Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Messung des Membranlipidumsatzes mit dem pH-empfindlichen Fluoreszenz-Lipid-Analogon ND6

Published: July 29, 2021 doi: 10.3791/62717
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 3, 3, 1,2
1The Brain Institute at Florida Atlantic University, 2Department of Biomedical Sciences, Florida Atlantic University, 3Department of Chemistry and Biochemistry, Florida Atlantic University

Summary

Dieses Protokoll stellt eine Fluoreszenzbildgebungsmethode vor, die eine Klasse von pH-empfindlichen Lipidfluorophoren verwendet, um den Lipidmembrantransport während der Zellexozytose und des Endozytosezyklus zu überwachen.

Abstract

Die Exo-/Endozytose ist ein gängiger Prozess, der den Austausch von Biomolekülen zwischen Zellen und ihrer Umgebung sowie zwischen verschiedenen Zellen vermittelt. Spezialisierte Zellen nutzen diesen Prozess, um lebenswichtige Körperfunktionen wie die Insulinsekretion von β Zellen und die Freisetzung von Neurotransmittern aus chemischen Synapsen auszuführen. Aufgrund ihrer physiologischen Bedeutung ist die Exo-/Endozytose eines der am meisten untersuchten Themen in der Zellbiologie. Es wurden viele Werkzeuge entwickelt, um diesen Prozess auf Gen- und Proteinebene zu untersuchen, weshalb viel über die an diesem Prozess beteiligte Proteinmaschinerie bekannt ist. Es wurden jedoch nur sehr wenige Methoden entwickelt, um den Membranlipidumsatz zu messen, der die physikalische Grundlage der Exo-/Endozytose ist.

In dieser Arbeit wird eine Klasse neuer fluoreszierender Lipidanaloga vorgestellt, die eine pH-abhängige Fluoreszenz aufweisen, und ihre Verwendung zur Verfolgung des Lipidrecyclings zwischen der Plasmamembran und den sekretorischen Vesikeln demonstriert. Mit Hilfe einfacher pH-Manipulationen ermöglichen diese Analoga auch die Quantifizierung der Lipidverteilung über die Oberfläche und die intrazellulären Membrankompartimente sowie die Messung der Lipidumsatzrate während der Exo-/Endozytose. Diese neuartigen Lipidreporter werden für verschiedene biologische Forschungsbereiche wie Zellbiologie und Neurowissenschaften von großem Interesse sein.

Introduction

Die Lipiddoppelschicht ist eine der häufigsten Biomolekül-Anordnungen und für alle Zellen unverzichtbar. Außerhalb der Zellen bildet es die Plasmamembran, die Zellen und ihre Umgebung miteinander verbindet; In Zellen unterteilt es verschiedene Organellen, die auf bestimmte Funktionalitäten spezialisiert sind. Lipidmembranen sind eher dynamisch als still und erfahren ständig Fusion und Spaltung, die den Transport von Biomaterial, die Organellenreform, die Morphologieänderung und die zelluläre Kommunikation vermittelt. Zweifellos ist die Lipidmembran die physikalische Grundlage für fast alle zellulären Prozesse, und ihre Funktionsstörung spielt eine entscheidende Rolle bei verschiedenen Erkrankungen von Krebs1 bis Alzheimer2. Obwohl Lipidmoleküle weit weniger vielfältig sind als Proteine, war die Membranforschung bisher hauptsächlich proteinzentriert. Zum Beispiel ist viel mehr über die Proteinmaschinerie als über Lipide in der Exozytosebekannt 3,4,5. Darüber hinaus sind die Organisation, Verteilung, Dynamik und Homöostase von Lipiden über Oberflächen- und intrazelluläre Membranen im Vergleich zu Membranproteinen weitgehend unerforscht6.

Dies ist nicht verwunderlich, da moderne molekularbiologische Techniken wie die Mutagenese einen methodischen Vorteil für die Untersuchung von Proteinen anstelle von Lipiden bieten. Beispielsweise erleichtert die transgene Markierung von pH-empfindlichem grün fluoreszierendem Protein (auch bekannt als pHluorin) an vesikuläre Proteine die quantitative Messung der Menge und Geschwindigkeit des vesikulären Proteinumsatzes während der Exo-/Endozytose 7,8,9. Es ist jedoch fast unmöglich, Membranlipide in vivo genetisch zu verändern. Darüber hinaus sind qualitative und sogar quantitative Manipulationen von Proteinmengen und -verteilungen viel praktikabler als die von Lipiden10. Dennoch wurden native und synthetische fluoreszierende Lipide isoliert und entwickelt, um endogene Membranlipide in vitro und in vivo zu simulieren 11. Eine Gruppe weit verbreiteter fluoreszierender Lipide sind Styrylfarbstoffe, z. B. FM1-43, die membranverstärkte Fluoreszenz aufweisen und ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Freisetzung synaptischer Vesikel (SV) in Neuronen sind12. In letzter Zeit wurden umweltempfindliche Lipidfarbstoffe erfunden und als neue Klasse von Reportern verwendet, um verschiedene Zellmembraneigenschaften zu untersuchen, einschließlich Membranpotential11, Phasenordnung13 und Sekretion14.

Eine neue Klasse von Lipidmimetika, deren Fluoreszenz sowohl pH-sensitiv (z.B. pHluorin) als auch membransensitiv (z.B. FM1-43) ist, wurde entwickelt, um die Lipidverteilung in der Plasmamembran und den Endosomen/Lysosomen sowie den Lipidverkehr während der Exo-/Endozytose direkt zu messen. Zu diesem Zweck wurden die bekannten solvatochromen Fluorophore ausgewählt, die aufgrund des intramolekularen Ladungstransfers Push-Pull-Eigenschaften aufweisen. Unter den bestehenden solvatochromen Fluorophoren ist das 1,8-Naphthalimid (ND)-Gerüst relativ leicht zu modifizieren, vielseitig für die Markierung und einzigartig in der Photophysik15 und wurde daher in DNA-Interkalatoren, organischen Leuchtdioden und Biomolekülsensoren verwendet 16,17,18.

Durch das Anbringen einer elektronenabgebenden Gruppe an der C4-Position des ND-Gerüsts wird eine Push-Pull-Struktur erzeugt, die durch Umverteilung der Elektronendichte im angeregten Zustand19,20 zu einem erhöhten Dipolmoment führt. Ein solcher intramolekularer Ladungstransfer erzeugt große Quantenausbeuten und Stokes-Verschiebungen, was zu einer hellen und stabilen Fluoreszenzführt 21. Diese Gruppe hat kürzlich eine Reihe von solvatochromen Lipidanaloga auf der Grundlage des ND-Gerüsts entwickelt und sie mit guten synthetischen Ausbeutenerhalten 20.

Die spektroskopische Charakterisierung zeigt, dass ND6 unter diesen Produkten die besten Fluoreszenzeigenschaften besitzt (Abbildung 1)20. Erstens hat es im Vergleich zu gängigen Fluorophoren wie Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin oder GFP gut getrennte Anregungs- und Emissionspeaks (d. h. ~400 nm bzw. ~520 nm in Abbildung 2A, B), wodurch es spektral von ihnen getrennt werden kann und daher für die mehrfarbige Bildgebung nützlich ist. Zweitens weist die ND6-Fluoreszenz in Gegenwart von Mizellen einen mehr als achtfachen Anstieg ihrer Fluoreszenz auf (Abbildung 2C), was auf eine starke Membranabhängigkeit hindeutet. Frühere Fluoreszenz-Bildgebungsstudien mit verschiedenen Zelltypen zeigten eine hervorragende Membranfärbung durch ND620. Drittens, wenn der pH-Wert der Lösung von 7,5 (häufig in extrazellulären oder zytosolischen Umgebungen zu finden) auf 5,5 (häufig in Endosomen und Lysosomen zu finden) gesenkt wird, zeigt ND6 einen etwa zweifachen Anstieg der Fluoreszenz (Abbildung 2D), was seine pH-Empfindlichkeit zeigt. Darüber hinaus zeigt die Molekulardynamik-Simulation, dass sich ND6 leicht in die Lipiddoppelschicht integriert, wobei sein ND-Gerüst aus der Membran und dem Piperazinrest herausragt und starke Wechselwirkungen mit Phospholipidkopfgruppen zeigt (Abbildung 3). Insgesamt machen diese Eigenschaften ND6 zu einem idealen fluoreszierenden Lipidanalogon zur Visualisierung und Messung des Membranlipidumsatzes während der Exo-/Endozytose.

In dieser Arbeit wird eine Methode zur Untersuchung der Umsatzrate und Dynamik von SV-Lipiden unter Verwendung kultivierter Maus-Hippocampus-Neuronen vorgestellt. Durch die Stimulation von Neuronen mit hohen K+-Tyrode-Lösungen wurden SVs und die Plasmamembran mit ND6 beladen (Abbildung 4A,B). Anschließend wurden die Neuronen mit verschiedenen Stimuli restimuliert, gefolgt von NH4Cl-haltigen und pH 5,5 Tyrode-Lösungen (Abbildung 4D). Dieses Protokoll erleichtert die quantitative Messung der zusammengestellten Exozytose- und Endozytoseraten unter verschiedenen Umständen (Abbildung 4C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Das folgende Protokoll enthält (1) ein vereinfachtes Verfahren zur Etablierung von Hippocampus- und Kortikalkulturen der Maus auf der Grundlage eines etablierten Protokolls22, (2) eine kurze Einführung in einen Epifluoreszenzmikroskop-Aufbau für lebende Neuronen, (3) eine detaillierte Beschreibung der Beladung und Abbildung von ND6 in Mausneuronen, (4) eine Diskussion über die Quantifizierung des Membrantransports durch ND6-Signal. Alle Verfahren folgen den Biosicherheits- und IACUC-Richtlinien der Florida Atlantic University. Die Synthese von ND6 wurde bereits beschrieben20.

1. Präparation von Hippocampus- und Kortikalkulturen der Maus

HINWEIS: Wenn nicht anders angegeben, müssen alle Schritte in einer Laminar-Flow-Haube der Biosicherheitsstufe 2 durchgeführt werden. Sterilisieren Sie alle Werkzeuge und Materialien.

  1. Verwenden Sie eine Pinzette der Größe 5, um Glasdeckgläser in Multiwell-Kulturplatten zu legen.
    HINWEIS: Eine 24-Well-Platte ist beispielsweise ideal für 12-mm-Deckgläser Equation 1 .
  2. Fügen Sie das entsprechende Volumen an extrazellulären Matrizen hinzu, um die Zellkulturoberfläche zu beschichten (z. B. 75 μl Basalmembranmatrixlösung pro 12 mm Equation 1 Deckglas; siehe Materialtabelle)
  3. Legen Sie die vorbereiteten Platten für 1-4 Stunden in den Gewebekultur-Inkubator (5 % CO2, 100 % Luftfeuchtigkeit und 37 °C), um die Vernetzung der Basalmembranmatrix zu ermöglichen.
  4. Opfern Sie die Tiere, öffnen Sie den Schädel und geben Sie das gesamte Gehirn in eine 35-mm-Petrischale mit 3 ml Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), die 20% fötales Rinderserum (H+20) enthält. Schneiden Sie das Gehirn entlang der Mittellinie und trennen Sie die Kortexe und Hippocampi in einer Laminar-Flow-Dissektionshaube, um die Kontamination zu reduzieren.
  5. Schneiden Sie das Gewebe mit einer Mikroschere in kleine Stücke (~1 mm3). Übertragen Sie diese Gewebe in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 5 ml H+20.
  6. Waschen Sie die Tücher dreimal mit 5 ml H+20 und dreimal mit 5 ml HBSS.
  7. 1,5 ml 1% Trypsin mit Ethylendiamintetraessigsäure zugeben und 10 Minuten lang bei 37 °C für den Enzymaufschluss inkubieren.
  8. Wiederholen Sie Schritt 1.6 und verwenden Sie am Ende Vakuum, um HBSS abzusaugen.
  9. Dissoziieren Sie das Gewebe mechanisch in 1 ml HBSS mit 2,95 g/l MgSO4•7H2O mit einer feuerpolierten Glaspipette.
  10. Die Zellsuspension bei 400 × g, 4 °C 5 min zentrifugieren.
  11. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem geeigneten Volumen von Kulturmedien, um eine Konzentration von ~10.000.000 Zellen/ml zu erhalten.
  12. Plattieren Sie die Zellen mit ~1.000.000 Zellen/cm2 und legen Sie die Kultur für 1-4 Stunden in den Inkubator (5 % CO2, 100 % Luftfeuchtigkeit und 37 °C), um die Zellanhaftung an die Glasdeckgläser zu erleichtern.
  13. Fügen Sie ein geeignetes Volumen des Kulturmediums hinzu (z. B. 1 ml pro Vertiefung für eine 24-Well-Platte). Fügen Sie nach 1 Woche das gleiche Volumen des Nährmediums hinzu. Ersetzen Sie nach 2 Wochen jede Woche die Hälfte des vorhandenen Nährmediums durch frisches Medium.

2. Mikroskopaufbau für die Fluoreszenzbildgebung lebender Zellen

HINWEIS: Ein beispielhafter Bildgebungsaufbau (Abbildung 5) umfasst mindestens ein inverses Fluoreszenzmikroskop (siehe Materialtabelle), eine Fluoreszenzlichtquelle mit automatischem Verschluss, Fluoreszenzfiltersätze (z. B. für die Bildgebung von ND6 verwenden Sie 405/10 BP für die Anregung, 495 LP für dichroitische und 510/20 BP für die Emission) und eine hochempfindliche Kamera (Materialtabelle), die alle von einer Bilderfassungssoftware (Materialtabelle) gesteuert werden.

  1. Bereiten Sie eine Bildgebungskammer vor, die eine Temperaturregelung und einen Ein-/Ausgang der Lösung für die Fluoreszenzbildgebung lebender Zellen ermöglicht.
    HINWEIS: In diesem Protokoll wurde beispielsweise eine modifizierte Bildgebungskammer mit offenem Bad verwendet, die auf einer Heizplattform befestigt ist (Abbildung 6).
  2. Richten Sie ein programmierbares Gerät ein, um die Perfusionslösungen umzuschalten und den elektrischen Stimulus zu definierten Zeitpunkten während der Bildgebung abzugeben.
    HINWEIS: Für quantitative Analysen ist eine Hardware- und Softwaresynchronisierung erforderlich (Abbildung 7). In diesem Protokoll wurde beispielsweise ein Triggerausgang der Bildkamera verwendet, um ein Computerprogramm zu starten, das eine automatische Schaltvorrichtung steuert, die ein Mehrkanal-Perfusionssystem und einen Rechteckpulsstimulator steuert.
  3. Um zwei oder mehr Fluoreszenzreporter gemeinsam abzubilden, führen Sie eine Mehrkanal-Fluoreszenzbildgebung durch, indem Sie entweder nacheinander die Filtersätze wechseln oder gleichzeitig verschiedene Fluoreszenzemissionen aufteilen und auf dieselbe Kamera projizieren.

3. Laden und Imaging von ND6 in neuronalen Kulturen

  1. Wiegen Sie eine angemessene Menge ND6 ab, lösen Sie es in Dimethylsulfoxid (DMSO) auf und lassen Sie es bei Raumtemperatur löslich werden. kurz beschallen (z. B. 3 min). Filtrieren Sie die Rohstammlösung mit einem 0,22-μm-Filter, um große Farbstoffaggregate zu entfernen. Nach der Filtration wird die Farbstoffkonzentration durch Absorptionsspektroskopie bei 405 nm mit einem herkömmlichen oder Mikrovolumen-Spektrophotometer mit ε = 10.700 M-1 cm-1 bestimmt.
  2. Vor der Anwendung die Stammlösung mit der Badlösung auf eine Konzentration von 1 μM verdünnen. Bewahren Sie die Stammlösung bei Raumtemperatur im Dunkeln auf.
  3. Markierung von Endosomen und synaptischen Vesikeln
    1. Um endozytierte Membrankompartimente wie Endosomen ubiquitär zu markieren, geben Sie ND6-Stammlösung (z. B. 1 mM in DMSO) in der Endkonzentration von 1 μM in das Kulturmedium und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 5 % CO2, 100 % Luftfeuchtigkeit und 37 °C. Um das Ausmaß der SV-Markierung zu reduzieren, unterdrücken Sie die spontane neuronale Aktivität pharmakologisch. Verwenden Sie beispielsweise Tetrodotoxin, um Aktionspotentiale zu blockieren, oder 2,3-Dioxo-6-nitro-1,2,3,4-tetrahydrobenzo[f]chinoxalin-7-sulfonamid (NBQX) und D-(-)-2-amino-5-phosphonopentansäure (D-AP5), um die exzitatorische Übertragungzu hemmen 23.
    2. Um SVs selektiv zu markieren, verwenden Sie eine kurze, aber starke Stimulation, um präsynaptische Exo-/Endozytose hervorzurufen. Zuerst werden die Kulturdeckgläser in eine 35-mm-Petrischale Equation 1 mit 2 ml normaler Tyrode-Lösung bei Raumtemperatur gegeben. Zweitens wird die ND6-Stammlösung in der Tyrodelösung mit hohem K+ -Gehalt (90 mM KCl) auf die Endkonzentration von 1 μM verdünnt. Drittens ersetzen Sie die normale Tyrode-Lösung in der Petrischale durch ND6-haltige High-K+ -Tyrode-Lösung und inkubieren Sie sie 2 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  4. Die ND6-markierte Zellkultur wird in die Bildgebungskammer überführt, die mit vorgewärmter normaler Tyrode-Lösung gefüllt ist, die 10 μM NBQX und 10 μM D-AP5 enthält.
  5. Stellen Sie die Perfusionsgeschwindigkeit auf ~0,2 ml/s (d. h. 1 Tropfen pro Sekunde) ein und beginnen Sie mit der Perfusion der vorgewärmten normalen Tyrode-Lösung, die NBQX und D-AP5 enthält, um überschüssiges ND6 in der Kultur zu entfernen.
  6. Passen Sie den Fokus an und suchen Sie das entsprechende Sichtfeld mit gesunden und gut verteilten Neuronen, die verbundene Neuriten tragen. Vermeiden Sie Bereiche mit ungelösten Farbstoffkolloiden.
  7. Versuchen Sie, ND6-beladene Zellen mit unterschiedlichen Belichtungszeiten zu fotografieren, um die besten Bildgebungseinstellungen zu ermitteln.
    HINWEIS: Für die beste Belichtungszeit beträgt die höchste Pixelfluoreszenzintensität im resultierenden Bild etwa die Hälfte des Bitbereichs (z. B. für ein 16-Bit-Bild liegt der Bitbereich zwischen 0 und 65.535), was eine weitere Erhöhung der Fluoreszenz ermöglicht, wenn die saure Badlösung aufgetragen wird. Die gewählte Belichtungszeit sollte für alle ND6-Aufnahmen verwendet werden.
  8. Richten Sie das Stimulations- und Perfusionsprotokoll, das Bildintervall und die Gesamtdauer ein. Verwenden Sie im folgenden Protokoll beispielsweise eine 30 s Basislinie, eine 10 s 30 Hz elektrische Feldstimulation, 50 s Erholung, 120 s 90 mM K+, 60 s Erholung, 60 s Tyrode-Lösung mit 50 mM NH4Cl, 60 s Tyrode-Lösung bei pH 5,5 und ein Frame-Intervall von 3 s.
  9. Starten Sie die Bildaufnahme begleitet von der synchronisierten Stimulation und Perfusion. Überwachen Sie die Simulation und den Lösungsaustausch während der Bildgebung.
  10. Stoppen Sie die Perfusion nach Beendigung der Bildgebung, entfernen Sie das Deckglas und reinigen Sie die Bildgebungskammer für den nächsten Versuch.

4. Quantifizierung des Membrantransports durch eine Änderung der ND6-Fluoreszenz

  1. Sichern und/oder erstellen Sie eine elektronische Kopie aller Bilddateien.
  2. Wählen Sie ein Analyseprogramm für die Datenextraktion, z. B. eine Open-Source-Bildanalysesoftware wie ImageJ24 und/oder FIJI25.
  3. Öffnen oder importieren Sie einen Bildstapel in das Analyseprogramm.
  4. Legen Sie das erste Bild als Referenz fest und richten Sie den Rest mit Funktionen/Plugins wie Rigid Registration26 daran aus, wodurch Artefakte aufgrund von xy-Drifting gemildert werden. In Abbildung 8 finden Sie Beispielbilder.
  5. Mittelung aller Bilder, die während der 30 Sekunden vor der Baseline aufgenommen wurden, um ein Referenzbild zu erstellen. Speichern Sie eine Kopie dieses Bildes zum späteren Nachschlagen.
  6. Legen Sie den Intensitätsschwellenwert fest, um ein binäres Bild aus dem gemittelten Basislinienbild zu generieren.
  7. Verwenden Sie Watershed in ImageJ oder ähnliche Funktionen in einem anderen Programm, um Verbindungsneuriten oder Zellen zu trennen.
  8. Verwenden Sie die Funktion Partikel analysieren mit geeigneter Flächengröße und Zirkularität, um ROIs (Regions of Interest) anzufordern, die Zellmembranen, Endosomen, Lysosomen oder synaptischen Boutons entsprechen. Speichern Sie alle ausgewählten ROIs.
  9. Wählen Sie vier Hintergrund-ROIs in zellenfreien Bereichen innerhalb des Sichtfelds aus.
  10. Messen Sie die durchschnittliche Pixelintensität für jeden ROI in jedem Frame des Bildstapels und exportieren Sie die Ergebnisse für statistische Analysen.
  11. Berechnen Sie die mittlere Intensität der Hintergrund-ROIs als Basisrauschen, das von den durchschnittlichen Pixelintensitäten für jeden ROI subtrahiert wird.
  12. Mittelung der drei höchsten durchschnittlichen Intensitäten für jeden ausgewählten ROI während der Anwendung der pH 5,5 Tyrode-Lösung, um die maximale Fluoreszenzintensität zu erhalten, die für die Normalisierung als 100% definiert ist.
  13. Mittelung der drei niedrigsten durchschnittlichen Intensitäten für jeden ausgewählten ROI während der Anwendung von 50 mM NH4Cl, um die minimale Fluoreszenzintensität festzulegen, die für die Normalisierung als 0 % definiert ist.
  14. Berechnen Sie die relativen Fluoreszenzänderungen für jeden ROI basierend auf seinen eigenen 0 % und 100 % Intensitäten. Ableiten von mittleren Fluoreszenzänderungen, Änderungskinetiken und anderen Werten/Diagrammen aus einzelnen ROI-Daten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

SVs sind auf die Freisetzung von Neurotransmittern über evozierte Exo-/Endozytosespezialisiert 27. SVs haben ein stark saures Lumen (d. h. pH 5,5), was ideal für ND6 ist. Wir verwendeten eine hohe K+ -Stimulation, um SV-Exo-/Endozytose hervorzurufen, um ND6 den Zugang zu SV zu ermöglichen. Erwartungsgemäß zeigten sich nach dem Laden hellgrün fluoreszierende Punkte entlang neuronaler Prozesse (Abbildung 9A). Das in Abbildung 4B gezeigte Linienprofil zeigte eine starke Überlappung zwischen ND6 (grüne Kurve) und FM4-64 puncta (rote Kurve). Die starke Korrelation zwischen ND6- und FM4-64-Fluoreszenzintensitäten deutet ebenfalls auf eine SV-Färbung von ND6 hin (Abbildung 9B).

Eine elektrische Stimulation und eine hohe K+ -Stimulation wurden verwendet, um die Freisetzung des leicht lösbaren Pools (RRP, d.h. SVs mit hoher Freisetzungswahrscheinlichkeit) bzw. der Reservepool-SVs (d.h. SVs mit niedriger Freisetzungswahrscheinlichkeit) hervorzurufen. Es gab eine Abnahme der ND6-Fluoreszenz als Reaktion auf beide Stimuli (Abbildung 4C und Abbildung 4E), was darauf hindeutet, dass sich ND6 in der SV-Membran befindet und dass das SV-Lumen während der SV-Freisetzung neutralisiert wird (berichtet durch ND6-Signalabnahme).

Am Ende jedes Versuchs wurden 50 mM NH4Cl zur Entsäuerung von SVs28 und pH 5,5-Lösung zur Aufhellung der Oberflächenmembran ND6 aufgetragen (Abbildung 4D und Abbildung 4F). Die Unterschiede in der Fluoreszenz ermöglichen es uns, ND6 in der Oberflächenmembran (~44%) und der SV-Membran (~56%) zu bestimmen. Diese Zahl stimmt mit den Anteilen der Oberflächen- und SV-Membranen an den Axonenden29 überein, was darauf hindeutet, dass sich ND6 gleichmäßig über die Membranen verteilt. Darüber hinaus können wir anhand von ND6-Signalen während zwei verschiedenen Stimuli und zwei pH-Manipulationen abschätzen, dass der kurze elektrische Burst etwa ~31% SVs mobilisierte und eine hohe K+ -Stimulation ~70% der verbleibenden SVs freisetzte. Die Raten der ND-Fluoreszenzabnahme während der Stimulationen stimmen auch mit der Zeitkonstante für die zuvor berichtete evozierte SV-Exozytose überein30.

Die kompakte Größe von ND6 führt zu einer viel geringeren sterischen Störung der Zellmembranen als die bisherige Markierungsmethode14 und bietet somit eine genauere Messung des SV-Transports. Diese Idee wird durch eine zehnfach höhere Beladungskonzentration unterstützt, die keinen signifikanten Unterschied in der FM4-64-Entfärbung während der Stimulation zeigte (Abbildung 10). 1 μM wird jedoch aufgrund seiner mäßigen Färbung in Astrozyten immer noch empfohlen.

Da bei der SV-Exo-/Endozytose Cholesterin (ein reichlich vorhandenes und lebenswichtiges Lipid in den neuronalen Membranen) beteiligt ist, haben wir die ND6-Bildgebung verwendet, um zu untersuchen, wie Membrancholesterin die SV-Freisetzung und -Rückgewinnung beeinflusst. Eine 1-mM-Behandlung mit Methyl-β-Cyclodextrin (MβCD) für 90 Minuten kann ~10% Cholesterin aus der neuronalen Oberflächenmembranentfernen 31 und eine altersassoziierte Membran-Cholesterinsenkung nachahmen. Unter einer umfassenden elektrischen Stimulation reduzierte die MβCD-Behandlung die SV-Freisetzung und -Retrieval, gemessen durch ND6-Bildgebung (Abbildung 11A), signifikant, was darauf hindeutet, dass Membrancholesterin die SV-Exo-/Endozytose erleichtert32. Wir untersuchten auch den Beitrag von Cholesterin zur Wiederauffüllung des SV-Pools, der für die Genauigkeit der Neurotransmission entscheidend ist33. Zwei elektrische Stimulationen mit einem 10-s-Intervall wurden in Gegenwart von Bafilomycin A1 (BafA1) durchgeführt. BafA1 hemmt selektiv die v-ATPase, die SVs ansäuert. Durch die akute Blockierung der Wiederansäuerung der zurückgewonnenen SVs verhindert BafA1 die Erholung der ND6-Fluoreszenz nach der Stimulation (Abbildung 11B). Die ND6-Abnahme während des zweiten Stimulus sollte nur von entstehenden SVs stammen, die leere UVP wieder auffüllen. Im Vergleich zur Scheinkontrolle wurde in den mit MβCD vorbehandelten Neuronen eine signifikant geringere ND6-Antwort auf den zweiten Stimulus beobachtet (d.h. kleinere Amplitude und schnellerer Zerfall der ND6-Fluoreszenzreduktion). Dieses Ergebnis unterstützt die Vorstellung, dass Cholesterin eine zentrale Rolle bei der Rekrutierung neuer SVs für RRP spielt.

Figure 1
Abbildung 1: Allgemeines Syntheseschema für die ND6-Sonde. Diese Abbildung wurde von Thomas et al.20 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Eigenschaften von ND6. (A und B) Solvatochrome Eigenschaften von ND6. Absorptionsspektren (A) und Fluoreszenzspektren (B) in verschiedenen Lösungsmitteln, die bei 405 nm angeregt wurden. (C) Vergleich der Fluoreszenzintensität von ND6 in Wasser (rot) und 1%iger Octylglucosidlösung bei 1 μM. (D) Die ND6-Fluoreszenz als Funktion des pH-Werts in 1%iger OG-Lösung ist proportional zum Protonierungszustand der Piperazinkopfgruppe (berechnet pKa = 7,4). Der Einschub zeigt den berechneten Protonierungszustand der ND6-Piperazin-Einheit (vorhergesagter pKa = 8,83). Die gestrichelte Linie stellt angepasste Werte dar. Diese Abbildung wurde von Thomas et al.20 modifiziert. Abkürzungen: DCM = Dichlormethan; MeCN = Acetonitril; DMSO = Dimethylsulfoxid; EtOH = Ethylalkohol; MeOH = Methylalkohol; Abs = Absorption; Em = Emission; OG = Octylglucosid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Momentaufnahme der Molekulardynamik-Simulationsbahn. Wechselwirkung der ND6-Sonde in der POPC-Membran (linkes Bild). Die Piperazin-Kopfgruppe interagiert durch elektrostatische Wechselwirkungen stark mit Phosphatgruppen (rechtes Feld). Der schwarze Pfeil (rechtes Bild) zeigt auf die C-N-Bindung zwischen dem Naphthalimidring und Piperazin. Die Ergebnisse zeigen, dass sich die Piperazingruppe nur geringfügig bewegt, wobei der Flächenwinkel (Atome gezeigt) zwischen 90 und 120 Grad liegt, während sie ihre Stuhlkonformation beibehält. Diese Abbildung wurde von Thomas et al.20 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: ND6 markiert synaptische Vesikel und berichtet über ihre Freisetzung und Entnahme in den Nervenendigungen. (A) Beispielbilder von FM4-64 (rot), ND6 (grün) und Overlay (gelb). Die Neurite und das Soma eines Neurons wurden linienprofiliert. Die begradigten Linienbilder (20 Pixel Breite) befinden sich neben den entsprechenden Bildern. Pfeilspitzen zeigen auf synaptische Boutons, die mit FM4-64 gekennzeichnet sind. Maßstabsbalken = 100 μm. (B) Linienprofile der FM4-64- und ND6-Fluoreszenzintensitäten weisen eine signifikante Ähnlichkeit auf. (C) Probenspuren von ND6-Fluoreszenzänderungen an synaptischen Boutons, die durch Pfeilspitzen in A als Reaktion auf Stimuli angezeigt werden. (D) Probenspuren von ND6-Fluoreszenzänderungen als Reaktion auf NH4Cl und pH 5,5 Tyrode-Lösungen. (E) Die Entfärbung von FM4-64 ist vorübergehend an ND6-Intensitätsänderungen gekoppelt. Die Daten werden als Mittelwert ± S.E.M. (F) ND6-Fluoreszenzintensität, aber nicht der FM4-64-Intensität dargestellt, wurde durch die Anwendung von 50 mM NH4Cl bzw. pH 5,5 Tyrode-Lösungen verringert und erhöht. Die Daten werden als Mittelwert ± S.E.M. dargestellt. Diese Abbildung wurde von Thomas et al.20 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Bildgebungsaufbau basierend auf einem inversen Nikon-TiE-Mikroskop. Annotiert sind vier Komponenten, die für die Fluoreszenzbildgebung lebender Zellen erforderlich sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Aufbau der Stimulationsbildgebung. Setup, modifiziert aus einer Warner Instruments RC-26-Kammer und einer PH-1-Heizplattform für Temperaturregelung und Lösungsaustausch. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Diagramm der Gerätekonfigurationen für die Bildaufnahme mit synchronisierten Stimulationen und Lösungsaustausch. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 8
Abbildung 8: Beispielbilder, die die wichtigsten Schritte der Bildanalyse demonstrieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 9
Abbildung 9: ND6 hebt synaptische Vesikel hervor, die an präsynaptischen Enden gebündelt sind. (A) Beispielbilder FM4-64 (rot) und ND6 (grün) beim Co-Laden bei hoher Vergrößerung. Maßstabsbalken = 30 μm. (B) Streudiagramm der mittleren Fluoreszenzintensitäten von FM4-64 und ND6 bei gleichen ROIs, die synaptischen Boutons und linearer Regressionsanpassung entsprechen. r = 0,8353; p = 1,7 × 10-8; Sichtfelder N = 9; ROIs n = 450. Der Schwellenwert für FM4-64 liegt bei 1.200 Au (beliebige Einheit) und 160 Au für ND6. Diese Abbildung wurde von Thomas et al.20 modifiziert. Abkürzung: ROIs = Regions of Interest. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 10
Abbildung 10: ND6 interveniert nicht mit SVs. (A) ND6-repräsentierter SV-Umsatz (durch elektrischen Stimulus) nach 1 oder 10 μM ND6-Belastung. (B) FM4-64-gemessener SV-Umsatz (mit dem elektrischen Stimulus). Diese Abbildung wurde von Thomas et al.20 modifiziert. Abkürzung: SVs = synaptische Vesikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 11
Abbildung 11: Cholesterinsenkung beeinträchtigt den SV-Umsatz. (A) ND6-repräsentierter SV-Umsatz unter 10 Hz, 120 s elektrischer Stimulus in Kontroll- und MβCD-behandelten Neuronen. (B) Bafilomycin A1 verhindert die Wiederansäuerung von recycelten SVs (d. h. keine ND6-Fluoreszenzerholung nach stimulationsinduzierter Abnahme) und klärt den Einfluss von MβCD auf die SV-Wiederauffüllung weiter auf. Diese Abbildung wurde von Thomas et al.20 modifiziert. Abkürzung: SV = synaptisches Vesikel; MβCD = Methyl-β-Cyclodextrin; BafA1 = Bafilomycin A1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Farbstoffe auf Lipidbasis wie 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanin (DiI) und 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyaninperchlorat (DiO) werden seit langem verwendet, um die Zellmorphologie zu veranschaulichen und zelluläre Prozesse wie die Axonprojektionen von Neuronen zu verfolgen. Styrylfarbstoffe wie FM1-43 wurden erfunden und erfolgreich zur Untersuchung der Exozytoseeingesetzt 34. Aufgrund ihrer geringen Membranaffinität markieren sie selektiv endozytierte Vesikel, wo sie eingeschlossen sind, während auf der Plasmamembran verbleibende Farbstoffe durch konstante Perfusion abgewaschen werden. Daher sind Styrolylfarbstoffe nicht für die kontinuierliche Überwachung des Vesikelrecyclings geeignet.

Die jüngste Erfindung des pH-empfindlichen GFP (d.h. pHluorin) ermöglichte es, das Vesikelrecycling wiederholt zu visualisieren, wenn es an ein vesikuläres Membranprotein wie VAMPII oder Synaptophysin35 getaggt wurde. Nach dem gleichen Prinzip ermöglicht die Markierung eines pH-empfindlichen Fluorophors an Lipidmoleküle die Verfolgung des Lipidmembranrecyclings während Zyklen der Exo-/Endozytose14. In diesem Fall ist ND6 als einzelne Lipideinheit einfacher herzustellen, einfacher anzuwenden, effizienter bei der Markierung von Lipidmembranen, weniger störend für Zellen, stabiler beim Verbleib in Zellmembranen und daher zuverlässiger für die Fluoreszenzbildgebung. Seine Membranabhängigkeit und inverse pH-Empfindlichkeit ermöglichen eine hellere Färbung von sauren Organellen wie SVs und Endosomen.

Darüber hinaus ist es auch möglich, solche sauren Organellen oder präsynaptischen Endungen in Geweben wie Hippocampusschnitten zu markieren, da unspezifisch verteiltes ND6 durch neutralen pH-Wert in extrazellulären oder zytosolischen Räumen abgeschreckt wird. Darüber hinaus ist ND6 aufgrund seiner großen Stokes-Verschiebung ideal für die Multiphotonen-Bildgebung von tiefen Geweben. Daher ermöglichen ND6 und andere pH-empfindliche Fluorophore auf Lipidbasis die optische Echtzeitmessung des Lipid- und Zellmembrantransports zwischen der Plasmamembran und intrazellulären Apparaten wie SVs und Endosomen für mehrere Runden der Exo-/Endozytose. Angesichts der Tatsache, dass Synapsen und SVs für die Neurotransmission von entscheidender Bedeutung sind, ist ND6 zweifellos nützlich für die Untersuchung der synaptischen Physiologie.

Aufgrund des modularen Aufbaus dieser Lipidanaloga ist es möglich, ND in verschiedenen Arten von Zellmembranen oder Organellen an andere Lipide wie Phospholipide und Sphingolipide zu konjugieren. Darüber hinaus können die ND-Gruppen durch andere umweltempfindliche Fluorophore ersetzt werden, um andere Umweltfaktoren wie Kalzium- oder Zinkkonzentration innerhalb oder außerhalb von Zellen oder Organellen zu erkennen. Darüber hinaus können Fluorophore mit unterschiedlichen Emissionsspektren mit Membranlipiden verknüpft werden, um die Palette der Lipidreporter zu erweitern. Für all diese Modifikationen kann der Linker zwischen Lipiden und ND oder anderen fluoreszierenden Gruppen angepasst werden, um bessere Photoeigenschaften und/oder gewünschte Empfindlichkeiten zu erreichen.

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von ND6 bei der Visualisierung des SV-Umsatzes mithilfe von Lebendzell-Imaging. Zu den kritischen Schritten gehören das Laden, synchronisierte Stimulationen und die Fluoreszenzquantifizierung, die alle die Qualität der Ergebnisse erheblich beeinflussen. Darüber hinaus können die in diesen Schritten verwendeten Parameter/Einstellungen entsprechend den Anforderungen der Studie geändert werden. Beispielsweise kann die Stimulation während der Belastung angepasst werden (kürzere oder längere Dauer), um den Zugriff auf verschiedene Pools von SVs (Pools mit hoher bzw. niedriger freisetzbarer Wahrscheinlichkeit) zu ermöglichen. Für die Fluoreszenzbildgebung lebender Zellen ist es wichtig, ein Gleichgewicht zwischen Zellgesundheit und Fluoreszenzintensität zu finden, was hier besonders wichtig ist. Dies liegt daran, dass die Anregung für ND6 nahe im UV-Bereich (d. h. 405 nm) liegt, was mehr Phototoxizität und Farbstoffabbau verursachen kann als sichtbares Licht. Daher ist es wichtig, die Anregungsleistung, die Belichtungszeit, die Bildrate und die Bilddauer anzupassen, um Lichtschäden zu minimieren und die Signalqualität zu maximieren.

ND6 ist eine sehr interessante Sonde. Seine große Stokes-Verschiebung ermöglichte es, es gleichzeitig mit anderen Membranfarbstoffen wie FM4-6420 zu verwenden. Noch wichtiger ist, dass es ein geeigneter Donorkandidat für den Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) ist und durch violettes Licht angeregt werden kann, das den FRET-Empfänger viel weniger wahrscheinlich miterregt. Lipid-imitierende Farbstoffe wie ND6 ermöglichen es, die Wechselwirkungen zwischen Membranproteinen und Lipiden während der Exo-/Endozytose zu untersuchen. Die pH-abhängige Assoziation und Dissoziation zwischen Membranproteinen und Lipiden wird im sauren Lumen von SVs oder Endosomen verstärkt, was die Erforschung der Rolle von Membranlipiden bei der Rezeptor-vermittelten Endozytose und Sortierung erleichtert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ND6 und seine Derivate den Werkzeugkasten für die Untersuchung von Membranlipiden und deren Transport in lebenden Zellen erheblich erweitern können.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch das Florida Atlantic University Office of Undergraduate Research and Inquiry Grant (M.J.S.), das Florida Department of Health Ed and Ethel Moore Pilot Grant 20A17 (Q.Z.), das Alzheimer's Association Grant AARG-NTF-19-618710 (Q.Z.) und das NIA R21 Grant AG061656-01A1 (Q.Z.) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digidata 1440A Data Acquistion System Molecular Devices Digidata 1440A For synchronized stimulation and solution exchange
Dual Channel Temperature Controller Warner Instruments TC-344B For live-cell imaging
Fetal Bovine Serum OMEGA Scientific FB-01 For making H+20 solution used in dissection and tissue culture
Hamamatsu Flash4.0 sCOMS camera Hamamatsu Inc. C13440-20CU high-sensitivity camera
Hank's Balanced Salt Solution Sigma H6648 For making H+20 solution used in dissection and tissue culture
Heated Platform Warner Instruments PH-1 For live-cell imaging
Matrigel BD Biosciences 354234 For tissue culture
Micro-G Vibration Isolation Table TMC 63-564 For live-cell imaging
Micro-manager https://micro-manager.org/ NA For image acquisition control
Multi-Line In-Line Solution Heater Warner Instruments SHM-6 For live-cell imaging
Neurobasal Plus Medium THermoFisher Scientific A3582901 For tissue culture
Nikon Ti-E Inverted Microscope Nikon Ti-E/B For live-cell imaging
ORCA-Flash4.0 Digital CMOS camera Hamamatsu C1340-20CU For live-cell imaging
Perfusion Chamber Warner Instruments RC-26G For live-cell imaging
Six-Channel Valve Control Perfusion System Warner Instruments VC-6 For solution exchange
Square Pulse Stimulator Grass Instrument SD9 For electric field stimulation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Polo, S., Pece, S., Di Fiore, P. P. Endocytosis and cancer. Current Opinion in Cell Biology. 16 (2), 156-161 (2004).
  2. Eckert, G. P., Wood, W. G., Muller, W. E. Lipid membranes and beta-amyloid: a harmful connection. Current Protein and Pept Science. 11 (5), 319-325 (2010).
  3. Augustine, G. J., Burns, M. E., DeBello, W. M., Pettit, D. L., Schweizer, F. E. Exocytosis: proteins and perturbations. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 36, 659-701 (1996).
  4. Ammar, M. R., Kassas, N., Chasserot-Golaz, S., Bader, M. F., Vitale, N. Lipids in regulated exocytosis: what are they doing. Frontiers in Endocrinology. 4, 125 (2013).
  5. Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112 (4), 519-533 (2003).
  6. Chabanon, M., Stachowiak, J. C., Rangamani, P. Systems biology of cellular membranes: a convergence with biophysics. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 9 (5), 1386 (2017).
  7. Prosser, D. C., Wrasman, K., Woodard, T. K., O'Donnell, A. F., Wendland, B. Applications of pHluorin for quantitative, kinetic and high-throughput analysis of endocytosis in budding yeast. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54587 (2016).
  8. Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nature Protocols. 1 (6), 2970-2978 (2006).
  9. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  10. Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  11. Demchenko, A. P., Mély, Y., Duportail, G., Klymchenko, A. S. Monitoring biophysical properties of lipid membranes by environment-sensitive fluorescent probes. Biophysical Journal. 96 (9), 3461-3470 (2009).
  12. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 77-83 (2012).
  13. Gaus, K., Zech, T., Harder, T. Visualizing membrane microdomains by Laurdan 2-photon microscopy. Molecular Membrane Biology. 23 (1), 41-48 (2006).
  14. Kahms, M., Klingauf, J. Novel pH-sensitive lipid based exo-endocytosis tracers reveal fast intermixing of synaptic vesicle pools. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 18 (2018).
  15. Zhou, L., Xie, L., Liu, C., Xiao, Y. New trends of molecular probes based on the fluorophore 4-amino-1,8-naphthalimide. Chinese Chemical Letters. 30 (10), 1799-1808 (2019).
  16. Tomczyk, M. D., Walczak, K. Z. l,8-Naphthalimide based DNA intercalators and anticancer agents. A systematic review from 2007 to 2017. European Journal of Medicinal Chemistry. 159, 393-422 (2018).
  17. Ulla, H., et al. Blue emitting 1,8-naphthalimides with electron transport properties for organic light emitting diode applications. Journal of Molecular Structure. 1143 (5), 344-354 (2017).
  18. Duke, R. M., Veale, E. B., Pfeffer, F. M., Kruger, P. E., Gunnlaugsson, T. Colorimetric and fluorescent anion sensors: An overview of recent developments in the use of 1,8-naphthalimide-based chemosensors. Chemical Society Reviews. 39 (10), 3936-3953 (2010).
  19. Panja, S. K., Dwivedi, N., Saha, S. Tuning the intramolecular charge transfer (ICT) process in push-pull systems: Effect of nitro groups. RSC Advances. 6 (107), 105786-105794 (2016).
  20. Thomas, D., et al. Solvatochromic and pH-sensitive fluorescent membrane probes for imaging of live cells. ACS Chemical Neuroscience. 12 (4), 719-734 (2021).
  21. Leslie, K. G., Jacquemin, D., New, E. J., Jolliffe, K. A. Expanding the breadth of 4-amino-1,8-naphthalimide photophysical properties through substitution of the naphthalimide core. Chemistry - A European Journal. 24 (21), 5569-5573 (2018).
  22. Liu, G. S., Tsien, R. W. Properties of synaptic transmission at single hippocampal synaptic boutons. Nature. 375 (6530), 404-408 (1995).
  23. Zhang, Q., Cao, Y. -Q., Tsien, R. W. Quantum dots provide an optical signal specific to full collapse fusion of synaptic vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 104 (45), 17843-17848 (2007).
  24. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  27. Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle. Annual Review of Neuroscience. 27, 509-547 (2004).
  28. Lazarenko, R. M., DelBove, C. E., Strothman, C. E., Zhang, Q. Ammonium chloride alters neuronal excitability and synaptic vesicle release. Scientific Reports. 7 (1), 5061 (2017).
  29. Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344 (6187), 1023-1028 (2014).
  30. Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nature Reviews. Neuroscience. 6 (1), 57-69 (2005).
  31. DelBove, C. E., et al. Reciprocal modulation between amyloid precursor protein and synaptic membrane cholesterol revealed by live cell imaging. Neurobiology of Disease. 127, 449-461 (2019).
  32. Dason, J. S., Smith, A. J., Marin, L., Charlton, M. P. Vesicular sterols are essential for synaptic vesicle cycling. Journal of Neuroscience. 30 (47), 15856-15865 (2010).
  33. Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms. Journal of Neuroscience. 39 (42), 8209-8216 (2019).
  34. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200 (1992).
  35. Afuwape, O. A., Kavalali, E. T. Imaging synaptic vesicle exocytosis-endocytosis with pH-sensitive fluorescent proteins. Methods in Molecular Biology. 1474, 187-200 (2016).

Tags

Membranlipidumsatz PH-sensitives fluoreszierendes Lipidanalogon ND6Exo-/Endozytose Biomolekülaustausch spezialisierte Zellen Insulinsekretion Neurotransmitterfreisetzung Exo-/Endozytoseforschung Gen- und Proteinebene Membranlipidrecycling Plasmamembran sekretorische Vesikel Lipidverteilung intrazelluläre Membrankompartimente Lipidumsatzrate biologische Forschungsgebiete
Messung des Membranlipidumsatzes mit dem pH-empfindlichen Fluoreszenz-Lipid-Analogon ND6
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alamgir, S., Pelletier, O. B.,… More

Alamgir, S., Pelletier, O. B., Thomas, D., Rubio, V., Stawikowski, M. J., Zhang, Q. Measuring Membrane Lipid Turnover with the pH-sensitive Fluorescent Lipid Analog ND6. J. Vis. Exp. (173), e62717, doi:10.3791/62717 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter