Summary
Denne protokollen presenterer en fluorescensavbildningsmetode som bruker en klasse av pH-følsomme lipidfluoroforer for å overvåke lipidmembrantrafikk under celleeksocytose og endocytosesyklusen.
Abstract
Ekso-/endocytose er en vanlig prosess som formidler utveksling av biomolekyler mellom celler og deres miljø og mellom forskjellige celler. Spesialiserte celler bruker denne prosessen til å utføre vitale kroppsfunksjoner som insulinutskillelse fra β celler og frigjøring av nevrotransmittere fra kjemiske synapser. På grunn av sin fysiologiske betydning har ekso-/endocytose vært et av de mest studerte temaene innen cellebiologi. Mange verktøy er utviklet for å studere denne prosessen på gen- og proteinnivå, på grunn av hvilken mye er kjent om proteinmaskineriet som deltar i denne prosessen. Imidlertid er det utviklet svært få metoder for å måle membranlipidomsetning, som er det fysiske grunnlaget for ekso-/endocytose.
Dette papiret introduserer en klasse av nye fluorescerende lipidanaloger som viser pH-avhengig fluorescens og demonstrerer deres bruk for å spore lipidresirkulering mellom plasmamembranen og sekretoriske vesikler. Ved hjelp av enkle pH-manipulasjoner tillater disse analogene også kvantifisering av lipidfordeling over overflaten og de intracellulære membranrommene, samt måling av lipidomsetningshastighet under ekso-/endocytose. Disse nye lipidreporterne vil være av stor interesse for ulike biologiske forskningsfelt som cellebiologi og nevrovitenskap.
Introduction
Lipid-dobbeltlaget er en av de vanligste biomolekylsamlingene og er uunnværlig for alle celler. Utenfor celler danner det plasmamembranens grensesnittceller og deres miljø; Inne i celler deler den forskjellige organeller spesialisert for utpekte funksjoner. Snarere dynamisk enn fortsatt, opplever lipidmembraner stadig fusjon og fisjon, som formidler biomaterialtransport, organellreform, morfologiendring og cellulær kommunikasjon. Utvilsomt er lipidmembranen det fysiske grunnlaget for nesten alle cellulære prosesser, og dysfunksjonen spiller en avgjørende rolle i ulike lidelser som spenner fra kreft1 til Alzheimers sykdom2. Selv om lipidmolekyler er langt mindre mangfoldige enn proteiner, har membranforskningen hittil hovedsakelig vært proteinsentrisk. For eksempel er mye mer kjent om proteinmaskiner enn om lipider i eksocytose 3,4,5. Videre forblir organisering, distribusjon, dynamikk og homeostase av lipider på tvers av overflate- og intracellulære membraner i stor grad uutforsket i forhold til membranproteiner6.
Dette er ikke overraskende da moderne molekylærbiologiske teknikker, som mutagenese, gir en metodologisk fordel for å studere proteiner i stedet for lipider. For eksempel letter transgen merking av pH-følsomt grønt fluorescerende protein (aka pHluorin) til vesikulære proteiner den kvantitative målingen av mengden og hastigheten av vesikulær proteinomsetning under exo-/endocytose 7,8,9. Imidlertid er det nesten umulig å genetisk modifisere membranlipider in vivo. Videre er kvalitative og til og med kvantitative manipulasjoner av proteinmengder og distribusjoner mye mer gjennomførbare enn lipider10. Likevel har innfødte og syntetiske fluorescerende lipider blitt isolert og utviklet for å simulere endogene membranlipider in vitro og in vivo11. En gruppe av mye brukte fluorescerende lipider er styrylfargestoffer, for eksempel FM1-43, som utviser membranforsterket fluorescens og er et kraftig verktøy for å studere synaptisk vesikkel (SV) frigjøring i nevroner12. I det siste har miljøfølsomme lipidfargestoffer blitt oppfunnet og mye brukt som en ny klasse journalister for å studere forskjellige cellemembranegenskaper, inkludert membranpotensial11, faserekkefølge13 og sekresjon14.
En ny klasse lipidmimetika hvis fluorescens er både pH-følsom (f.eks. pHluorin) og membranfølsom (f.eks. FM1-43) ble utviklet for direkte å måle lipidfordelingen i plasmamembranen og endosomer / lysosomer og lipidtrafikken under ekso-/endocytose. De velkjente solvatokrome fluoroforene som viser push-pull-egenskaper på grunn av intramolekylær ladningsoverføring ble valgt for dette formålet. Blant eksisterende solvatokrome fluoroforer er 1,8-naftalimid (ND) stillaset relativt enkelt å modifisere, allsidig for merking, og er unikt i fotofysikk15 og har derfor blitt brukt i DNA-interkalatorer, organiske lysemitterende dioder og biomolekylsensorer 16,17,18.
Å feste en elektrondonerende gruppe til C4-posisjonen til ND-stillaset genererer en push-pull-struktur, noe som fører til et økt dipolmoment ved å omfordele elektrondensiteten i eksitert tilstand19,20. En slik intramolekylær ladningsoverføring gir store kvanteutbytter og Stokes-skift, noe som resulterer i lys og stabil fluorescens21. Denne gruppen har nylig utviklet en serie solvatokrome lipidanaloger basert på ND-stillaset og oppnådd dem med gode syntetiske utbytter20.
Spektroskopisk karakterisering viser at blant disse produktene har ND6 de beste fluorescensegenskapene (figur 1)20. For det første har den godt separerte eksitasjons- og utslippstopper (dvs. henholdsvis ~ 400 nm og ~ 520 nm i figur 2A, B) sammenlignet med populære fluoroforer som fluoresceinisotiocyanat, rhodamin eller GFP, noe som gjør den spektralt separerbar fra dem og dermed nyttig for flerfarget bildebehandling. For det andre viser ND6-fluorescens en mer enn åtte ganger økning i fluorescensen i nærvær av miceller (figur 2C), noe som tyder på en sterk membranavhengighet. Tidligere levende cellefluorescensavbildningsstudier med forskjellige typer celler viste utmerket membranfarging av ND620. For det tredje, når løsningens pH reduseres fra 7,5 (vanligvis funnet i ekstracellulære eller cytosoliske miljøer) til 5,5 (vanligvis funnet i endosomer og lysosomer), viser ND6 en omtrent to ganger økning i fluorescens (figur 2D), som viser dens pH-følsomhet. Videre indikerer molekylær dynamikksimulering at ND6 lett integreres i lipid-dobbeltlaget med ND-stillaset vendt ut av membranen og piperazinrester som viser sterke interaksjoner med fosfolipidhodegrupper (figur 3). Til sammen gjør disse egenskapene ND6 til en ideell fluorescerende lipidanalog for å visualisere og måle membranlipidomsetning under exo-/endocytose.
Denne artikkelen presenterer en metode for å studere omsetningshastigheten og dynamikken til SV-lipider ved hjelp av dyrkede hippocampus-nevroner fra mus. Ved å stimulere nevroner med høye K+ Tyrodes løsninger ble SV og plasmamembranen lastet med ND6 (figur 4A,B). Deretter ble nevroner restimulert med forskjellige stimuli etterfulgt av NH4Cl-holdige og pH 5,5 Tyrodes løsninger (figur 4D). Denne protokollen forenkler den kvantitative målingen av de samlede eksocytose- og endocytoseratene under forskjellige omstendigheter (figur 4C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokoll inkluderer (1) en forenklet prosedyre for å etablere musehippocampus- og kortikale kulturer basert på en veletablert protokoll22, (2) en kort introduksjon til et epifluorescensmikroskopoppsett for levende nevroner, (3) en detaljert beskrivelse av lasting og avbildning av ND6 i musenevroner, (4) en diskusjon om kvantifisering av membrantrafikk ved ND6-signal. Alle prosedyrer følger retningslinjene for biosikkerhet og IACUC ved Florida Atlantic University. Syntesen av ND6 er beskrevet tidligere20.
1. Forberedelse av mus hippocampus og kortikale kulturer
MERK: Hvis ikke annet er spesifisert, må alle trinn utføres i en avtrekk for laminær strømning på biosikkerhetsnivå 2. Steriliser alle verktøy og materialer.
- Bruk tang i størrelse 5 til å plassere glassdeksler i multibrønnskulturplater.
MERK: For eksempel er en 24-brønns plate ideell for 12 mm
coverslips. - Legg til passende volum ekstracellulære matriser for å belegge cellekulturoverflaten (f.eks. 75 μL kjellermembranmatriksløsning per 12 mm deksel, se materialfortegnelsen)
- Plasser de tilberedte platene i vevskulturinkubatoren (5% CO2, 100% fuktighet og 37 ° C) i 1-4 timer for å tillate kjellermembranmatriksbinding.
- Ofre dyrene, åpne skallen og overfør hele hjernen til en 35 mm petriskål med 3 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) som inneholder 20% føtalt bovint serum (H + 20). Klipp hjernen langs midtlinjen, og skille cortices og hippocampi i en laminær strømningsdisseksjonshette for å redusere forurensning.
- Bruk mikrosaks til å kutte vevet i små biter (~ 1 mm3). Overfør disse vevene til et 15 ml konisk rør som inneholder 5 ml H + 20.
- Vask vevet tre ganger med 5 ml H+20 og tre ganger med 5 ml HBSS.
- Tilsett 1,5 ml 1% trypsin med etylendiamintetraeddiksyre og inkuber ved 37 °C i 10 minutter for enzymfordøyelse.
- Gjenta trinn 1.6 og bruk vakuum for å aspirere HBSS til slutt.
- Dissosiere vevet mekanisk i 1 ml HBSS inneholdende 2,95 g / l MgSO4 • 7H2O ved hjelp av en brannpolert glasspipette.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 400 × g, 4 °C i 5 minutter.
- Aspirer supernatanten og resuspender cellene i et passende volum kulturmedier for å oppnå en konsentrasjon på ~ 10.000.000 celler / ml.
- Plate cellene ved ~ 1,000,000 celler / cm2 og plasser kulturen i inkubatoren (5% CO2, 100% fuktighet og 37 ° C) i 1-4 timer for å lette cellefesting til glassdekslene.
- Tilsett et passende volum kulturmedium (f.eks. 1 ml per brønn for en 24-brønnsplate). Tilsett samme volum kulturmedium etter 1 uke. Etter 2 uker, erstatt halvparten av det eksisterende kulturmediet med friske medier hver uke.
coverslips.2. Mikroskopoppsett for levende cellefluorescensavbildning
MERK: Et eksemplarisk bildeoppsett (figur 5) inkluderer minst et invertert fluorescensmikroskop (se materiallisten), fluorescenslyskilde med automatisk lukker, fluorescensfiltersett (f.eks. for avbildning ND6, bruk 405/10 BP for eksitasjon, 495 LP for dikroisk og 510/20 BP for utslipp), og et høysensitivt kamera (materialfortegnelse), som alle styres av programvare for bildeinnsamling (materialfortegnelse).
- Forbered et bildekammer som tillater temperaturkontroll og løsningsinngang / utgang for levende cellefluorescensavbildning.
MERK: For eksempel ble et modifisert bildekammer med åpent bad festet på en varmeplattform brukt i denne protokollen (figur 6). - Sett opp en programmerbar enhet for å bytte perfusjonsløsninger og levere elektrisk stimulans på bestemte tidspunkter under avbildning.
MERK: Maskinvare- og programvaresynkronisering er nødvendig for kvantitative analyser (figur 7). For eksempel, i denne protokollen, ble en utløserutgang fra bildekameraet brukt til å starte et dataprogram som styrer en automatisk bryterenhet, som styrer et flerkanals perfusjonssystem og en firkantpulsstimulator. - For å avbilde to eller flere fluorescerende reportere, utfør flerkanals fluorescensavbildning enten ved å bytte filtersett sekvensielt eller ved samtidig å dele forskjellige fluorescensutslipp og projisere til samme kamera.
3. Lasting og avbildning av ND6 i nevrale kulturer
- Vei ut en passende mengde ND6, oppløs den i dimetylsulfoksid (DMSO), og la den oppløses ved romtemperatur; Sonikere kort (f.eks. 3 min). Filtrer råoljeløsningen med et 0,22 μm filter for å fjerne store fargestoffaggregater. Etter filtrering, bestem fargestoffkonsentrasjonen ved absorpsjonsspektroskopi ved 405 nm ved bruk av et konvensjonelt eller mikrovolumspektrofotometer ved bruk av ε = 10.700 M-1 cm-1.
- Før påføring, fortynn stamløsningen til en konsentrasjon på 1 μM ved bruk av badoppløsningen. Oppbevar stamløsningen ved romtemperatur i mørket.
- Merking av endosomer og synaptiske vesikler
- For allestedsnærværende merking av endocytoserte membranrom som endosomer, tilsett ND6 stamløsning (f.eks. 1 mM i DMSO) til kulturmediet ved den endelige konsentrasjonen på 1 μM, og inkuber ved 5% CO2, 100% fuktighet og 37 ° C i 30 minutter. For å redusere omfanget av SV-merking, undertrykk den spontane nevronaktiviteten farmakologisk. Bruk for eksempel tetrodotoksin til å blokkere aksjonspotensialer eller 2,3-diokso-6-nitro-1,2,3,4-tetrahydrobenzo[f]kinokalin-7-sulfonamid (NBQX) og D-(-)-2-amino-5-fosfonuopentansyre (D-AP5) for å hemme eksitatorisk overføring23.
- For å selektivt merke SV, bruk kort, men sterk stimulering for å fremkalle presynaptisk exo-/endocytose. Dyrkningsseddelen(e) skal først overføres til en 35 mm petriskål som inneholder 2 ml normal Tyrodes oppløsning ved romtemperatur. For det andre, fortynn ND6-stamløsningen i høy-K+ Tyrodes løsning (90 mM KCl) ved den endelige konsentrasjonen på 1 μM. For det tredje, bytt ut den vanlige Tyrodes oppløsning i petriskålen med ND6-inneholdende høy-K+ Tyrodes oppløsning og inkuber ved romtemperatur i 2 minutter.
- Overfør den ND6-merkede cellekulturen til bildekammeret fylt med forvarmet normal Tyrodes oppløsning inneholdende 10 μM NBQX og 10 μM D-AP5.
- Juster perfusjonshastigheten til ~0,2 ml/s (dvs. 1 dråpe per sekund) og start perfusjonen av forvarmet normal Tyrodes oppløsning inneholdende NBQX og D-AP5 for å fjerne overflødig ND6 i kulturen.
- Juster fokus og finn riktig synsfelt som inneholder sunne og godt spredte nevroner som bærer tilkoblede nevritter. Unngå områder som inneholder uløste fargestoffkolloider.
- Prøv å avbilde ND6-belastede celler med forskjellige eksponeringstider for å identifisere de beste bildeinnstillingene.
MERK: For den beste eksponeringstiden er den høyeste pikselfluorescensintensiteten i det resulterende bildet omtrent halvparten av bitområdet (f.eks. For et 16-biters bilde er bitområdet fra 0 til 65 535), noe som vil tillate en ytterligere økning i fluorescens når den sure badeoppløsningen påføres. Den valgte eksponeringstiden skal brukes for all ND6-avbildning. - Definer stimulerings- og perfusjonsprotokollen, rammeintervallet og total varighet. For eksempel, i følgende protokoll, bruk en 30 s baseline, en 10 s 30 Hz elektrisk feltstimulering, 50 s utvinning, 120 s 90 mM K+, 60 s utvinning, 60 s Tyrodes løsning med 50 mM NH4Cl, 60 s Tyrodes løsning ved pH 5,5, og et rammeintervall på 3 s.
- Start bildeoppkjøpet ledsaget av synkronisert stimulering og perfusjon. Overvåk simuleringen og løsningsutvekslingen under avbildning.
- Stopp perfusjonen etter at avbildningen er avsluttet, fjern dekselet og rengjør bildekammeret for neste prøveversjon.
4. Kvantifisering av membrantrafikk ved endring i ND6-fluorescens
- Sikkerhetskopier og/eller lag en elektronisk kopi av alle bildefiler.
- Velg et analyseprogram for datautvinning, for eksempel en åpen kildekode-bildeanalyseprogramvare som ImageJ24 og/eller FIJI25.
- Åpne eller importer en bildestakk til analyseprogrammet.
- Sett det første bildet som referanse og juster resten til det ved hjelp av funksjoner / plugins som Rigid Registration26, som vil redusere artefakter på grunn av xy-drifting. Se figur 8 for eksempel bilder.
- Gjennomsnitt alle bilder som er tatt i løpet av 30-s pre-baseline for å produsere et referansebilde. Lagre en kopi av dette bildet for fremtidig referanse.
- Angi intensitetsterskelen for å generere et binært bilde fra bildet med grunnlinjegjennomsnitt.
- Bruk Watershed i ImageJ eller lignende funksjoner i et annet program for å skille koble nevritter eller celler.
- Bruk funksjonen Analyser partikkel med passende arealstørrelse og sirkularitet for å be om interesseområder (ROI) som tilsvarer cellemembraner, endosomer, lysosomer eller synaptiske boutoner. Lagre alle valgte avkastninger.
- Velg fire bakgrunnsavkastninger i cellefrie områder innenfor synsfeltet.
- Mål gjennomsnittlig bildepunktintensitet for hver avkastning i hver ramme i bildestakken, og eksporter resultatene for statistisk analyse.
- Beregn den gjennomsnittlige intensiteten til bakgrunnsavkastningen som grunnlinjestøy, som trekkes fra den gjennomsnittlige pikselintensiteten for hver avkastning.
- Gjennomsnitt de tre høyeste gjennomsnittlige intensitetene for hver valgt avkastning under påføring av pH 5,5 Tyrodes løsning for å oppnå maksimal fluorescensintensitet, som er definert som 100% for normalisering.
- Gjennomsnittlig de tre laveste gjennomsnittlige intensitetene for hver valgt avkastning under påføring av 50 mM NH4Cl for å stille inn minimal fluorescensintensitet, som er definert som 0% for normalisering.
- Beregn de relative fluorescensendringene for hver avkastning basert på egne 0% og 100% intensiteter. Utlede gjennomsnittlige fluorescensendringer, endringskinetikk og andre verdier/plott fra individuelle avkastningsdata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SV er spesialisert for frigjøring av nevrotransmittere via fremkalt exo-/endocytose27. SV har svært surt lumen (dvs. pH 5,5), som er ideelt for ND6. Vi brukte høy K+ -stimulering for å fremkalle SV-ekso-/endocytose for å gi ND6 tilgang til SV. Forventet dukket lysegrønn fluorescerende puncta langs nevronprosesser opp etter belastning (figur 9A). Linjeprofilen vist i figur 4B viste sterk overlapp mellom ND6 (grønn kurve) og FM4-64 puncta (rød kurve). Den sterke korrelasjonen mellom ND6 og FM4-64 fluorescensintensiteter antyder også en SV-farging av ND6 (figur 9B).
En elektrisk stimulering og en høy K + -stimulering ble brukt til å fremkalle frigjøring av henholdsvis det lett frigjørbare bassenget (RRP, dvs. SVs med høy frigjøringssannsynlighet) og reservebassenget SVs (dvs. SVs med lav frigjøringssannsynlighet). Det var reduksjoner i ND6-fluorescens som respons på begge stimuli (figur 4C og figur 4E), noe som antyder at ND6 ligger i SV-membranen og at SV-lumen nøytraliseres (rapportert av ND6-signalreduksjon) under SV-frigjøringen.
På slutten av hvert forsøk ble 50 mM NH4Cl påført for å deacidifisere SVs28 og pH 5.5-løsning for å lysne overflatemembranen ND6 (figur 4D og figur 4F). Forskjellene i fluorescens tillater oss å bestemme ND6 i overflatemembranen (~ 44%) og SV-membranen (~ 56%). Disse tallene samsvarer med fraksjonene av overflate- og SV-membraner ved aksonterminalene29, noe som tyder på at ND6 fordeler seg jevnt over membraner. Videre tillater ND6-signaler under to forskjellige stimuli og to pH-manipulasjoner oss å estimere at det korte elektriske utbruddet mobiliserte omtrent ~ 31% SV og høy K + -stimulering frigjorde ~ 70% av de gjenværende SV-ene. Frekvensen av ND-fluorescens reduseres under stimuleringene samsvarer også med tidskonstanten for den fremkalte SV-eksocytosen tidligere rapportert30.
ND6s kompakte størrelse fører til mye mindre sterisk forstyrrelse av cellemembraner enn tidligere merkemetode14 og gir dermed mer nøyaktig måling av SV-trafikk. Til støtte for denne ideen viste en ti ganger høyere belastningskonsentrasjon ingen signifikant forskjell i FM4-64-avfarging under stimulering (figur 10). Imidlertid anbefales fortsatt 1μM på grunn av moderat farging i astrocytter.
Siden SV exo-/endocytose involverer kolesterol (et rikt og vitalt lipid i nervemembranene), har vi brukt ND6-avbildning for å spørre hvordan membrankolesterol påvirker SV-frigjøring og gjenfinning. En 1-mM for 90-minutters behandling av metyl-β-cyklodekstrin (MβCD) kan fjerne ~ 10% kolesterol fra nevronoverflatemembran31, etterligne aldringsassosiert membrankolesterolreduksjon. Under en uttømmende elektrisk stimulering reduserte MβCD-behandlingen signifikant SV-frigjøring og gjenfinning målt ved ND6-avbildning (figur 11A), noe som tyder på at membrankolesterol letter SV exo-/endocytose32. Vi evaluerte også kolesterolets bidrag til SV-bassengpåfylling, noe som er avgjørende for troskapen til nevrotransmisjon33. To elektriske stimuleringer med et 10-s-intervall ble påført i nærvær av Bafilomycin A1 (BafA1). BafA1 hemmer selektivt v-ATPase som reacidifiserer SV. Ved akutt å blokkere reacidifiseringen av uthentede SV, forhindrer BafA1 ND6-fluorescensgjenoppretting etter stimulering (figur 11B). ND6-reduksjonen under den andre stimulansen bør bare komme fra begynnende SV-er som fyller tomme RRP. Sammenlignet med simuleringskontrollen ble det observert en signifikant mindre ND6-respons på den andre stimulansen i nevronene som ble forbehandlet med MβCD (dvs. mindre amplitude og raskere forfall av ND6-fluorescensreduksjon). Dette resultatet støtter forestillingen om at kolesterol spiller en sentral rolle i rekruttering av nye SV til RRP.
Figur 1: Generelt synteseskjema for ND6-sonde. Dette tallet er modifisert fra Thomas et al.20. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Egenskaper til ND6. (A og B) Solvatokromiske egenskaper til ND6. Absorbansspektra (A) og fluorescensspektra (B) i forskjellige løsningsmidler eksitert ved 405 nm. (C) Sammenligning av fluorescensintensitet av ND6 i vann (rødt) og 1 % oktylglukosidoppløsning ved 1 μM. (D) ND6-fluorescens som funksjon av pH i 1 % OG-oppløsning er proporsjonal med protonasjonstilstanden til piperazinhodegruppen (beregnet pKa = 7,4). Innfelt viser beregnet protonasjonstilstand for ND6 piperazindel (predikert pKa = 8,83). Den stiplede linjen representerer tilpassede verdier. Dette tallet er modifisert fra Thomas et al.20. Forkortelser: DCM = diklormetan; MeCN = acetonitril; DMSO = dimetylsulfoksid; EtOH = etylalkohol; MeOH = metylalkohol; Abs = absorbans; Em = utslipp; OG = oktyl glukosid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Øyeblikksbilde fra molekylær dynamikksimuleringsbane. Interaksjon av ND6-sonde i POPC-membran (venstre panel). Piperazinhodegruppen samhandler sterkt med fosfatgrupper (høyre panel) gjennom elektrostatiske interaksjoner. Den svarte pilen (høyre panel) peker på C-N-bindingen mellom naftalimidringen og piperazin. Resultatene viser at piperazingruppen bare beveger seg svakt med en preferanse for dihedralvinkelen (atomer vist) mellom 90 og 120 grader samtidig som stolkonformasjonen opprettholdes. Dette tallet er modifisert fra Thomas et al.20. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: ND6 merker synaptiske vesikler og rapporterer frigjøring og uthenting i nerveterminalene. (A) Eksempelbilder av FM4-64 (rød), ND6 (grønn) og overlegg (gul). Nevrittene og soma hos ett nevron var linjeprofilert. De rettede linjebildene (20 pikslers bredde) er ved siden av de tilsvarende bildene. Pilspisser peker på synaptiske boutoner merket med FM4-64. Skalastenger = 100 μm. (B) Linjeprofiler for FM4-64 og ND6 fluorescensintensiteter viser signifikant likhet. (C) Prøvespor av ND6-fluorescensendringer ved synaptiske boutoner indikert med pilspisser i A som respons på stimuli. (D) Prøvespor av ND6-fluorescensendringer som respons på NH4Cl og pH 5,5 Tyrodes løsninger. (E) Avfargingen av FM4-64 er midlertidig koblet til ND6-intensitetsendringer. Data er plottet som gjennomsnittlig ± S.E.M. (F) ND6 fluorescensintensitet, men ikke FM4-64 intensitet ble redusert og økt ved anvendelser av henholdsvis 50 mM NH4Cl og pH 5.5 Tyrodes løsninger. Data plottes som gjennomsnitt ± S.E.M. Dette tallet er modifisert fra Thomas et al.20. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Bildeoppsett basert på et Nikon-TiE invertert mikroskop. Annotert er fire komponenter som kreves for levende cellefluorescensavbildning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Oppsett for stimulering-avbildning. Oppsett modifisert fra et Warner Instruments RC-26 kammer og PH-1 varmeplattform for temperaturkontroll og løsningsutveksling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Diagram over enhetskonfigurasjoner for avbildning med synkroniserte stimuleringer og løsningsbytter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Eksempelbilder som viser de viktigste trinnene i bildeanalyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: ND6 fremhever synaptiske vesikler gruppert ved presynaptiske terminaler. (A) Eksempelbilder FM4-64 (rød) og ND6 (grønn) samtidig lasting ved høy forstørrelse. Skala bar = 30 μm. (B) Spredningsplott av FM4-64 og ND6 betyr fluorescensintensiteter ved samme avkastning som tilsvarer synaptiske boutoner og lineær regresjonspassform. r = 0,8353; p = 1,7 × 10-8; synsfelt N = 9; ROI n = 450. Terskelen for FM4-64 er 1,200 au (vilkårlig enhet) og 160 au for ND6. Dette tallet er modifisert fra Thomas et al.20. Forkortelse: ROI = regioner av interesse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: ND6 griper ikke inn i SV . (A) ND6-representert SV-omsetning (ved elektrisk stimulus) etter 1 eller 10 μM ND6-belastning. (B) FM4-64-målt SV-omsetning (med elektrisk stimulans). Dette tallet er modifisert fra Thomas et al.20. Forkortelse: SV = synaptiske vesikler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 11: Kolesterolreduksjon svekker SV-omsetningen. (A) ND6-representert SV-omsetning under 10 Hz, 120 s elektrisk stimulus i kontroll og MβCD-behandlede nevroner. (B) Bafilomycin A1 forhindrer reacidifisering av resirkulerte SV-er (dvs. ingen ND6-fluorescensgjenvinning etter stimuleringsfremkalt reduksjon) og belyser MβCDs innvirkning på SV-etterfylling. Dette tallet er modifisert fra Thomas et al.20. Forkortelse: SV = synaptisk vesikkel; MβCD = metyl-β-cyklodekstrin; BafA1 = Bafilomycin A1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lipidbaserte fargestoffer, som 1,1'-dioktadecyl-3,3,3',3'-tetrametylindokarbocyanin (DiI) og 3,3'-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), har lenge vært brukt til å illustrere cellemorfologi og spore cellulære prosesser som aksonprojeksjoner av nevroner. Styrylfargestoffer, som FM1-43, har blitt oppfunnet og brukt med hell for studier av eksocytose34. På grunn av deres lave membranaffinitet merker de selektivt endocytoserte vesikler hvor de er fanget mens fargestoffer som er igjen på plasmamembranen, vaskes av ved konstant perfusjon. Som sådan er styrylfargestoffer ikke egnet for kontinuerlig overvåking av vesikkelgjenvinning.
Den nylige oppfinnelsen av pH-sensitiv GFP (dvs. pHluorin) gjorde det mulig å gjentatte ganger visualisere vesikkelresirkulering når det ble merket til et vesikulært membranprotein som VAMPII eller Synaptophysin35. Etter samme prinsipp muliggjør merking av en pH-sensitiv fluorofor til lipidmolekyler sporing av resirkulering av lipidmembran under sykluser av exo-/endocytose14. I dette tilfellet, som en enkelt enhet av lipid, er ND6 lettere å forberede, enklere å påføre, mer effektiv å merke lipidmembraner, mindre forstyrrende for celler, mer stabil i å holde seg i cellemembraner, og dermed mer pålitelig for fluorescensavbildning. Dens membranavhengighet og inverse pH-følsomhet tillater lysere farging av sure organeller som SV og endosomer.
Videre er det også mulig å merke slike sure organeller eller presynaptiske terminaler i vev som hippocampusskiver som uspesifikt distribuert ND6 slokkes av nøytral pH i ekstracellulære eller cytosoliske rom. I tillegg gjør det store Stokes-skiftet ND6 ideell for multifotonavbildning av dype vev. Derfor tillater ND6 og andre pH-sensitive lipidbaserte fluoroforer sanntids optisk måling av lipid- og cellemembrantrafikk mellom plasmamembranen og intracellulært apparat som SV og endosomer for flere runder med ekso-/endocytose. Gitt at synapser og SV er avgjørende for nevrotransmisjon, er ND6 utvilsomt nyttig for å studere synaptisk fysiologi.
Gitt den modulære utformingen av disse lipidanalogene, er det mulig å konjugere ND til andre lipider, slik som fosfolipider og sfingolipider, i forskjellige typer cellemembraner eller organeller. Videre kan ND-gruppene erstattes med andre miljøfølsomme fluoroforer for å oppdage andre miljøfaktorer som kalsium- eller sinkkonsentrasjon i eller utenfor celler eller organeller. Videre kan fluoroforer med forskjellige utslippsspektra kobles til membranlipider for å utvide paletten til lipidreportere. For alle disse modifikasjonene kan koblingen mellom lipider og ND eller andre fluorescerende grupper justeres for å oppnå bedre fotoegenskaper og / eller ønsket følsomhet.
Denne protokollen beskriver bruken av ND6 i visualisering av SV-omsetning ved bruk av levende celleavbildning. Kritiske trinn inkluderer lasting, synkroniserte stimuleringer og fluorescenskvantifisering, som alle påvirker kvaliteten på resultatene betydelig. Videre kan parametrene / innstillingene som brukes i disse trinnene, endres i henhold til studiens behov. For eksempel kan stimuleringen under belastningen justeres (kortere eller lengre varighet) for å gi tilgang til forskjellige bassenger av SV-er (bassenger med henholdsvis høy eller lav releasable sannsynlighet). For levende cellefluorescensavbildning er det viktig å finne en balanse mellom cellehelse og fluorescensintensitet, noe som er spesielt viktig her. Dette skyldes at eksitasjonen for ND6 er nær UV (dvs. 405 nm), noe som kan forårsake mer fototoksisitet og fargestoffbrudd enn synlig lys. Derfor er det viktig å justere eksitasjonseffekten, eksponeringstiden, bildefrekvensen og bildevarigheten for å minimere fotoskader og maksimere signalkvaliteten.
ND6 er en veldig interessant sonde. Det store Stokes-skiftet gjorde det mulig å bruke det samtidig med andre membranfarger som FM4-6420. Enda viktigere, det er en egnet donorkandidat for fluorescensresonans energioverføring (FRET) og kan bli begeistret av lilla lys, noe som vil være mye mindre sannsynlig å co-excitere FRET-mottakeren. Lipidlignende fargestoffer, som ND6, gjør det mulig å studere interaksjonene mellom membranproteiner og lipider under exo-/endocytose. Den pH-avhengige assosiasjonen og dissosiasjonen mellom membranproteiner og lipider vil bli forstørret i det sure lumen av SV eller endosomer, noe som letter utforskningen av membranlipidens rolle i reseptormediert endocytose og sortering. Oppsummert kan ND6 og dets derivater betydelig utvide verktøykassen for å studere membranlipider og deres handel med levende celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Florida Atlantic University Office of Undergraduate Research and Inquiry grant (MJS), Florida Department of Health Ed og Ethel Moore Pilot Grant 20A17 (Q.Z.), Alzheimers Association grant AARG-NTF-19-618710 (Q.Z.), og NIA R21 grant AG061656-01A1 (Q.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digidata 1440A Data Acquistion System | Molecular Devices | Digidata 1440A | For synchronized stimulation and solution exchange |
| Dual Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | For live-cell imaging |
| Fetal Bovine Serum | OMEGA Scientific | FB-01 | For making H+20 solution used in dissection and tissue culture |
| Hamamatsu Flash4.0 sCOMS camera | Hamamatsu Inc. | C13440-20CU | high-sensitivity camera |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | For making H+20 solution used in dissection and tissue culture |
| Heated Platform | Warner Instruments | PH-1 | For live-cell imaging |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | For tissue culture |
| Micro-G Vibration Isolation Table | TMC | 63-564 | For live-cell imaging |
| Micro-manager | https://micro-manager.org/ | NA | For image acquisition control |
| Multi-Line In-Line Solution Heater | Warner Instruments | SHM-6 | For live-cell imaging |
| Neurobasal Plus Medium | THermoFisher Scientific | A3582901 | For tissue culture |
| Nikon Ti-E Inverted Microscope | Nikon | Ti-E/B | For live-cell imaging |
| ORCA-Flash4.0 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C1340-20CU | For live-cell imaging |
| Perfusion Chamber | Warner Instruments | RC-26G | For live-cell imaging |
| Six-Channel Valve Control Perfusion System | Warner Instruments | VC-6 | For solution exchange |
| Square Pulse Stimulator | Grass Instrument | SD9 | For electric field stimulation |
References
- Polo, S., Pece, S., Di Fiore, P. P.
- Eckert, G. P., Wood, W. G., Muller, W. E. Lipid membranes and beta-amyloid: a harmful connection. Current Protein and Pept Science. 11 (5), 319-325 (2010).
- Augustine, G. J., Burns, M. E., DeBello, W. M., Pettit, D. L., Schweizer, F. E.
- Ammar, M. R., Kassas, N., Chasserot-Golaz, S., Bader, M. F., Vitale, N. Lipids in regulated exocytosis: what are they doing. Frontiers in Endocrinology. 4, 125 (2013).
- Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C.
- Chabanon, M., Stachowiak, J. C., Rangamani, P. Systems biology of cellular membranes: a convergence with biophysics. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 9 (5), 1386 (2017).
- Prosser, D. C., Wrasman, K., Woodard, T. K., O'Donnell, A. F., Wendland, B. Applications of pHluorin for quantitative, kinetic and high-throughput analysis of endocytosis in budding yeast. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54587 (2016).
- Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nature Protocols. 1 (6), 2970-2978 (2006).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
- Demchenko, A. P., Mély, Y., Duportail, G., Klymchenko, A. S. Monitoring biophysical properties of lipid membranes by environment-sensitive fluorescent probes. Biophysical Journal. 96 (9), 3461-3470 (2009).
- Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 77-83 (2012).
- Gaus, K., Zech, T., Harder, T. Visualizing membrane microdomains by Laurdan 2-photon microscopy. Molecular Membrane Biology. 23 (1), 41-48 (2006).
- Kahms, M., Klingauf, J. Novel pH-sensitive lipid based exo-endocytosis tracers reveal fast intermixing of synaptic vesicle pools. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 18 (2018).
- Zhou, L., Xie, L., Liu, C., Xiao, Y. New trends of molecular probes based on the fluorophore 4-amino-1,8-naphthalimide. Chinese Chemical Letters. 30 (10), 1799-1808 (2019).
- Tomczyk, M. D., Walczak, K. Z. l,8-Naphthalimide based DNA intercalators and anticancer agents. A systematic review from 2007 to 2017. European Journal of Medicinal Chemistry. 159, 393-422 (2018).
- Ulla, H., et al. Blue emitting 1,8-naphthalimides with electron transport properties for organic light emitting diode applications. Journal of Molecular Structure. 1143 (5), 344-354 (2017).
- Duke, R. M., Veale, E. B., Pfeffer, F. M., Kruger, P. E., Gunnlaugsson, T. Colorimetric and fluorescent anion sensors: An overview of recent developments in the use of 1,8-naphthalimide-based chemosensors. Chemical Society Reviews. 39 (10), 3936-3953 (2010).
- Panja, S. K., Dwivedi, N., Saha, S. Tuning the intramolecular charge transfer (ICT) process in push-pull systems: Effect of nitro groups. RSC Advances. 6 (107), 105786-105794 (2016).
- Thomas, D., et al. Solvatochromic and pH-sensitive fluorescent membrane probes for imaging of live cells. ACS Chemical Neuroscience. 12 (4), 719-734 (2021).
- Leslie, K. G., Jacquemin, D., New, E. J., Jolliffe, K. A. Expanding the breadth of 4-amino-1,8-naphthalimide photophysical properties through substitution of the naphthalimide core. Chemistry - A European Journal. 24 (21), 5569-5573 (2018).
- Liu, G. S., Tsien, R. W. Properties of synaptic transmission at single hippocampal synaptic boutons. Nature. 375 (6530), 404-408 (1995).
- Zhang, Q., Cao, Y. -Q., Tsien, R. W. Quantum dots provide an optical signal specific to full collapse fusion of synaptic vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 104 (45), 17843-17848 (2007).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Sudhof, T. C.
- Lazarenko, R. M., DelBove, C. E., Strothman, C. E., Zhang, Q. Ammonium chloride alters neuronal excitability and synaptic vesicle release. Scientific Reports. 7 (1), 5061 (2017).
- Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344 (6187), 1023-1028 (2014).
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J.
- DelBove, C. E., et al. Reciprocal modulation between amyloid precursor protein and synaptic membrane cholesterol revealed by live cell imaging. Neurobiology of Disease. 127, 449-461 (2019).
- Dason, J. S., Smith, A. J., Marin, L., Charlton, M. P. Vesicular sterols are essential for synaptic vesicle cycling. Journal of Neuroscience. 30 (47), 15856-15865 (2010).
- Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms. Journal of Neuroscience. 39 (42), 8209-8216 (2019).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200 (1992).
- Afuwape, O. A., Kavalali, E. T. Imaging synaptic vesicle exocytosis-endocytosis with pH-sensitive fluorescent proteins. Methods in Molecular Biology. 1474, 187-200 (2016).
