Summary
Este protocolo apresenta um método de imagem por fluorescência que utiliza uma classe de fluoróforos lipídicos sensíveis ao pH para monitorar o tráfego de membrana lipídica durante a exocitose celular e o ciclo de endocitose.
Abstract
Exo-/endocitose é um processo comum que medeia a troca de biomoléculas entre as células e seu ambiente e entre diferentes células. Células especializadas usam esse processo para executar funções vitais do corpo, como a secreção de insulina das células β e liberação de neurotransmissores das sinapses químicas. Devido ao seu significado fisiológico, a exo-/endocitose tem sido um dos tópicos mais estudados em biologia celular. Muitas ferramentas têm sido desenvolvidas para estudar este processo a nível de genes e proteínas, por causa das quais muito se sabe sobre a maquinaria proteica que participa neste processo. No entanto, poucos métodos foram desenvolvidos para medir o turnover lipídico da membrana, que é a base física da exo-/endocitose.
Este artigo apresenta uma classe de novos análogos lipídicos fluorescentes exibindo fluorescência dependente de pH e demonstra seu uso para rastrear a reciclagem lipídica entre a membrana plasmática e as vesículas secretoras. Auxiliados por simples manipulações de pH, esses análogos também permitem a quantificação da distribuição lipídica através da superfície e dos compartimentos da membrana intracelular, bem como a medida da taxa de turnover lipídico durante a exo-/endocitose. Esses novos repórteres lipídicos serão de grande interesse para vários campos de pesquisa biológica, como biologia celular e neurociência.
Introduction
A bicamada lipídica é um dos conjuntos de biomoléculas mais comuns e é indispensável para todas as células. Fora das células, forma a membrana plasmática que faz interface com as células e seu ambiente; Dentro das células, compartimentaliza várias organelas especializadas para designar funcionalidades. Mais dinâmicas do que paradas, as membranas lipídicas experimentam constantemente fusão e fissão, o que medeia o transporte de biomateriais, a reforma da organela, a mudança morfológica e a comunicação celular. Sem dúvida, a membrana lipídica é a base física para quase todos os processos celulares, e sua disfunção desempenha um papel crucial em várias desordens que vão desde o câncer1 até a doença de Alzheimer2. Embora as moléculas lipídicas sejam muito menos diversas do que as proteínas, a pesquisa de membrana até agora tem sido principalmente centrada em proteínas. Por exemplo, sabe-se muito mais sobre a maquinaria proteica do que sobre os lipídios na exocitose 3,4,5. Além disso, a organização, distribuição, dinâmica e homeostase dos lipídios através das membranas superficiais e intracelulares permanecem em grande parte inexploradas em comparação com as proteínas de membrana6.
Isso não é surpreendente, pois técnicas modernas de biologia molecular, como a mutagênese, fornecem uma vantagem metodológica para estudar proteínas em vez de lipídios. Por exemplo, a marcação transgênica de proteína verde fluorescente sensível ao pH (também conhecida como pHluorina) para proteínas vesiculares facilita a medida quantitativa da quantidade e taxa de turnover proteico vesicular durante a exo-/endocitose 7,8,9. No entanto, é quase impossível modificar geneticamente os lipídios da membrana in vivo. Além disso, manipulações qualitativas e mesmo quantitativas de quantidades e distribuições de proteínas são muito mais viáveis do que as de lipídios10. No entanto, lipídios fluorescentes nativos e sintéticos têm sido isolados e desenvolvidos para simular lipídios de membrana endógena in vitro e in vivo11. Um grupo de lipídios fluorescentes amplamente utilizado são os corantes estiril, por exemplo, FM1-43, que exibem fluorescência realçada por membrana e são uma ferramenta poderosa no estudo da liberação de vesículas sinápticas (VS) em neurônios12. Ultimamente, corantes lipídicos sensíveis ao ambiente têm sido inventados e amplamente utilizados como uma nova classe de repórteres para estudar várias propriedades da membrana celular, incluindo potencial de membrana11, ordem de fase13 e secreção14.
Uma nova classe de miméticos lipídicos cuja fluorescência é sensível ao pH (por exemplo, pHluorina) e sensível à membrana (por exemplo, FM1-43) foi desenvolvida para medir diretamente a distribuição lipídica na membrana plasmática e endossomos/lisossomos e o tráfego lipídico durante a exo-/endocitose. Os conhecidos fluoróforos solvatocrômicos exibindo características push-pull devido à transferência de carga intramolecular foram selecionados para este propósito. Dentre os fluoróforos solvatocrômicos existentes, o arcabouço 1,8-naftalimida (ND) é relativamente fácil de modificar, versátil para marcação, único em fotofísica15 e, portanto, tem sido utilizado em intercaladores de DNA, diodos orgânicos emissores de luz e sensores de biomoléculas 16,17,18.
A ligação de um grupo doador de elétrons à posição C4 do arcabouço ND gera uma estrutura push-pull, que leva a um aumento do momento dipolar ao redistribuir a densidade eletrônica no estado excitado19,20. Tal transferência de carga intramolecular produz grandes rendimentos quânticos e desvios de Stokes, resultando em fluorescência brilhante e estável21. Recentemente, esse grupo desenvolveu uma série de análogos lipídicos solvatocrômicos baseados no arcabouço ND e os obteve com bons rendimentos sintéticos20.
A caracterização espectroscópica mostra que, dentre esses produtos, o ND6 possui as melhores propriedades de fluorescência (Figura 1)20. Primeiro, ele tem picos de excitação e emissão bem separados (ou seja, ~400 nm e ~520 nm, respectivamente, na Figura 2A,B) em comparação com fluoróforos populares como isotiocianato de fluoresceína, rodamina ou GFP, tornando-o espectralmente separável deles e, portanto, útil para imagens multicoloridas. Em segundo lugar, a fluorescência ND6 exibe um aumento de mais de oito vezes em sua fluorescência na presença de micelas (Figura 2C), sugerindo uma forte dependência de membrana. Estudos prévios de fluorescência de células vivas com diferentes tipos de células mostraram excelente coloração de membrana por ND620. Terceiro, quando o pH da solução é diminuído de 7,5 (comumente encontrado em ambientes extracelulares ou citosólicos) para 5,5 (comumente encontrado em endossomos e lisossomos), o ND6 mostra um aumento de aproximadamente duas vezes na fluorescência (Figura 2D), mostrando sua sensibilidade ao pH. Além disso, a simulação de dinâmica molecular indica que o ND6 se integra prontamente à bicamada lipídica com seu arcabouço ND voltado para fora da membrana e do resíduo de piperazina mostrando fortes interações com grupos de cabeças de fosfolipídios (Figura 3). Em conjunto, essas características fazem do ND6 um análogo lipídico fluorescente ideal para visualizar e medir o turnover lipídico da membrana durante a exo-/endocitose.
Este trabalho apresenta um método para estudar a taxa de turnover e a dinâmica de lipídios SV usando cultura de neurônios hipocampais de camundongos. Ao estimular neurônios com soluções de Tyrode, com alto teor de K+, as VS e a membrana plasmática foram carregadas com ND6 (Figura 4A,B). Posteriormente, os neurônios foram reestimulados com diferentes estímulos, seguidos por soluções de NH4Cl e pH 5,5 de Tyrode (Figura 4D). Esse protocolo facilita a mensuração quantitativa das taxas de exocitose e endocitose montadas em diferentes circunstâncias (Figura 4C).
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Protocol
O protocolo a seguir inclui (1) um procedimento simplificado para estabelecer culturas hipocampais e corticais de camundongos com base em um protocolo bemestabelecido22, (2) uma breve introdução a uma instalação de microscópio de epifluorescência para neurônios vivos, (3) uma descrição detalhada da carga e imagem de ND6 em neurônios de camundongo, (4) uma discussão sobre a quantificação do tráfego de membrana pelo sinal ND6. Todos os procedimentos seguem as diretrizes de biossegurança e IACUC da Florida Atlantic University. A síntese de ND6 já foi descritaanteriormente20.
1. Preparação das culturas hipocampal e cortical de camundongos
NOTA: Se não especificado de outra forma, todas as etapas devem ser executadas em uma capela de fluxo laminar nível 2 de biossegurança. Esterilizar todas as ferramentas e materiais.
- Use pinças de tamanho 5 para colocar tampas de vidro em placas de cultura multipoço.
NOTA: Por exemplo, uma placa de 24 poços é ideal para lamínulas de 12 mm
. - Adicionar o volume apropriado de matrizes extracelulares para revestir a superfície de cultura celular (por exemplo, 75 μL de solução de matriz de membrana basal por lamínula de 12 mm ; ver Tabela de Materiais)
- Colocar as placas preparadas na incubadora de cultura de tecidos (5% CO2, 100% de umidade e 37 °C) por 1-4 h para permitir a reticulação da matriz da membrana basal.
- Sacrificar os animais, abrir o crânio e transferir todo o cérebro para uma placa de Petri de 35 mm com 3 mL de Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) contendo 20% de soro fetal bovino (H+20). Corte o cérebro ao longo da linha média e separe os córtices e hipocampos em uma capela de dissecção de fluxo laminar para reduzir a contaminação.
- Use microtesouras para cortar os tecidos em pequenos pedaços (~1 mm3). Transfira esses tecidos para um tubo cônico de 15 mL contendo 5 mL de H+20.
- Lavar os tecidos três vezes com 5 mL de H+20 e três vezes com 5 mL de HBSS.
- Adicionar 1,5 ml de tripsina a 1% com ácido etilenodiaminotetracético e incubar a 37 °C durante 10 minutos para digestão enzimática.
- Repita o passo 1.6 e utilize o vácuo para aspirar HBSS no final.
- Dissociar os tecidos mecanicamente em 1 mL de HBSS contendo 2,95 g/L de MgSO4•7H2O usando uma pipeta de vidro polido a fogo.
- Centrifugar a suspensão celular a 400 × g, 4 °C durante 5 min.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em um volume apropriado de meio de cultura para obter uma concentração de ~10.000.000 células/ml.
- Plaquear as células a ~1.000.000 células/cm2 e colocar a cultura na incubadora (5% CO2, 100% de umidade e 37 °C) por 1-4 h para facilitar a fixação das células às lamínulas de vidro.
- Adicione um volume apropriado de meio de cultura (por exemplo, 1 mL por poço para uma placa de 24 poços). Adicione o mesmo volume de meio de cultura após 1 semana. Após 2 semanas, substitua metade do meio de cultura existente por meios frescos a cada semana.
.2. Configuração do microscópio para imagens de fluorescência de células vivas
NOTA: Uma configuração de imagem exemplar (Figura 5) inclui pelo menos um microscópio de fluorescência invertida (consulte a Tabela de Materiais), fonte de luz de fluorescência com obturador automático, conjuntos de filtros de fluorescência (por exemplo, para geração de imagens ND6, use 405/10 BP para excitação, 495 LP para dicroico e 510/20 BP para emissão) e uma câmera de alta sensibilidade (Tabela de Materiais), todos controlados por software de aquisição de imagens (Tabela de Materiais).
- Prepare uma câmara de imagem que permita o controle de temperatura e a entrada/saída de solução para imagens de fluorescência de células vivas.
NOTA: Por exemplo, uma câmara de imagem de banho aberto modificada fixada em uma plataforma de aquecimento foi usada neste protocolo (Figura 6). - Configure um dispositivo programável para alternar as soluções de perfusão e fornecer o estímulo elétrico em pontos de tempo definidos durante a aquisição de imagens.
NOTA: A sincronização de hardware e software é necessária para análises quantitativas (Figura 7). Por exemplo, nesse protocolo, uma saída de gatilho da câmera de imagem foi usada para iniciar um programa de computador que controla um dispositivo de comutação automática, que controla um sistema de perfusão multicanal e um estimulador de pulso quadrado. - Para co-imagear dois ou mais repórteres fluorescentes, execute imagens de fluorescência multicanal alternando sequencialmente conjuntos de filtros ou dividindo simultaneamente diferentes emissões de fluorescência e projetando para a mesma câmera.
3. Carregamento e obtenção de imagens ND6 em culturas neuronais
- Pesar uma quantidade adequada de ND6, dissolvê-lo em dimetilsulfóxido (DMSO) e deixá-lo solubilizar à temperatura ambiente; sonicar brevemente (por exemplo, 3 min). Filtrar a solução-mãe bruta utilizando um filtro de 0,22 μm para remover grandes agregados corantes. Após filtração, determinar a concentração do corante por espectroscopia de absorção a 405 nm usando um espectrofotômetro convencional ou de microvolume usando ε = 10.700 M-1 cm-1.
- Antes da aplicação, diluir a solução-mãe até uma concentração de 1 μM utilizando a solução de banho. Manter a solução-mãe à temperatura ambiente no escuro.
- Marcação de endossomos e vesículas sinápticas
- Para rotular de forma ubíqua compartimentos de membrana endocitosados, como endossomos, adicione a solução estoque de ND6 (por exemplo, 1 mM em DMSO) ao meio de cultura na concentração final de 1 μM e incube a 5% de CO2, 100% de umidade e 37 °C por 30 min. Para reduzir a extensão da marcação de VS, suprimir farmacologicamente a atividade neuronal espontânea. Por exemplo, utilizar a tetrodotoxina para bloquear potenciais de ação ou o ácido 2,3-dioxo-6-nitro-1,2,3,4-tetraidrobenzo[f]quinoxalina-7-sulfonamida (NBQX) e o ácido D-(-)-2-amino-5-fosfonopentanóico (D-AP5) para inibir a transmissão excitatória23.
- Para marcar seletivamente as SVs, use estimulação breve, mas forte, para evocar exo-/endocitose pré-sináptica. Primeiro, transfira a(s) tampa(s) de cultura para uma placa de Petri de 35 mm contendo 2 mL de solução normal de Tyrode à temperatura ambiente. Em segundo lugar, diluir a solução-estoque de ND6 em solução de Tyrode com alto teor de K+ (KCl 90 mM) na concentração final de 1 μM. Em terceiro lugar, substitua a solução normal de Tyrode na placa de Petri por uma solução de Tyrode com alto teor de K+ ND6 e incube à temperatura ambiente durante 2 minutos.
- Transferir a cultura celular marcada com ND6 para a câmara de imagem preenchida com solução normal de Tyrode pré-aquecida contendo 10 μM NBQX e 10 μM D-AP5.
- Ajustar a velocidade de perfusão para ~0,2 mL/s (ou seja, 1 gota por segundo) e iniciar a perfusão da solução normal de Tyrode pré-aquecida contendo NBQX e D-AP5 para remover o excesso de ND6 na cultura.
- Ajuste o foco e localize o campo de visão apropriado contendo neurônios saudáveis e bem espalhados com neuritos conectados. Evite áreas que contenham coloides corantes não resolvidos.
- Tente criar imagens de células carregadas com ND6 com diferentes tempos de exposição para identificar as melhores configurações de imagem.
NOTA: Para o melhor tempo de exposição, a maior intensidade de fluorescência de pixels na imagem resultante é cerca de metade do intervalo de bits (por exemplo, para uma imagem de 16 bits, o intervalo de bits é de 0 a 65.535), o que permitirá um aumento adicional na fluorescência quando a solução de banho ácido for aplicada. O tempo de exposição selecionado deve ser usado para todas as imagens ND6. - Estabeleça o protocolo de estimulação e perfusão, o frame interval e a duração total. Por exemplo, no protocolo a seguir, use uma linha de base de 30 s, uma estimulação de campo elétrico de 10 s 30 Hz, recuperação de 50 s, K+ de 120 s 90 mM, recuperação de 60 s, solução de Tyrode de 60 s com NH4Cl de 50 mM, solução de Tirode de 60 s em pH 5,5 e um intervalo de quadros de 3 s.
- Iniciar a aquisição das imagens acompanhado da estimulação e perfusão sincronizadas. Monitore a simulação e a troca de soluções durante a aquisição de imagens.
- Pare a perfusão após o término da imagem, remova a lamínula e limpe a câmara de imagem para o próximo teste.
4. Quantificação do tráfego de membrana por uma mudança na fluorescência ND6
- Faça backup e/ou cópia eletrônica de todos os arquivos de imagem.
- Escolha um programa de análise para extração de dados, por exemplo, um software de análise de imagem de código aberto como o ImageJ24 e/ou FIJI25.
- Abra ou importe uma pilha de imagens para o programa de análise.
- Defina a primeira imagem como referência e alinhe o restante a ela usando funções/plugins como o Rigid Registration26, que mitigará artefatos devido ao xy-drifting. Consulte a Figura 8 para ver imagens de exemplo.
- Média de todas as imagens adquiridas durante a pré-linha de base de 30 s para produzir uma imagem de referência. Salve uma cópia desta imagem para referência futura.
- Defina o limite de intensidade para gerar uma imagem binária a partir da imagem média da linha de base.
- Use Watershed no ImageJ ou funções semelhantes em outro programa para separar neuritos ou células de conexão.
- Use a função Analisar Partícula com tamanho de área e circularidade apropriados para solicitar regiões de interesse (ROIs) correspondentes a membranas celulares, endossomos, lisossomos ou boutons sinápticos. Salve todos os ROIs selecionados.
- Selecione quatro ROIs em segundo plano em regiões livres de células dentro do campo de visão.
- Meça as intensidades médias de pixel para cada ROI em cada quadro da pilha de imagens e exporte os resultados para análise estatística.
- Calcule a intensidade média das ROIs de fundo como o ruído basal, que será subtraído das intensidades médias de pixel para cada ROI.
- Média das três maiores intensidades médias para cada ROI selecionada durante a aplicação da solução de Tyrode pH 5,5 para obtenção da intensidade máxima de fluorescência, que é definida como 100% para normalização.
- Média das três menores intensidades médias para cada ROI selecionada durante a aplicação de 50 mM NH4Cl para definir a intensidade mínima de fluorescência, que é definida como 0% para normalização.
- Calcule as mudanças relativas de fluorescência para cada ROI com base em suas próprias intensidades de 0% e 100%. Derive mudanças de fluorescência média, cinética de mudança e outros valores/gráficos de dados individuais de ROI.
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Representative Results
As VS são especializadas na liberação de neurotransmissores via exo-/endocitose evocada27. As SVs têm lúmen altamente ácido (i.e., pH 5,5), o que é ideal para ND6. Utilizamos alta estimulação com K+ para evocar a VS exo-/endocitose a fim de permitir que o ND6 acessasse o VS. Esperava-se que pontos fluorescentes verde-vivos ao longo dos processos neuronais aparecessem após a carga (Figura 9A). O perfil de retas mostrado na Figura 4B demonstrou forte sobreposição entre o ponto ND6 (curva verde) e o ponto FM4-64 (curva vermelha). A forte correlação entre as intensidades de fluorescência ND6 e FM4-64 também sugere uma coloração VS de ND6 (Figura 9B).
Uma estimulação elétrica e uma estimulação com alto K+ foram utilizadas para evocar a liberação da piscina prontamente liberável (PRR, ou seja, VS com alta probabilidade de liberação) e das VS da piscina de reserva (i.e., VS com baixa probabilidade de liberação), respectivamente. Houve diminuição da fluorescência do ND6 em resposta a ambos os estímulos (Figura 4C e Figura 4E), o que sugere que o ND6 reside na membrana do VS e que o lúmen do VS é neutralizado (relatado pela diminuição do sinal do ND6) durante a liberação do VS.
Ao final de cada ensaio, 50 mM NH4Cl foi aplicado para desacidificar SVs28 e solução de pH 5,5 para clarear a membrana de superfície ND6 (Figura 4D e Figura 4F). As diferenças na fluorescência permitem determinar ND6 na membrana de superfície (~44%) e na membrana de VS (~56%). Esses números correspondem às frações das membranas de superfície e SV nos terminais axonais29, sugerindo que ND6 se distribui uniformemente pelas membranas. Além disso, os sinais ND6 durante dois estímulos diferentes e duas manipulações de pH permitem estimar que o burst elétrico curto mobilizou cerca de ~31% das VS e a estimulação de K+ alta liberou ~70% das VS restantes. As taxas de diminuição da fluorescência do DN durante os estímulos também correspondem à constante de tempo para a exocitose SV evocada previamente relatada30.
O tamanho compacto do ND6 leva a muito menos perturbação estérica das membranas celulares do que o método de marcação anterior14 e, portanto, oferece uma medição mais precisa do tráfego de SV. Apoiando essa ideia, uma concentração de carga dez vezes maior não mostrou diferença significativa na coloração de FM4-64 durante a estimulação (Figura 10). No entanto, 1μM ainda é recomendado dada a sua coloração moderada em astrócitos.
Como a exo-/endocitose da VS envolve colesterol (um lipídio abundante e vital nas membranas neuronais), usamos a imagem do ND6 para perguntar como o colesterol da membrana afeta a liberação e a recuperação da VS. Um tratamento de 1 mM para 90 min de metil-β-ciclodextrina (MβCD) pode remover ~10% de colesterol da membrana da superfície neuronal31, mimetizando a diminuição do colesterol da membrana associada ao envelhecimento. Sob uma estimulação elétrica exaustiva, o tratamento com MβCD reduziu significativamente a liberação e recuperação de VS medida por imagem ND6 (Figura 11A), o que sugere que o colesterol de membrana facilita a exo-endocitose de VS32. Também avaliamos a contribuição do colesterol para a reposição do pool de VS, que é crucial para a fidelidade da neurotransmissão33. Foram aplicados dois eletrostimulations com intervalo de 10s na presença de Bafilomicina A1 (BafA1). BafA1 inibe seletivamente a v-ATPase que reacidifica as VSs. Ao bloquear agudamente a reacidificação das VS recuperadas, o BafA1 impede a recuperação da fluorescência ND6 após estimulação (Figura 11B). A diminuição do ND6 durante o segundo estímulo deve vir apenas de VS nascentes que repõem a PRR vazia. Em comparação com o controle simulado, uma resposta ND6 significativamente menor ao segundo estímulo foi observada nos neurônios pré-tratados com MβCD (isto é, menor amplitude e decaimento mais rápido da redução da fluorescência ND6). Esse resultado apoia a noção de que o colesterol desempenha um papel fundamental no recrutamento de novas VS para a PRR.
Figura 1: Esquema geral de síntese da sonda ND6. Esse número foi modificado a partir de Thomas et al.20. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Propriedades de ND6. (A e B) Propriedades solvatocrômicas de ND6. Espectros de absorbância (A) e espectros de fluorescência (B) em vários solventes excitados a 405 nm. (C) Comparação da intensidade de fluorescência do ND6 em água (vermelho) e solução de octilglicosídeo a 1% a 1 μM. (D) A fluorescência do ND6 em função do pH em solução OG a 1% é proporcional ao estado de protonação do grupo cabeça da piperazina (pKa calculado = 7,4). Inset mostra o estado de protonação calculado da fração piperazina ND6 (pKa predito = 8,83). A linha tracejada representa valores ajustados. Esse número foi modificado a partir de Thomas et al.20. Abreviaturas: DCM = diclorometano; MeCN = acetonitrila; DMSO = dimetilsulfóxido; EtOH = álcool etílico; MeOH = álcool metílico; Abs= absorbância; Em = emissão; OG = octilglicosídeo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Instantâneo da trajetória de simulação da dinâmica molecular. Interação da sonda ND6 na membrana POPC (painel esquerdo). O grupo cabeça de piperazina interage fortemente com grupos fosfato (painel direito) através de interações eletrostáticas. A seta preta (painel direito) aponta para a ligação C-N entre o anel de naftalimida e a piperazina. Os resultados mostram que o grupo piperazina move-se apenas ligeiramente com uma preferência pelo ângulo diedro (átomos mostrados) entre 90 e 120 graus, mantendo sua conformação de cadeira. Esse número foi modificado a partir de Thomas et al.20. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: ND6 marca vesículas sinápticas e relata sua liberação e recuperação nos terminais nervosos. (A) Imagens de amostra de FM4-64 (vermelho), ND6 (verde) e sobreposição (amarelo). Os neuritos e o soma de um neurônio foram perfilados em linha. As imagens de linha reta (largura de 20 pixels) estão ao lado das imagens correspondentes. As pontas de seta apontam para boutons sinápticos marcados por FM4-64. Barras de escala = 100 μm. (B) Os perfis de linha das intensidades de fluorescência FM4-64 e ND6 exibem semelhança significativa. (C) Traços amostrais de alterações de fluorescência ND6 em boutons sinápticos indicados por pontas de seta em A em resposta a estímulos. (D) Traços de amostra de alterações de fluorescência ND6 em resposta a soluções de NH4Cl e pH 5,5 Tyrode. (E) A descoloração de FM4-64 está temporariamente acoplada a mudanças de intensidade de ND6. Os dados são plotados como média ± intensidade de fluorescência S.E.M. (f) ND6, mas não FM4-64, a intensidade foi diminuída e aumentada pelas aplicações de 50 mM NH4Cl e pH 5,5 soluções de Tyrode, respectivamente. Os dados são plotados como média ± S.E.M. Esse número foi modificado a partir de Thomas et al.20. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Configuração da imagem baseada em microscópio invertido Nikon-TiE. Anotados são quatro componentes necessários para imagens de fluorescência de células vivas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Configuração da imagem por estimulação. Configuração modificada a partir de uma câmara Warner Instruments RC-26 e plataforma de aquecimento PH-1 para controle de temperatura e troca de solução. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Diagrama de configurações dos dispositivos para aquisição de imagens com estimulações sincronizadas e trocas de soluções. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Imagens de amostra demonstrando os principais passos na análise de imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: ND6 destaca vesículas sinápticas agrupadas em terminais pré-sinápticos. (A) Imagens de amostra FM4-64 (vermelho) e ND6 (verde) co-carregando em alta magnificação. Barra de escala = 30 μm. (B) Gráfico de dispersão das intensidades médias de fluorescência de FM4-64 e ND6 nas mesmas ROIs correspondentes a boutons sinápticos e ajuste de regressão linear. r = 0,8353; p = 1,7 × 10-8; campos de visão N = 9; ROIs n = 450. O limiar para FM4-64 é de 1.200 au (unidade arbitrária) e 160 au para ND6. Esse número foi modificado a partir de Thomas et al.20. Abreviação: ROIs = regiões de interesse. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: ND6 não interfere com VS. (A) Turnover de VS representado por ND6 (por estímulo elétrico) após carregamento de 1 ou 10 μM de ND6. (B) Turnover de VS medido pelo FM4-64 (com o estímulo elétrico). Esse número foi modificado a partir de Thomas et al.20. Abreviação: SVs = vesículas sinápticas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11: A redução do colesterol prejudica o turnover da VS. (A) Turnover de VS representado por ND6 abaixo de 10 Hz, estímulo elétrico de 120 s no controle e neurônios tratados com MβCD. (B) A bafilomicina A1 previne a reacidificação de SVs recicladas (ou seja, não há recuperação da fluorescência ND6 após diminuição evocada por estimulação) e elucida ainda mais o impacto da MβCD na reposição de VS. Esse número foi modificado a partir de Thomas et al.20. Abreviação: VS = vesícula sináptica; MβCD = metil-β-ciclodextrina; BafA1 = Bafilomicina A1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Corantes à base de lipídios, como 1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3′-tetrametilindocarbocianina (DiI) e perclorato de 3,3′-dioctadeciloxacarbocianina (DiO), têm sido usados há muito tempo para ilustrar a morfologia celular e rastrear processos celulares, como as projeções axonais dos neurônios. Corantes de estirila, como o FM1-43, têm sido inventados e utilizados com sucesso para o estudo da exocitose34. Devido à sua baixa afinidade com a membrana, eles marcam seletivamente as vesículas endocitadas onde ficam aprisionadas enquanto os corantes remanescentes na membrana plasmática são lavados por perfusão constante. Como tal, os corantes de estirilo não são adequados para a monitorização contínua da reciclagem de vesículas.
A recente invenção da GFP sensível ao pH (i.e., pHluorin) tornou possível visualizar repetidamente a reciclagem da vesícula quando marcada para uma proteína da membrana vesicular como VAMPII ou Synaptophysin35. Seguindo o mesmo princípio, a marcação de um fluoróforo sensível ao pH em moléculas lipídicas permite o rastreamento da reciclagem da membrana lipídica durante ciclos de exo-/endocitose14. Neste caso, sendo uma entidade única de lipídios, o ND6 é mais fácil de preparar, mais simples de aplicar, mais eficiente para marcar membranas lipídicas, menos perturbador para as células, mais estável em permanecer nas membranas celulares e, portanto, mais confiável para imagens de fluorescência. Sua dependência de membrana e sensibilidade ao pH inverso permitem coloração mais brilhante de organelas ácidas, como SVs e endossomos.
Além disso, também é viável rotular tais organelas ácidas ou terminais pré-sinápticos em tecidos como cortes hipocampais como ND6 inespecificamente distribuído é extinguido por pH neutro em espaços extracelulares ou citosólicos. Além disso, seu grande desvio de Stokes torna o ND6 ideal para imagens de múltiplos fótons de tecidos profundos. Portanto, ND6 e outros fluoróforos lipídicos sensíveis ao pH permitem a medição óptica em tempo real do tráfego lipídico e da membrana celular entre a membrana plasmática e o aparato intracelular, como SVs e endossomos para múltiplas rodadas de exo-/endocitose. Dado que sinapses e SVs são vitais para a neurotransmissão, a ND6 é, sem dúvida, útil para o estudo da fisiologia sináptica.
Dado o desenho modular desses análogos lipídicos, é viável conjugar ND a outros lipídios, como fosfolipídios e esfingolipídios, em vários tipos de membranas celulares ou organelas. Além disso, os grupos ND podem ser substituídos por outros fluoróforos sensíveis ao ambiente para detectar outros fatores ambientais, como a concentração de cálcio ou zinco dentro ou fora das células ou organelas. Além disso, fluoróforos com diferentes espectros de emissão podem ser ligados a lipídios de membrana para expandir a paleta de repórteres lipídicos. Para todas essas modificações, o ligante entre lipídios e ND ou outros grupos fluorescentes pode ser ajustado para alcançar melhores fotopropriedades e/ou sensibilidades desejadas.
Este protocolo descreve o uso de ND6 na visualização do turnover da VS usando imagens de células vivas. As etapas críticas incluem carregamento, estimulação sincronizada e quantificação de fluorescência, que afetam significativamente a qualidade dos resultados. Além disso, os parâmetros/configurações utilizados nessas etapas podem ser modificados de acordo com as necessidades do estudo. Por exemplo, a estimulação durante o carregamento pode ser ajustada (menor ou maior duração) para permitir o acesso de diferentes pools de SVs (pools com altas ou baixas probabilidades liberáveis, respectivamente). Para imagens de fluorescência de células vivas, é importante encontrar um equilíbrio entre a saúde celular e a intensidade da fluorescência, o que é particularmente importante aqui. Isso ocorre porque a excitação para ND6 é quase UV (ou seja, 405 nm), o que pode causar mais fototoxicidade e quebra de corante do que a luz visível. Assim, é importante ajustar o poder de excitação, o tempo de exposição, a taxa de quadros e a duração da imagem para minimizar o fotodano e maximizar a qualidade do sinal.
ND6 é uma sonda muito interessante. Seu grande deslocamento de Stokes possibilitou sua utilização simultânea com outros corantes de membrana, como o FM4-6420. Mais importante, é um candidato a doador adequado para transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) e pode ser excitado pela luz roxa, que será muito menos provável de co-excitar o receptor de FET. Corantes que mimetizam lipídios, como o ND6, permitem estudar as interações entre proteínas de membrana e lipídios durante a exo-/endocitose. A associação e dissociação pH-dependente entre proteínas de membrana e lipídios serão ampliadas no lúmen ácido de SVs ou endossomos, facilitando a exploração do papel dos lipídios de membrana na endocitose e classificação mediada por receptores. Em resumo, ND6 e seus derivados podem expandir significativamente a caixa de ferramentas para estudar lipídios de membrana e seu tráfego em células vivas.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Florida Atlantic University Office of Undergraduate Research and Inquiry grant (M.J.S.), Florida Department of Health Ed and Ethel Moore Pilot Grant 20A17 (Q.Z.), Alzheimer's Association grant AARG-NTF-19-618710 (Q.Z.) e NIA R21 grant AG061656-01A1 (Q.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digidata 1440A Data Acquistion System | Molecular Devices | Digidata 1440A | For synchronized stimulation and solution exchange |
| Dual Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | For live-cell imaging |
| Fetal Bovine Serum | OMEGA Scientific | FB-01 | For making H+20 solution used in dissection and tissue culture |
| Hamamatsu Flash4.0 sCOMS camera | Hamamatsu Inc. | C13440-20CU | high-sensitivity camera |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | For making H+20 solution used in dissection and tissue culture |
| Heated Platform | Warner Instruments | PH-1 | For live-cell imaging |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | For tissue culture |
| Micro-G Vibration Isolation Table | TMC | 63-564 | For live-cell imaging |
| Micro-manager | https://micro-manager.org/ | NA | For image acquisition control |
| Multi-Line In-Line Solution Heater | Warner Instruments | SHM-6 | For live-cell imaging |
| Neurobasal Plus Medium | THermoFisher Scientific | A3582901 | For tissue culture |
| Nikon Ti-E Inverted Microscope | Nikon | Ti-E/B | For live-cell imaging |
| ORCA-Flash4.0 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C1340-20CU | For live-cell imaging |
| Perfusion Chamber | Warner Instruments | RC-26G | For live-cell imaging |
| Six-Channel Valve Control Perfusion System | Warner Instruments | VC-6 | For solution exchange |
| Square Pulse Stimulator | Grass Instrument | SD9 | For electric field stimulation |
References
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