Summary
Этот протокол представляет собой метод флуоресцентной визуализации, который использует класс pH-чувствительных липидных флуорофоров для мониторинга транспорта липидных мембран во время клеточного экзоцитоза и цикла эндоцитоза.
Abstract
Экзо-/эндоцитоз является распространенным процессом, опосредующим обмен биомолекулами между клетками и окружающей средой, а также между различными клетками. Специализированные клетки используют этот процесс для выполнения жизненно важных функций организма, таких как секреция инсулина из β клеток и высвобождение нейротрансмиттеров из химических синапсов. Благодаря своему физиологическому значению, экзо-/эндоцитоз является одной из наиболее изученных тем в клеточной биологии. Разработано множество инструментов для изучения этого процесса на генном и белковом уровне, благодаря чему многое известно о белковых механизмах, участвующих в этом процессе. Тем не менее, было разработано очень мало методов для измерения мембранного липидного обмена, который является физической основой экзо-/эндоцитоза.
В данной работе представлен класс новых флуоресцентных аналогов липидов, проявляющих рН-зависимую флуоресценцию, и продемонстрировано их использование для отслеживания рециркуляции липидов между плазматической мембраной и секреторными везикулами. С помощью простых манипуляций с pH эти аналоги также позволяют количественно оценить распределение липидов по поверхности и внутриклеточным мембранным компартментам, а также измерить скорость обновления липидов во время экзо-/эндоцитоза. Эти новые липидные репортеры будут представлять большой интерес для различных областей биологических исследований, таких как клеточная биология и нейробиология.
Introduction
Липидный бислой является одной из наиболее распространенных сборок биомолекул и незаменим для всех клеток. Вне клеток он образует плазматическую мембрану, соединяющую клетки с окружающей средой; Внутри клеток он разделяет различные органеллы, специализированные для определенных функций. Липидные мембраны, скорее динамичные, чем неподвижные, постоянно испытывают слияние и деление, что опосредует транспорт биоматериала, преобразование органелл, изменение морфологии и клеточную коммуникацию. Несомненно, липидная мембрана является физической основой практически всех клеточных процессов, и ее дисфункция играет решающую роль при различных расстройствах, начиная от рака1 и заканчивая болезнью Альцгеймера2. Хотя молекулы липидов гораздо менее разнообразны, чем белки, мембранные исследования до сих пор были в основном ориентированы на белки. Например, о белковых механизмах известно гораздо больше, чем о липидах при экзоцитозе 3,4,5. Более того, организация, распределение, динамика и гомеостаз липидов через поверхностные и внутриклеточные мембраны в значительной степени остаются неизученными по сравнению с мембранными белками6.
Это неудивительно, поскольку современные методы молекулярной биологии, такие как мутагенез, дают методологическое преимущество для изучения белков, а не липидов. Например, трансгенное мечение pH-чувствительного зеленого флуоресцентного белка (также известного как pHluorin) к везикулярным белкам облегчает количественное измерение количества и скорости обновления везикулярного белка при экзо-/эндоцитозе 7,8,9. Однако генетически модифицировать мембранные липиды in vivo практически невозможно. Более того, качественные и даже количественные манипуляции с количеством и распределением белка гораздо более осуществимы, чем манипуляции с липидами10. Тем не менее, нативные и синтетические флуоресцентные липиды были выделены и разработаны для моделирования эндогенных мембранных липидов in vitro и in vivo11. Одной из групп широко используемых флуоресцентных липидов являются стириловые красители, например, FM1-43, которые проявляют мембраноусиленную флуоресценцию и являются мощным инструментом в изучении высвобождения синаптических везикул (SV) в нейронах12. В последнее время были изобретены чувствительные к окружающей среде липидные красители, которые широко используются в качестве нового класса для изучения различных свойств клеточных мембран, включая мембранный потенциал11, фазовый порядок13 и секрецию14.
Новый класс липидных миметиков, флуоресценция которых является одновременно pH-чувствительной (например, pHluorin) и мембраночувствительной (например, FM1-43), был разработан для непосредственного измерения распределения липидов в плазматической мембране и эндосомах/лизосомах, а также липидного трафика во время экзо-/эндоцитоза. Для этого были выбраны известные сольватохромные флуорофоры, обладающие двухтактными характеристиками за счет внутримолекулярного переноса заряда. Среди существующих сольватохромных флуорофоров 1,8-нафталимидный (ND) скаффолд относительно легко модифицируется, универсален для мечения и является уникальным в фотофизике15 и поэтому используется в ДНК-интеркаляторах, органических светодиодах и биомолекулярных сенсорах 16,17,18.
Присоединение электрон-донорной группы к положению С4 ND-каркаса генерирует двухтактную структуру, которая приводит к увеличению дипольного момента за счет перераспределения электронной плотности в возбужденном состоянии19,20. Такой внутримолекулярный перенос заряда приводит к большим квантовым выходам и сдвигам Стокса, что приводит к яркой и стабильной флуоресценции21. Эта группа недавно разработала серию сольватохромных аналогов липидов на основе ND-скаффолда и получила их с хорошими синтетическими выходами20.
Спектроскопическая характеристика показывает, что среди этих продуктов ND6 обладает наилучшими флуоресцентными свойствами (рис. 1)20. Во-первых, он имеет хорошо разделенные пики возбуждения и излучения (т.е. ~400 нм и ~520 нм соответственно на рисунке 2A, B) по сравнению с популярными флуорофорами, такими как флуоресцеин изотиоцианат, родамин или GFP, что делает его спектрально отделимым от них и, таким образом, полезным для многоцветной визуализации. Во-вторых, флуоресценция ND6 демонстрирует более чем восьмикратное увеличение своей флуоресценции в присутствии мицелл (рис. 2C), что указывает на сильную мембранозависимость. Предыдущие исследования флуоресцентной визуализации живых клеток с различными типами клеток показали превосходное окрашивание мембран ND620. В-третьих, когда рН раствора снижается с 7,5 (обычно встречается во внеклеточной или цитозольной среде) до 5,5 (обычно обнаруживается в эндосомах и лизосомах), ND6 показывает примерно двукратное увеличение флуоресценции (рис. 2D), что свидетельствует о его чувствительности к рН. Более того, молекулярно-динамическое моделирование показывает, что ND6 легко интегрируется в липидный бислой, при этом его ND-каркас обращен наружу из мембраны, а остаток пиперазина демонстрирует сильное взаимодействие с фосфолипидными головными группами (рис. 3). В совокупности эти особенности делают ND6 идеальным флуоресцентным аналогом липидов для визуализации и измерения мембранного липидного обмена во время экзо-/эндоцитоза.
В данной работе представлен метод исследования скорости обновления и динамики липидов SV с использованием культивируемых нейронов гиппокампа мыши. Стимулируя нейроны растворами Тироде с высоким содержанием К+, SV и плазматическую мембрану нагружали ND6 (рис. 4A,B). В дальнейшем нейроны рестимулировали различными стимулами с последующим введением растворов NH4Cl и pH 5,5 Тироде (рис. 4D). Этот протокол облегчает количественное измерение скорости собранного экзоцитоза и эндоцитоза при различных обстоятельствах (рис. 4C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Следующий протокол включает в себя (1) упрощенную процедуру создания культур гиппокампа и коры головного мозга мышей на основе хорошо зарекомендовавшего себя протокола22, (2) краткое введение в установку эпифлуоресцентного микроскопа для живых нейронов, (3) подробное описание нагрузки и визуализации ND6 в нейронах мыши, (4) обсуждение количественной оценки мембранного транспорта сигналом ND6. Все процедуры проводятся в соответствии с рекомендациями по биобезопасности и IACUC в Атлантическом университете Флориды. Синтез ND6 был описан ранее20.
1. Подготовка мышиного гиппокампа и кортикальных культур
ПРИМЕЧАНИЕ: Если не указано иное, все шаги должны выполняться в ламинарном колпаке 2-го уровня биобезопасности. Простерилизуйте все инструменты и материалы.
- Используйте щипцы размера 5, чтобы поместить стеклянные покровные стекла в мультилуночные культуральные планшеты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, пластина с 24 отверстиями идеально подходит для покровных стеблей диаметром 12 мм
. - Добавьте соответствующий объем внеклеточных матриц для покрытия поверхности клеточной культуры (например, 75 мкл раствора матрицы базальной мембраны на 12 мм покровного стекла; см. таблицу материалов)
- Поместите подготовленные планшеты в инкубатор для тканевых культур (5%CO2, влажность 100% и 37 °C) на 1-4 ч, чтобы обеспечить сшивание матрицы базальной мембраны.
- Принесите животных в жертву, вскройте череп и перенесите весь мозг в чашку Петри диаметром 35 мм с 3 мл сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS), содержащего 20% фетальной бычьей сыворотки (H+20). Разрежьте мозг по средней линии и отделите кору головного мозга и гиппокамп в колпаке для вскрытия ламинарным потоком, чтобы уменьшить загрязнение.
- С помощью микроножниц разрежьте ткани на мелкие кусочки (~1мм3). Перенесите эти ткани в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл H+20.
- Вымойте салфетки три раза с 5 мл H+20 и три раза с 5 мл HBSS.
- Добавьте 1,5 мл 1% трипсина с этилендиаминтетрауксусной кислотой и инкубируйте при 37 °C в течение 10 мин для ферментного разложения.
- Повторите шаг 1.6 и используйте вакуум для аспирации HBSS в конце.
- Механически диссоциировать ткани в 1 мл HBSS, содержащего 2,95 г/л MgSO4•7H2O, с помощью пипетки из полированного огнем стекла.
- Центрифугируют клеточную суспензию при 400 × г, 4 °С в течение 5 мин.
- Аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют клетки в соответствующем объеме питательной среды для получения концентрации ~10 000 000 клеток/мл.
- Распределите ячейки при концентрации ~1 000 000 клеток/см2 и поместите культуру в инкубатор (5% CO2, влажность 100% и 37 °C) на 1-4 ч для облегчения прикрепления клеток к стеклянным покровным стеклам.
- Добавьте соответствующий объем питательной среды (например, 1 мл на лунку для 24-луночного планшета). Добавьте такой же объем питательной среды через 1 неделю. Через 2 недели каждую неделю заменяйте половину имеющейся питательной среды свежей средой.
.2. Установка микроскопа для флуоресцентной визуализации живых клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Примерная установка для визуализации (Рисунок 5) включает в себя, по крайней мере, инвертированный флуоресцентный микроскоп (см. Таблицу материалов), флуоресцентный источник света с автоматическим затвором, наборы флуоресцентных фильтров (например, для визуализации ND6 используйте 405/10 ПН для возбуждения, 495 LP для дихроичного и 510/20 ПН для излучения) и высокочувствительную камеру (Таблица материалов), все из которых управляются программным обеспечением для получения изображений (Таблица материалов).
- Подготовьте камеру визуализации, которая позволяет контролировать температуру и входить/выводить раствор для флуоресцентной визуализации живых клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, в этом протоколе использовалась модифицированная камера визуализации с открытой ванной, закрепленная на нагревательной платформе (рис. 6). - Настройте программируемое устройство для переключения перфузионных растворов и подачи электрического стимула в определенные моменты времени во время визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для количественного анализа необходима синхронизация аппаратного и программного обеспечения (рис. 7). Например, в этом протоколе триггерный выход с камеры визуализации использовался для запуска компьютерной программы, управляющей устройством автоматического переключения, которое управляет многоканальной системой перфузии и стимулятором прямоугольного импульса. - Чтобы получить совместное изображение двух или более флуоресцентных репортеров, выполните многоканальную флуоресцентную визуализацию либо путем последовательного переключения наборов фильтров, либо путем одновременного разделения различных флуоресцентных излучений и проецирования на одну и ту же камеру.
3. Загрузка и визуализация ND6 в культурах нейронов
- Взвесьте соответствующее количество ND6, растворите его в диметилсульфоксиде (ДМСО) и дайте ему раствориться при комнатной температуре; Кратковременное ультразвуковое воздействие (например, 3 мин). Отфильтруйте исходный раствор с помощью фильтра 0,22 мкм для удаления крупных агрегатов красителей. После фильтрации определяют концентрацию красителя методом абсорбционной спектроскопии на длине волны 405 нм с помощью обычного или микрообъемного спектрофотометра с использованием ε = 10 700 М-1 см-1.
- Перед применением разбавьте исходный раствор до концентрации 1 мкМ с помощью раствора для ванны. Храните исходный раствор при комнатной температуре в темноте.
- Маркировка эндосом и синаптических везикул
- Для повсеместной маркировки эндоцитозированных мембранных компартментов, таких как эндосомы, добавляют исходный раствор ND6 (например, 1 мМ в ДМСО) в питательную среду при конечной концентрации 1 мкМ и инкубируют при 5%СО2, 100% влажности и 37 °C в течение 30 мин. Чтобы уменьшить степень мечения SV, фармакологически подавляют спонтанную активность нейронов. Например, используйте тетродотоксин для блокировки потенциалов действия или 2,3-диоксо-6-нитро-1,2,3,4-тетрагидробензо[f]хиноксалин-7-сульфаниламид (NBQX) и D-(-)-2-амино-5-фосфонопентановую кислоту (D-AP5) для ингибирования возбуждающей передачи23.
- Чтобы селективно маркировать SV, используйте короткую, но сильную стимуляцию, чтобы вызвать пресинаптический экзо-/эндоцитоз. Сначала переложите покровные стекла культуры в чашку Петри диаметром 35 мм , содержащую 2 мл обычного раствора Тироде при комнатной температуре. Во-вторых, разбавьте исходный раствор ND6 в растворе Tyrode с высоким содержанием K+ (90 мМ KCl) в конечной концентрации 1 мкМ. В-третьих, замените обычный раствор Тироде в чашке Петри раствором Тироде, содержащим ND6 с высоким содержанием К+ , и инкубируйте при комнатной температуре в течение 2 мин.
- Перенесите меченую ND6-меченую клеточную культуру в камеру визуализации, заполненную предварительно подогретым нормальным раствором Tyrode, содержащим 10 мкМ NBQX и 10 мкМ D-AP5.
- Отрегулируйте скорость перфузии до ~0,2 мл/с (т.е. 1 капля в секунду) и начните перфузию предварительно подогретого нормального раствора Tyrode, содержащего NBQX и D-AP5, для удаления избытка ND6 в культуре.
- Отрегулируйте фокус и найдите соответствующее поле зрения, содержащее здоровые и хорошо распределенные нейроны, несущие связанные нейриты. Избегайте участков, содержащих нерастворимые коллоиды красителя.
- Попробуйте визуализировать ячейки, загруженные ND6, с разным временем экспозиции, чтобы определить наилучшие настройки визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для наилучшего времени экспозиции наибольшая интенсивность флуоресценции пикселей в результирующем изображении составляет около половины битового диапазона (например, для 16-битного изображения диапазон битов составляет от 0 до 65,535), что позволит еще больше увеличить флуоресценцию при нанесении раствора для кислотной ванны. Выбранное время экспозиции должно использоваться для всех изображений ND6. - Настройте протокол стимуляции и перфузии, интервал кадров и общую продолжительность. Например, в следующем протоколе используется исходный уровень 30 с, стимуляция электрическим полем 10 с 30 Гц, восстановление 50 с, 120 с 90 мМ K+, восстановление 60 с, раствор Тироде 60 с 50 мМ NH4Cl, 60 с раствор Тироде при pH 5,5 и интервал кадра 3 с.
- Начните получение изображения в сопровождении синхронизированной стимуляции и перфузии. Контролируйте симуляцию и обмен решениями во время визуализации.
- Остановите перфузию после окончания визуализации, снимите покровное стекло и очистите камеру визуализации для следующего испытания.
4. Количественная оценка мембранного транспорта по изменению флуоресценции ND6
- Создайте резервную копию и/или создайте электронную копию всех файлов изображений.
- Выберите аналитическую программу для извлечения данных, например, программное обеспечение для анализа изображений с открытым исходным кодом, такое как ImageJ24 и/или FIJI25.
- Откройте или импортируйте стек изображений в программу анализа.
- Установите первое изображение в качестве эталона и выровняйте остальные по нему с помощью функций/плагинов, таких как Rigid Registration26, которые уменьшат артефакты из-за смещения xy. Примеры изображений приведены на рисунке 8 .
- Усредните все изображения, полученные в течение 30-х годов, чтобы получить эталонное изображение. Сохраните копию этого изображения для использования в будущем.
- Установите пороговое значение интенсивности, чтобы создать двоичное изображение на основе усредненного по базовому уровню изображения.
- Используйте Watershed в ImageJ или аналогичные функции в другой программе для разделения соединительных нейритов или клеток.
- Используйте функцию «Анализ частиц » с соответствующим размером области и круговой структурой для получения областей интереса (ROI), соответствующих клеточным мембранам, эндосомам, лизосомам или синаптическим бутонам. Сохраните все выбранные ROI.
- Выберите четыре фоновых ROI в свободных от ячеек областях в поле зрения.
- Измерьте среднюю интенсивность пикселей для каждого ROI в каждом кадре стека изображений и экспортируйте результаты для статистического анализа.
- Вычислите среднюю интенсивность фоновых ROI как базовый уровень шума, который будет вычтен из средней интенсивности пикселей для каждого ROI.
- Усредните три самые высокие средние интенсивности для каждого выбранного ROI во время применения раствора pH 5,5 Tyrode, чтобы получить максимальную интенсивность флуоресценции, которая определяется как 100% для нормализации.
- Усредните три наименьшие средние интенсивности для каждого выбранного ROI во время применения 50 мМ NH4Cl, чтобы установить минимальную интенсивность флуоресценции, которая определяется как 0% для нормализации.
- Рассчитайте относительные изменения флуоресценции для каждого ROI на основе его собственных 0% и 100% интенсивностей. Получение средних изменений флуоресценции, кинетики изменений и других значений/графиков из отдельных данных ROI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
СВ специализированы для высвобождения нейротрансмиттеров посредством вызванного экзо-/эндоцитоза27. SV имеют высококислый просвет (т.е. pH 5,5), что идеально подходит для ND6. Мы использовали высокую стимуляцию К+ , чтобы вызвать экзо-/эндоцитоз SV, чтобы позволить ND6 получить доступ к SV. Ожидаемо, что после нагрузки появились ярко-зеленые флуоресцентные пункты вдоль нейронных отростков (рис. 9А). Профиль линии, показанный на рисунке 4B , продемонстрировал сильное перекрытие между ND6 (зеленая кривая) и FM4-64 puncta (красная кривая). Сильная корреляция между интенсивностями флуоресценции ND6 и FM4-64 также позволяет предположить SV-окрашивание ND6 (рис. 9B).
Электрическая стимуляция и стимуляция с высоким уровнем К+ были использованы для того, чтобы вызвать высвобождение легко высвобождаемого пула (РРЦ, т.е. SV с высокой вероятностью высвобождения) и SV резервного пула (т.е. SV с низкой вероятностью высвобождения) соответственно. Наблюдалось снижение флуоресценции ND6 в ответ на оба стимула (рис. 4C и рис. 4E), что позволяет предположить, что ND6 находится в мембране SV и что просвет SV нейтрализуется (о чем свидетельствует снижение сигнала ND6) во время высвобождения SV.
В конце каждого испытания 50 мМ NH4Cl применяли для снижения кислотности SVs28 и раствора pH 5,5 для осветления поверхностной мембраны ND6 (рис. 4D и рис. 4F). Различия во флуоресценции позволяют определить ND6 в поверхностной мембране (~44%) и SV-мембране (~56%). Эти цифры совпадают с долями поверхностных мембран и мембран SV на концахаксона 29, что позволяет предположить, что ND6 равномерно распределяется по мембранам. Более того, сигналы ND6 при двух разных стимулах и двух манипуляциях с рН позволяют оценить, что короткий электрический всплеск мобилизовал около ~31% SV, а высокая стимуляция K+ высвободила ~70% оставшихся SV. Скорость снижения НД-флуоресценции во время стимуляций также соответствует постоянной времени для вызванного экзоцитоза SV, о котором сообщалось ранее30.
Компактный размер ND6 приводит к гораздо меньшему стерическому нарушению клеточных мембран по сравнению с предыдущим методом мечения14 и, таким образом, обеспечивает более точное измерение транспорта SV. В пользу этой идеи говорит тот факт, что десятикратно более высокая концентрация нагрузки не показала существенной разницы в обесцвечивании FM4-64 во время стимуляции (рис. 10). Тем не менее, 1 мкМ по-прежнему рекомендуется, учитывая его умеренное окрашивание в астроцитах.
Поскольку экзо-/эндоцитоз SV включает в себя холестерин (обильный и жизненно важный липид в мембранах нейронов), мы использовали визуализацию ND6, чтобы выяснить, как мембранный холестерин влияет на высвобождение и извлечение SV. 1-мМ в течение 90 минут метил-β-циклодекстрина (MβCD) может удалить ~10% холестерина из поверхностной мембранынейронов 31, имитируя снижение уровня холестерина в мембранах, связанное со старением. При исчерпывающей электрической стимуляции лечение MβCD значительно снижало высвобождение и извлечение SV, измеренное с помощью визуализации ND6 (рис. 11A), что позволяет предположить, что мембранный холестерин способствует экзо-/эндоцитозу SV32. Мы также оценили вклад холестерина в пополнение пула SV, что имеет решающее значение для точности нейротрансмиссии33. Применяли две электростимуляции с интервалом 10 с в присутствии бафиломицина А1 (BafA1). BafA1 селективно ингибирует v-АТФазу, которая реакислизирует SV. Остро блокируя повторное подкисление извлеченных SV, BafA1 предотвращает восстановление флуоресценции ND6 после стимуляции (рис. 11B). Снижение ND6 во время второго стимула должно происходить только за счет зарождающихся SV, которые восполняют пустую RRP. По сравнению с фиктивным контролем у нейронов, предварительно обработанных MβCD, наблюдался значительно меньший ответ ND6 на второй стимул (т.е. меньшая амплитуда и более быстрое снижение флуоресценции ND6). Этот результат подтверждает мнение о том, что холестерин играет ключевую роль в привлечении новых SV в RRP.
Рисунок 1: Общая схема синтеза зонда ND6. Эта цифра была изменена из Thomas et al.20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Свойства ND6. (A и B) Сольватохромные свойства ND6. Спектры поглощения (А) и спектры флуоресценции (В) в различных растворителях, возбуждаемых с длиной волны 405 нм. (C) Сравнение интенсивности флуоресценции ND6 в воде (красный) и 1% растворе октилглюкозида при 1 мкМ. (D) Флуоресценция ND6 в зависимости от рН в 1% растворе ОГ пропорциональна протонному состоянию головной группы пиперазина (расчетное pKa = 7,4). На врезке показано расчетное протонное состояние пиперазинового фрагмента ND6 (предсказанное pKa = 8,83). Пунктирной линией обозначены подогнанные значения. Эта цифра была изменена из Thomas et al.20. Сокращения: DCM = дихлорметан; MeCN = ацетонитрил; ДМСО = диметилсульфоксид; EtOH = этиловый спирт; MeOH = метиловый спирт; Abs = абсорбция; Em = излучение; OG = октилглюкозид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Снимок траектории молекулярно-динамического моделирования. Взаимодействие зонда ND6 с POPC-мембраной (левая панель). Головная группа пиперазина сильно взаимодействует с фосфатными группами (правая панель) посредством электростатических взаимодействий. Черная стрелка (правая панель) указывает на связь C-N между нафталимидным кольцом и пиперазином. Результаты показывают, что пиперазиновая группа смещается лишь незначительно с предпочтением двугранного угла (показаны атомы) между 90 и 120 градусами, сохраняя при этом свою кресельную конформацию. Эта цифра была изменена из Thomas et al.20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: ND6 помечает синаптические везикулы и сообщает об их высвобождении и извлечении в нервных окончаниях. (A) Примеры изображений FM4-64 (красный), ND6 (зеленый) и наложение (желтый). Нейриты и сомы одного нейрона профилированы по линиям. Изображения с выпрямленными линиями (шириной 20 пикселей) находятся рядом с соответствующими изображениями. Наконечники стрелок указывают на синаптические бутоны, помеченные FM4-64. Масштабные линейки = 100 мкм. (B) Линейные профили интенсивности флуоресценции FM4-64 и ND6 демонстрируют значительное сходство. (C) Образцы следов изменений флуоресценции ND6 в синаптических бутонах, обозначенные стрелками в А в ответ на стимулы. (D) Следы изменений флуоресценции ND6 в образцах в ответ на растворы NH4Cl и pH 5,5 Tyrode. (E) Обесцвечивание FM4-64 временно связано с изменениями интенсивности ND6. Данные построены как среднее значение ± интенсивность флуоресценции S.E.M. (F)ND6, но не FM4-64, была уменьшена и увеличена при применении растворов 50 мМ NH4Cl и pH 5,5 Tyrode, соответственно. Данные отображаются в виде среднего значения ± S.E.M. Эта цифра была изменена из Thomas et al.20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Установка визуализации на основе инвертированного микроскопа Nikon-TiE. Аннотированы четыре компонента, необходимые для флуоресцентной визуализации живых клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Установка стимуляции-визуализации. Модификация из камеры Warner Instruments RC-26 и нагревательной платформы PH-1 для контроля температуры и замены раствора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Схема конфигураций устройств для получения изображений с синхронизированными стимуляциями и обменом растворами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Примеры изображений, демонстрирующие основные этапы анализа изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9: ND6 выделяет синаптические везикулы, сгруппированные на пресинаптических окончаниях. (A) Примеры изображений FM4-64 (красный) и ND6 (зеленый) с совместной нагрузкой при большом увеличении. Масштабная линейка = 30 мкм. (B) Диаграмма рассеяния FM4-64 и ND6 средних интенсивностей флуоресценции при одинаковых ROI, соответствующих синаптическому бутону и линейной регрессионной подгонке. r = 0,8353; р = 1,7 × 10-8; поля зрения N = 9; ROI n = 450. Пороговое значение для FM4-64 составляет 1 200 а.е. (произвольная единица) и 160 а.е. для ND6. Эта цифра была изменена из Thomas et al.20. Аббревиатура: ROI = интересующие регионы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 10: ND6 не вмешивается в работу SV. (A) ND6-представленный оборот SV (с помощью электрического стимула) после нагрузки ND6 1 или 10 мкМ. (B) FM4-64 - измеренный оборот КА (с помощью электрического стимула). Эта цифра была изменена из Thomas et al.20. Аббревиатура: SVs = синаптические везикулы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 11: Снижение уровня холестерина ухудшает оборот SV. (A) ND6-представленный оборот SV при частоте 10 Гц, электрический стимул 120 с в контроле и нейроны, обработанные MβCD. (B) Бафиломицин А1 предотвращает повторное подкисление переработанных SV (т.е. отсутствие восстановления флуоресценции ND6 после снижения, вызванного стимуляцией) и дополнительно объясняет влияние MβCD на восполнение SV. Эта цифра была изменена из Thomas et al.20. Аббревиатура: SV = синаптический пузырь; MβCD = метил-β-циклодекстрин; BafA1 = Бафиломицин А1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Красители на основе липидов, такие как 1,1′-диоктадецил-3,3,3′,3′-тетраметилиндокарбоцианин (DiI) и 3,3′-диоктадецилоксакарбоцианин перхлорат (DiO), уже давно используются для иллюстрации морфологии клеток и отслеживания клеточных процессов, таких как проекции аксонов нейронов. Стириловые красители, такие как FM1-43, были изобретены и успешно использованы для изучения экзоцитоза34. Из-за низкого сродства к мембране они избирательно помечают эндоцитозированные везикулы там, где они захвачены, в то время как красители, оставшиеся на плазматической мембране, смываются постоянной перфузией. Таким образом, стириловые красители не подходят для постоянного контроля переработки везикул.
Недавнее изобретение pH-чувствительного GFP (т.е. pHluorin) позволило многократно визуализировать рециркуляцию везикул при пометке с белком везикулярной мембраны, таким как VAMPII или Synaptophysin35. Следуя тому же принципу, маркировка pH-чувствительного флуорофора липидными молекулами позволяет отслеживать рециркуляцию липидных мембран во время циклов экзо-/эндоцитоза14. В этом случае, будучи единым целым липидом, ND6 легче приготовить, проще наносить, более эффективно маркировать липидные мембраны, меньше разрушать клетки, более стабильно оставаться в клеточных мембранах и, следовательно, более надежен для флуоресцентной визуализации. Его мембранозависимость и обратная чувствительность к pH позволяют более ярко окрашивать кислые органеллы, такие как SV и эндосомы.
Кроме того, такие кислые органеллы или пресинаптические окончания в тканях, таких как срезы гиппокампа, также можно пометить, поскольку неспецифически распределенный ND6 гасится нейтральным рН во внеклеточных или цитозольных пространствах. Кроме того, большой сдвиг Стокса делает ND6 идеальным для многофотонной визуализации глубоких тканей. Таким образом, ND6 и другие pH-чувствительные флуорофоры на основе липидов позволяют в режиме реального времени оптически измерять транспорт липидов и клеточных мембран между плазматической мембраной и внутриклеточным аппаратом, таким как SV и эндосомы, для нескольких раундов экзо-/эндоцитоза. Учитывая, что синапсы и SV жизненно важны для нейротрансмиссии, ND6, несомненно, полезен для изучения синаптической физиологии.
Учитывая модульную конструкцию этих аналогов липидов, возможно конъюгирование НД с другими липидами, такими как фосфолипиды и сфинголипиды, в различных типах клеточных мембран или органелл. Кроме того, нейтральные группы могут быть заменены другими чувствительными к окружающей среде флуорофорами для обнаружения других факторов окружающей среды, таких как концентрация кальция или цинка внутри или снаружи клеток или органелл. Кроме того, флуорофоры с различными спектрами излучения могут быть связаны с мембранными липидами для расширения палитры липидных репортеров. Для всех этих модификаций линкер между липидами и ND или другими флуоресцентными группами может быть скорректирован для достижения лучших фотосвойств и/или желаемой чувствительности.
Этот протокол описывает использование ND6 для визуализации оборота SV с помощью визуализации живых клеток. Важнейшие этапы включают нагрузку, синхронизированную стимуляцию и количественную оценку флуоресценции, которые существенно влияют на качество результатов. Более того, параметры/настройки, используемые на этих этапах, могут быть изменены в соответствии с потребностями исследования. Например, стимуляция во время загрузки может быть скорректирована (более короткая или более длительная продолжительность), чтобы обеспечить доступ к различным пулам SV (пулы с высокой или низкой вероятностью освобождения, соответственно). Для флуоресцентной визуализации живых клеток важно соблюсти баланс между здоровьем клеток и интенсивностью флуоресценции, что здесь особенно важно. Это связано с тем, что возбуждение ND6 близко к ультрафиолетовому излучению (т.е. 405 нм), что может вызвать большую фототоксичность и разрушение красителя, чем видимый свет. Таким образом, важно отрегулировать мощность возбуждения, время экспозиции, частоту кадров и продолжительность изображения, чтобы свести к минимуму фотоповреждение и максимизировать качество сигнала.
ND6 – очень интересный зонд. Большой сдвиг Стокса позволял использовать его одновременно с другими мембранными красителями, такими как FM4-6420. Что еще более важно, он является подходящим кандидатом в доноры для флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) и может возбуждаться фиолетовым светом, который с гораздо меньшей вероятностью будет вызывать совместное возбуждение реципиента FRET. Имитирующие липиды красители, такие как ND6, позволяют изучать взаимодействия между мембранными белками и липидами при экзо- и эндоцитозе. pH-зависимая ассоциация и диссоциация между мембранными белками и липидами будет усиливаться в кислом просвете SV или эндосом, что облегчает изучение роли мембранных липидов в рецептор-опосредованном эндоцитозе и сортировке. Таким образом, ND6 и его производные могут значительно расширить инструментарий для изучения мембранных липидов и их транспорта в живых клетках.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом Управления исследований и расследований Атлантического университета Флориды (M.J.S.), Департаментом здравоохранения Флориды и Пилотным грантом Этель Мур 20A17 (Q.Z.), грантом Ассоциации Альцгеймера AARG-NTF-19-618710 (Q.Z.) и грантом NIA R21 AG061656-01A1 (Q.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digidata 1440A Data Acquistion System | Molecular Devices | Digidata 1440A | For synchronized stimulation and solution exchange |
| Dual Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | For live-cell imaging |
| Fetal Bovine Serum | OMEGA Scientific | FB-01 | For making H+20 solution used in dissection and tissue culture |
| Hamamatsu Flash4.0 sCOMS camera | Hamamatsu Inc. | C13440-20CU | high-sensitivity camera |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | For making H+20 solution used in dissection and tissue culture |
| Heated Platform | Warner Instruments | PH-1 | For live-cell imaging |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | For tissue culture |
| Micro-G Vibration Isolation Table | TMC | 63-564 | For live-cell imaging |
| Micro-manager | https://micro-manager.org/ | NA | For image acquisition control |
| Multi-Line In-Line Solution Heater | Warner Instruments | SHM-6 | For live-cell imaging |
| Neurobasal Plus Medium | THermoFisher Scientific | A3582901 | For tissue culture |
| Nikon Ti-E Inverted Microscope | Nikon | Ti-E/B | For live-cell imaging |
| ORCA-Flash4.0 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C1340-20CU | For live-cell imaging |
| Perfusion Chamber | Warner Instruments | RC-26G | For live-cell imaging |
| Six-Channel Valve Control Perfusion System | Warner Instruments | VC-6 | For solution exchange |
| Square Pulse Stimulator | Grass Instrument | SD9 | For electric field stimulation |
References
- Polo, S., Pece, S., Di Fiore, P. P.
- Eckert, G. P., Wood, W. G., Muller, W. E. Lipid membranes and beta-amyloid: a harmful connection. Current Protein and Pept Science. 11 (5), 319-325 (2010).
- Augustine, G. J., Burns, M. E., DeBello, W. M., Pettit, D. L., Schweizer, F. E.
- Ammar, M. R., Kassas, N., Chasserot-Golaz, S., Bader, M. F., Vitale, N. Lipids in regulated exocytosis: what are they doing. Frontiers in Endocrinology. 4, 125 (2013).
- Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C.
- Chabanon, M., Stachowiak, J. C., Rangamani, P. Systems biology of cellular membranes: a convergence with biophysics. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 9 (5), 1386 (2017).
- Prosser, D. C., Wrasman, K., Woodard, T. K., O'Donnell, A. F., Wendland, B. Applications of pHluorin for quantitative, kinetic and high-throughput analysis of endocytosis in budding yeast. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54587 (2016).
- Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nature Protocols. 1 (6), 2970-2978 (2006).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
- Demchenko, A. P., Mély, Y., Duportail, G., Klymchenko, A. S. Monitoring biophysical properties of lipid membranes by environment-sensitive fluorescent probes. Biophysical Journal. 96 (9), 3461-3470 (2009).
- Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 77-83 (2012).
- Gaus, K., Zech, T., Harder, T. Visualizing membrane microdomains by Laurdan 2-photon microscopy. Molecular Membrane Biology. 23 (1), 41-48 (2006).
- Kahms, M., Klingauf, J. Novel pH-sensitive lipid based exo-endocytosis tracers reveal fast intermixing of synaptic vesicle pools. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 18 (2018).
- Zhou, L., Xie, L., Liu, C., Xiao, Y. New trends of molecular probes based on the fluorophore 4-amino-1,8-naphthalimide. Chinese Chemical Letters. 30 (10), 1799-1808 (2019).
- Tomczyk, M. D., Walczak, K. Z. l,8-Naphthalimide based DNA intercalators and anticancer agents. A systematic review from 2007 to 2017. European Journal of Medicinal Chemistry. 159, 393-422 (2018).
- Ulla, H., et al. Blue emitting 1,8-naphthalimides with electron transport properties for organic light emitting diode applications. Journal of Molecular Structure. 1143 (5), 344-354 (2017).
- Duke, R. M., Veale, E. B., Pfeffer, F. M., Kruger, P. E., Gunnlaugsson, T. Colorimetric and fluorescent anion sensors: An overview of recent developments in the use of 1,8-naphthalimide-based chemosensors. Chemical Society Reviews. 39 (10), 3936-3953 (2010).
- Panja, S. K., Dwivedi, N., Saha, S. Tuning the intramolecular charge transfer (ICT) process in push-pull systems: Effect of nitro groups. RSC Advances. 6 (107), 105786-105794 (2016).
- Thomas, D., et al. Solvatochromic and pH-sensitive fluorescent membrane probes for imaging of live cells. ACS Chemical Neuroscience. 12 (4), 719-734 (2021).
- Leslie, K. G., Jacquemin, D., New, E. J., Jolliffe, K. A. Expanding the breadth of 4-amino-1,8-naphthalimide photophysical properties through substitution of the naphthalimide core. Chemistry - A European Journal. 24 (21), 5569-5573 (2018).
- Liu, G. S., Tsien, R. W. Properties of synaptic transmission at single hippocampal synaptic boutons. Nature. 375 (6530), 404-408 (1995).
- Zhang, Q., Cao, Y. -Q., Tsien, R. W. Quantum dots provide an optical signal specific to full collapse fusion of synaptic vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 104 (45), 17843-17848 (2007).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Sudhof, T. C.
- Lazarenko, R. M., DelBove, C. E., Strothman, C. E., Zhang, Q. Ammonium chloride alters neuronal excitability and synaptic vesicle release. Scientific Reports. 7 (1), 5061 (2017).
- Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344 (6187), 1023-1028 (2014).
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J.
- DelBove, C. E., et al. Reciprocal modulation between amyloid precursor protein and synaptic membrane cholesterol revealed by live cell imaging. Neurobiology of Disease. 127, 449-461 (2019).
- Dason, J. S., Smith, A. J., Marin, L., Charlton, M. P. Vesicular sterols are essential for synaptic vesicle cycling. Journal of Neuroscience. 30 (47), 15856-15865 (2010).
- Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms. Journal of Neuroscience. 39 (42), 8209-8216 (2019).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200 (1992).
- Afuwape, O. A., Kavalali, E. T. Imaging synaptic vesicle exocytosis-endocytosis with pH-sensitive fluorescent proteins. Methods in Molecular Biology. 1474, 187-200 (2016).
