Summary
Ce protocole présente une méthode d’imagerie par fluorescence qui utilise une classe de fluorophores lipidiques sensibles au pH pour surveiller le trafic des membranes lipidiques pendant l’exocytose cellulaire et le cycle d’endocytose.
Abstract
L’exo-/endocytose est un processus courant qui médie l’échange de biomolécules entre les cellules et leur environnement et entre différentes cellules. Les cellules spécialisées utilisent ce processus pour exécuter des fonctions vitales du corps telles que la sécrétion d’insuline par les cellules β et la libération de neurotransmetteurs par les synapses chimiques. En raison de son importance physiologique, l’exocytose a été l’un des sujets les plus étudiés en biologie cellulaire. De nombreux outils ont été développés pour étudier ce processus au niveau des gènes et des protéines, grâce auxquels on sait beaucoup de choses sur la machinerie protéique participant à ce processus. Cependant, très peu de méthodes ont été développées pour mesurer le renouvellement lipidique membranaire, qui est la base physique de l’exo-/endocytose.
Cet article présente une classe de nouveaux analogues lipidiques fluorescents présentant une fluorescence dépendante du pH et démontre leur utilisation pour tracer le recyclage des lipides entre la membrane plasmique et les vésicules sécrétoires. Aidés par de simples manipulations du pH, ces analogues permettent également de quantifier la distribution des lipides à la surface et dans les compartiments de la membrane intracellulaire, ainsi que de mesurer le taux de renouvellement des lipides pendant l’exo-/endocytose. Ces nouveaux rapporteurs lipidiques seront d’un grand intérêt pour divers domaines de recherche biologique tels que la biologie cellulaire et les neurosciences.
Introduction
La bicouche lipidique est l’un des assemblages de biomolécules les plus courants et est indispensable à toutes les cellules. À l’extérieur des cellules, il forme la membrane plasmique qui interface les cellules et leur environnement ; À l’intérieur des cellules, il compartimente divers organites spécialisés pour des fonctionnalités désignées. Plutôt dynamiques qu’immobiles, les membranes lipidiques subissent constamment une fusion et une fission, qui interviennent dans le transport des biomatériaux, la réforme des organites, le changement morphologique et la communication cellulaire. Sans aucun doute, la membrane lipidique est la base physique de presque tous les processus cellulaires, et son dysfonctionnement joue un rôle crucial dans divers troubles allant du cancer1 à la maladie d’Alzheimer2. Bien que les molécules lipidiques soient beaucoup moins diversifiées que les protéines, la recherche sur les membranes a jusqu’à présent été principalement centrée sur les protéines. Par exemple, on en sait beaucoup plus sur la machinerie protéique que sur les lipides dans l’exocytose 3,4,5. De plus, l’organisation, la distribution, la dynamique et l’homéostasie des lipides à travers les membranes de surface et intracellulaires restent largement inexplorées par rapport aux protéines membranaires6.
Ce n’est pas surprenant car les techniques modernes de biologie moléculaire, telles que la mutagénèse, offrent un avantage méthodologique pour étudier les protéines plutôt que les lipides. Par exemple, le marquage transgénique de la protéine fluorescente verte sensible au pH (pHluorine) sur les protéines vésiculaires facilite la mesure quantitative de la quantité et du taux de renouvellement des protéines vésiculaires au cours de l’exocytoseet de l’endocytose 7,8,9. Cependant, il est presque impossible de modifier génétiquement les lipides membranaires in vivo. De plus, les manipulations qualitatives et même quantitatives des quantités et des distributions de protéines sont beaucoup plus réalisables que celles des lipides10. Néanmoins, des lipides fluorescents natifs et synthétiques ont été isolés et développés pour simuler des lipides membranaires endogènes in vitro et in vivo11. Un groupe de lipides fluorescents largement utilisés sont les colorants styryliques, par exemple FM1-43, qui présentent une fluorescence membranaire améliorée et constituent un outil puissant dans l’étude de la libération de vésicules synaptiques (SV) dans les neurones12. Dernièrement, des colorants lipidiques sensibles à l’environnement ont été inventés et largement utilisés comme nouvelle classe de rapporteurs pour étudier diverses propriétés de la membrane cellulaire, notamment le potentiel de membrane11, l’ordre de phase13 et la sécrétion14.
Une nouvelle classe de mimétiques lipidiques dont la fluorescence est à la fois sensible au pH (p. ex., pHluorin) et à la membrane (p. ex., FM1-43) a été mise au point pour mesurer directement la distribution des lipides dans la membrane plasmique et les endosomes/lysosomes et le trafic lipidique pendant l’exo-/endocytose. Les fluorophores solvatochromiques bien connus présentant des caractéristiques push-pull dues au transfert de charge intramoléculaire ont été sélectionnés à cette fin. Parmi les fluorophores solvatochromes existants, l’échafaudage de 1,8-naphtalimide (ND) est relativement facile à modifier, polyvalent pour le marquage, et est unique en photophysique15 et a donc été utilisé dans les intercalateurs d’ADN, les diodes électroluminescentes organiques et les capteurs de biomolécules 16,17,18.
L’attachement d’un groupe donneur d’électrons à la position C4 de l’échafaudage ND génère une structure push-pull, qui conduit à une augmentation du moment dipolaire en redistribuant la densité électronique dans l’état excité19,20. Un tel transfert de charge intramoléculaire produit de grands rendements quantiques et des décalages de Stokes, ce qui donne une fluorescence brillante et stable21. Ce groupe a récemment développé une série d’analogues lipidiques solvatochromes basés sur l’échafaudage ND et les a obtenus avec de bons rendements synthétiques20.
La caractérisation spectroscopique montre que parmi ces produits, ND6 possède les meilleures propriétés de fluorescence (Figure 1)20. Tout d’abord, il a des pics d’excitation et d’émission bien séparés (c’est-à-dire ~400 nm et ~520 nm, respectivement, dans la figure 2A,B) par rapport aux fluorophores populaires tels que l’isothiocyanate de fluorescéine, la rhodamine ou la GFP, ce qui le rend spectrement séparable d’eux et donc utile pour l’imagerie multicolore. Deuxièmement, la fluorescence ND6 présente une augmentation de plus de huit fois de sa fluorescence en présence de micelles (Figure 2C), suggérant une forte dépendance membranaire. Des études antérieures d’imagerie par fluorescence de cellules vivantes avec différents types de cellules ont montré une excellente coloration membranaire par ND620. Troisièmement, lorsque le pH de la solution est réduit de 7,5 (couramment trouvé dans les environnements extracellulaires ou cytosoliques) à 5,5 (couramment trouvé dans les endosomes et les lysosomes), ND6 montre une augmentation d’environ deux fois de la fluorescence (Figure 2D), montrant sa sensibilité au pH. De plus, la simulation de dynamique moléculaire indique que ND6 s’intègre facilement dans la bicouche lipidique avec son échafaudage ND tourné vers l’extérieur de la membrane et le résidu de pipérazine montrant de fortes interactions avec les groupes de tête phospholipidiques (Figure 3). Ensemble, ces caractéristiques font de ND6 un analogue lipidique fluorescent idéal pour visualiser et mesurer le renouvellement lipidique membranaire pendant l’exo-/endocytose.
Cet article présente une méthode pour étudier le taux de renouvellement et la dynamique des lipides SV à l’aide de neurones hippocampiques de souris en culture. En stimulant les neurones avec des solutions de Tyrode à haute teneur en K+, les SV et la membrane plasmique ont été chargés en ND6 (Figure 4A,B). Par la suite, les neurones ont été restimulés avec différents stimuli suivis de solutions contenant du NH4Cl et du pH 5,5 de Tyrode (Figure 4D). Ce protocole facilite la mesure quantitative des taux d’exocytose et d’endocytose assemblés dans différentes circonstances (Figure 4C).
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Protocol
Le protocole suivant comprend (1) une procédure simplifiée pour établir des cultures hippocampiques et corticales de souris basée sur un protocole bien établi22, (2) une brève introduction à une configuration de microscope à épifluorescence pour les neurones vivants, (3) une description détaillée de la charge et de l’imagerie de ND6 dans les neurones de souris, (4) une discussion sur la quantification du trafic membranaire par le signal ND6. Toutes les procédures suivent les directives de biosécurité et de l’IACUC de la Florida Atlantic University. La synthèse de ND6 a été décrite précédemment20.
1. Préparation des cultures hippocampiques et corticales de souris
REMARQUE : Sauf indication contraire, toutes les étapes doivent être effectuées dans une hotte à flux laminaire de niveau 2 de biosécurité. Stérilisez tous les outils et matériaux.
- Utiliser une pince de taille 5 pour placer les lamelles de verre dans des plaques de culture multipuits.
REMARQUE : Par exemple, une plaque à 24 puits est idéale pour les lamelles de 12 mm
. - Ajouter le volume approprié de matrices extracellulaires pour recouvrir la surface de culture cellulaire (p. ex., 75 μL de solution de matrice de membrane basale par lamelle de 12 mm ; voir le tableau des matières)
- Placer les plaques préparées dans l’incubateur de culture tissulaire (5 % de CO2, 100 % d’humidité et 37 °C) pendant 1 à 4 h pour permettre la réticulation de la matrice de la membrane basale.
- Sacrifiez les animaux, ouvrez le crâne et transférez tout le cerveau dans une boîte de Pétri de 35 mm avec 3 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBSS) contenant 20 % de sérum fœtal bovin (H+20). Coupez le cerveau le long de la ligne médiane et séparez les cortex et l’hippocampe dans une hotte de dissection à flux laminaire pour réduire la contamination.
- Utilisez des microciseaux pour couper les tissus en petits morceaux (~1 mm3). Transférez ces tissus dans un tube conique de 15 mL contenant 5 mL de H+20.
- Lavez les mouchoirs trois fois avec 5 ml de H+20 et trois fois avec 5 ml de HBSS.
- Ajouter 1,5 mL de trypsine à 1 % avec de l’acide éthylènediamine tétraacétique et incuber à 37 °C pendant 10 minutes pour la digestion enzymatique.
- Répétez l’étape 1.6 et utilisez le vide pour aspirer HBSS à la fin.
- Dissocier mécaniquement les tissus dans 1 mL de HBSS contenant 2,95 g/L de MgSO4•7H2O à l’aide d’une pipette en verre poli au feu.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 400 × g, 4 °C pendant 5 min.
- Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans un volume approprié de milieu de culture pour obtenir une concentration de ~10 000 000 cellules/ml.
- Plaquez les cellules à ~1 000 000 cellules/cm2 et placez la culture dans l’incubateur (5 % de CO2, 100 % d’humidité et 37 °C) pendant 1 à 4 h pour faciliter la fixation des cellules aux lamelles de verre.
- Ajouter un volume approprié de milieu de culture (p. ex., 1 mL par puits pour une plaque de 24 puits). Ajouter le même volume de milieu de culture après 1 semaine. Après 2 semaines, remplacez la moitié du milieu de culture existant par des milieux frais chaque semaine.
.2. Configuration du microscope pour l’imagerie par fluorescence de cellules vivantes
REMARQUE : Une configuration d’imagerie exemplaire (Figure 5) comprend au moins un microscope à fluorescence inversée (voir le tableau des matériaux), une source lumineuse de fluorescence avec obturateur automatique, des jeux de filtres de fluorescence (par exemple, pour l’imagerie ND6, utilisez 405/10 BP pour l’excitation, 495 LP pour le dichroïque et 510/20 BP pour l’émission) et une caméra haute sensibilité (Table des matériaux), tous contrôlés par un logiciel d’acquisition d’images (Table des matériaux).
- Préparez une chambre d’imagerie qui permet le contrôle de la température et l’entrée/sortie de solution pour l’imagerie par fluorescence de cellules vivantes.
REMARQUE : Par exemple, une chambre d’imagerie à bain ouvert modifiée fixée sur une plate-forme chauffante a été utilisée dans ce protocole (Figure 6). - Configurez un dispositif programmable pour changer les solutions de perfusion et délivrer le stimulus électrique à des moments définis pendant l’imagerie.
REMARQUE : La synchronisation matérielle et logicielle est nécessaire pour les analyses quantitatives (Figure 7). Par exemple, dans ce protocole, une sortie de déclenchement de la caméra d’imagerie a été utilisée pour démarrer un programme informatique qui contrôle un dispositif de commutation automatique, qui contrôle un système de perfusion multicanal et un stimulateur à impulsions carrées. - Pour co-imager deux rapporteurs fluorescents ou plus, effectuez une imagerie de fluorescence multicanal soit en changeant séquentiellement d’ensembles de filtres, soit en divisant simultanément différentes émissions de fluorescence et en projetant sur la même caméra.
3. Chargement et imagerie de ND6 dans les cultures neuronales
- Pesez une quantité appropriée de ND6, dissolvez-le dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) et laissez-le se solubiliser à température ambiante ; sonicate brièvement (p. ex., 3 min). Filtrer la solution brute à l’aide d’un filtre de 0,22 μm pour éliminer les gros agrégats de colorant. Après filtration, déterminer la concentration du colorant par spectroscopie d’absorption à 405 nm à l’aide d’un spectrophotomètre conventionnel ou microvolume en utilisant ε = 10 700 M-1 cm-1.
- Avant l’application, diluer la solution mère à une concentration de 1 μM à l’aide de la solution de bain. Conservez la solution mère à température ambiante dans l’obscurité.
- Marquage des endosomes et des vésicules synaptiques
- Pour marquer de manière ubiquitaire les compartiments membranaires endocytosés tels que les endosomes, ajouter une solution mère de ND6 (p. ex., 1 mM dans le DMSO) au milieu de culture à la concentration finale de 1 μM, et incuber à 5 % de CO2, 100 % d’humidité et 37 °C pendant 30 minutes. Pour réduire l’étendue du marquage SV, supprimer l’activité neuronale spontanée pharmacologiquement. Par exemple, utiliser la tétrodotoxine pour bloquer les potentiels d’action ou l’acide 2,3-dioxo-6-nitro-1,2,3,4-tétrahydrobenzo[f]quinoxaline-7-sulfonamide (NBQX) et l’acide D-(-)-2-amino-5-phosphonopentanoïque (D-AP5) pour inhiber la transmission excitatrice23.
- Pour marquer sélectivement les SV, utilisez une stimulation brève mais forte pour évoquer l’exo-/endocytose présynaptique. Tout d’abord, transférez la ou les lamelles de culture dans une boîte de Pétri de 35 mm contenant 2 mL de solution normale de Tyrode à température ambiante. Deuxièmement, diluer la solution mère de ND6 dans une solution de Tyrode à haute teneur en K+ (90 mM de KCl) à la concentration finale de 1 μM. Troisièmement, remplacer la solution normale de Tyrode dans la boîte de Pétri par une solution de Tyrode à haute teneur en K+ contenant du ND6 et incuber à température ambiante pendant 2 min.
- Transférer la culture cellulaire marquée ND6 dans la chambre d’imagerie remplie de solution normale de Tyrode préchauffée contenant 10 μM de NBQX et 10 μM de D-AP5.
- Ajuster la vitesse de perfusion à ~0,2 mL/s (c.-à-d. 1 goutte par seconde) et commencer la perfusion d’une solution normale préchauffée de Tyrode contenant du NBQX et du D-AP5 pour éliminer l’excès de ND6 dans la culture.
- Ajustez la mise au point et localisez le champ de vision approprié contenant des neurones sains et bien répartis portant des neurites connectées. Évitez les zones contenant des colloïdes de colorant non résolus.
- Essayez d’imager des cellules chargées de ND6 avec des temps d’exposition différents pour identifier les meilleurs paramètres d’imagerie.
REMARQUE : Pour un temps d’exposition optimal, l’intensité de fluorescence des pixels la plus élevée dans l’image résultante est d’environ la moitié de la plage de bits (par exemple, pour une image 16 bits, la plage de bits est de 0 à 65 535), ce qui permettra une augmentation supplémentaire de la fluorescence lorsque la solution de bain acide est appliquée. Le temps d’exposition sélectionné doit être utilisé pour toutes les images ND6. - Configurez le protocole de stimulation et de perfusion, l’intervalle de cadre et la durée totale. Par exemple, dans le protocole suivant, utilisez une ligne de base de 30 s, une stimulation du champ électrique de 10 s à 30 Hz, une récupération de 50 s, une récupération de 120 s à 90 mM K+, une récupération de 60 s, une solution de Tyrode à 60 s avec 50 mM de NH4Cl, une solution de Tyrode à 60 s à pH 5,5 et un intervalle de trame de 3 s.
- Démarrez l’acquisition d’images accompagnée de la stimulation et de la perfusion synchronisées. Surveillez la simulation et l’échange de solution pendant l’imagerie.
- Arrêtez la perfusion une fois l’imagerie terminée, retirez la lamelle et nettoyez la chambre d’imagerie pour le prochain essai.
4. Quantification du trafic membranaire par une modification de la fluorescence ND6
- Sauvegardez et/ou faites une copie électronique de tous les fichiers image.
- Choisissez un programme d’analyse pour l’extraction de données, par exemple un logiciel d’analyse d’images open source tel que ImageJ24 et/ou FIJI25.
- Ouvrez ou importez une pile d’images dans le programme d’analyse.
- Définissez la première image comme référence et alignez le reste sur celle-ci à l’aide de fonctions/plugins tels que Rigid Registration26, qui atténuera les artefacts dus à la dérive xy. Reportez-vous à la figure 8 pour des exemples d’images.
- Faites la moyenne de toutes les images acquises au cours des 30 secondes précédant la ligne de base pour produire une image de référence. Enregistrez une copie de cette image pour référence future.
- Définissez le seuil d’intensité pour générer une image binaire à partir de l’image moyenne de base.
- Utilisez Watershed dans ImageJ ou des fonctions similaires dans un autre programme pour séparer les neurites ou les cellules connectées.
- Utilisez la fonction Analyser les particules avec la taille de zone et la circularité appropriées pour solliciter des régions d’intérêt correspondant aux membranes cellulaires, aux endosomes, aux lysosomes ou aux boutons synaptiques. Enregistrez tous les retours sur investissement sélectionnés.
- Sélectionnez quatre zones d’intérêt d’arrière-plan dans des régions sans cellule dans le champ de vision.
- Mesurez l’intensité moyenne des pixels pour chaque retour sur investissement dans chaque image de la pile d’images et exportez les résultats pour une analyse statistique.
- Calculez l’intensité moyenne des ROI d’arrière-plan comme bruit de base, qui sera soustrait des intensités moyennes des pixels pour chaque ROI.
- Faites la moyenne des trois intensités moyennes les plus élevées pour chaque retour sur investissement sélectionné lors de l’application de la solution de pH 5,5 Tyrode pour obtenir l’intensité de fluorescence maximale, définie à 100 % pour la normalisation.
- Faites la moyenne des trois intensités moyennes les plus basses pour chaque retour sur investissement sélectionné lors de l’application de 50 mM NH4Cl pour définir l’intensité de fluorescence minimale, définie à 0 % pour la normalisation.
- Calculez les changements de fluorescence relatifs pour chaque retour sur investissement en fonction de ses propres intensités de 0 % et 100 %. Dérivez les changements de fluorescence moyens, la cinétique des changements et d’autres valeurs/graphiques à partir des données de retour sur investissement individuelles.
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Representative Results
Les SV sont spécialisés dans la libération de neurotransmetteurs via l’exocytose/endocytoseévoquée 27. Les SV ont une lumière très acide (c’est-à-dire pH 5,5), ce qui est idéal pour le ND6. Nous avons utilisé une stimulation K+ élevée pour évoquer l’exo-/endocytose SV afin de permettre à ND6 d’accéder à SV. Comme on pouvait s’y attendre, des ponctuations fluorescentes vert vif le long des processus neuronaux sont apparues après la charge (Figure 9A). Le profil de ligne illustré à la figure 4B a montré un fort chevauchement entre ND6 (courbe verte) et FM4-64 puncta (courbe rouge). La forte corrélation entre les intensités de fluorescence ND6 et FM4-64 suggère également une coloration SV de ND6 (Figure 9B).
Une stimulation électrique et une stimulation K+ élevée ont été utilisées pour évoquer la libération du pool facilement libérable (RRP, c’est-à-dire les SV à forte probabilité de libération) et des SV du pool de réserve (c’est-à-dire les SV à faible probabilité de libération), respectivement. Il y a eu des diminutions de la fluorescence du ND6 en réponse aux deux stimuli (Figure 4C et Figure 4E), ce qui suggère que le ND6 réside dans la membrane SV et que la lumière du SV est neutralisée (signalée par la diminution du signal ND6) pendant la libération du SV.
À la fin de chaque essai, 50 mM de NH4Cl ont été appliqués pour désacidifier les SV28 et une solution de pH 5,5 pour éclaircir la membrane de surface ND6 (Figure 4D et Figure 4F). Les différences de fluorescence nous permettent de déterminer ND6 dans la membrane de surface (~44%) et la membrane SV (~56%). Ces nombres correspondent aux fractions des membranes de surface et SV aux terminaisons axonales29, ce qui suggère que ND6 se répartit uniformément sur les membranes. De plus, les signaux ND6 lors de deux stimuli différents et de deux manipulations de pH nous permettent d’estimer que le court sursaut électrique a mobilisé environ ~31% des SV et qu’une stimulation K+ élevée a libéré ~70% des SV restants. Les taux de diminution de la fluorescence ND pendant les stimulations correspondent également à la constante de temps pour l’exocytose SV évoquée précédemment rapportée30.
La taille compacte de ND6 entraîne beaucoup moins de perturbations stériques des membranes cellulaires que la méthode de marquage précédente14 et offre donc une mesure plus précise du trafic de SV. À l’appui de cette idée, une concentration de charge dix fois plus élevée n’a montré aucune différence significative dans la décoloration de FM4-64 pendant la stimulation (Figure 10). Cependant, 1μM est toujours recommandé compte tenu de sa coloration modérée dans les astrocytes.
Comme l’exo-/endocytose SV implique le cholestérol (un lipide abondant et vital dans les membranes neuronales), nous avons utilisé l’imagerie ND6 pour demander comment le cholestérol membranaire affecte la libération et la récupération de SV. Un traitement de 1 mM pendant 90 minutes de méthyl-β-cyclodextrine (MβCD) peut éliminer ~10 % de cholestérol de la membrane de surface neuronale31, imitant la diminution du cholestérol membranaire associée au vieillissement. Sous une stimulation électrique exhaustive, le traitement MβCD a significativement réduit la libération et la récupération de SV mesurées par imagerie ND6 (Figure 11A), ce qui suggère que le cholestérol membranaire facilite l’exo-/endocytoseSV 32. Nous avons également évalué la contribution du cholestérol à la reconstitution du pool SV, ce qui est crucial pour la fidélité de la neurotransmission33. Deux stimulations électriques avec un intervalle de 10 s ont été appliquées en présence de bafilomycine A1 (BafA1). BafA1 inhibe sélectivement la v-ATPase qui réacidifie les SV. En bloquant de manière aiguë la réacidification des SV récupérés, BafA1 empêche la récupération de la fluorescence ND6 après stimulation (Figure 11B). La diminution de ND6 au cours du deuxième stimulus ne devrait provenir que des SV naissants qui reconstituent le RRP vide. Par rapport au contrôle fictif, une réponse ND6 significativement plus faible au deuxième stimulus a été observée dans les neurones prétraités avec MβCD (c’est-à-dire une amplitude plus petite et une décroissance plus rapide de la réduction de la fluorescence ND6). Ce résultat soutient l’idée que le cholestérol joue un rôle central dans le recrutement de nouveaux SV pour le RRP.
Figure 1 : Schéma général de synthèse de la sonde ND6. Cette figure a été modifiée à partir de Thomas et al.20. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Propriétés du ND6. (A et B) Propriétés solvatochromiques du ND6. Spectres d’absorbance (A) et spectres de fluorescence (B) dans divers solvants excités à 405 nm. (C) Comparaison de l’intensité de fluorescence du ND6 dans l’eau (rouge) et d’une solution d’octylglucoside à 1 % à 1 μM. (D) La fluorescence du ND6 en fonction du pH dans une solution d’OG à 1 % est proportionnelle à l’état de protonation du groupe de tête de pipérazine (pKa calculé = 7,4). L’encart montre l’état de protonation calculé de la fraction pipérazine ND6 (pKa prédit = 8,83). La ligne pointillée représente les valeurs ajustées. Cette figure a été modifiée à partir de Thomas et al.20. Abréviations : DCM = dichlorométhane ; MeCN = acétonitrile ; DMSO = diméthylsulfoxyde ; EtOH = alcool éthylique ; MeOH = alcool méthylique ; Abs = absorbance ; Em = émission ; OG = glucoside d’octyle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Instantané de la trajectoire de simulation de dynamique moléculaire. Interaction de la sonde ND6 dans la membrane du POPC (panneau de gauche). Le groupe de tête pipérazine interagit fortement avec les groupes phosphate (panneau de droite) par des interactions électrostatiques. La flèche noire (panneau de droite) pointe vers la liaison C-N entre le cycle naphtalimide et la pipérazine. Les résultats montrent que le groupe pipérazine ne se déplace que légèrement avec une préférence pour l’angle dièdre (atomes montrés) entre 90 et 120 degrés tout en conservant sa conformation en chaise. Cette figure a été modifiée à partir de Thomas et al.20. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : ND6 marque les vésicules synaptiques et signale leur libération et leur récupération dans les terminaisons nerveuses. (A) Exemples d’images de FM4-64 (rouge), ND6 (vert) et superposition (jaune). Les neurites et le soma d’un neurone ont été profilés en ligne. Les images en ligne redressée (20 pixels de largeur) sont à côté des images correspondantes. Les pointes de flèches pointent vers des boutons synaptiques marqués par FM4-64. Barres d’échelle = 100 μm. (B) Les profils de raie des intensités de fluorescence FM4-64 et ND6 présentent une ressemblance significative. (C) Traces d’échantillons de changements de fluorescence ND6 au niveau des boutons synaptiques indiqués par des pointes de flèche en A en réponse à des stimuli. (D) Traces d’échantillons de changements de fluorescence ND6 en réponse aux solutions de Tyrode NH4Cl et pH 5,5. (E) La décoloration de FM4-64 est temporairement couplée à des changements d’intensité de ND6. Les données sont présentées comme étant la moyenne ± l’intensité de fluorescence S.E.M. (F) ND6, mais pas l’intensité de FM4-64, a été diminuée et augmentée par les applications de solutions de Tyrode à 50 mM NH4Cl et pH 5,5, respectivement. Les données sont représentées comme moyenne ± S.E.M. Cette figure a été modifiée à partir de Thomas et al.20. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Configuration d’imagerie basée sur un microscope inversé Nikon-TiE. Les quatre composants annotés nécessaires à l’imagerie par fluorescence de cellules vivantes sont annotés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Configuration de stimulation-imagerie. Configuration modifiée à partir d’une chambre Warner Instruments RC-26 et d’une plate-forme de chauffage PH-1 pour le contrôle de la température et l’échange de solution. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Schéma des configurations des dispositifs pour l’acquisition d’images avec des stimulations synchronisées et des échanges de solutions. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Exemples d’images illustrant les étapes clés de l’analyse d’images. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : ND6 met en évidence les vésicules synaptiques regroupées aux terminaisons présynaptiques. (A) Exemples d’images FM4-64 (rouge) et ND6 (vert) co-chargées à fort grossissement. Barre d’échelle = 30 μm. (B) Nuage de points des intensités moyennes de fluorescence FM4-64 et ND6 aux mêmes ROI correspondant aux boutons synaptiques et à l’ajustement de régression linéaire. r = 0,8353 ; p = 1,7 × 10-8 ; champs de vision N = 9 ; Retours sur investissement n = 450. Le seuil pour FM4-64 est de 1 200 ua (unité arbitraire) et de 160 ua pour ND6. Cette figure a été modifiée à partir de Thomas et al.20. Abréviation : ROIs = régions d’intérêt. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 10 : ND6 n’intervient pas avec les SV. (A) Le renouvellement des SV représenté par ND6 (par stimulus électrique) après une charge de ND6 de 1 ou 10 μM. (B) Renouvellement du SV mesuré par FM4-64 (avec le stimulus électrique). Cette figure a été modifiée à partir de Thomas et al.20. Abréviation : SV = vésicules synaptiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 11 : La réduction du cholestérol altère le renouvellement des SV. (A) Renouvellement des SV représenté par ND6 sous 10 Hz, stimulus électrique de 120 s dans les neurones témoins et traités par MβCD. (B) La bafilomycine A1 empêche la réacidification des SV recyclés (c’est-à-dire aucune récupération de fluorescence ND6 après une diminution évoquée par stimulation) et élucide davantage l’impact de MβCD sur la reconstitution des SV. Cette figure a été modifiée à partir de Thomas et al.20. Abréviation : SV = vésicule synaptique ; MβCD = méthyl-β-cyclodextrine ; BafA1 = Bafilomycine A1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les colorants à base de lipides, tels que le 1,1′-dioctadécyl-3,3,3′,3′-tétraméthylindocarbocyanine (DiI) et le perchlorate de 3,3′-dioctadécyloxacarbocyanine (DiO), sont utilisés depuis longtemps pour illustrer la morphologie cellulaire et suivre les processus cellulaires tels que les projections axonales des neurones. Les colorants styryliques, tels que FM1-43, ont été inventés et utilisés avec succès pour l’étude de l’exocytose34. En raison de leur faible affinité membranaire, ils marquent sélectivement les vésicules endocytosées où elles sont piégées tandis que les colorants restant sur la membrane plasmique sont lavés par perfusion constante. En tant que tels, les colorants styryliques ne conviennent pas à la surveillance continue du recyclage des vésicules.
L’invention récente de la GFP sensible au pH (c’est-à-dire la pHluorine) a permis de visualiser à plusieurs reprises le recyclage des vésicules lorsqu’elles sont marquées sur une protéine membranaire vésiculaire telle que VAMPII ou Synaptophysin35. Suivant le même principe, le marquage d’un fluorophore sensible au pH sur des molécules lipidiques permet de suivre le recyclage de la membrane lipidique pendant les cycles d’exo-/endocytose14. Dans ce cas, étant une seule entité lipidique, ND6 est plus facile à préparer, plus simple à appliquer, plus efficace pour marquer les membranes lipidiques, moins perturbateur pour les cellules, plus stable à rester dans les membranes cellulaires et donc plus fiable pour l’imagerie par fluorescence. Sa dépendance membranaire et sa sensibilité au pH inverse permettent une coloration plus brillante des organites acides tels que les SV et les endosomes.
De plus, il est également possible de marquer de tels organites acides ou terminaisons présynaptiques dans des tissus tels que des tranches d’hippocampe lorsque le ND6 distribué de manière non spécifique est éteint par un pH neutre dans les espaces extracellulaires ou cytosoliques. De plus, son grand décalage de Stokes rend ND6 idéal pour l’imagerie multiphotonique des tissus profonds. Par conséquent, ND6 et d’autres fluorophores à base de lipides sensibles au pH permettent la mesure optique en temps réel du trafic des lipides et des membranes cellulaires entre la membrane plasmique et les appareils intracellulaires tels que les SV et les endosomes pour plusieurs cycles d’exo-/endocytose. Étant donné que les synapses et les SV sont vitales pour la neurotransmission, ND6 est sans aucun doute utile pour étudier la physiologie synaptique.
Compte tenu de la conception modulaire de ces analogues lipidiques, il est possible de conjuguer la ND à d’autres lipides, tels que les phospholipides et les sphingolipides, dans divers types de membranes cellulaires ou d’organites. De plus, les groupes ND peuvent être remplacés par d’autres fluorophores sensibles à l’environnement pour détecter d’autres facteurs environnementaux tels que la concentration de calcium ou de zinc à l’intérieur ou à l’extérieur des cellules ou des organites. De plus, des fluorophores avec des spectres d’émission différents peuvent être liés à des lipides membranaires pour élargir la palette de rapporteurs lipidiques. Pour toutes ces modifications, l’agent de liaison entre les lipides et les groupes ND ou autres groupes fluorescents peut être ajusté pour obtenir de meilleures photopropriétés et/ou les sensibilités souhaitées.
Ce protocole décrit l’utilisation de ND6 dans la visualisation du renouvellement des SV à l’aide de l’imagerie de cellules vivantes. Les étapes critiques comprennent la mise en charge, les stimulations synchronisées et la quantification de la fluorescence, qui affectent toutes de manière significative la qualité des résultats. De plus, les paramètres/réglages utilisés dans ces étapes peuvent être modifiés en fonction des besoins de l’étude. Par exemple, la stimulation pendant le chargement peut être ajustée (durée plus courte ou plus longue) pour permettre l’accès à différents pools de SV (pools avec des probabilités de libération élevées ou faibles, respectivement). Pour l’imagerie par fluorescence de cellules vivantes, il est important de trouver un équilibre entre la santé des cellules et l’intensité de la fluorescence, ce qui est particulièrement important ici. En effet, l’excitation du ND6 est proche de l’UV (c’est-à-dire 405 nm), ce qui peut provoquer plus de phototoxicité et de dégradation du colorant que la lumière visible. Il est donc important d’ajuster la puissance d’excitation, le temps d’exposition, la fréquence d’images et la durée d’imagerie pour minimiser les photodommages et maximiser la qualité du signal.
ND6 est une sonde très intéressante. Son grand décalage de Stokes permettait de l’utiliser simultanément avec d’autres colorants membranaires tels que FM4-6420. Plus important encore, il s’agit d’un candidat donneur approprié pour le transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET) et peut être excité par la lumière violette, qui sera beaucoup moins susceptible de co-exciter le receveur FRET. Les colorants imitant les lipides, tels que le ND6, permettent d’étudier les interactions entre les protéines membranaires et les lipides lors de l’exo-/endocytose. L’association et la dissociation dépendantes du pH entre les protéines membranaires et les lipides seront amplifiées dans la lumière acide des SV ou des endosomes, facilitant l’exploration du rôle des lipides membranaires dans l’endocytose et le tri médiés par les récepteurs. En résumé, ND6 et ses dérivés peuvent élargir considérablement la boîte à outils pour étudier les lipides membranaires et leur trafic dans les cellules vivantes.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la subvention du Bureau de la recherche et de l’enquête de premier cycle de la Florida Atlantic University (M.J.S.), la subvention pilote 20A17 (Q.Z.) du ministère de la Santé de Floride, la subvention AARG-NTF-19-618710 (Q.Z.) de l’Alzheimer’s Association et la subvention NIA R21 AG061656-01A1 (Q.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digidata 1440A Data Acquistion System | Molecular Devices | Digidata 1440A | For synchronized stimulation and solution exchange |
| Dual Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | For live-cell imaging |
| Fetal Bovine Serum | OMEGA Scientific | FB-01 | For making H+20 solution used in dissection and tissue culture |
| Hamamatsu Flash4.0 sCOMS camera | Hamamatsu Inc. | C13440-20CU | high-sensitivity camera |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | For making H+20 solution used in dissection and tissue culture |
| Heated Platform | Warner Instruments | PH-1 | For live-cell imaging |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | For tissue culture |
| Micro-G Vibration Isolation Table | TMC | 63-564 | For live-cell imaging |
| Micro-manager | https://micro-manager.org/ | NA | For image acquisition control |
| Multi-Line In-Line Solution Heater | Warner Instruments | SHM-6 | For live-cell imaging |
| Neurobasal Plus Medium | THermoFisher Scientific | A3582901 | For tissue culture |
| Nikon Ti-E Inverted Microscope | Nikon | Ti-E/B | For live-cell imaging |
| ORCA-Flash4.0 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C1340-20CU | For live-cell imaging |
| Perfusion Chamber | Warner Instruments | RC-26G | For live-cell imaging |
| Six-Channel Valve Control Perfusion System | Warner Instruments | VC-6 | For solution exchange |
| Square Pulse Stimulator | Grass Instrument | SD9 | For electric field stimulation |
References
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