Summary
Bu protokol, hücre ekzositozu ve endositoz döngüsü sırasında lipid membran trafiğini izlemek için pH'a duyarlı lipid florofor sınıfı kullanan bir floresan görüntüleme yöntemi sunar.
Abstract
Ekzo-/endositoz, hücreler ve çevreleri arasında ve farklı hücreler arasında biyomolekül alışverişine aracılık eden yaygın bir süreçtir. Özel hücreler bu işlemi, β hücrelerden insülin salgılanması ve kimyasal sinapslardan nörotransmitter salınımı gibi hayati vücut fonksiyonlarını yerine getirmek için kullanır. Fizyolojik önemi nedeniyle, ekzo-/endositoz hücre biyolojisinde en çok çalışılan konulardan biri olmuştur. Bu süreci gen ve protein düzeyinde incelemek için birçok araç geliştirilmiştir, çünkü bu sürece katılan protein mekanizması hakkında çok şey bilinmektedir. Bununla birlikte, ekzo-/endositozun fiziksel temeli olan membran lipid döngüsünü ölçmek için çok az yöntem geliştirilmiştir.
Bu makale, pH'a bağlı floresan sergileyen yeni floresan lipid analoglarının bir sınıfını tanıtmakta ve plazma membranı ile salgı vezikülleri arasındaki lipid geri dönüşümünü izlemek için kullanımlarını göstermektedir. Basit pH manipülasyonları ile desteklenen bu analoglar, yüzey ve hücre içi zar bölmeleri boyunca lipid dağılımının ölçülmesine ve ayrıca ekzo-/endositoz sırasında lipid devir hızının ölçülmesine de izin verir. Bu yeni lipid muhabirleri, hücre biyolojisi ve sinirbilim gibi çeşitli biyolojik araştırma alanlarına büyük ilgi duyacaktır.
Introduction
Lipid çift tabakası, en yaygın biyomolekül düzeneklerinden biridir ve tüm hücreler için vazgeçilmezdir. Hücrelerin dışında, hücreleri ve çevrelerini birbirine bağlayan plazma zarını oluşturur; Hücrelerin içinde, belirlenmiş işlevler için özelleşmiş çeşitli organelleri bölümlere ayırır. Durgundan ziyade dinamik olan lipid zarları, biyomateryal taşınımı, organel reformunu, morfoloji değişimini ve hücresel iletişimi aracılık eden sürekli olarak füzyon ve fisyon yaşar. Kuşkusuz, lipid zarı hemen hemen tüm hücresel süreçlerin fiziksel temelidir ve işlev bozukluğu, kanser1'den Alzheimer hastalığı2'ye kadar çeşitli bozukluklarda çok önemli bir rol oynar. Lipid molekülleri proteinlerden çok daha az çeşitli olmasına rağmen, şimdiye kadar yapılan zar araştırmaları esas olarak protein merkezli olmuştur. Örneğin, protein makineleri hakkında ekzositozdaki lipitlerden çok daha fazla şey bilinmektedir 3,4,5. Ayrıca, yüzey ve hücre içi zarlar boyunca lipitlerin organizasyonu, dağılımı, dinamikleri ve homeostazı, zar proteinlerine kıyasla büyük ölçüde keşfedilmemiş kalmaktadır6.
Mutajenez gibi modern moleküler biyoloji teknikleri, lipitlerden ziyade proteinleri incelemek için metodolojik bir avantaj sağladığından, bu şaşırtıcı değildir. Örneğin, pH'a duyarlı yeşil floresan proteinin (diğer adıyla pHluorin) veziküler proteinlere transgenik olarak etiketlenmesi, ekzo-/endositoz 7,8,9 sırasında veziküler protein devir miktarının ve hızının kantitatif ölçümünü kolaylaştırır. Bununla birlikte, membran lipidlerini in vivo olarak genetik olarak değiştirmek neredeyse imkansızdır. Ayrıca, protein miktarlarının ve dağılımlarının kalitatif ve hatta kantitatif manipülasyonları, lipitlerinkinden çok daha uygundur10. Bununla birlikte, doğal ve sentetik floresan lipidler, endojen membran lipidlerini in vitro ve in vivo11 simüle etmek için izole edilmiş ve geliştirilmiştir. Yaygın olarak kullanılan floresan lipitlerin bir grubu, membranla geliştirilmiş floresan sergileyen ve nöronlarda sinaptik vezikül (SV) salınımını incelemede güçlü bir araç olan FM1-43 gibi stiril boyalardır12. Son zamanlarda, çevreye duyarlı lipid boyalar icat edildi ve zar potansiyeli11, faz sırası13 ve sekresyon14 dahil olmak üzere çeşitli hücre zarı özelliklerini incelemek için yeni bir raportör sınıfı olarak yaygın olarak kullanıldı.
Floresansı hem pH'a duyarlı (örneğin, pHluorin) hem de membrana duyarlı (örneğin, FM1-43) olan yeni bir lipid mimetiği sınıfı, plazma zarındaki ve endozomlar/lizozomlardaki lipid dağılımını ve ekzo-/endositoz sırasındaki lipid trafiğini doğrudan ölçmek için geliştirilmiştir. Bu amaçla, molekül içi yük transferine bağlı itme-çekme özellikleri gösteren iyi bilinen solvatokromik floroforlar seçilmiştir. Mevcut solvatokromik floroforlar arasında, 1,8-naftalimid (ND) iskelesinin değiştirilmesi nispeten kolaydır, etiketleme için çok yönlüdür ve foto-fiziktebenzersizdir 15 ve bu nedenle DNA interkalatörlerinde, organik ışık yayan diyotlarda ve biyomolekül sensörlerindekullanılmıştır 16,17,18.
ND iskelesinin C4 konumuna elektron veren bir grubun bağlanması, elektron yoğunluğunuuyarılmış durumda 19,20 yeniden dağıtarak artan bir dipol momentine yol açan bir itme-çekme yapısı oluşturur. Böyle bir molekül içi yük transferi, büyük kuantum verimleri ve Stokes kaymaları üreterek parlak ve kararlı floresan21 ile sonuçlanır. Bu grup yakın zamanda ND iskelesine dayalı bir dizi solvatokromik lipid analoğu geliştirmiş ve bunları iyi sentetik verimlerleelde etmiştir 20.
Spektroskopik karakterizasyon, bu ürünler arasında ND6'nın en iyi floresan özelliklerine sahip olduğunu göstermektedir (Şekil 1)20. İlk olarak, floresein izotiyosiyanat, rodamin veya GFP gibi popüler floroforlara kıyasla iyi ayrılmış uyarma ve emisyon tepe noktalarına (yani, Şekil 2A, B'de sırasıyla ~400 nm ve ~520 nm) sahiptir, bu da onu spektral olarak onlardan ayrılabilir hale getirir ve bu nedenle çok renkli görüntüleme için kullanışlıdır. İkincisi, ND6 floresansı, misellerin varlığında floresansında sekiz kattan fazla bir artış sergiler (Şekil 2C), bu da güçlü bir membran bağımlılığını düşündürür. Farklı hücre tipleri ile yapılan önceki canlı hücre floresan görüntüleme çalışmaları, ND620 ile mükemmel membran boyaması göstermiştir. Üçüncüsü, çözeltinin pH'ı 7.5'ten (genellikle hücre dışı veya sitozolik ortamlarda bulunur) 5.5'e (genellikle endozomlarda ve lizozomlarda bulunur) düşürüldüğünde, ND6 floresanda yaklaşık iki kat artış gösterir (Şekil 2D), pH duyarlılığını gösterir. Ayrıca, moleküler dinamik simülasyonu, ND6'nın, fosfolipid baş grupları ile güçlü etkileşimler gösteren membran ve piperazin kalıntısından dışarı bakan ND iskelesi ile lipid çift tabakasına kolayca entegre olduğunu göstermektedir (Şekil 3). Toplamda, bu özellikler ND6'yı ekzo-/endositoz sırasında membran lipid döngüsünü görselleştirmek ve ölçmek için ideal bir floresan lipid analoğu yapar.
Bu makale, kültürlenmiş fare hipokampal nöronlarını kullanarak SV lipidlerinin devir hızını ve dinamiklerini incelemek için bir yöntem sunmaktadır. Yüksek K+ Tyrode çözeltileri ile nöronları uyararak, SV'ler ve plazma membranı ND6 ile yüklendi (Şekil 4A,B). Daha sonra, nöronlar farklı uyaranlarla yeniden uyarıldı, ardından NH4Cl içeren ve pH 5.5 Tyrode çözeltileri izledi (Şekil 4D). Bu protokol, farklı koşullar altında birleştirilmiş ekzositoz ve endositoz oranlarının kantitatif ölçümünü kolaylaştırır (Şekil 4C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıdaki protokol şunları içerir: (1) iyi kurulmuş bir protokole dayalı fare hipokampal ve kortikal kültürleri oluşturmak için basitleştirilmiş bir prosedür22, (2) canlı nöronlar için bir epifloresan mikroskop kurulumuna kısa bir giriş, (3) fare nöronlarında ND6'nın yüklenmesi ve görüntülenmesinin ayrıntılı bir açıklaması, (4) ND6 sinyali ile membran trafiğinin ölçülmesi hakkında bir tartışma. Tüm prosedürler Florida Atlantic Üniversitesi'ndeki biyogüvenlik ve IACUC yönergelerini takip eder. ND6'nın sentezi daha önce20 olarak tanımlanmıştır.
1. Fare hipokampal ve kortikal kültürlerinin hazırlanması
NOT: Aksi belirtilmedikçe, tüm adımlar biyogüvenlik seviyesi 2 laminer akış başlığında gerçekleştirilmelidir. Tüm alet ve malzemeleri sterilize edin.
- Cam lamelleri çok kuyulu kültür plakalarına yerleştirmek için 5 numara forseps kullanın.
NOT: Örneğin, 24 oyuklu bir plaka 12 mm
lameller için idealdir. - Hücre kültürü yüzeyini kaplamak için uygun hacimde hücre dışı matrisler ekleyin (örneğin, 12 mm lamel başına 75 μL bazal membran matris çözeltisi; Malzeme Tablosuna bakınız)
- Hazırlanan plakaları, bazal membran matrisinin çapraz bağlanmasına izin vermek için doku kültürü inkübatörüne (%5 CO2, %100 nem ve 37 ° C) 1-4 saat yerleştirin.
- Hayvanları kurban edin, kafatasını açın ve tüm beyni% 20 fetal sığır serumu (H + 20) içeren 3 mL Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) içeren 35 mm'lik bir Petri kabına aktarın. Beyni orta hat boyunca kesin ve kontaminasyonu azaltmak için korteksleri ve hipokampusları laminer akışlı bir diseksiyon başlığında ayırın.
- Dokuları küçük parçalara (~1 mm3) kesmek için mikromakas kullanın. Bu dokuları 5 mL H+20 içeren 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
- Dokuları üç kez 5 mL H+20 ve üç kez 5 mL HBSS ile yıkayın.
- Etilendiamin tetraasetik asit ile 1.5 mL %1 tripsin ekleyin ve enzim sindirimi için 37 °C'de 10 dakika inkübe edin.
- Adım 1.6'yı tekrarlayın ve sonunda HBSS'yi aspire etmek için vakum kullanın.
- Ateşle parlatılmış bir cam pipet kullanarak dokuları 2.95 g / L MgSO4 • 7H2O içeren 1 mL HBSS'de mekanik olarak ayırın.
- Hücre süspansiyonunu 400 × g'da, 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı aspire edin ve ~ 10.000.000 hücre / ml'lik bir konsantrasyon elde etmek için hücreleri uygun bir hacimde kültür ortamında yeniden süspanse edin.
- Hücreleri ~ 1.000.000 hücre /cm2'de kaplayın ve hücrenin cam lamellere bağlanmasını kolaylaştırmak için kültürü inkübatöre (%5CO2, %100 nem ve 37 °C) 1-4 saat yerleştirin.
- Uygun hacimde kültür ortamı ekleyin (ör., 24 oyuklu bir plaka için oyuk başına 1 mL). 1 hafta sonra aynı hacimde kültür ortamı ekleyin. 2 hafta sonra, mevcut kültür ortamının yarısını her hafta yeni ortamla değiştirin.
lameller için idealdir.2. Canlı hücre floresan görüntüleme için mikroskop kurulumu
NOT: Örnek bir görüntüleme kurulumu (Şekil 5) en azından ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu (Malzeme Tablosuna bakın), otomatik deklanşörlü floresan ışık kaynağı, floresan filtre setleri (örneğin, ND6 görüntüleme için, uyarma için 405/10 BP, dikroik için 495 LP ve emisyon için 510/20 BP kullanın) ve tümü görüntü elde etme yazılımı (Malzeme Tablosu) tarafından kontrol edilen yüksek hassasiyetli bir kamera (Malzeme Tablosu) içerir.
- Canlı hücre floresan görüntüleme için sıcaklık kontrolüne ve çözelti giriş/çıkışına izin veren bir görüntüleme odası hazırlayın.
NOT: Örneğin, bu protokolde bir ısıtma platformuna sabitlenmiş modifiye edilmiş bir açık banyo görüntüleme odası kullanılmıştır (Şekil 6). - Perfüzyon solüsyonlarını değiştirmek ve görüntüleme sırasında tanımlanmış zaman noktalarında elektrik uyarıcısı vermek için programlanabilir bir cihaz kurun.
NOT: Kantitatif analizler için donanım ve yazılım senkronizasyonu gereklidir (Şekil 7). Örneğin, bu protokolde, çok kanallı bir perfüzyon sistemini ve bir kare nabız stimülatörünü kontrol eden otomatik bir anahtarlama cihazını kontrol eden bir bilgisayar programını başlatmak için görüntüleme kamerasından bir tetik çıkışı kullanıldı. - İki veya daha fazla floresan raportörü birlikte görüntülemek için, filtre setlerini sırayla değiştirerek veya aynı anda farklı floresan emisyonlarını bölerek ve aynı kameraya yansıtarak çok kanallı floresan görüntüleme gerçekleştirin.
3. Nöronal kültürlerde ND6'nın yüklenmesi ve görüntülenmesi
- Uygun miktarda ND6'yı tartın, dimetilsülfoksit (DMSO) içinde çözün ve oda sıcaklığında çözünmesine izin verin; kısaca sonicate (örneğin, 3 dakika). Büyük boya agregalarını çıkarmak için 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak ham stok çözeltisini filtreleyin. Filtrasyondan sonra, ε = 10.700 M-1 cm-1 kullanarak geleneksel veya mikro hacimli bir spektrofotometre kullanarak 405 nm'de absorpsiyon spektroskopisi ile boya konsantrasyonunu belirleyin.
- Uygulamadan önce, banyo solüsyonunu kullanarak stok çözeltisini 1 μM konsantrasyona seyreltin. Stok çözeltisini karanlıkta oda sıcaklığında tutun.
- Endozomların ve sinaptik veziküllerin etiketlenmesi
- Endozomlar gibi endositozlu membran bölmelerini her yerde etiketlemek için, ND6 stok çözeltisini (örneğin, DMSO'da 1 mM) 1 μM'lik son konsantrasyonda kültür ortamına ekleyin ve% 5 CO2,% 100 nem ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. SV etiketlemesinin kapsamını azaltmak için, spontan nöronal aktiviteyi farmakolojik olarak baskılayın. Örneğin, aksiyon potansiyellerini bloke etmek için tetrodotoksin veya uyarıcıiletimi inhibe etmek için 2,3-diokso-6-nitro-1,2,3,4-tetrahidrobenzo[f]kinoksalin-7-sülfonamid (NBQX) ve D-(-)-2-amino-5-fosfonopentanoik asit (D-AP5) kullanın.
- SV'leri seçici olarak etiketlemek için, presinaptik ekzo-/endositozu uyandırmak için kısa ama güçlü bir stimülasyon kullanın. İlk olarak, kültür lamel(ler)ini oda sıcaklığında 2 mL normal Tyrode çözeltisi içeren 35 mm'lik bir Petri kabına aktarın. İkinci olarak, ND6 stok çözeltisini yüksek K+ Tyrode çözeltisi (90 mM KCl) içinde 1 μM'lik son konsantrasyonda seyreltin. Üçüncüsü, Petri kabındaki normal Tyrode solüsyonunu ND6 içeren yüksek K+ Tyrode solüsyonu ile değiştirin ve oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin.
- ND6 etiketli hücre kültürünü, 10 μM NBQX ve 10 μM D-AP5 içeren önceden ısıtılmış normal Tyrode çözeltisi ile doldurulmuş görüntüleme odasına aktarın.
- Perfüzyon hızını ~ 0.2 mL / s'ye ayarlayın (yani, saniyede 1 damla) ve kültürdeki aşırı ND6'yı gidermek için NBQX ve D-AP5 içeren önceden ısıtılmış normal Tyrode çözeltisinin perfüzyonunu başlatın.
- Odağı ayarlayın ve bağlı nöritler taşıyan sağlıklı ve iyi yayılmış nöronları içeren uygun görüş alanını bulun. Çözülmemiş boya kolloidleri içeren alanlardan kaçının.
- En iyi görüntüleme ayarlarını belirlemek için ND6 yüklü hücreleri farklı pozlama süreleriyle görüntülemeyi deneyin.
NOT: En iyi pozlama süresi için, ortaya çıkan görüntüdeki en yüksek piksel floresan yoğunluğu, bit aralığının yaklaşık yarısıdır (örneğin, 16 bitlik bir görüntü için bit aralığı 0 ila 65.535 arasındadır), bu da asidik banyo çözeltisi uygulandığında floresanda daha fazla artışa izin verecektir. Seçilen pozlama süresi tüm ND6 görüntüleme için kullanılmalıdır. - Stimülasyon ve perfüzyon protokolünü, çerçeve aralığını ve toplam süreyi ayarlayın. Örneğin, aşağıdaki protokolde, 30 s'lik bir taban çizgisi, 10 s'lik 30 Hz'lik bir elektrik alan stimülasyonu, 50 s'lik bir geri kazanım, 120 s'lik 90 mM K+, 60 s'lik geri kazanım, 50 mM NH4Cl ile 60 s'lik Tyrode çözeltisi, pH 5.5'te 60 s'lik Tyrode çözeltisi ve 3 s'lik bir çerçeve aralığı kullanın.
- Senkronize stimülasyon ve perfüzyon eşliğinde görüntü alımını başlatın. Görüntüleme sırasında simülasyonu ve çözüm alışverişini izleyin.
- Görüntüleme bittikten sonra perfüzyonu durdurun, lamel çıkarın ve bir sonraki deneme için görüntüleme odasını temizleyin.
4. ND6 floresansındaki bir değişiklikle membran kaçakçılığının ölçülmesi
- Tüm görüntü dosyalarını yedekleyin ve/veya elektronik bir kopyasını alın.
- Veri çıkarma için bir analiz programı seçin, örneğin ImageJ24 ve/veya FIJI25 gibi açık kaynaklı bir görüntü analiz yazılımı.
- Bir görüntü yığınını açın veya analiz programına aktarın.
- İlk görüntüyü referans olarak ayarlayın ve geri kalanını, xy sürüklenmesinden kaynaklanan artefaktları azaltacak olan Rigid Registration26 gibi işlevleri/eklentileri kullanarak ona hizalayın. Örnek görüntüler için Şekil 8'e bakın.
- Bir referans görüntü oluşturmak için 30 sn ön taban çizgisi sırasında elde edilen tüm görüntülerin ortalamasını alın. İleride başvurmak üzere bu resmin bir kopyasını saklayın.
- Temel ortalaması alınan görüntüden ikili bir görüntü oluşturmak için yoğunluk eşiğini ayarlayın.
- Bağlanan nöritleri veya hücreleri ayırmak için ImageJ'deki Watershed'i veya başka bir programdaki benzer işlevleri kullanın.
- Hücre zarlarına, endozomlara, lizozomlara veya sinaptik butonlara karşılık gelen ilgi alanlarını (ROI'ler) istemek için uygun alan boyutu ve dairesellik ile Parçacığı Analiz Et işlevini kullanın. Seçilen tüm ROI'leri kaydedin.
- Görüş alanı içindeki hücresiz bölgelerde dört arka plan ROI'si seçin.
- Görüntü yığınının her karesindeki her bir ROI için ortalama piksel yoğunluklarını ölçün ve sonuçları istatistiksel analiz için dışa aktarın.
- Arka plan ROI'lerinin ortalama yoğunluğunu, her ROI için ortalama piksel yoğunluklarından çıkarılacak olan temel gürültü olarak hesaplayın.
- Normalizasyon için %100 olarak tanımlanan maksimum floresan yoğunluğunu elde etmek için pH 5.5 Tyrode çözeltisinin uygulanması sırasında seçilen her ROI için en yüksek üç ortalama yoğunluğun ortalamasını alın.
- Normalizasyon için %0 olarak tanımlanan minimum floresan yoğunluğunu ayarlamak için 50 mM NH4Cl uygulaması sırasında seçilen her ROI için en düşük üç ortalama yoğunluğun ortalamasını alın.
- Her ROI için bağıl floresan değişikliklerini kendi %0 ve %100 yoğunluklarına göre hesaplayın. Bireysel ROI verilerinden ortalama floresan değişikliklerini, değişiklik kinetiklerini ve diğer değerleri/grafikleri türetin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SV'ler, uyarılmış ekzo-/endositoz27 yoluyla nörotransmitter salınımı için uzmanlaşmıştır. SV'ler, ND6 için ideal olan yüksek asidik lümene (yani pH 5.5) sahiptir. ND6'nın SV'ye erişmesine izin vermek için SV ekzo-/endositozu uyandırmak için yüksek K+ stimülasyonu kullandık. Beklendiği gibi, yüklemeden sonra nöronal süreçler boyunca parlak yeşil floresan punkta ortaya çıktı (Şekil 9A). Şekil 4B'de gösterilen çizgi profili, ND6 (yeşil eğri) ve FM4-64 punkta (kırmızı eğri) arasında güçlü bir örtüşme göstermiştir. ND6 ve FM4-64 floresan yoğunlukları arasındaki güçlü korelasyon da ND6'nın SV boyamasını düşündürmektedir (Şekil 9B).
Sırasıyla kolayca serbest bırakılabilir havuzun (RRP, yani yüksek salım olasılığına sahip SV'ler) ve yedek havuz SV'lerinin (yani düşük salım olasılığına sahip SV'ler) salınımını uyandırmak için bir elektrik stimülasyonu ve yüksek bir K+ stimülasyonu kullanıldı. Her iki uyarana yanıt olarak ND6 floresansında azalmalar olmuştur (Şekil 4C ve Şekil 4E), bu da ND6'nın SV membranında bulunduğunu ve SV salınımı sırasında SV lümeninin nötralize edildiğini (ND6 sinyal azalması ile bildirilir) düşündürmektedir.
Her denemenin sonunda, yüzey membranı ND6'yı aydınlatmak için SVs28 ve pH 5.5 çözeltisini asitten arındırmak için 50 mM NH4Cl uygulandı (Şekil 4D ve Şekil 4F). Floresandaki farklılıklar, yüzey membranında (~%44) ve SV membranında (~%56) ND6'yı belirlememizi sağlar. Bu sayılar, akson terminalleri29'daki yüzey ve SV membranlarının fraksiyonlarıyla eşleşir, bu da ND6'nın membranlar arasında eşit olarak dağıldığını gösterir. Ayrıca, iki farklı uyaran ve iki pH manipülasyonu sırasında ND6 sinyalleri, kısa elektrik patlamasının yaklaşık ~%31 SV'leri harekete geçirdiğini ve yüksek K+ stimülasyonunun kalan SV'lerin ~%70'ini serbest bıraktığını tahmin etmemizi sağlar. Stimülasyonlar sırasında ND floresan azalma oranları, daha önce bildirilen uyarılmış SV ekzositozu için zaman sabiti ile de eşleşir30.
ND6'nın kompakt boyutu, önceki etiketleme yöntemi14'e göre hücre zarlarında çok daha az sterik bozulmaya yol açar ve böylece SV kaçakçılığının daha doğru ölçümünü sağlar. Bu fikri destekleyen on kat daha yüksek yükleme konsantrasyonu, stimülasyon sırasında FM4-64 lekelenmesinde önemli bir fark göstermedi (Şekil 10). Bununla birlikte, astrositlerde orta derecede boyanması göz önüne alındığında 1μM hala tavsiye edilir.
SV ekzo-/endositoz kolesterolü (nöronal membranlarda bol ve hayati bir lipid) içerdiğinden, membran kolesterolünün SV salınımını ve alımını nasıl etkilediğini sormak için ND6 görüntülemeyi kullandık. Metil-β-siklodekstrinin (MβCD) 90 dakikalık tedavisi için 1 mM, yaşlanmaya bağlı membran kolesterol düşüşünü taklit ederek nöronal yüzey membranından(31) ~% 10 kolesterolü çıkarabilir. Kapsamlı bir elektrik stimülasyonu altında, MβCD tedavisi, ND6 görüntüleme ile ölçülen SV salınımını ve alımını önemli ölçüde azaltmıştır (Şekil 11A), bu da membran kolesterolünün SV ekzo-/endositozu kolaylaştırdığını düşündürmektedir32. Ayrıca, kolesterolün nörotransmisyonun aslına uygunluğu için çok önemli olan SV havuzunun yenilenmesine katkısını da değerlendirdik33. Bafilomisin A1 (BafA1) varlığında 10 saniye arayla iki elektrik stimülasyonu uygulandı. BafA1, SV'leri yeniden asitleştiren v-ATPaz'ı seçici olarak inhibe eder. BafA1, alınan SV'lerin yeniden asitlenmesini akut olarak bloke ederek, stimülasyondan sonra ND6 floresan geri kazanımını önler (Şekil 11B). İkinci uyaran sırasındaki ND6 düşüşü, yalnızca boş RRP'yi yenileyen yeni ortaya çıkan SV'lerden gelmelidir. Sahte kontrole kıyasla, MβCD ile ön işleme tabi tutulan nöronlarda ikinci uyarana önemli ölçüde daha küçük bir ND6 yanıtı gözlenmiştir (yani, daha küçük genlik ve ND6 floresan azalmasının daha hızlı bozulması). Bu sonuç, kolesterolün RRP'ye yeni SV'lerin alınmasında çok önemli bir rol oynadığı fikrini desteklemektedir.
Şekil 1: ND6 probu için genel sentez şeması. Bu rakam Thomas ve ark.20'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: ND6'nın özellikleri. (A ve B) ND6'nın solvatokromik özellikleri. 405 nm'de uyarılan çeşitli çözücülerde absorbans spektrumları (A) ve floresan spektrumları (B). (C) ND6'nın su (kırmızı) ve 1 μM'de %1 oktil glukozit çözeltisindeki floresan yoğunluğunun karşılaştırılması. (D) %1 OG çözeltisinde pH'ın bir fonksiyonu olarak ND6 floresansı, piperazin baş grubunun protonasyon durumu ile orantılıdır (hesaplanan pKa = 7.4). Ek, ND6 piperazin parçasının hesaplanan protonasyon durumunu gösterir (tahmin edilen pKa = 8.83). Kesikli çizgi, takılan değerleri temsil eder. Bu rakam Thomas ve ark.20'den değiştirilmiştir. Kısaltmalar: DCM = diklorometan; MeCN = asetonitril; DMSO = dimetilsülfoksit; EtOH = etil alkol; MeOH = metil alkol; Abs= absorbans; Em = emisyon; OG = oktil glukozit. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Moleküler dinamik simülasyon yörüngesinden anlık görüntü. ND6 probunun POPC membranındaki etkileşimi (sol panel). Piperazin baş grubu, elektrostatik etkileşimler yoluyla fosfat grupları (sağ panel) ile güçlü bir şekilde etkileşime girer. Siyah ok (sağ panel), naftalimid halkası ve piperazin arasındaki C-N bağını gösterir. Sonuçlar, piperazin grubunun, sandalye konformasyonunu korurken, 90 ila 120 derece arasındaki dihedral açı (gösterilen atomlar) tercihiyle sadece hafifçe hareket ettiğini göstermektedir. Bu rakam Thomas ve ark.20'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: ND6 sinaptik vezikülleri işaretler ve sinir terminallerinde salınımlarını ve alımlarını bildirir. (A) FM4-64 (kırmızı), ND6 (yeşil) ve bindirme (sarı) örnek görüntüleri. Bir nöronun nöritleri ve soma'sı çizgi profilliydi. Düzleştirilmiş çizgi görüntüleri (20 piksel genişliğinde) ilgili görüntülerin yanındadır. Ok uçları, FM4-64 ile işaretlenmiş sinaptik butonları gösterir. Ölçek çubukları = 100 μm. (B) FM4-64 ve ND6 floresan yoğunluklarının çizgi profilleri önemli benzerlik gösterir. (C) Uyaranlara yanıt olarak A'da ok uçlarıyla gösterilen sinaptik boutonlarda ND6 floresan değişikliklerinin örnek izleri. (D) NH4 Cl ve pH 5.5 Tyrode çözeltilerine yanıt olarakND6floresan değişikliklerinin numune izleri. (E) FM4-64'ün lekesizleştirilmesi geçici olarak ND6 yoğunluk değişikliklerine bağlanır. Veriler ortalama ± S.E.M. (F) ND6 floresan yoğunluğu olarak çizildi, ancak FM4-64 yoğunluğu sırasıyla 50 mM NH4 Cl ve pH 5.5 Tyrode çözeltilerinin uygulanmasıyla azaltıldı ve arttırıldı. Veriler ortalama ± S.E.M. olarak çizilir. Bu rakam Thomas ve ark.20'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Nikon-TiE ters çevrilmiş mikroskoba dayalı görüntüleme kurulumu. Canlı hücre floresan görüntüleme için gerekli olan dört bileşen açıklamalıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Stimülasyon görüntüleme kurulumu. Kurulum, sıcaklık kontrolü ve çözelti değişimi için bir Warner Instruments RC-26 odasından ve PH-1 ısıtma platformundan değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Senkronize stimülasyonlar ve çözüm değişimleri ile görüntü alımı için cihaz konfigürasyonlarının şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Görüntü analizindeki temel adımları gösteren örnek görüntüler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: ND6, presinaptik terminallerde kümelenmiş sinaptik vezikülleri vurgular. (A) Örnek görüntüler FM4-64 (kırmızı) ve ND6 (yeşil) yüksek büyütmede birlikte yükleme. Ölçek çubuğu = 30 μm. (B) FM4-64 ve ND6'nın dağılım grafiği, sinaptik butonlara ve doğrusal regresyon uyumuna karşılık gelen aynı ROI'lerde ortalama floresan yoğunlukları. r = 0.8353; p = 1.7 × 10-8; görüş alanları N = 9; Yatırım getirisi n = 450. FM4-64 için eşik 1.200 au (keyfi birim) ve ND6 için 160 au'dur. Bu rakam Thomas ve ark.20'den değiştirilmiştir. Kısaltma: ROI'ler = ilgi alanları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10: ND6, SV'lere müdahale etmez. (A) 1 veya 10 μM ND6 yüklemesinden sonra ND6 ile temsil edilen SV cirosu (elektrik uyarısı ile). (B) FM4-64 ile ölçülen SV cirosu (elektrik uyarıcısı ile). Bu rakam Thomas ve ark.20'den değiştirilmiştir. Kısaltma: SV'ler = sinaptik veziküller. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 11: Kolesterol azalması SV cirosunu bozar. (A) ND6 ile temsil edilen SV 10 Hz altında ciro, kontrolde 120 s elektrik uyarısı ve MβCD ile tedavi edilen nöronlar. (B) Bafilomisin A1, geri dönüştürülmüş SV'lerin yeniden asitlenmesini önler (yani, stimülasyonla uyarılmış azalmadan sonra ND6 floresan geri kazanımı olmaz) ve MβCD'nin SV ikmali üzerindeki etkisini daha da açıklar. Bu rakam Thomas ve ark.20'den değiştirilmiştir. Kısaltma: SV = sinaptik vezikül; MβCD = metil-β-siklodekstrin; BafA1 = Bafilomisin A1. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1,1′-dioktadesil-3,3,3′,3′-tetrametilindokarbosiyanin (DiI) ve 3,3′-Dioktadesilinoksakarbosiyanin perklorat (DiO) gibi lipid bazlı boyalar, hücre morfolojisini göstermek ve nöronların akson projeksiyonları gibi hücresel süreçleri izlemek için uzun süredir kullanılmaktadır. FM1-43 gibi stiril boyalar, ekzositoz34 çalışması için icat edilmiş ve başarıyla kullanılmıştır. Düşük membran afiniteleri nedeniyle, plazma membranında kalan boyalar sürekli perfüzyonla yıkanırken, sıkıştıkları endositozlu vezikülleri seçici olarak etiketlerler. Bu nedenle, stiril boyalar vezikül geri dönüşümünün sürekli izlenmesi için uygun değildir.
pH'a duyarlı GFP'nin (yani pHluorin) son buluşu, VAMPII veya Synaptophysin35 gibi bir veziküler membran proteinine etiketlendiğinde vezikül geri dönüşümünü tekrar tekrar görselleştirmeyi mümkün kılmıştır. Aynı prensibi izleyerek, pH'a duyarlı bir floroforun lipid moleküllerine etiketlenmesi, ekzo-/endositoz14 döngüleri sırasında lipid membran geri dönüşümünün izlenmesini sağlar. Bu durumda, tek bir lipid varlığı olan ND6'nın hazırlanması daha kolaydır, uygulanması daha basittir, lipid membranlarını etiketlemek için daha verimlidir, hücrelere daha az zarar verir, hücre zarlarında kalmada daha kararlıdır ve bu nedenle floresan görüntüleme için daha güvenilirdir. Membrana bağımlılığı ve ters pH duyarlılığı, SV'ler ve endozomlar gibi asidik organellerin daha parlak boyanmasına izin verir.
Ayrıca, hipokampal dilimler gibi dokulardaki bu tür asidik organelleri veya presinaptik terminalleri, spesifik olarak dağılmış ND6, hücre dışı veya sitozolik boşluklarda nötr pH ile söndürülür. Ek olarak, büyük Stokes kayması, ND6'yı derin dokuların çoklu foton görüntülemesi için ideal hale getirir. Bu nedenle, ND6 ve diğer pH'a duyarlı lipid bazlı floroforlar, çoklu ekzo-/endositoz turları için plazma zarı ile SV'ler ve endozomlar gibi hücre içi aparatlar arasındaki lipid ve hücre zarı trafiğinin gerçek zamanlı optik ölçümüne izin verir. Sinapsların ve SV'lerin nörotransmisyon için hayati önem taşıdığı göz önüne alındığında, ND6 şüphesiz sinaptik fizyolojiyi incelemek için yararlıdır.
Bu lipid analoglarının modüler tasarımı göz önüne alındığında, ND'nin çeşitli hücre zarları veya organellerde fosfolipitler ve sfingolipidler gibi diğer lipitlere konjuge edilmesi mümkündür. Ayrıca, ND grupları, hücrelerin veya organellerin içindeki veya dışındaki kalsiyum veya çinko konsantrasyonu gibi diğer çevresel faktörleri tespit etmek için çevreye duyarlı diğer floroforlarla değiştirilebilir. Ayrıca, farklı emisyon spektrumlarına sahip floroforlar, lipid raportörlerinin paletini genişletmek için membran lipidlerine bağlanabilir. Tüm bu modifikasyonlar için, lipitler ve ND veya diğer floresan grupları arasındaki bağlayıcı, daha iyi foto özellikler ve/veya istenen hassasiyetler elde etmek için ayarlanabilir.
Bu protokol, canlı hücre görüntüleme kullanarak SV cirosunu görselleştirmede ND6'nın kullanımını açıklar. Kritik adımlar, tümü sonuçların kalitesini önemli ölçüde etkileyen yükleme, senkronize stimülasyonlar ve floresan miktar tayinini içerir. Ayrıca, bu adımlarda kullanılan parametreler/ayarlar etüdün ihtiyaçlarına göre değiştirilebilir. Örneğin, yükleme sırasındaki stimülasyon, farklı SV havuzlarına (sırasıyla yüksek veya düşük serbest bırakılabilir olasılıklara sahip havuzlar) erişime izin verecek şekilde ayarlanabilir (daha kısa veya daha uzun süre). Canlı hücre floresan görüntüleme için, hücre sağlığı ile floresan yoğunluğu arasında bir denge kurmak önemlidir ve bu özellikle önemlidir. Bunun nedeni, ND6 için uyarımın UV'ye yakın (yani 405 nm) olmasıdır, bu da görünür ışıktan daha fazla fototoksisiteye ve boya bozulmasına neden olabilir. Bu nedenle, fotohasarı en aza indirmek ve sinyal kalitesini en üst düzeye çıkarmak için uyarma gücünü, pozlama süresini, kare hızını ve görüntüleme süresini ayarlamak önemlidir.
ND6 çok ilginç bir sondadır. Büyük Stokes kayması, FM4-6420 gibi diğer membran boyalarla aynı anda kullanılmasını mümkün kılmıştır. Daha da önemlisi, floresan rezonans enerji transferi (FRET) için uygun bir donör adayıdır ve FRET alıcısını birlikte uyarma olasılığı çok daha düşük olan mor ışıkla uyarılabilir. ND6 gibi lipid taklit eden boyalar, ekzo-/endositoz sırasında membran proteinleri ve lipitler arasındaki etkileşimleri incelemeyi mümkün kılar. Membran proteinleri ve lipitler arasındaki pH'a bağlı ilişki ve ayrışma, SV'lerin veya endozomların asidik lümeninde büyütülecek ve membran lipidlerinin reseptör aracılı endositoz ve sıralamadaki rolünün araştırılmasını kolaylaştıracaktır. Özetle, ND6 ve türevleri, membran lipidlerini ve bunların canlı hücrelerdeki ticaretini incelemek için araç kutusunu önemli ölçüde genişletebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.
Acknowledgments
Bu çalışma Florida Atlantik Üniversitesi Lisans Araştırma ve Araştırma Ofisi hibesi (MJS), Florida Sağlık Bakanlığı Ed ve Ethel Moore Pilot Hibesi 20A17 (QZ), Alzheimer Derneği hibesi AARG-NTF-19-618710 (QZ) ve NIA R21 hibesi AG061656-01A1 (QZ) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digidata 1440A Data Acquistion System | Molecular Devices | Digidata 1440A | For synchronized stimulation and solution exchange |
| Dual Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | For live-cell imaging |
| Fetal Bovine Serum | OMEGA Scientific | FB-01 | For making H+20 solution used in dissection and tissue culture |
| Hamamatsu Flash4.0 sCOMS camera | Hamamatsu Inc. | C13440-20CU | high-sensitivity camera |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | For making H+20 solution used in dissection and tissue culture |
| Heated Platform | Warner Instruments | PH-1 | For live-cell imaging |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | For tissue culture |
| Micro-G Vibration Isolation Table | TMC | 63-564 | For live-cell imaging |
| Micro-manager | https://micro-manager.org/ | NA | For image acquisition control |
| Multi-Line In-Line Solution Heater | Warner Instruments | SHM-6 | For live-cell imaging |
| Neurobasal Plus Medium | THermoFisher Scientific | A3582901 | For tissue culture |
| Nikon Ti-E Inverted Microscope | Nikon | Ti-E/B | For live-cell imaging |
| ORCA-Flash4.0 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C1340-20CU | For live-cell imaging |
| Perfusion Chamber | Warner Instruments | RC-26G | For live-cell imaging |
| Six-Channel Valve Control Perfusion System | Warner Instruments | VC-6 | For solution exchange |
| Square Pulse Stimulator | Grass Instrument | SD9 | For electric field stimulation |
References
- Polo, S., Pece, S., Di Fiore, P. P.
- Eckert, G. P., Wood, W. G., Muller, W. E. Lipid membranes and beta-amyloid: a harmful connection. Current Protein and Pept Science. 11 (5), 319-325 (2010).
- Augustine, G. J., Burns, M. E., DeBello, W. M., Pettit, D. L., Schweizer, F. E.
- Ammar, M. R., Kassas, N., Chasserot-Golaz, S., Bader, M. F., Vitale, N. Lipids in regulated exocytosis: what are they doing. Frontiers in Endocrinology. 4, 125 (2013).
- Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C.
- Chabanon, M., Stachowiak, J. C., Rangamani, P. Systems biology of cellular membranes: a convergence with biophysics. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 9 (5), 1386 (2017).
- Prosser, D. C., Wrasman, K., Woodard, T. K., O'Donnell, A. F., Wendland, B. Applications of pHluorin for quantitative, kinetic and high-throughput analysis of endocytosis in budding yeast. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54587 (2016).
- Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nature Protocols. 1 (6), 2970-2978 (2006).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
- Demchenko, A. P., Mély, Y., Duportail, G., Klymchenko, A. S. Monitoring biophysical properties of lipid membranes by environment-sensitive fluorescent probes. Biophysical Journal. 96 (9), 3461-3470 (2009).
- Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 77-83 (2012).
- Gaus, K., Zech, T., Harder, T. Visualizing membrane microdomains by Laurdan 2-photon microscopy. Molecular Membrane Biology. 23 (1), 41-48 (2006).
- Kahms, M., Klingauf, J. Novel pH-sensitive lipid based exo-endocytosis tracers reveal fast intermixing of synaptic vesicle pools. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 18 (2018).
- Zhou, L., Xie, L., Liu, C., Xiao, Y. New trends of molecular probes based on the fluorophore 4-amino-1,8-naphthalimide. Chinese Chemical Letters. 30 (10), 1799-1808 (2019).
- Tomczyk, M. D., Walczak, K. Z. l,8-Naphthalimide based DNA intercalators and anticancer agents. A systematic review from 2007 to 2017. European Journal of Medicinal Chemistry. 159, 393-422 (2018).
- Ulla, H., et al. Blue emitting 1,8-naphthalimides with electron transport properties for organic light emitting diode applications. Journal of Molecular Structure. 1143 (5), 344-354 (2017).
- Duke, R. M., Veale, E. B., Pfeffer, F. M., Kruger, P. E., Gunnlaugsson, T. Colorimetric and fluorescent anion sensors: An overview of recent developments in the use of 1,8-naphthalimide-based chemosensors. Chemical Society Reviews. 39 (10), 3936-3953 (2010).
- Panja, S. K., Dwivedi, N., Saha, S. Tuning the intramolecular charge transfer (ICT) process in push-pull systems: Effect of nitro groups. RSC Advances. 6 (107), 105786-105794 (2016).
- Thomas, D., et al. Solvatochromic and pH-sensitive fluorescent membrane probes for imaging of live cells. ACS Chemical Neuroscience. 12 (4), 719-734 (2021).
- Leslie, K. G., Jacquemin, D., New, E. J., Jolliffe, K. A. Expanding the breadth of 4-amino-1,8-naphthalimide photophysical properties through substitution of the naphthalimide core. Chemistry - A European Journal. 24 (21), 5569-5573 (2018).
- Liu, G. S., Tsien, R. W. Properties of synaptic transmission at single hippocampal synaptic boutons. Nature. 375 (6530), 404-408 (1995).
- Zhang, Q., Cao, Y. -Q., Tsien, R. W. Quantum dots provide an optical signal specific to full collapse fusion of synaptic vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 104 (45), 17843-17848 (2007).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Sudhof, T. C.
- Lazarenko, R. M., DelBove, C. E., Strothman, C. E., Zhang, Q. Ammonium chloride alters neuronal excitability and synaptic vesicle release. Scientific Reports. 7 (1), 5061 (2017).
- Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344 (6187), 1023-1028 (2014).
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J.
- DelBove, C. E., et al. Reciprocal modulation between amyloid precursor protein and synaptic membrane cholesterol revealed by live cell imaging. Neurobiology of Disease. 127, 449-461 (2019).
- Dason, J. S., Smith, A. J., Marin, L., Charlton, M. P. Vesicular sterols are essential for synaptic vesicle cycling. Journal of Neuroscience. 30 (47), 15856-15865 (2010).
- Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms. Journal of Neuroscience. 39 (42), 8209-8216 (2019).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200 (1992).
- Afuwape, O. A., Kavalali, E. T. Imaging synaptic vesicle exocytosis-endocytosis with pH-sensitive fluorescent proteins. Methods in Molecular Biology. 1474, 187-200 (2016).
