Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Måling af membranlipidomsætning med den pH-følsomme fluorescerende lipidanalog ND6

Published: July 29, 2021 doi: 10.3791/62717
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 3, 3, 1,2
1The Brain Institute at Florida Atlantic University, 2Department of Biomedical Sciences, Florida Atlantic University, 3Department of Chemistry and Biochemistry, Florida Atlantic University

Summary

Denne protokol præsenterer en fluorescensbilleddannelsesmetode, der bruger en klasse af pH-følsomme lipidfluoroforer til at overvåge lipidmembranhandel under celleexocytose og endocytosecyklussen.

Abstract

Exo-/endocytose er en almindelig proces, der medierer udvekslingen af biomolekyler mellem celler og deres miljø og mellem forskellige celler. Specialiserede celler bruger denne proces til at udføre vitale kropsfunktioner såsom insulinsekretion fra β celler og neurotransmitterfrigivelse fra kemiske synapser. På grund af sin fysiologiske betydning har exo-/endocytose været et af de mest studerede emner inden for cellebiologi. Mange værktøjer er blevet udviklet til at studere denne proces på gen- og proteinniveau, på grund af hvilket meget er kendt om proteinmaskineriet, der deltager i denne proces. Der er dog udviklet meget få metoder til at måle membranlipidomsætningen, som er det fysiske grundlag for exo-/endocytose.

Dette papir introducerer en klasse af nye fluorescerende lipidanaloger, der udviser pH-afhængig fluorescens og demonstrerer deres anvendelse til at spore lipidgenanvendelse mellem plasmamembranen og de sekretoriske vesikler. Ved hjælp af simple pH-manipulationer tillader disse analoger også kvantificering af lipidfordeling over overfladen og de intracellulære membranrum samt måling af lipidomsætningshastighed under exo-/endocytose. Disse nye lipidreportere vil være af stor interesse for forskellige biologiske forskningsområder som cellebiologi og neurovidenskab.

Introduction

Lipiddobbeltlaget er en af de mest almindelige biomolekylesamlinger og er uundværlig for alle celler. Udenfor celler danner det plasmamembranens grænsefladeceller og deres miljø; Inde i celler opdeler den forskellige organeller, der er specialiserede til udpegede funktioner. I stedet for dynamisk end stadig oplever lipidmembraner konstant fusion og fission, som medierer biomaterialetransport, organelreform, morfologiændring og cellulær kommunikation. Uden tvivl er lipidmembranen det fysiske fundament for næsten alle cellulære processer, og dets dysfunktion spiller en afgørende rolle i forskellige lidelser lige fra kræft1 til Alzheimers sygdom2. Selvom lipidmolekyler er langt mindre forskelligartede end proteiner, har membranforskning hidtil hovedsageligt været proteincentreret. For eksempel er der meget mere kendt om proteinmaskiner end om lipider i exocytose 3,4,5. Desuden forbliver organiseringen, distributionen, dynamikken og homeostase af lipider på tværs af overflade- og intracellulære membraner stort set uudforsket sammenlignet med membranproteiner6.

Dette er ikke overraskende, da moderne molekylærbiologiske teknikker, såsom mutagenese, giver en metodologisk fordel til at studere proteiner snarere end lipider. For eksempel letter transgen mærkning af pH-følsomt grønt fluorescerende protein (alias pHluorin) til vesikulære proteiner den kvantitative måling af mængden og hastigheden af vesikulær proteinomsætning under exo-/endocytose 7,8,9. Det er imidlertid næsten umuligt at genetisk modificere membranlipider in vivo. Desuden er kvalitative og endda kvantitative manipulationer af proteinmængder og -fordelinger meget mere gennemførlige end lipider10. Ikke desto mindre er indfødte og syntetiske fluorescerende lipider blevet isoleret og udviklet til at simulere endogene membranlipider in vitro og in vivo11. En gruppe af almindeligt anvendte fluorescerende lipider er styrylfarvestoffer, fx FM1-43, som udviser membranforstærket fluorescens og er et kraftfuldt værktøj til at studere frigivelse af synaptisk vesikel (SV) i neuroner12. På det seneste er miljøfølsomme lipidfarvestoffer blevet opfundet og udbredt som en ny klasse af journalister til at studere forskellige cellemembranegenskaber, herunder membranpotentiale11, faserækkefølge13 og sekretion14.

En ny klasse af lipidmimetika, hvis fluorescens er både pH-følsom (fx pHluorin) og membranfølsom (fx FM1-43) blev udviklet til direkte måling af lipidfordelingen i plasmamembranen og endosomer/lysosomer og lipidtrafikken under exo-/endocytose. De velkendte solvatokromiske fluoroforer, der udviser push-pull-egenskaber på grund af intramolekylær ladningsoverførsel, blev valgt til dette formål. Blandt eksisterende solvatokromiske fluoroforer er stilladset med 1,8-naphthalimid (ND) relativt let at ændre, alsidigt til mærkning og er unikt i fotofysik15 og er derfor blevet brugt i DNA-interkalatorer, organiske lysemitterende dioder og biomolekylesensorer 16,17,18.

Fastgørelse af en elektrondonerende gruppe til ND-stilladsets C4-position genererer en push-pull-struktur, hvilket fører til et øget dipolmoment ved at omfordele elektrondensiteten i exciteret tilstand19,20. En sådan intramolekylær ladningsoverførsel producerer store kvanteudbytter og Stokes-skift, hvilket resulterer i lys og stabil fluorescens21. Denne gruppe har for nylig udviklet en række solvatokromiske lipidanaloger baseret på ND-stilladset og opnået dem med gode syntetiske udbytter20.

Spektroskopisk karakterisering viser, at blandt disse produkter har ND6 de bedste fluorescensegenskaber (figur 1)20. For det første har den godt adskilte excitationstoppe og emissionstoppe (dvs. henholdsvis ~ 400 nm og ~ 520 nm i figur 2A, B) sammenlignet med populære fluoroforer såsom fluoresceinisothiocyanat, rhodamin eller GFP, hvilket gør det spektralt adskilt fra dem og dermed nyttigt til flerfarvet billeddannelse. For det andet udviser ND6-fluorescens en mere end otte gange stigning i dens fluorescens i nærvær af miceller (figur 2C), hvilket tyder på en stærk membranafhængighed. Tidligere levende cellefluorescensbilleddannelsesundersøgelser med forskellige typer celler viste fremragende membranfarvning ved ND620. For det tredje, når opløsningens pH reduceres fra 7,5 (almindeligvis fundet i ekstracellulære eller cytosoliske miljøer) til 5,5 (almindeligvis fundet i endosomer og lysosomer), viser ND6 en cirka to gange stigning i fluorescens (figur 2D), hvilket viser dens pH-følsomhed. Desuden indikerer simulering af molekylær dynamik, at ND6 let integreres i lipiddobbeltlaget med dets ND-stillads, der vender ud af membranen, og piperazinrester, der viser stærke interaktioner med phospholipidhovedgrupper (figur 3). Alt i alt gør disse funktioner ND6 til en ideel fluorescerende lipidanalog til at visualisere og måle membranlipidomsætning under exo- / endocytose.

Dette papir præsenterer en metode til at studere omsætningshastigheden og dynamikken af SV-lipider ved hjælp af dyrkede musehippocampale neuroner. Ved at stimulere neuroner med høje K + Tyrodes opløsninger blev SV'er og plasmamembranen fyldt med ND6 (figur 4A, B). Derefter blev neuroner restimuleret med forskellige stimuli efterfulgt af NH4Cl-holdige og pH 5,5 Tyrodes opløsninger (figur 4D). Denne protokol letter den kvantitative måling af de samlede exocytose- og endocytosehastigheder under forskellige omstændigheder (figur 4C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Følgende protokol indeholder (1) en forenklet procedure til etablering af hippocampus og kortikale kulturer med mus baseret på en veletableret protokol22, (2) en kort introduktion til en epifluorescensmikroskopopsætning for levende neuroner, (3) en detaljeret beskrivelse af indlæsning og billeddannelse ND6 i museneuroner, (4) en diskussion om kvantificering af membranhandel ved ND6-signal. Alle procedurer følger biosikkerheds- og IACUC-retningslinjerne på Florida Atlantic University. Syntesen af ND6 er tidligere beskrevet20.

1. Forberedelse af mushippocampus og kortikale kulturer

BEMÆRK: Hvis ikke andet er angivet, skal alle trin udføres i en laminar flowhætte til biosikkerhedsniveau 2. Steriliser alle værktøjer og materialer.

  1. Brug størrelse 5 tang til at placere glasdæksler i multiwell kulturplader.
    BEMÆRK: For eksempel er en plade med 24 brønde ideel til 12 mm Equation 1 dæksedler.
  2. Tilføj den passende mængde ekstracellulære matricer for at belægge cellekulturoverfladen (f.eks. 75 μL kældermembranmatrixopløsning pr. 12 mm Equation 1 dæksel; se materialetabellen)
  3. De forberedte plader anbringes i vævskulturinkubatoren (5 % CO2, 100 % fugtighed og 37 °C) i 1-4 timer for at muliggøre tværbinding af kældermembranmatrixen.
  4. Ofre dyrene, åbne kraniet og overføre hele hjernen til en 35 mm petriskål med 3 ml Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) indeholdende 20% føtalt bovint serum (H + 20). Skær hjernen langs midterlinjen, og adskil cortices og hippocampi i en laminar flow dissektionshætte for at reducere forurening.
  5. Brug en mikrosaks til at skære vævene i små stykker (~1 mm3). Overfør disse væv til et 15 ml konisk rør indeholdende 5 ml H + 20.
  6. Vævene vaskes tre gange med 5 ml H+20 og tre gange med 5 ml HBSS.
  7. Tilsæt 1,5 ml 1% trypsin med ethylendiamintetraeddikesyre og inkuber ved 37 °C i 10 minutter til enzymfordøjelse.
  8. Gentag trin 1.6 og brug vakuum til at aspirere HBSS til sidst.
  9. Vævene adskilles mekanisk i 1 ml HBSS indeholdende 2,95 g/lMgSO4•7H2O, ved hjælp af en brandpoleret glaspipette.
  10. Cellesuspensionen centrifugeres ved 400 × g, 4 °C i 5 minutter.
  11. Supernatanten suges til syn, og cellerne resuspenderes i en passende mængde dyrkningsmedier for at opnå en koncentration på ~10 000 000 celler/ml.
  12. Plade cellerne ved ~ 1.000.000 celler / cm2 og anbring kulturen i inkubatoren (5% CO2, 100% fugtighed og 37 ° C) i 1-4 timer for at lette cellefastgørelsen til glasdækslerne.
  13. Der tilsættes en passende mængde dyrkningsmedium (f.eks. 1 ml pr. hul for en plade med 24 huller). Tilsæt det samme volumen kulturmedium efter 1 uge. Efter 2 uger udskiftes halvdelen af det eksisterende kulturmedium med friske medier hver uge.

2. Mikroskopopsætning til levende cellefluorescensbilleddannelse

BEMÆRK: En eksemplarisk billedopsætning (figur 5) inkluderer mindst et inverteret fluorescensmikroskop (se materialetabellen), fluorescenslyskilde med automatisk lukker, fluorescensfiltersæt (f.eks. til billeddannelse ND6, brug 405/10 BP til excitation, 495 LP til dikroisk og 510/20 BP til emission) og et højfølsomt kamera (materialetabel), som alle styres af billedoptagelsessoftware (materialetabel).

  1. Forbered et billeddannelseskammer, der tillader temperaturstyring og opløsningsinput/-output til levende cellefluorescensbilleddannelse.
    BEMÆRK: For eksempel blev et modificeret billedbehandlingskammer med åbent bad fastgjort på en varmeplatform brugt i denne protokol (figur 6).
  2. Konfigurer en programmerbar enhed til at skifte perfusionsopløsningerne og levere den elektriske stimulus på definerede tidspunkter under billeddannelsen.
    BEMÆRK: Hardware- og softwaresynkronisering er nødvendig for kvantitative analyser (figur 7). For eksempel blev der i denne protokol brugt en triggerudgang fra billedkameraet til at starte et computerprogram, der styrer en automatisk switch-enhed, som styrer et multikanals perfusionssystem og en firkantpulsstimulator.
  3. For at co-image to eller flere fluorescerende reportere skal du udføre multikanals fluorescensbilleddannelse enten ved sekventielt at skifte filtersæt eller ved samtidig at opdele forskellige fluorescensemissioner og projicere til det samme kamera.

3. Indlæsning og billeddannelse ND6 i neuronale kulturer

  1. Der afvejes en passende mængde ND6, opløses i dimethylsulfoxid (DMSO), og det opløses ved stuetemperatur; sonikere kort (f.eks. 3 min). Råstamopløsningen filtreres ved hjælp af et 0,22 μm filter for at fjerne store farvestofaggregater. Efter filtrering bestemmes farvestofkoncentrationen ved absorptionsspektroskopi ved 405 nm under anvendelse af et konventionelt spektrofotometer eller mikrovolumenspektrofotometer under anvendelse af ε = 10.700 M-1 cm-1.
  2. Før påføring fortyndes stamopløsningen til en koncentration på 1 μM ved hjælp af badopløsningen. Opbevar stamopløsningen ved stuetemperatur i mørke.
  3. Mærkning af endosomer og synaptiske vesikler
    1. For allestedsnærværende mærkning af endocytoserede membranrum såsom endosomer tilsættes ND6-stamopløsning (f.eks. 1 mM i DMSO) til dyrkningsmediet ved den endelige koncentration på 1 μM og inkuberes ved 5% CO2, 100% fugtighed og 37 ° C i 30 minutter. For at reducere omfanget af SV-mærkning skal du undertrykke den spontane neuronale aktivitet farmakologisk. Brug for eksempel tetrodotoxin til at blokere aktionspotentialer eller 2,3-dioxo-6-nitro-1,2,3,4-tetrahydrobenzo[f]quinoxalin-7-sulfonamid (NBQX) og D-(-)-2-amino-5-phosphonpentansyre (D-AP5) til at hæmme excitatorisk transmission23.
    2. For selektivt at mærke SV'er skal du bruge kort, men stærk stimulering til at fremkalde præsynaptisk exo- / endocytose. Overfør først kulturdækselen til en 35 mm Equation 1 petriskål indeholdende 2 ml normal tyrodeopløsning ved stuetemperatur. For det andet fortyndes ND6-stamopløsningen i høj-K+ Tyrodes opløsning (90 mM KCl) ved den endelige koncentration på 1 μM. For det tredje udskiftes den normale tyrodeopløsning i petriskålen med ND6-holdig høj-K + tyrodeopløsning og inkuberes ved stuetemperatur i 2 min.
  4. Overfør den ND6-mærkede cellekultur til billedkammeret fyldt med forvarmet normal Tyrodes opløsning indeholdende 10 μM NBQX og 10 μM D-AP5.
  5. Juster perfusionshastigheden til ~ 0,2 ml / s (dvs. 1 dråbe pr. Sekund) og start perfusionen af forvarmet normal Tyrodes opløsning indeholdende NBQX og D-AP5 for at fjerne overdreven ND6 i kulturen.
  6. Juster fokus og find det passende synsfelt, der indeholder sunde og velspredte neuroner, der bærer forbundne neuritter. Undgå områder, der indeholder uopløste farvekolloider.
  7. Prøv at afbilde ND6-belastede celler med forskellige eksponeringstider for at identificere de bedste billedindstillinger.
    BEMÆRK: For den bedste eksponeringstid er den højeste pixelfluorescensintensitet i det resulterende billede ca. halvdelen af bitområdet (f.eks. for et 16-bit billede er bitområdet fra 0 til 65.535), hvilket vil muliggøre en yderligere stigning i fluorescens, når den sure badopløsning påføres. Den valgte eksponeringstid skal bruges til al ND6-billeddannelse.
  8. Indstil stimulerings- og perfusionsprotokollen, billedintervallet og den samlede varighed. For eksempel skal du i den følgende protokol bruge en 30 s baseline, en 10 s 30 Hz elektrisk feltstimulering, 50 s genvinding, 120 s 90 mM K +, 60 s genvinding, 60 s Tyrodes opløsning med 50 mM NH4Cl, 60 s Tyrodes opløsning ved pH 5,5 og et rammeinterval på 3 s.
  9. Start billedoptagelsen ledsaget af den synkroniserede stimulering og perfusion. Overvåg simuleringen og løsningsudvekslingen under billeddannelse.
  10. Stop perfusionen, når billeddannelsen er afsluttet, fjern dæksedlen, og rengør billedkammeret til næste forsøg.

4. Kvantificering af membranhandel ved en ændring i ND6-fluorescens

  1. Sikkerhedskopier og/eller lav en elektronisk kopi af alle billedfiler.
  2. Vælg et analyseprogram til dataudtræk, f.eks. en open source billedanalysesoftware som ImageJ24 og/eller FIJI25.
  3. Åbn eller importer en billedstak til analyseprogrammet.
  4. Indstil det første billede som reference, og juster resten til det ved hjælp af funktioner / plugins såsom Rigid Registration26, som vil afbøde artefakter på grund af xy-drifting. Se f.eks. billeder i figur 8 .
  5. Gennemsnittet af alle billeder, der er taget i løbet af 30'erne før baseline, for at producere et referencebillede. Gem en kopi af dette billede til fremtidig reference.
  6. Angiv intensitetstærsklen for at generere et binært billede ud fra det gennemsnitlige billede i grundlinjen.
  7. Brug Watershed i ImageJ eller lignende funktioner i et andet program til at adskille forbindelsesneuritter eller celler.
  8. Brug funktionen Analysér partikel med passende arealstørrelse og cirkularitet til at anmode om interesseområder (ROI'er) svarende til cellemembraner, endosomer, lysosomer eller synaptiske boutoner. Gem alle valgte investeringsafkast.
  9. Vælg fire baggrunds-ROI'er i cellefrie områder inden for synsfeltet.
  10. Mål de gennemsnitlige pixelintensiteter for hvert investeringsafkast i hver ramme i billedstakken, og eksporter resultaterne til statistisk analyse.
  11. Beregn den gennemsnitlige intensitet af baggrunds-ROI'erne som basisstøj, som trækkes fra de gennemsnitlige pixelintensiteter for hvert investeringsafkast.
  12. Gennemsnit de tre højeste gennemsnitlige intensiteter for hver valgt ROI under påføring af pH 5,5 Tyrodes opløsning for at opnå den maksimale fluorescensintensitet, som er defineret som 100% for normalisering.
  13. Gennemsnit de tre laveste gennemsnitlige intensiteter for hver valgt ROI under anvendelse af 50 mM NH4Cl for at indstille den minimale fluorescensintensitet, som defineres som 0% for normalisering.
  14. Beregn de relative fluorescensændringer for hvert investeringsafkast baseret på dets egne 0% og 100% intensiteter. Udlede gennemsnitlige fluorescensændringer, ændre kinetik og andre værdier/plots fra individuelle ROI-data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

SV'er er specialiserede til frigivelse af neurotransmittere via fremkaldt exo-/endocytose27. SV'er har meget surt lumen (dvs. pH 5,5), hvilket er ideelt til ND6. Vi brugte høj K + stimulering til at fremkalde SV exo-/endocytose for at give ND6 adgang til SV. Forventet viste lysegrøn fluorescerende punktspil langs neuronale processer op efter indlæsning (figur 9A). Linjeprofilet vist i figur 4B viste en stærk overlapning mellem ND6 (grøn kurve) og FM4-64 puncta (rød kurve). Den stærke korrelation mellem ND6 og FM4-64 fluorescensintensiteter tyder også på en SV-farvning af ND6 (figur 9B).

En elektrisk stimulering og en høj K + stimulering blev brugt til at fremkalde frigivelsen af henholdsvis den let frigørelige pulje (RRP, dvs. SV'er med høj frigivelsessandsynlighed) og reservepuljens SV'er (dvs. SV'er med lav frigivelsessandsynlighed). Der var fald i ND6-fluorescens som reaktion på begge stimuli (figur 4C og figur 4E), hvilket tyder på, at ND6 befinder sig i SV-membranen, og at SV-lumen neutraliseres (rapporteret ved ND6-signalfald) under SV-frigivelsen.

Ved afslutningen af hvert forsøg blev 50 mM NH4Cl anvendt til afsyring af SVs28 og pH 5,5 opløsning for at lysne overflademembran ND6 (figur 4D og figur 4F). Forskellene i fluorescens giver os mulighed for at bestemme ND6 i overflademembranen (~ 44%) og SV-membranen (~ 56%). Disse tal matcher fraktionerne af overflade- og SV-membraner ved axonterminalerne29, hvilket tyder på, at ND6 fordeler jævnt over membraner. Desuden giver ND6-signaler under to forskellige stimuli og to pH-manipulationer os mulighed for at estimere, at den korte elektriske burst mobiliserede omkring ~ 31% SV'er og høj K + stimulering frigav ~ 70% af de resterende SV'er. Hastigheden af ND-fluorescensfald under stimuleringerne matcher også tidskonstanten for den fremkaldte SV-exocytose, der tidligere blev rapporteret30.

ND6's kompakte størrelse fører til meget mindre sterisk forstyrrelse af cellemembraner end tidligere mærkningsmetode14 og giver dermed en mere nøjagtig måling af SV-handel. Til støtte for denne idé viste en ti gange højere belastningskoncentration ingen signifikant forskel i FM4-64-affarvning under stimulering (figur 10). Imidlertid anbefales 1μM stadig i betragtning af dens moderate farvning i astrocytter.

Da SV exo-/endocytose involverer kolesterol (et rigeligt og vitalt lipid i neuronmembranerne), har vi brugt ND6-billeddannelse til at spørge, hvordan membrankolesterol påvirker SV-frigivelse og -udtagning. En 1-mM til 90-minutters behandling af methyl-β-cyclodextrin (MβCD) kan fjerne ~ 10% kolesterol fra neuronal overflademembran31, efterligne aldringsassocieret membrankolesterolfald. Under en udtømmende elektrisk stimulering reducerede MβCD-behandlingen signifikant SV-frigivelse og -hentning målt ved ND6-billeddannelse (figur 11A), hvilket tyder på, at membrankolesterol letter SV exo-/endocytose32. Vi evaluerede også kolesterolets bidrag til SV-puljens genopfyldning, hvilket er afgørende for nøjagtigheden af neurotransmission33. To elektriske stimuleringer med et interval på 10 s blev påført i nærvær af Bafilomycin A1 (BafA1). BafA1 hæmmer selektivt v-ATPase, der resyrer SV'er. Ved akut at blokere forsuringen af hentede SV'er forhindrer BafA1 ND6-fluorescensgenopretning efter stimulering (figur 11B). ND6-faldet under den anden stimulus bør kun komme fra spirende SV'er, der genopfylder tomme RRP. I sammenligning med skinkontrollen blev der observeret et signifikant mindre ND6-respons på den anden stimulus i neuronerne, der var forbehandlet med MβCD (dvs. mindre amplitude og hurtigere henfald af ND6-fluorescensreduktion). Dette resultat understøtter forestillingen om, at kolesterol spiller en afgørende rolle i rekruttering af nye SV'er til RRP.

Figure 1
Figur 1: Generelt synteseskema for ND6-sonde. Dette tal er ændret fra Thomas et al.20. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: ND6's egenskaber. (A og B) Solvatokromiske egenskaber af ND6. Absorbansspektre (A) og fluorescensspektre (B) i forskellige opløsningsmidler exciteret ved 405 nm. (C) Sammenligning af fluorescensintensiteten af ND6 i vand (rød) og 1% octylglucosidopløsning ved 1 μM. (D) ND6-fluorescens som funktion af pH i 1% OG-opløsning er proportional med protoneringstilstanden for piperazinhovedgruppen (beregnet pKa = 7,4). Indsat viser beregnet protoneringstilstand for ND6 piperazindel (forudsagt pKa = 8,83). Den stiplede linje repræsenterer tilpassede værdier. Dette tal er ændret fra Thomas et al.20. Forkortelser: DCM = dichlormethan; MeCN = acetonitril; DMSO = dimethylsulfoxid; EtOH = ethylalkohol; MeOH = methylalkohol; Abs= absorbans; Em = emission; OG = octylglucosid. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Snapshot fra simuleringsbane for molekylær dynamik. Interaktion mellem ND6-sonde i POPC-membran (venstre panel). Piperazinhovedgruppen interagerer stærkt med fosfatgrupper (højre panel) gennem elektrostatiske interaktioner. Den sorte pil (højre panel) peger på C-N-bindingen mellem naphthalimidringen og piperazin. Resultaterne viser, at piperazingruppen kun bevæger sig lidt med en præference for dihedralvinklen (atomer viste) mellem 90 og 120 grader, samtidig med at stolens kropsbygning opretholdes. Dette tal er ændret fra Thomas et al.20. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: ND6 mærker synaptiske vesikler og rapporterer deres frigivelse og hentning i nerveterminalerne. (A) Eksempler på billeder af FM4-64 (rød), ND6 (grøn) og overlay (gul). Neuritterne og soma af en neuron var linjeprofileret. De rettede stregbilleder (20 pixel bredde) er ved siden af de tilsvarende billeder. Pilespidser peger på synaptiske boutoner markeret med FM4-64. Skalastænger = 100 μm. (B) Linjeprofiler af FM4-64 og ND6 fluorescensintensiteter udviser betydelig lighed. (C) Prøvespor af ND6-fluorescensændringer ved synaptiske boutoner angivet med pilespidser i A som reaktion på stimuli. (D) Prøvespor af ND6-fluorescensændringer som reaktion påNH4Cl og pH 5,5 tyrods opløsninger. (E) Affarvningen af FM4-64 er midlertidigt koblet til ND6-intensitetsændringer. Data plottes som middelværdi ± S.E.M. (F) ND6 fluorescensintensitet, men ikke FM4-64 intensitet blev reduceret og øget ved anvendelse af henholdsvis 50 mM NH4Cl og pH 5,5 Tyrodes opløsninger. Data afbildes som middelværdi ± S.E.M. Dette tal er ændret fra Thomas et al.20. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Billedbehandlingsopsætning baseret på et inverteret Nikon-TiE-mikroskop. Annoteret er fire komponenter, der kræves til levende cellefluorescensbilleddannelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Opsætning af stimulering-billeddannelse. Opsætning modificeret fra et Warner Instruments RC-26 kammer og PH-1 varmeplatform til temperaturstyring og løsningsudveksling. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Diagram over enhedskonfigurationer til billedoptagelse med synkroniserede stimuleringer og løsningsudvekslinger. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Eksempler på billeder, der viser de vigtigste trin i billedanalyse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: ND6 fremhæver synaptiske vesikler grupperet ved præsynaptiske terminaler. (A) Prøvebilleder FM4-64 (rød) og ND6 (grøn) ved samtidig indlæsning ved høj forstørrelse. Skalabjælke = 30 μm. (B) Spredningsplot af FM4-64 og ND6 gennemsnitlige fluorescensintensiteter ved de samme ROI'er svarende til synaptiske boutoner og lineær regressionstilpasning. r = 0, 8353; p = 1,7 × 10-8; synsfelter N = 9; ROI'er n = 450. Tærsklen for FM4-64 er 1.200 au (vilkårlig enhed) og 160 au for ND6. Dette tal er ændret fra Thomas et al.20. Forkortelse: ROIs = regioner af interesse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 10
Figur 10: ND6 griber ikke ind med SV'er. (A) ND6-repræsenteret SV-omsætning (ved elektrisk stimulus) efter 1 eller 10 μM ND6-belastning. B) FM4-64-målt SV-omsætning (med elektrisk stimulus). Dette tal er ændret fra Thomas et al.20. Forkortelse: SVs = synaptiske vesikler. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 11
Figur 11: Kolesterolreduktion forringer SV-omsætningen. (A) ND6-repræsenteret SV-omsætning under 10 Hz, 120 s elektrisk stimulus i kontrol og MβCD-behandlede neuroner. (B) Bafilomycin A1 forhindrer forsuring af genanvendte SV'er (dvs. ingen ND6-fluorescensgenvinding efter stimuleringsfremkaldt fald) og belyser yderligere MβCD's indvirkning på SV-genopfyldning. Dette tal er ændret fra Thomas et al.20. Forkortelse: SV = synaptisk vesikel; MβCD = methyl-β-cyclodextrin; BafA1 = Bafilomycin A1. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Lipidbaserede farvestoffer, såsom 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanin (DiI) og 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyaninperchlorat (DiO), har længe været brugt til at illustrere cellemorfologi og spore cellulære processer såsom axonfremskrivninger af neuroner. Styrylfarvestoffer, såsom FM1-43, er blevet opfundet og anvendt med succes til undersøgelse af exocytose34. På grund af deres lave membranaffinitet mærker de selektivt endocytoserede vesikler, hvor de fanges, mens farvestoffer, der er tilbage på plasmamembranen, vaskes af ved konstant perfusion. Som sådan er styrylfarvestoffer ikke egnede til kontinuerlig overvågning af vesikelgenanvendelse.

Den nylige opfindelse af pH-følsom GFP (dvs. pHluorin) gjorde det muligt gentagne gange at visualisere vesikelgenanvendelse, når den blev mærket til et vesikulært membranprotein såsom VAMPII eller Synaptophysin35. Efter samme princip muliggør mærkning af en pH-følsom fluorofor til lipidmolekyler sporing af lipidmembrangenanvendelse under cyklusser af exo-/endocytose14. I dette tilfælde, da ND6 er en enkelt enhed af lipid, er den lettere at forberede, enklere at anvende, mere effektiv til at mærke lipidmembraner, mindre forstyrrende for celler, mere stabil i at forblive i cellemembraner og dermed mere pålidelig til fluorescensbilleddannelse. Dens membranafhængighed og inverse pH-følsomhed tillader lysere farvning af sure organeller såsom SV'er og endosomer.

Desuden er det også muligt at mærke sådanne sure organeller eller presynaptiske terminaler i væv såsom hippocampale skiver som uspecifikt fordelt ND6 slukkes af neutral pH i ekstracellulære eller cytosoliske rum. Derudover gør dens store Stokes-skift ND6 ideel til multifotonbilleddannelse af dybe væv. Derfor tillader ND6 og andre pH-følsomme lipidbaserede fluoroforer optisk måling i realtid af lipid- og cellemembranhandel mellem plasmamembranen og intracellulære apparater såsom SV'er og endosomer til flere runder af exo-/endocytose. I betragtning af at synapser og SV'er er afgørende for neurotransmission, er ND6 utvivlsomt nyttig til at studere synaptisk fysiologi.

I betragtning af det modulære design af disse lipidanaloger er det muligt at konjugere ND til andre lipider, såsom phospholipider og sphingolipider, i forskellige typer cellemembraner eller organeller. Desuden kan ND-grupperne erstattes med andre miljøfølsomme fluoroforer for at detektere andre miljøfaktorer såsom calcium- eller zinkkoncentration i eller uden for celler eller organeller. Desuden kan fluoroforer med forskellige emissionsspektre knyttes til membranlipider for at udvide paletten af lipidreportere. For alle disse modifikationer kan koblingen mellem lipider og ND eller andre fluorescerende grupper justeres for at opnå bedre fotoegenskaber og / eller ønskede følsomheder.

Denne protokol beskriver brugen af ND6 til visualisering af SV-omsætning ved hjælp af live-celle-billeddannelse. Kritiske trin omfatter belastning, synkroniserede stimuleringer og fluorescenskvantificering, som alle påvirker kvaliteten af resultaterne væsentligt. Desuden kan de parametre/indstillinger, der anvendes i disse trin, ændres i overensstemmelse med undersøgelsens behov. For eksempel kan stimuleringen under lastningen justeres (kortere eller længere varighed) for at give adgang til forskellige puljer af SV'er (puljer med henholdsvis høj eller lav frigørelig sandsynlighed). For levende cellefluorescensbilleddannelse er det vigtigt at finde en balance mellem cellesundhed og fluorescensintensitet, hvilket er særligt vigtigt her. Dette skyldes, at excitationen for ND6 er nær-UV (dvs. 405 nm), hvilket kan forårsage mere fototoksicitet og nedbrydning af farvestof end synligt lys. Det er således vigtigt at justere excitationskraften, eksponeringstiden, billedhastigheden og billedbehandlingsvarigheden for at minimere fotoskader og maksimere signalkvaliteten.

ND6 er en meget interessant sonde. Dens store Stokes-skift gjorde det muligt at bruge det samtidigt med andre membranfarvestoffer såsom FM4-6420. Endnu vigtigere er det, at det er en egnet donorkandidat til fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) og kan blive ophidset af lilla lys, hvilket vil være meget mindre sandsynligt at co-excitere FRET-modtageren. Lipidlignende farvestoffer, såsom ND6, gør det muligt at studere interaktionerne mellem membranproteiner og lipider under exo-/endocytose. Den pH-afhængige association og dissociation mellem membranproteiner og lipider vil blive forstørret i det sure lumen af SV'er eller endosomer, hvilket letter udforskningen af membranlipidernes rolle i receptormedieret endocytose og sortering. Sammenfattende kan ND6 og dets derivater betydeligt udvide værktøjskassen til undersøgelse af membranlipider og deres handel med levende celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Florida Atlantic University Office of Undergraduate Research and Inquiry grant (M.J.S.), Florida Department of Health Ed og Ethel Moore Pilot Grant 20A17 (Q.Z.), Alzheimers Association grant AARG-NTF-19-618710 (Q.Z.) og NIA R21 grant AG061656-01A1 (Q.Z.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digidata 1440A Data Acquistion System Molecular Devices Digidata 1440A For synchronized stimulation and solution exchange
Dual Channel Temperature Controller Warner Instruments TC-344B For live-cell imaging
Fetal Bovine Serum OMEGA Scientific FB-01 For making H+20 solution used in dissection and tissue culture
Hamamatsu Flash4.0 sCOMS camera Hamamatsu Inc. C13440-20CU high-sensitivity camera
Hank's Balanced Salt Solution Sigma H6648 For making H+20 solution used in dissection and tissue culture
Heated Platform Warner Instruments PH-1 For live-cell imaging
Matrigel BD Biosciences 354234 For tissue culture
Micro-G Vibration Isolation Table TMC 63-564 For live-cell imaging
Micro-manager https://micro-manager.org/ NA For image acquisition control
Multi-Line In-Line Solution Heater Warner Instruments SHM-6 For live-cell imaging
Neurobasal Plus Medium THermoFisher Scientific A3582901 For tissue culture
Nikon Ti-E Inverted Microscope Nikon Ti-E/B For live-cell imaging
ORCA-Flash4.0 Digital CMOS camera Hamamatsu C1340-20CU For live-cell imaging
Perfusion Chamber Warner Instruments RC-26G For live-cell imaging
Six-Channel Valve Control Perfusion System Warner Instruments VC-6 For solution exchange
Square Pulse Stimulator Grass Instrument SD9 For electric field stimulation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Polo, S., Pece, S., Di Fiore, P. P. Endocytosis and cancer. Current Opinion in Cell Biology. 16 (2), 156-161 (2004).
  2. Eckert, G. P., Wood, W. G., Muller, W. E. Lipid membranes and beta-amyloid: a harmful connection. Current Protein and Pept Science. 11 (5), 319-325 (2010).
  3. Augustine, G. J., Burns, M. E., DeBello, W. M., Pettit, D. L., Schweizer, F. E. Exocytosis: proteins and perturbations. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 36, 659-701 (1996).
  4. Ammar, M. R., Kassas, N., Chasserot-Golaz, S., Bader, M. F., Vitale, N. Lipids in regulated exocytosis: what are they doing. Frontiers in Endocrinology. 4, 125 (2013).
  5. Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112 (4), 519-533 (2003).
  6. Chabanon, M., Stachowiak, J. C., Rangamani, P. Systems biology of cellular membranes: a convergence with biophysics. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 9 (5), 1386 (2017).
  7. Prosser, D. C., Wrasman, K., Woodard, T. K., O'Donnell, A. F., Wendland, B. Applications of pHluorin for quantitative, kinetic and high-throughput analysis of endocytosis in budding yeast. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54587 (2016).
  8. Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nature Protocols. 1 (6), 2970-2978 (2006).
  9. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  10. Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  11. Demchenko, A. P., Mély, Y., Duportail, G., Klymchenko, A. S. Monitoring biophysical properties of lipid membranes by environment-sensitive fluorescent probes. Biophysical Journal. 96 (9), 3461-3470 (2009).
  12. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 77-83 (2012).
  13. Gaus, K., Zech, T., Harder, T. Visualizing membrane microdomains by Laurdan 2-photon microscopy. Molecular Membrane Biology. 23 (1), 41-48 (2006).
  14. Kahms, M., Klingauf, J. Novel pH-sensitive lipid based exo-endocytosis tracers reveal fast intermixing of synaptic vesicle pools. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 18 (2018).
  15. Zhou, L., Xie, L., Liu, C., Xiao, Y. New trends of molecular probes based on the fluorophore 4-amino-1,8-naphthalimide. Chinese Chemical Letters. 30 (10), 1799-1808 (2019).
  16. Tomczyk, M. D., Walczak, K. Z. l,8-Naphthalimide based DNA intercalators and anticancer agents. A systematic review from 2007 to 2017. European Journal of Medicinal Chemistry. 159, 393-422 (2018).
  17. Ulla, H., et al. Blue emitting 1,8-naphthalimides with electron transport properties for organic light emitting diode applications. Journal of Molecular Structure. 1143 (5), 344-354 (2017).
  18. Duke, R. M., Veale, E. B., Pfeffer, F. M., Kruger, P. E., Gunnlaugsson, T. Colorimetric and fluorescent anion sensors: An overview of recent developments in the use of 1,8-naphthalimide-based chemosensors. Chemical Society Reviews. 39 (10), 3936-3953 (2010).
  19. Panja, S. K., Dwivedi, N., Saha, S. Tuning the intramolecular charge transfer (ICT) process in push-pull systems: Effect of nitro groups. RSC Advances. 6 (107), 105786-105794 (2016).
  20. Thomas, D., et al. Solvatochromic and pH-sensitive fluorescent membrane probes for imaging of live cells. ACS Chemical Neuroscience. 12 (4), 719-734 (2021).
  21. Leslie, K. G., Jacquemin, D., New, E. J., Jolliffe, K. A. Expanding the breadth of 4-amino-1,8-naphthalimide photophysical properties through substitution of the naphthalimide core. Chemistry - A European Journal. 24 (21), 5569-5573 (2018).
  22. Liu, G. S., Tsien, R. W. Properties of synaptic transmission at single hippocampal synaptic boutons. Nature. 375 (6530), 404-408 (1995).
  23. Zhang, Q., Cao, Y. -Q., Tsien, R. W. Quantum dots provide an optical signal specific to full collapse fusion of synaptic vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 104 (45), 17843-17848 (2007).
  24. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  27. Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle. Annual Review of Neuroscience. 27, 509-547 (2004).
  28. Lazarenko, R. M., DelBove, C. E., Strothman, C. E., Zhang, Q. Ammonium chloride alters neuronal excitability and synaptic vesicle release. Scientific Reports. 7 (1), 5061 (2017).
  29. Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344 (6187), 1023-1028 (2014).
  30. Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nature Reviews. Neuroscience. 6 (1), 57-69 (2005).
  31. DelBove, C. E., et al. Reciprocal modulation between amyloid precursor protein and synaptic membrane cholesterol revealed by live cell imaging. Neurobiology of Disease. 127, 449-461 (2019).
  32. Dason, J. S., Smith, A. J., Marin, L., Charlton, M. P. Vesicular sterols are essential for synaptic vesicle cycling. Journal of Neuroscience. 30 (47), 15856-15865 (2010).
  33. Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms. Journal of Neuroscience. 39 (42), 8209-8216 (2019).
  34. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200 (1992).
  35. Afuwape, O. A., Kavalali, E. T. Imaging synaptic vesicle exocytosis-endocytosis with pH-sensitive fluorescent proteins. Methods in Molecular Biology. 1474, 187-200 (2016).

Tags

Membranlipidomsætning PH-følsom fluorescerende lipidanalog ND6Exo-/endocytose Biomolekyleudveksling Specialiserede celler Insulinsekretion Frigivelse af neurotransmittere Exo-/endocytoseforskning Gen- og proteinniveau Membranlipidgenanvendelse Plasmamembran Sekretoriske vesikler Lipidfordeling Intracellulære membranrum Lipidomsætningshastighed Biologiske forskningsfelter
Måling af membranlipidomsætning med den pH-følsomme fluorescerende lipidanalog ND6
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alamgir, S., Pelletier, O. B.,… More

Alamgir, S., Pelletier, O. B., Thomas, D., Rubio, V., Stawikowski, M. J., Zhang, Q. Measuring Membrane Lipid Turnover with the pH-sensitive Fluorescent Lipid Analog ND6. J. Vis. Exp. (173), e62717, doi:10.3791/62717 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter