Summary
Questo protocollo presenta un metodo di imaging a fluorescenza che utilizza una classe di fluorofori lipidici sensibili al pH per monitorare il traffico della membrana lipidica durante l'esocitosi cellulare e il ciclo di endocitosi.
Abstract
L'eso-/endocitosi è un processo comune che media lo scambio di biomolecole tra le cellule e il loro ambiente e tra cellule diverse. Le cellule specializzate utilizzano questo processo per eseguire funzioni vitali del corpo come la secrezione di insulina dalle cellule β e il rilascio di neurotrasmettitori dalle sinapsi chimiche. A causa del suo significato fisiologico, l'eso-/endocitosi è stato uno degli argomenti più studiati in biologia cellulare. Sono stati sviluppati molti strumenti per studiare questo processo a livello genico e proteico, grazie ai quali si sa molto sul macchinario proteico che partecipa a questo processo. Tuttavia, sono stati sviluppati pochissimi metodi per misurare il turnover lipidico di membrana, che è la base fisica dell'eso-/endocitosi.
Questo articolo introduce una classe di nuovi analoghi lipidici fluorescenti che presentano fluorescenza pH-dipendente e dimostra il loro uso per tracciare il riciclaggio dei lipidi tra la membrana plasmatica e le vescicole secretorie. Aiutati da semplici manipolazioni del pH, questi analoghi consentono anche la quantificazione della distribuzione dei lipidi attraverso la superficie e i compartimenti intracellulari della membrana, nonché la misurazione del tasso di turnover lipidico durante l'eso-/endocitosi. Questi nuovi reporter lipidici saranno di grande interesse per vari campi di ricerca biologica come la biologia cellulare e le neuroscienze.
Introduction
Il doppio strato lipidico è uno degli assemblaggi di biomolecole più comuni ed è indispensabile per tutte le cellule. All'esterno delle cellule, forma la membrana plasmatica che interfaccia le cellule e il loro ambiente; All'interno delle cellule, compartimenta vari organelli specializzati per le funzionalità designate. Piuttosto dinamiche che ferme, le membrane lipidiche sperimentano costantemente la fusione e la fissione, che media il trasporto di biomateriali, la riforma degli organelli, il cambiamento morfologico e la comunicazione cellulare. Indubbiamente, la membrana lipidica è la base fisica di quasi tutti i processi cellulari e la sua disfunzione svolge un ruolo cruciale in vari disturbi che vanno dal cancro1 al morbo di Alzheimer2. Sebbene le molecole lipidiche siano molto meno diversificate delle proteine, la ricerca sulle membrane finora è stata principalmente incentrata sulle proteine. Ad esempio, si sa molto di più sul macchinario proteico che sui lipidi nell'esocitosi 3,4,5. Inoltre, l'organizzazione, la distribuzione, la dinamica e l'omeostasi dei lipidi attraverso le membrane superficiali e intracellulari rimangono in gran parte inesplorate rispetto alle proteine di membrana6.
Ciò non sorprende in quanto le moderne tecniche di biologia molecolare, come la mutagenesi, forniscono un vantaggio metodologico per lo studio delle proteine piuttosto che dei lipidi. Ad esempio, la marcatura transgenica della proteina fluorescente verde sensibile al pH (nota anche come pHluorin) alle proteine vescicolari facilita la misurazione quantitativa della quantità e del tasso di turnover delle proteine vescicolari durante l'eso-/endocitosi 7,8,9. Tuttavia, è quasi impossibile modificare geneticamente i lipidi di membrana in vivo. Inoltre, le manipolazioni qualitative e persino quantitative delle quantità e delle distribuzioni delle proteine sono molto più fattibili di quelle dei lipidi10. Ciononostante, lipidi fluorescenti nativi e sintetici sono stati isolati e sviluppati per simulare lipidi endogeni di membrana in vitro e in vivo11. Un gruppo di lipidi fluorescenti ampiamente utilizzati sono i coloranti stirilici, ad esempio FM1-43, che mostrano una fluorescenza potenziata dalla membrana e sono un potente strumento nello studio del rilascio di vescicole sinaptiche (SV) nei neuroni12. Ultimamente, i coloranti lipidici sensibili all'ambiente sono stati inventati e ampiamente utilizzati come una nuova classe di reporter per studiare varie proprietà della membrana cellulare, tra cui il potenziale di membrana11, l'ordine di fase13 e la secrezione14.
È stata sviluppata una nuova classe di mimetici lipidici la cui fluorescenza è sia sensibile al pH (ad esempio, pHluorin) che sensibile alla membrana (ad esempio, FM1-43) per misurare direttamente la distribuzione dei lipidi nella membrana plasmatica e negli endosomi/lisosomi e il traffico lipidico durante l'eso-/endocitosi. A questo scopo sono stati selezionati i ben noti fluorofori solvatocromici che presentano caratteristiche push-pull dovute al trasferimento di carica intramolecolare. Tra i fluorofori solvatocromici esistenti, lo scaffold di 1,8-naftalimmide (ND) è relativamente facile da modificare, versatile per la marcatura ed è unico in fotofisica15 ed è stato quindi utilizzato in intercalatori di DNA, diodi organici emettitori di luce e sensori di biomolecole 16,17,18.
Il collegamento di un gruppo donatore di elettroni alla posizione C4 dello scaffold ND genera una struttura push-pull, che porta ad un aumento del momento di dipolo ridistribuendo la densità elettronica nello stato eccitato19,20. Un tale trasferimento di carica intramolecolare produce grandi rese quantistiche e spostamenti di Stokes, con conseguente fluorescenzaluminosa e stabile 21. Questo gruppo ha recentemente sviluppato una serie di analoghi lipidici solvatocromici basati sullo scaffold ND e li ha ottenuti con buone rese sintetiche20.
La caratterizzazione spettroscopica mostra che, tra questi prodotti, ND6 possiede le migliori proprietà di fluorescenza (Figura 1)20. In primo luogo, ha picchi di eccitazione ed emissione ben separati (cioè, ~ 400 nm e ~ 520 nm, rispettivamente, nella Figura 2A, B) rispetto ai fluorofori popolari come l'isotiocianato di fluoresceina, la rodamina o la GFP, rendendolo spettralmente separabile da loro e quindi utile per l'imaging multicolore. In secondo luogo, la fluorescenza ND6 mostra un aumento di oltre otto volte della sua fluorescenza in presenza di micelle (Figura 2C), suggerendo una forte dipendenza dalla membrana. Precedenti studi di imaging a fluorescenza su cellule vive con diversi tipi di cellule hanno mostrato un'eccellente colorazione della membrana con ND620. In terzo luogo, quando il pH della soluzione è diminuito da 7,5 (che si trova comunemente in ambienti extracellulari o citosolici) a 5,5 (che si trova comunemente negli endosomi e nei lisosomi), ND6 mostra un aumento di circa due volte della fluorescenza (Figura 2D), mostrando la sua sensibilità al pH. Inoltre, la simulazione della dinamica molecolare indica che ND6 si integra prontamente nel doppio strato lipidico con la sua impalcatura ND rivolta verso l'esterno della membrana e il residuo di piperazina che mostra forti interazioni con i gruppi di testa dei fosfolipidi (Figura 3). Nel complesso, queste caratteristiche rendono ND6 un analogo lipidico fluorescente ideale per visualizzare e misurare il turnover lipidico di membrana durante l'eso-/endocitosi.
Questo articolo presenta un metodo per studiare il tasso di turnover e la dinamica dei lipidi SV utilizzando neuroni ippocampali di topo in coltura. Stimolando i neuroni con soluzioni di tirodo ad alto K+, le SV e la membrana plasmatica sono state caricate con ND6 (Figura 4A,B). Successivamente, i neuroni sono stati ristimolati con diversi stimoli seguiti da soluzioni contenenti NH4Cl e pH 5,5 di Tyrode (Figura 4D). Questo protocollo facilita la misurazione quantitativa dei tassi di esocitosi ed endocitosi assemblati in diverse circostanze (Figura 4C).
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Protocol
Il seguente protocollo include (1) una procedura semplificata per stabilire colture ippocampali e corticali di topo basate su un protocolloconsolidato 22, (2) una breve introduzione a una configurazione di microscopio a epifluorescenza per neuroni vivi, (3) una descrizione dettagliata del carico e dell'imaging di ND6 nei neuroni di topo, (4) una discussione sulla quantificazione del traffico di membrana da parte del segnale ND6. Tutte le procedure seguono le linee guida sulla biosicurezza e IACUC della Florida Atlantic University. La sintesi di ND6 è stata descritta in precedenza20.
1. Preparazione di colture ippocampali e corticali di topo
NOTA: Se non diversamente specificato, tutti i passaggi devono essere eseguiti in una cappa a flusso laminare di livello 2 di biosicurezza. Sterilizzare tutti gli strumenti e i materiali.
- Utilizzare una pinza di misura 5 per posizionare i vetrini coprioggetti in piastre di coltura a più pozzetti.
NOTA: Ad esempio, una piastra a 24 pozzetti è ideale per vetrini coprioggetti da 12 mm
. - Aggiungere il volume appropriato di matrici extracellulari per rivestire la superficie della coltura cellulare (ad esempio, 75 μL di soluzione di matrice di membrana basale per vetrino coprioggetto da 12 mm ; vedere la tabella dei materiali)
- Posizionare le piastre preparate nell'incubatore per colture tissutali (5% di CO2, 100% di umidità e 37 °C) per 1-4 ore per consentire la reticolazione della matrice della membrana basale.
- Sacrificare gli animali, aprire il cranio e trasferire l'intero cervello in una capsula di Petri da 35 mm con 3 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) contenente il 20% di siero fetale bovino (H+20). Taglia il cervello lungo la linea mediana e separa le cortecce e gli ippocampi in una cappa di dissezione a flusso laminare per ridurre la contaminazione.
- Utilizzare le microforbici per tagliare i fazzoletti in piccoli pezzi (~1 mm3). Trasferire questi tessuti in una provetta conica da 15 mL contenente 5 mL di H+20.
- Lavare i fazzoletti tre volte con 5 mL di H+20 e tre volte con 5 mL di HBSS.
- Aggiungere 1,5 mL di tripsina all'1% con acido etilendiammina tetraacetico e incubare a 37 °C per 10 minuti per la digestione enzimatica.
- Ripetere il passaggio 1.6 e utilizzare il vuoto per aspirare HBSS alla fine.
- Dissociare meccanicamente i tessuti in 1 mL di HBSS contenente 2,95 g/L MgSO4•7H2O utilizzando una pipetta di vetro lucidato a fuoco.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 400 × g, 4 °C per 5 min.
- Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in un volume appropriato di terreno di coltura per ottenere una concentrazione di ~10.000.000 di cellule/ml.
- Placcare le cellule a ~1.000.000 di cellule/cm2 e posizionare la coltura nell'incubatore (5% di CO2, 100% di umidità e 37 °C) per 1-4 ore per facilitare l'attacco delle cellule ai vetrini coprioggetti.
- Aggiungere un volume appropriato di terreno di coltura (ad es. 1 mL per pozzetto per una piastra da 24 pozzetti). Aggiungere lo stesso volume di terreno di coltura dopo 1 settimana. Dopo 2 settimane, sostituire metà del terreno di coltura esistente con terreno fresco ogni settimana.
.2. Configurazione del microscopio per l'imaging a fluorescenza di cellule vive
NOTA: Una configurazione di imaging esemplare (Figura 5) include almeno un microscopio a fluorescenza invertito (vedere la Tabella dei materiali), una sorgente di luce a fluorescenza con otturatore automatico, set di filtri a fluorescenza (ad esempio, per l'imaging ND6, utilizzare 405/10 BP per l'eccitazione, 495 LP per la dicroica e 510/20 BP per l'emissione) e una fotocamera ad alta sensibilità (Tabella dei materiali), tutti controllati da un software di acquisizione delle immagini (Tabella dei materiali).
- Preparare una camera di imaging che consenta il controllo della temperatura e l'ingresso/uscita della soluzione per l'imaging a fluorescenza di cellule vive.
NOTA: Ad esempio, in questo protocollo è stata utilizzata una camera di imaging a bagno aperto modificata fissata su una piattaforma di riscaldamento (Figura 6). - Impostare un dispositivo programmabile per commutare le soluzioni di perfusione e fornire lo stimolo elettrico in punti temporali definiti durante l'imaging.
NOTA: La sincronizzazione hardware e software è necessaria per le analisi quantitative (Figura 7). Ad esempio, in questo protocollo, un'uscita trigger dalla fotocamera per immagini è stata utilizzata per avviare un programma per computer che controlla un dispositivo di commutazione automatica, che controlla un sistema di perfusione multicanale e uno stimolatore a impulsi quadrati. - Per co-immagine di due o più reporter fluorescenti, eseguire l'imaging a fluorescenza multicanale commutando in sequenza i set di filtri o suddividendo simultaneamente diverse emissioni di fluorescenza e proiettando sulla stessa telecamera.
3. Caricamento e imaging di ND6 in colture neuronali
- Pesare una quantità adeguata di ND6, scioglierlo in dimetilsolfossido (DMSO) e lasciarlo solubilizzare a temperatura ambiente; sonicare brevemente (ad es. 3 min). Filtrare la soluzione madre grezza utilizzando un filtro da 0,22 μm per rimuovere gli aggregati coloranti di grandi dimensioni. Dopo la filtrazione, determinare la concentrazione del colorante mediante spettroscopia di assorbimento a 405 nm utilizzando uno spettrofotometro convenzionale o a microvolumi utilizzando ε = 10.700 M-1 cm-1.
- Prima dell'applicazione, diluire la soluzione madre a una concentrazione di 1 μM utilizzando la soluzione del bagno. Conservare la soluzione madre a temperatura ambiente al buio.
- Marcatura di endosomi e vescicole sinaptiche
- Per marcare ubiquitariamente i compartimenti della membrana endocitosa come gli endosomi, aggiungere la soluzione madre ND6 (ad esempio, 1 mM in DMSO) al terreno di coltura alla concentrazione finale di 1 μM e incubare al 5% di CO2, al 100% di umidità e a 37 °C per 30 minuti. Per ridurre l'estensione della marcatura SV, sopprimere farmacologicamente l'attività neuronale spontanea. Ad esempio, utilizzare la tetrodotossina per bloccare i potenziali d'azione o l'acido 2,3-diosso-6-nitro-1,2,3,4-tetraidrobenzo[f]chinossalina-7-sulfonamide (NBQX) e l'acido D-(-)-2-ammino-5-fosfopentanoico (D-AP5) per inibire la trasmissione eccitatoria23.
- Per etichettare selettivamente le SV, utilizzare una stimolazione breve ma forte per evocare l'eso-/endocitosi presinaptica. Innanzitutto, trasferire il/i vetrino/i coprioggetti per coltura in una capsula di Petri da 35 mm contenente 2 mL di soluzione di Tyrode normale a temperatura ambiente. In secondo luogo, diluire la soluzione madre ND6 nella soluzione di tinodo ad alto K+ (90 mM KCl) alla concentrazione finale di 1 μM. In terzo luogo, sostituire la normale soluzione di Tyrode nella capsula di Petri con la soluzione di Tyrode ad alto contenuto di ND6 K+ e incubare a temperatura ambiente per 2 min.
- Trasferire la coltura cellulare marcata con ND6 nella camera di imaging riempita con una soluzione di Tyrode normale preriscaldata contenente 10 μM NBQX e 10 μM D-AP5.
- Regolare la velocità di perfusione a ~0,2 mL/s (cioè 1 goccia al secondo) e avviare la perfusione della soluzione di Tyrode normale preriscaldata contenente NBQX e D-AP5 per rimuovere l'ND6 in eccesso nella coltura.
- Regola la messa a fuoco e individua il campo visivo appropriato contenente neuroni sani e ben distribuiti che portano neuriti collegati. Evitare le aree contenenti colloidi coloranti non risolti.
- Prova a eseguire l'imaging di cellule caricate con ND6 con tempi di esposizione diversi per identificare le migliori impostazioni di imaging.
NOTA: Per ottenere il miglior tempo di esposizione, l'intensità di fluorescenza dei pixel più elevata nell'immagine risultante è circa la metà dell'intervallo di bit (ad esempio, per un'immagine a 16 bit, l'intervallo di bit è compreso tra 0 e 65.535), il che consentirà un ulteriore aumento della fluorescenza quando viene applicata la soluzione del bagno acido. Il tempo di esposizione selezionato deve essere utilizzato per tutte le immagini ND6. - Impostare il protocollo di stimolazione e perfusione, l'intervallo di frame e la durata totale. Ad esempio, nel seguente protocollo, utilizzare una linea di base di 30 s, una stimolazione del campo elettrico di 10 s a 30 Hz, un recupero di 50 s, un recupero di 120 s 90 mM K+, un recupero di 60 s, una soluzione di Tyrode di 60 s con 50 mM di NH4Cl, una soluzione di Tyrode di 60 s a pH 5,5 e un intervallo di frame di 3 s.
- Avviare l'acquisizione dell'immagine accompagnata dalla stimolazione e dalla perfusione sincronizzate. Monitora la simulazione e lo scambio di soluzioni durante l'imaging.
- Interrompere la perfusione al termine dell'imaging, rimuovere il vetrino coprioggetti e pulire la camera di imaging per la prova successiva.
4. Quantificazione del traffico di membrana mediante una variazione della fluorescenza ND6
- Eseguire il backup e/o una copia elettronica di tutti i file immagine.
- Scegli un programma di analisi per l'estrazione dei dati, ad esempio un software di analisi delle immagini open source come ImageJ24 e/o FIJI25.
- Aprire o importare una pila di immagini nel programma di analisi.
- Imposta la prima immagine come riferimento e allinea il resto ad essa utilizzando funzioni/plugin come Rigid Registration26, che mitigherà gli artefatti dovuti alla deriva xy. Fare riferimento alla Figura 8 per immagini di esempio.
- Calcola la media di tutte le immagini acquisite durante i 30 secondi prima del basale per produrre un'immagine di riferimento. Salvare una copia di questa immagine per riferimento futuro.
- Impostare la soglia di intensità per generare un'immagine binaria dall'immagine mediata di base.
- Usa Watershed in ImageJ o funzioni simili in un altro programma per separare neuriti o cellule in connessione.
- Utilizzare la funzione Analizza particella con dimensioni dell'area e circolarità appropriate per sollecitare le regioni di interesse (ROI) corrispondenti a membrane cellulari, endosomi, lisosomi o boutoni sinaptici. Salva tutte le ROI selezionate.
- Selezionare quattro ROI in background nelle aree prive di celle all'interno del campo visivo.
- Misura l'intensità media dei pixel per ogni ROI in ogni fotogramma della pila di immagini ed esporta i risultati per l'analisi statistica.
- Calcola l'intensità media delle ROI di fondo come rumore di base, che verrà sottratto dalle intensità medie dei pixel per ogni ROI.
- Calcolare la media delle tre intensità medie più alte per ogni ROI selezionato durante l'applicazione della soluzione di pH 5,5 Tyrode per ottenere l'intensità massima di fluorescenza, definita come 100% per la normalizzazione.
- Calcolare la media delle tre intensità medie più basse per ogni ROI selezionato durante l'applicazione di 50 mM NH4Cl per impostare l'intensità minima di fluorescenza, definita come 0% per la normalizzazione.
- Calcola le variazioni relative della fluorescenza per ogni ROI in base alle sue intensità 0% e 100%. Ricava le variazioni medie della fluorescenza, la cinetica delle variazioni e altri valori/grafici dai singoli dati ROI.
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Representative Results
Le SV sono specializzate per il rilascio di neurotrasmettitori tramite eso-/endocitosi evocata27. Le SV hanno un lume altamente acido (cioè pH 5,5), che è l'ideale per ND6. Abbiamo usato un'elevata stimolazione K+ per evocare l'eso-/endocitosi SV al fine di consentire a ND6 di accedere a SV. Com'era prevedibile, dopo il carico sono comparsi punti fluorescenti di colore verde brillante lungo i processi neuronali (Figura 9A). Il profilo della linea mostrato nella Figura 4B ha dimostrato una forte sovrapposizione tra ND6 (curva verde) e FM4-64 puncta (curva rossa). La forte correlazione tra le intensità di fluorescenza di ND6 e FM4-64 suggerisce anche una colorazione SV di ND6 (Figura 9B).
Una stimolazione elettrica e una stimolazione ad alto K+ sono state utilizzate per evocare rispettivamente il rilascio del pool prontamente rilasciabile (RRP, cioè SV con alta probabilità di rilascio) e il pool di riserva SV (cioè SV con bassa probabilità di rilascio). Ci sono state diminuzioni della fluorescenza ND6 in risposta a entrambi gli stimoli (Figura 4C e Figura 4E), il che suggerisce che ND6 risiede nella membrana SV e che il lume SV è neutralizzato (riportato dalla diminuzione del segnale ND6) durante il rilascio SV.
Alla fine di ogni prova, sono stati applicati 50 mM di NH4Cl per disacidificare SVs28 e una soluzione di pH 5,5 per illuminare la membrana superficiale ND6 (Figura 4D e Figura 4F). Le differenze di fluorescenza ci permettono di determinare ND6 nella membrana superficiale (~44%) e nella membrana SV (~56%). Questi numeri corrispondono alle frazioni di membrane superficiali e SV ai terminali dell'assone29, suggerendo che ND6 si distribuisce uniformemente attraverso le membrane. Inoltre, i segnali ND6 durante due diversi stimoli e due manipolazioni del pH ci permettono di stimare che il breve burst elettrico ha mobilitato circa ~ 31% di SV e la stimolazione ad alto K + ha rilasciato ~ 70% delle SV rimanenti. I tassi di diminuzione della fluorescenza ND durante le stimolazioni corrispondono anche alla costante di tempo per l'esocitosi SV evocata precedentemente riportata30.
Le dimensioni compatte di ND6 portano a un disturbo sterico molto minore alle membrane cellulari rispetto al precedente metodo di marcatura14 e quindi offrono una misurazione più accurata del traffico SV. A sostegno di questa idea, una concentrazione di carico dieci volte superiore non ha mostrato alcuna differenza significativa nella decolorazione di FM4-64 durante la stimolazione (Figura 10). Tuttavia, 1μM è ancora raccomandato data la sua moderata colorazione negli astrociti.
Poiché l'eso-/endocitosi SV coinvolge il colesterolo (un lipide abbondante e vitale nelle membrane neuronali), abbiamo utilizzato l'imaging ND6 per chiederci in che modo il colesterolo di membrana influisce sul rilascio e sul recupero di SV. Un trattamento di 1 mM per 90 minuti di metil-β-ciclodestrina (MβCD) può rimuovere ~ 10% di colesterolo dalla membrana di superficieneuronale 31, imitando la diminuzione del colesterolo di membrana associata all'invecchiamento. Sotto un'esaustiva stimolazione elettrica, il trattamento con MβCD ha ridotto significativamente il rilascio e il recupero di SV misurati mediante imaging ND6 (Figura 11A), il che suggerisce che il colesterolo di membrana facilita l'eso-/endocitosiSV 32. È stato anche valutato il contributo del colesterolo al rifornimento del pool SV, che è cruciale per la fedeltà della neurotrasmissione33. Due stimolazioni elettriche con un intervallo di 10 secondi sono state applicate in presenza di Bafilomicina A1 (BafA1). BafA1 inibisce selettivamente la v-ATPasi che riacidifica le SV. Bloccando in modo acuto la riacidificazione delle SV recuperate, BafA1 impedisce il recupero della fluorescenza ND6 dopo la stimolazione (Figura 11B). La diminuzione dell'ND6 durante il secondo stimolo dovrebbe provenire solo dalle SV nascenti che reintegrano il RRP vuoto. Rispetto al controllo fittizio, è stata osservata una risposta ND6 significativamente più piccola al secondo stimolo nei neuroni pretrattati con MβCD (cioè, ampiezza minore e decadimento più rapido della riduzione della fluorescenza ND6). Questo risultato supporta l'idea che il colesterolo svolga un ruolo fondamentale nel reclutamento di nuove SV per RRP.
Figura 1: Schema di sintesi generale per la sonda ND6. Questa cifra è stata modificata da Thomas et al.20. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Proprietà di ND6. (A e B) Proprietà solvatocromiche di ND6. Spettri di assorbanza (A) e spettri di fluorescenza (B) in vari solventi eccitati a 405 nm. (C) Confronto dell'intensità di fluorescenza di ND6 in acqua (rosso) e soluzione di ottilglucoside all'1% a 1 μM. (D) La fluorescenza di ND6 in funzione del pH in una soluzione OG all'1% è proporzionale allo stato di protonazione del gruppo di testa della piperazina (pKa = 7,4 calcolato). Il riquadro mostra lo stato di protonazione calcolato della porzione di piperazina ND6 (pKa previsto = 8,83). La linea tratteggiata rappresenta i valori adattati. Questa cifra è stata modificata da Thomas et al.20. Abbreviazioni: DCM = diclorometano; MeCN = acetonitrile; DMSO = dimetilsolfossido; EtOH = alcol etilico; MeOH = alcol metilico; Abs= assorbanza; Em = emissione; OG = ottilglucoside. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Istantanea della traiettoria di simulazione della dinamica molecolare. Interazione della sonda ND6 nella membrana POPC (pannello di sinistra). Il gruppo di testa della piperazina interagisce fortemente con i gruppi fosfato (pannello di destra) attraverso interazioni elettrostatiche. La freccia nera (pannello di destra) indica il legame C-N tra l'anello naftalimmico e la piperazina. I risultati mostrano che il gruppo piperazine si muove solo leggermente con una preferenza per l'angolo diedro (atomi mostrati) tra 90 e 120 gradi pur mantenendo la sua conformazione a sedia. Questa cifra è stata modificata da Thomas et al.20. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: ND6 etichetta le vescicole sinaptiche e ne riporta il rilascio e il recupero nelle terminazioni nervose. (A) Immagini di esempio di FM4-64 (rosso), ND6 (verde) e sovrapposizione (giallo). I neuriti e il soma di un neurone sono stati profilati in linea. Le immagini a linee raddrizzate (larghezza 20 pixel) si trovano accanto alle immagini corrispondenti. Le punte di freccia indicano i bouton sinaptici contrassegnati da FM4-64. Barre di scala = 100 μm. (B) I profili di linea delle intensità di fluorescenza FM4-64 e ND6 mostrano una somiglianza significativa. (C) Tracce di campioni di cambiamenti di fluorescenza ND6 a bouton sinaptici indicati da punte di freccia in A in risposta agli stimoli. (D) Tracce di campioni di variazioni di fluorescenza ND6 in risposta alle soluzioni di NH4Cl e pH 5.5 Tyrode. (E) La decolorazione di FM4-64 è temporaneamente accoppiata a variazioni di intensità di ND6. I dati sono tracciati come media ±'intensità di fluorescenza S.E.M. (F) ND6 ma non l'intensità FM4-64 è diminuita e aumentata rispettivamente dalle applicazioni di 50 mM NH4Cl e pH 5.5 soluzioni di Tyrode. I dati sono tracciati come media ± S.E.M. Questa cifra è stata modificata da Thomas et al.20. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Configurazione dell'imaging basata su un microscopio invertito Nikon-TiE. Sono annotati quattro componenti necessari per l'imaging a fluorescenza di cellule vive. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Configurazione della stimolazione-imaging. Configurazione modificata da una camera Warner Instruments RC-26 e piattaforma di riscaldamento PH-1 per il controllo della temperatura e lo scambio di soluzioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Diagramma delle configurazioni dei dispositivi per l'acquisizione di immagini con stimolazioni sincronizzate e scambi di soluzioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Immagini di esempio che illustrano i passaggi chiave dell'analisi delle immagini. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: ND6 evidenzia le vescicole sinaptiche raggruppate ai terminali presinaptici. (A) Immagini di esempio FM4-64 (rosso) e ND6 (verde) co-caricamento ad alto ingrandimento. Barra della scala = 30 μm. (B) Grafico a dispersione delle intensità medie di fluorescenza FM4-64 e ND6 alle stesse ROI corrispondenti ai boutoni sinaptici e all'adattamento della regressione lineare. r = 0,8353; p = 1,7 × 10-8; campi visivi N = 9; ROI n = 450. La soglia per FM4-64 è di 1.200 UA (unità arbitraria) e di 160 UA per ND6. Questa cifra è stata modificata da Thomas et al.20. Abbreviazione: ROI = regioni di interesse. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 10: ND6 non interviene con le SV. (A) Turnover SV rappresentato da ND6 (tramite stimolo elettrico) dopo 1 o 10 μM di carico ND6. (B) Turnover SV misurato da FM4-64 (con lo stimolo elettrico). Questa cifra è stata modificata da Thomas et al.20. Abbreviazione: SVs = vescicole sinaptiche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 11: La riduzione del colesterolo altera il turnover delle SV. (A) Turnover SV rappresentato da ND6 sotto i 10 Hz, stimolo elettrico di 120 s nel controllo e neuroni trattati con MβCD. (B) La bafilomicina A1 previene la riacidificazione delle SV riciclate (cioè, nessun recupero della fluorescenza ND6 dopo la diminuzione evocata dalla stimolazione) e chiarisce ulteriormente l'impatto di MβCD sul rifornimento delle SV. Questa cifra è stata modificata da Thomas et al.20. Abbreviazione: SV = vescicola sinaptica; MβCD = metil-β-ciclodestrina; BafA1 = Bafilomicina A1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I coloranti a base lipidica, come l'1,1′-diottadecil-3,3,3′,3′-tetrametilidautocarbocianina (DiI) e il perclorato di 3,3′-diottideciloxacarbocianina (DiO), sono stati a lungo utilizzati per illustrare la morfologia cellulare e tracciare i processi cellulari come le proiezioni assonali dei neuroni. I coloranti stirilici, come FM1-43, sono stati inventati e utilizzati con successo per lo studio dell'esocitosi34. A causa della loro bassa affinità di membrana, marcano selettivamente le vescicole endocitose dove sono intrappolate, mentre i coloranti rimasti sulla membrana plasmatica vengono lavati via dalla perfusione costante. Pertanto, i coloranti stirilici non sono adatti per il monitoraggio continuo del riciclaggio delle vescicole.
La recente invenzione della GFP sensibile al pH (cioè pHluorin) ha reso possibile visualizzare ripetutamente il riciclaggio delle vescicole quando vengono marcate con una proteina di membrana vescicolare come VAMPII o Synaptophysin35. Seguendo lo stesso principio, l'etichettatura di un fluoroforo sensibile al pH alle molecole lipidiche consente di tracciare il riciclaggio della membrana lipidica durante i cicli di eso-/endocitosi14. In questo caso, essendo una singola entità lipidica, ND6 è più facile da preparare, più semplice da applicare, più efficiente nell'etichettare le membrane lipidiche, meno distruttivo per le cellule, più stabile nel rimanere nelle membrane cellulari e quindi più affidabile per l'imaging a fluorescenza. La sua dipendenza dalla membrana e la sensibilità inversa al pH consentono una colorazione più brillante degli organelli acidi come le SV e gli endosomi.
Inoltre, è anche possibile marcare tali organelli acidi o terminali presinaptici in tessuti come fette di ippocampo, poiché ND6 distribuito in modo non specifico viene spento da pH neutro in spazi extracellulari o citosolici. Inoltre, il suo ampio spostamento di Stokes rende ND6 ideale per l'imaging multifotone dei tessuti profondi. Pertanto, ND6 e altri fluorofori a base lipidica sensibili al pH consentono la misurazione ottica in tempo reale del traffico lipidico e di membrana cellulare tra la membrana plasmatica e l'apparato intracellulare come SV ed endosomi per cicli multipli di eso-/endocitosi. Dato che le sinapsi e le SV sono vitali per la neurotrasmissione, ND6 è senza dubbio utile per studiare la fisiologia sinaptica.
Dato il design modulare di questi analoghi lipidici, è possibile coniugare ND ad altri lipidi, come fosfolipidi e sfingolipidi, in vari tipi di membrane cellulari o organelli. Inoltre, i gruppi ND possono essere sostituiti con altri fluorofori sensibili all'ambiente per rilevare altri fattori ambientali come la concentrazione di calcio o zinco all'interno o all'esterno delle cellule o degli organelli. Inoltre, i fluorofori con diversi spettri di emissione possono essere collegati ai lipidi di membrana per espandere la tavolozza dei reporter lipidici. Per tutte queste modifiche, il linker tra lipidi e ND o altri gruppi fluorescenti può essere regolato per ottenere migliori foto-proprietà e/o sensibilità desiderate.
Questo protocollo descrive l'uso di ND6 nella visualizzazione del turnover SV utilizzando l'imaging di cellule vive. I passaggi critici includono il carico, le stimolazioni sincronizzate e la quantificazione della fluorescenza, che influenzano in modo significativo la qualità dei risultati. Inoltre, i parametri/impostazioni utilizzati in queste fasi possono essere modificati in base alle esigenze dello studio. Ad esempio, la stimolazione durante il carico può essere regolata (durata più breve o più lunga) per consentire l'accesso a diversi pool di SV (pool con probabilità di rilascio alte o basse, rispettivamente). Per l'imaging a fluorescenza su cellule vive, è importante trovare un equilibrio tra la salute delle cellule e l'intensità della fluorescenza, che è particolarmente importante in questo caso. Questo perché l'eccitazione per ND6 è vicino all'UV (cioè 405 nm), che può causare più fototossicità e rottura del colorante rispetto alla luce visibile. Pertanto, è importante regolare la potenza di eccitazione, il tempo di esposizione, la frequenza dei fotogrammi e la durata dell'imaging per ridurre al minimo il fotodanneggiamento e massimizzare la qualità del segnale.
ND6 è una sonda molto interessante. Il suo ampio spostamento Stokes ha permesso di utilizzarlo contemporaneamente ad altri coloranti a membrana come FM4-6420. Ancora più importante, è un candidato donatore adatto per il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) e può essere eccitato dalla luce viola, che avrà molte meno probabilità di co-eccitare il ricevente FRET. I coloranti che imitano i lipidi, come ND6, consentono di studiare le interazioni tra proteine di membrana e lipidi durante l'eso-/endocitosi. L'associazione e la dissociazione pH-dipendente tra proteine di membrana e lipidi sarà amplificata nel lume acido delle SV o degli endosomi, facilitando l'esplorazione del ruolo dei lipidi di membrana nell'endocitosi e nello smistamento mediato dai recettori. In sintesi, ND6 e i suoi derivati possono espandere significativamente la cassetta degli attrezzi per lo studio dei lipidi di membrana e del loro traffico nelle cellule vive.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Florida Atlantic University Office of Undergraduate Research and Inquiry grant (M.J.S.), Florida Department of Health Ed and Ethel Moore Pilot Grant 20A17 (Q.Z.), Alzheimer's Association grant AARG-NTF-19-618710 (Q.Z.) e NIA R21 grant AG061656-01A1 (Q.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digidata 1440A Data Acquistion System | Molecular Devices | Digidata 1440A | For synchronized stimulation and solution exchange |
| Dual Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | For live-cell imaging |
| Fetal Bovine Serum | OMEGA Scientific | FB-01 | For making H+20 solution used in dissection and tissue culture |
| Hamamatsu Flash4.0 sCOMS camera | Hamamatsu Inc. | C13440-20CU | high-sensitivity camera |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | For making H+20 solution used in dissection and tissue culture |
| Heated Platform | Warner Instruments | PH-1 | For live-cell imaging |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | For tissue culture |
| Micro-G Vibration Isolation Table | TMC | 63-564 | For live-cell imaging |
| Micro-manager | https://micro-manager.org/ | NA | For image acquisition control |
| Multi-Line In-Line Solution Heater | Warner Instruments | SHM-6 | For live-cell imaging |
| Neurobasal Plus Medium | THermoFisher Scientific | A3582901 | For tissue culture |
| Nikon Ti-E Inverted Microscope | Nikon | Ti-E/B | For live-cell imaging |
| ORCA-Flash4.0 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C1340-20CU | For live-cell imaging |
| Perfusion Chamber | Warner Instruments | RC-26G | For live-cell imaging |
| Six-Channel Valve Control Perfusion System | Warner Instruments | VC-6 | For solution exchange |
| Square Pulse Stimulator | Grass Instrument | SD9 | For electric field stimulation |
References
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