेक्ट्रिक बर्स्ट ~ 31% एसवी के बारे में जुटाया गया और उच्च के + उत्तेजना शेष एसवी का ~ 70% जारी किया गया। उत्तेजनाओं के दौरान एनडी प्रतिदीप्ति की दर भी पहलेसे 30 की सूचना दी विकसित एसवी एक्सोसाइटोसिस के लिए समय स्थिर से मेल खाती है।

एनडी 6 का कॉम्पैक्ट आकार पिछले टैगिंग विधि14 की तुलना में कोशिका झिल्ली में बहुत कम स्टेरिक गड़बड़ी की ओर जाता है और इस प्रकार एसवी तस्करी का अधिक सटीक माप प्रदान करता है। उस विचार का समर्थन करते हुए, दस गुना उच्च लोडिंग एकाग्रता ने उत्तेजना (चित्रा 10)के दौरान एफएम 4-64 को बनाए रखने में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया। हालांकि, 1μM अभी भी astrocytes में अपने मध्यम धुंधला दे दिया सिफारिश की है.

एंडोसाइटोसिस में कोलेस्ट्रॉल (न्यूरोनल झिल्ली में एक प्रचुर मात्रा में और महत्वपूर्ण लिपिड) शामिल है, हमने एनडी 6 इमेजिंग का उपयोग यह पूछने के लिए किया है कि झिल्ली कोलेस्ट्रॉल एसवी रिलीज और पुनर्प्राप्ति को कैसे प्रभावित करता है। मिथाइल-β-साइक्लोडेक्सट्रिन (MβCD) के 90 मिनट के उपचार के लिए 1-मिमी न्यूरोनल सतह झिल्ली31 से ~ 10% कोलेस्ट्रॉल को हटा सकता है, उम्र बढ़ने से जुड़े झिल्ली कोलेस्ट्रॉल की कमी की नकल कर सकता है। एक संपूर्ण विद्युत उत्तेजना के तहत, MβCD उपचार ने SV रिलीज और ND6 इमेजिंग(चित्रा 11A)द्वारा मापा पुनर्प्राप्ति को काफी कम कर दिया, जो बताता है कि झिल्ली कोलेस्ट्रॉल एसवी एक्सो-/एंडोसाइटोसिस32की सुविधा प्रदान करता है। हमने एसवी पूल पुनःपूर्ति में कोलेस्ट्रॉल के योगदान का भी मूल्यांकन किया, जो न्यूरोट्रांसमिशन33 की निष्ठा के लिए महत्वपूर्ण है। 10-s अंतराल के साथ दो विद्युत उत्तेजनाओं को Bafilomycin A1 (BafA1) की उपस्थिति में लागू किया गया था। BafA1 चुनिंदा रूप से v-ATPase को रोकता है जो SVs को पुन: अम्लित करता है। तीव्रता से प्राप्त एसवी के reacidification अवरुद्ध करके, BafA1 उत्तेजना (चित्रा 11B) के बाद ND6 प्रतिदीप्ति वसूली रोकता है. दूसरी उत्तेजना के दौरान ND6 की कमी केवल नवजात SVs से आनी चाहिए जो खाली RRP की भरपाई करती है। दिखावा नियंत्रण की तुलना में, दूसरी उत्तेजना के लिए एक काफी छोटी एनडी 6 प्रतिक्रिया एमβसीडी (यानी, छोटे आयाम और एनडी 6 प्रतिदीप्ति में कमी के तेजी से क्षय) के साथ इलाज किए गए न्यूरॉन्स में देखी गई थी। यह परिणाम इस धारणा का समर्थन करता है कि कोलेस्ट्रॉल आरआरपी में नए एसवी की भर्ती में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

Figure 1
चित्रा 1: एनडी 6 जांच के लिए सामान्य संश्लेषण योजना। यह आंकड़ा थॉमस एट अल 20 से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एनडी 6 के गुण। (ए और बी) एनडी 6 के सोलवाटोक्रोमिक गुण। अवशोषण स्पेक्ट्रा (ए) और प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा (बी) 405 एनएम पर उत्साहित विभिन्न सॉल्वैंट्स में। (सी)पानी (लाल) में एनडी 6 की प्रतिदीप्ति तीव्रता की तुलना और 1 माइक्रोन पर 1% ऑक्टाइल ग्लूकोसाइड समाधान (डी) 1% ओजी समाधान में पीएच के एक समारोह के रूप में एनडी 6 प्रतिदीप्ति पाइपरज़ीन सिर समूह (गणना पीकेए = 7.4) के प्रोटोन राज्य के लिए आनुपातिक है। इनसेट ND6 piperazine moiety (अनुमानित pKa = 8.83) की गणना की गई प्रोटोनेशन स्थिति दिखाता है। धराशायी रेखा फिट मूल्यों का प्रतिनिधित्व करती है। यह आंकड़ा थॉमस एट अल 20 से संशोधित किया गया है। संक्षिप्ताक्षर: DCM = डाइक्लोरोमेथेन; मेकन = एसीटोनिट्राइल; डीएमएसओ = डाइमिथाइलसल्फ़ोक्साइड; EtOH = एथिल अल्कोहल; MeOH = मिथाइल अल्कोहल; एब्स = अवशोषण; Em = उत्सर्जन; OG = ऑक्टाइल ग्लूकोसाइड। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: आणविक गतिशीलता सिमुलेशन प्रक्षेपवक्र से स्नैपशॉट। पीओपीसी झिल्ली (बाएं पैनल) में एनडी 6 जांच की बातचीत। Piperazine सिर समूह इलेक्ट्रोस्टैटिक बातचीत के माध्यम से फॉस्फेट समूहों (सही पैनल) के साथ दृढ़ता से बातचीत करता है। काला तीर (दायां पैनल) नेफ्थालिमाइड रिंग और पाइपरज़ीन के बीच सी-एन बॉन्ड पर इंगित करता है। परिणाम बताते हैं कि पाइपरज़ीन समूह अपनी कुर्सी की संरचना को बनाए रखते हुए 90 और 120 डिग्री के बीच डायहेड्रल कोण (दिखाए गए परमाणुओं) के लिए वरीयता के साथ केवल थोड़ा आगे बढ़ता है। यह आंकड़ा थॉमस एट अल 20 से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एनडी 6 सिनैप्टिक पुटिकाओं को लेबल करता है और तंत्रिका टर्मिनलों में उनकी रिहाई और पुनर्प्राप्ति की रिपोर्ट करता है। (ए) एफएम 4-64 (लाल), एनडी 6 (हरा), और ओवरले (पीला) की नमूना छवियां। एक न्यूरॉन के न्यूराइट्स और सोमा लाइन-प्रोफाइल थे। सीधी रेखा की छवियां (20-पिक्सेल चौड़ाई) संबंधित छवियों के बगल में हैं। एरोहेड FM4-64 द्वारा चिह्नित सिनैप्टिक बाउटन की ओर इशारा करते हैं। स्केल बार = 100 माइक्रोन (बी) एफएम 4-64 और एनडी 6 प्रतिदीप्ति तीव्रता की लाइन प्रोफाइल महत्वपूर्ण समानता प्रदर्शित करती है। (सी)उत्तेजनाओं के जवाब में ए में एरोहेड द्वारा इंगित सिनैप्टिक बाउटन पर एनडी 6 प्रतिदीप्ति परिवर्तनों के नमूना निशान। (डी)एनएच4सीएल और पीएच 5.5 टायरोड के समाधान के जवाब में एनडी 6 प्रतिदीप्ति परिवर्तन के नमूना निशान। (ई) एफएम 4-64 के डी-स्टेनिंग को अस्थायी रूप से एनडी 6 तीव्रता परिवर्तनों के साथ जोड़ा जाता है। डेटा को एसईएम (एफ) एनडी 6 प्रतिदीप्ति तीव्रता ± मतलब के रूप में प्लॉट किया जाता है, लेकिन एफएम 4-64 तीव्रता क्रमशः 50 एमएम एनएच4सीएल और पीएच 5.5 टायरोड के समाधान के अनुप्रयोगों द्वारा कम और बढ़ी नहीं थी। आंकड़ों को एसईएम ± माध्य के रूप में आलेखित किया जाता है। यह आंकड़ा थॉमस एट अल 20 से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: निकोन-टीआईई उल्टे माइक्रोस्कोप के आधार पर इमेजिंग सेटअप। एनोटेट चार घटक हैं जो लाइव-सेल प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए आवश्यक हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: उत्तेजना-इमेजिंग सेटअप। तापमान नियंत्रण और समाधान विनिमय के लिए वार्नर इंस्ट्रूमेंट्स RC-26 कक्ष और PH-1 हीटिंग प्लेटफॉर्म से संशोधित सेटअप। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: सिंक्रनाइज़ उत्तेजना और समाधान एक्सचेंजों के साथ छवि अधिग्रहण के लिए डिवाइस विन्यास के आरेख. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्र 8: छवि विश्लेषण में महत्वपूर्ण चरणों का प्रदर्शन करने वाली नमूना छवियां। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 9
चित्रा 9: एनडी 6 प्रीसानेप्टिक टर्मिनलों पर क्लस्टर किए गए सिनैप्टिक पुटिकाओं पर प्रकाश डालता है। (ए) नमूना छवियां एफएम 4-64 (लाल) और एनडी 6 (हरा) उच्च आवर्धन पर सह-लोड हो रहा है। स्केल बार = 30 माइक्रोन। (बी) एफएम 4-64 और एनडी 6 के स्कैटर प्लॉट का मतलब सिनैप्टिक बाउटन और रैखिक प्रतिगमन फिट के अनुरूप एक ही आरओआई पर प्रतिदीप्ति तीव्रता है। आर = 0.8353; पी = 1.7 × 10-8; देखने के क्षेत्र एन = 9; आरओआई एन = 450। FM4-64 के लिए सीमा 1,200 au (मनमानी इकाई) और ND160 के लिए 6 au है। यह आंकड़ा थॉमस एट अल 20 से संशोधित किया गया है। संक्षिप्तीकरण: ROI = रुचि के क्षेत्र। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 10
चित्रा 10: एनडी 6 एसवी के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है (ए) एनडी 6 या 10 माइक्रोन एनडी 6 लोडिंग के बाद एनडी 6 का प्रतिनिधित्व एसवी टर्नओवर (विद्युत उत्तेजना द्वारा)। (बी) एफएम 4-64-मापा एसवी टर्नओवर (विद्युत उत्तेजना के साथ)। यह आंकड़ा थॉमस एट अल 20 से संशोधित किया गया है। संक्षिप्तीकरण: SVs = synaptic vesicles। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 11
चित्रा 11: कोलेस्ट्रॉल में कमी एसवी कारोबार को बाधित करती है। (ए) एनडी 6 का प्रतिनिधित्व एसवी टर्नओवर 10 हर्ट्ज के तहत, नियंत्रण में 120 एस इलेक्ट्रिक उत्तेजना और एमसीडी-उपचारित न्यूरॉन्स। (बी) बाफिलोमाइसिन ए 1 पुनर्नवीनीकरण एसवी के पुन: अम्लीकरण को रोकता है (यानी, उत्तेजना-विकसित कमी के बाद कोई एनडी 6 प्रतिदीप्ति वसूली नहीं) और एसवी पुनःपूर्ति पर एमसीडी के प्रभाव को और स्पष्ट करता है। यह आंकड़ा थॉमस एट अल 20 से संशोधित किया गया है। संक्षिप्त: SV = synaptic पुटिका; MβCD = मिथाइल-β-साइक्लोडेक्सट्रिन; BafA1 = Bafilomycin A1. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

लिपिड-आधारित रंजक, जैसे 1,1′-डाइऑक्टाडेसिल-3,3,3', 3'-टेट्रामेथिलिन्डोकार्बोसायनिन (डीआईआई) और 3,3′-डाइऑक्टाडेसिलोक्साकार्बोसायनिन परक्लोरेट (डीआईओ), लंबे समय से सेल आकृति विज्ञान को चित्रित करने और न्यूरॉन्स के अक्षतंतु अनुमानों जैसे सेलुलर प्रक्रियाओं को ट्रैक करने के लिए उपयोग किया जाता है। स्टायरिल रंजक, जैसे कि एफएम 1-43, का आविष्कार किया गया है और एक्सोसाइटोसिस34 के अध्ययन के लिए सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। उनकी कम झिल्ली आत्मीयता के कारण, वे चुनिंदा रूप से एंडोसाइटोज्ड पुटिकाओं को लेबल करते हैं जहां वे फंस जाते हैं जबकि प्लाज्मा झिल्ली पर शेष रंगों को निरंतर छिड़काव द्वारा धोया जाता है। जैसे, स्टाइरिल रंजक पुटिका रीसाइक्लिंग की निरंतर निगरानी के लिए उपयुक्त नहीं हैं।

पीएच-संवेदनशील जीएफपी (यानी, पीएचलुओरिन) के हालिया आविष्कार ने वैम्पीआई या सिनैप्टोफिसिन35 जैसे वेसिकुलर झिल्ली प्रोटीन को टैग किए जाने पर बार-बार पुटिका रीसाइक्लिंग की कल्पना करना संभव बना दिया। एक ही सिद्धांत के बाद, लिपिड अणुओं के लिए एक पीएच संवेदनशील फ्लोरोफोर टैगिंग एक्सो-/ इस मामले में, लिपिड की एक इकाई होने के नाते, एनडी 6 तैयार करना आसान है, लागू करने में आसान, लिपिड झिल्ली को लेबल करने के लिए अधिक कुशल, कोशिकाओं के लिए कम विघटनकारी, कोशिका झिल्ली में रहने में अधिक स्थिर, और इस प्रकार प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए अधिक विश्वसनीय है। इसकी झिल्ली-निर्भरता और उलटा पीएच-संवेदनशीलता एसवी और एंडोसोम जैसे अम्लीय जीवों के उज्जवल धुंधला होने की अनुमति देती है।

इसके अलावा, हिप्पोकैम्पस स्लाइस जैसे ऊतकों में ऐसे अम्लीय जीवों या प्रीसानेप्टिक टर्मिनलों को लेबल करना भी संभव है क्योंकि अनिर्दिष्ट रूप से वितरित एनडी 6 बाह्य या साइटोसोलिक रिक्त स्थान में तटस्थ पीएच द्वारा बुझता है। इसके अतिरिक्त, इसकी बड़ी स्टोक्स शिफ्ट एनडी 6 को गहरे ऊतकों की मल्टीफोटोन इमेजिंग के लिए आदर्श बनाती है। इसलिए, एनडी 6 और अन्य पीएच-संवेदनशील लिपिड-आधारित फ्लोरोफोर्स प्लाज्मा झिल्ली और इंट्रासेल्युलर तंत्र जैसे एसवी और एंडोसोम के बीच एक्सो- / एंडोसाइटोसिस के कई दौर के लिए लिपिड और सेल झिल्ली तस्करी के वास्तविक समय ऑप्टिकल माप की अनुमति देते हैं। यह देखते हुए कि सिनैप्स और एसवी न्यूरोट्रांसमिशन के लिए महत्वपूर्ण हैं, एनडी 6 निस्संदेह सिनैप्टिक फिजियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है।

इन लिपिड एनालॉग्स के मॉड्यूलर डिजाइन को देखते हुए, विभिन्न प्रकार के सेल झिल्ली या ऑर्गेनेल में एनडी को अन्य लिपिड, जैसे फॉस्फोलिपिड्स और स्फिंगोलिपिड्स को संयुग्मित करना संभव है। इसके अलावा, एनडी समूहों को अन्य पर्यावरणीय कारकों जैसे कैल्शियम या जस्ता एकाग्रता के अंदर या बाहर कोशिकाओं या जीवों का पता लगाने के लिए अन्य पर्यावरण-संवेदनशील फ्लोरोफोर्स के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। इसके अलावा, विभिन्न उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ फ्लोरोफोर्स को लिपिड पत्रकारों के पैलेट का विस्तार करने के लिए झिल्ली लिपिड से जोड़ा जा सकता है। उन सभी संशोधनों के लिए, लिपिड और एनडी या अन्य फ्लोरोसेंट समूहों के बीच लिंकर को बेहतर फोटो-गुण और / या वांछित संवेदनशीलता प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जा सकता है।

यह प्रोटोकॉल लाइव-सेल इमेजिंग का उपयोग करके एसवी टर्नओवर की कल्पना करने में एनडी 6 के उपयोग का वर्णन करता है। महत्वपूर्ण कदम लोड हो रहा है, सिंक्रनाइज़ उत्तेजना, और प्रतिदीप्ति मात्रा का ठहराव है, जो सभी के सभी महत्वपूर्ण परिणामों की गुणवत्ता को प्रभावित शामिल हैं. इसके अलावा, उन चरणों में उपयोग किए जाने वाले मापदंडों / सेटिंग्स को अध्ययन की जरूरतों के अनुसार संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, लोडिंग के दौरान उत्तेजना को एसवी के विभिन्न पूलों (क्रमशः उच्च या निम्न रिलीजेबल संभावनाओं वाले पूल) की पहुंच की अनुमति देने के लिए समायोजित किया जा सकता है (कम या लंबी अवधि)। लाइव-सेल प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए, सेल स्वास्थ्य और प्रतिदीप्ति तीव्रता के बीच संतुलन बनाना महत्वपूर्ण है, जो यहां विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। ऐसा इसलिए है क्योंकि एनडी 6 के लिए उत्तेजना निकट-यूवी (यानी, 405 एनएम) है, जो दृश्य प्रकाश की तुलना में अधिक फोटोटॉक्सिसिटी और डाई टूटने का कारण बन सकती है। इस प्रकार, फोटोडैमेज को कम करने और सिग्नल की गुणवत्ता को अधिकतम करने के लिए उत्तेजना शक्ति, एक्सपोज़र समय, फ्रेम दर और इमेजिंग अवधि को समायोजित करना महत्वपूर्ण है।

ND6 एक बहुत ही दिलचस्प जांच है। इसकी बड़ी स्टोक्स शिफ्ट ने इसे अन्य झिल्ली रंगों जैसे एफएम 4-6420 के साथ एक साथ इस्तेमाल करना संभव बना दिया। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि यह प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) के लिए एक उपयुक्त दाता उम्मीदवार है और बैंगनी प्रकाश से उत्साहित हो सकता है, जो झल्लाहट प्राप्तकर्ता को सह-उत्तेजित करने की बहुत कम संभावना होगी। एनडी 6 जैसे लिपिड-नकल करने वाले रंजक, एक्सो- / एंडोसाइटोसिस के दौरान झिल्ली प्रोटीन और लिपिड के बीच बातचीत का अध्ययन करना संभव बनाते हैं। झिल्ली प्रोटीन और लिपिड के बीच पीएच-निर्भर संघ और पृथक्करण को एसवी या एंडोसोम के अम्लीय लुमेन में बढ़ाया जाएगा, जिससे रिसेप्टर-मध्यस्थता एंडोसाइटोसिस और छँटाई में झिल्ली लिपिड की भूमिका की खोज की सुविधा मिलेगी। सारांश में, ND6 और इसके डेरिवेटिव झिल्ली लिपिड और जीवित कोशिकाओं में उनकी तस्करी का अध्ययन करने के लिए टूलबॉक्स का काफी विस्तार कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

इस काम को फ्लोरिडा अटलांटिक यूनिवर्सिटी ऑफिस ऑफ अंडरग्रेजुएट रिसर्च एंड इंक्वायरी ग्रांट (एमजेएस), फ्लोरिडा डिपार्टमेंट ऑफ हेल्थ एड और एथेल मूर पायलट ग्रांट 20A17 (Q.Z.), अल्जाइमर एसोसिएशन ग्रांट AARG-NTF-19-618710 (Q.Z.), और NIA R21 ग्रांट AG061656-01A1 (Q.Z.) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digidata 1440A Data Acquistion System Molecular Devices Digidata 1440A For synchronized stimulation and solution exchange
Dual Channel Temperature Controller Warner Instruments TC-344B For live-cell imaging
Fetal Bovine Serum OMEGA Scientific FB-01 For making H+20 solution used in dissection and tissue culture
Hamamatsu Flash4.0 sCOMS camera Hamamatsu Inc. C13440-20CU high-sensitivity camera
Hank's Balanced Salt Solution Sigma H6648 For making H+20 solution used in dissection and tissue culture
Heated Platform Warner Instruments PH-1 For live-cell imaging
Matrigel BD Biosciences 354234 For tissue culture
Micro-G Vibration Isolation Table TMC 63-564 For live-cell imaging
Micro-manager https://micro-manager.org/ NA For image acquisition control
Multi-Line In-Line Solution Heater Warner Instruments SHM-6 For live-cell imaging
Neurobasal Plus Medium THermoFisher Scientific A3582901 For tissue culture
Nikon Ti-E Inverted Microscope Nikon Ti-E/B For live-cell imaging
ORCA-Flash4.0 Digital CMOS camera Hamamatsu C1340-20CU For live-cell imaging
Perfusion Chamber Warner Instruments RC-26G For live-cell imaging
Six-Channel Valve Control Perfusion System Warner Instruments VC-6 For solution exchange
Square Pulse Stimulator Grass Instrument SD9 For electric field stimulation

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झिल्ली लिपिड टर्नओवर पीएच-संवेदनशील फ्लोरोसेंट लिपिड एनालॉग एनडी 6 एक्सो- / एंडोसाइटोसिस बायोमोलेक्यूल एक्सचेंज विशेष कोशिकाएं इंसुलिन स्राव न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज एक्सो- / एंडोसाइटोसिस रिसर्च जीन और प्रोटीन स्तर झिल्ली लिपिड रीसाइक्लिंग प्लाज्मा झिल्ली स्रावी पुटिकाएं लिपिड वितरण इंट्रासेल्युलर झिल्ली डिब्बे लिपिड टर्नओवर दर जैविक अनुसंधान क्षेत्र
पीएच-संवेदनशील फ्लोरोसेंट लिपिड एनालॉग ND6 के साथ झिल्ली लिपिड टर्नओवर को मापना
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Alamgir, S., Pelletier, O. B.,… More

Alamgir, S., Pelletier, O. B., Thomas, D., Rubio, V., Stawikowski, M. J., Zhang, Q. Measuring Membrane Lipid Turnover with the pH-sensitive Fluorescent Lipid Analog ND6. J. Vis. Exp. (173), e62717, doi:10.3791/62717 (2021).

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