Summary
We presenteren een microfluïdische Cancer-on-chip-model, de "Evolution Accelerator"-technologie, die een controleerbaar platform biedt voor langdurige realtime kwantitatieve studies van kanker dynamiek binnen goed gedefinieerde omgevingscondities op de eencellige Niveau. Deze technologie wordt verwacht te werken als een in vitro model voor fundamenteel onderzoek of pre-klinische ontwikkeling van de drug.
Abstract
Conventionele celcultuur blijft het meest gebruikte preklinische model, ondanks het bewezen beperkte vermogen om klinische resultaten bij kanker te voorspellen. Microfluïdische kanker-op-chip-modellen zijn voorgesteld om de kloof tussen de oververeenvoudigde conventionele 2D-culturen en meer gecompliceerde diermodellen te overbruggen, die een beperkt vermogen hebben om betrouwbare en reproduceerbaar kwantitatieve resultaten te produceren. Hier presenteren we een microfluïdische Cancer-on-chip-model dat belangrijke componenten van een complexe tumor micro-omgeving op een uitgebreide manier reproduceert, maar is eenvoudig genoeg om robuuste kwantitatieve beschrijvingen van de kanker dynamiek te bieden. Deze microfluïdische kanker-op-chip model, de "Evolution Accelerator," breekt een grote populatie van kankercellen in een onderling verbonden array van tumor micro-omgevingen terwijl het genereren van een heterogene chemotherapeutische stress landschap. De progressie en de evolutionaire dynamiek van kanker in reactie op de gradiënt van de drug kunnen weken in real time worden gemonitord, en talrijke downstreamexperimenten kunnen aanvullend worden uitgevoerd op de timelapse-beelden die door de loop van de experimenten zijn genomen.
Introduction
Kanker wordt steeds meer erkend als een complex ecosysteem dat niet alleen afhangt van de aanhoudende disregulatie van gemuleerde celpopulaties, maar ook van vitale interacties tussen kankercellen en de host-micro omgeving. In deze zin evolueert kanker op een adaptief landschap dat zich manifesteert door een combinatie van factoren, waaronder een heterogene tumor micro omgeving en overspraak met een verscheidenheid aan gastcellen, die allemaal selectieve druk leveren voor verdere genetische of epigenetische veranderingen1,2,3. In de context van solide tumoren draagt een ongelijke verdeling van chemotherapeutica en andere middelen gradiënten bij aan hun moleculaire heterogeniteit en kan een rol spelen bij de ontwikkeling van de resistentie tegen geneesmiddelen, verhoogde angiogenese tot bepaalde tumor subpopulaties, en zelfs metastase4,5,6. Conventionele in vitro 2D celkweek studies, terwijl het bezitten van grootschalige, handige experimentele capaciteit, biedt mean-veld, uniforme en vaste voorwaarden, vaak ontbreekt de precieze ruimtelijke en temporele milieucontrole nodig om echt emuleren in vivo tumor dynamiek. Er is dus behoefte aan meer representatieve ex vivo-modellen om de tumor micro te reproduceren voorafgaand aan diermodellen in de pijplijn ontwikkeling van de geneesmiddelen, zodat een betere voorspelling van kanker progressie en reacties op drugs binnen dynamische stress Landschappen. Microfluïdica is voorgesteld om de kloof tussen 2D celkweek studies en meer complexe in vivo dierstudies die mogelijk niet in staat zijn om controleerbaar kwantitatieve studies7,8,9te overbruggen.
Een ideaal in vitro systeem om de celdynamiek van kanker te karakteriseren, moet de mogelijkheid bezitten om een heterogene micro omgeving te genereren om de adaptieve cellulaire reacties die kunnen plaatsvinden in een tumor na te bootsen, en om de observatie van deze dynamiek op een resolutie met één cel. In dit artikel beschrijven we een microfluïdisch celcultuurplatform, een PDMS-gebaseerd apparaat dat de "Evolution Accelerator" (EA) wordt genoemd, dat parallelle in vitro studies van kanker celdynamica op cellulaire resolutie mogelijk maakt met real-time data-acquisitie over de loop van weken, terwijl stabiel hellingen van stress in het cultuurlandschap behouden blijft. Het ontwerp van dit platform is gebaseerd op ons vorige werk, waarin de evolutionaire dynamiek van organismen in een metaopulatie kan worden versneld10,11. Specifiek, in een groep van ruimtelijk gescheiden populaties die op een bepaald niveau interageren, bij blootstelling aan een heterogeen stress landschap, kunnen de meest geschikte soorten sneller domineren in een lokale populatie in vergelijking met die van een grote uniforme populatie. De voordelige soorten migreren vervolgens naar naburige micro habitats op zoek naar middelen en ruimte, en domineren uiteindelijk de hele bevolking. Zoals weergegeven in Figuur 1, is het patroon van de microfluïdische EA-chip samengesteld uit (i) een paar serpentine kanalen die nieuwe media circulatie bieden en vaste grenswaarden voor chemische diffusie construeren, en (II) het zeshoekige celkweek gebied dat bestaat uit 109 verbonden zeshoekige en 24 half-zeshoekige kamers in het midden, die lijken op een honingraatstructuur. De chip is 100 μm diep. Media kanalen en celcultuurregio zijn verbonden met kleine spleten (ongeveer 15 μm breed), die directe mediastroom en de resulterende shear stress in het celkweek gebied voorkomen, maar toch chemicaliën kunnen verspreiden door kleine spleten en voedingsstoffen uitwisselen, metabole afvalstoffen, enz. De aanmaak van chemische gradiënten wordt aangetoond in Figuur 1B, waarbij één media kanaal 0,1 mm fluoresceïne bevat, terwijl het andere kanaal vrij is van fluoresceïne. Cellen worden gekweekt op een gasdoorlatbaar membraan, ingekapseld door de microstructuren door de positieve rugdruk op het membraan tegen de chip. De componenten van de Apparaathouder worden geïllustreerd in Figuur 2, en de experimentele opstelling wordt geïllustreerd in Figuur 3, waar de cultuur wordt gehandhaafd op een omgekeerde Microscoop bij 37 °c, met boven 85% relatieve vochtigheid, en geconditioneerd onder normoxia-gassamenstelling.
Dit systeem biedt gedetailleerde observatie van gelokaliseerde cellulaire interacties via brightfield en fluorescerende kanalen en zorgt voor ruimtelijk opgeloste downstream testen zoals immunofluorescentie, Western Blot of massaspectrometrie. We hebben eerder gedemonstreerd als een proof-of-principe van deze microfluïdische kanker-op-chip model op de lange termijn co-cultuur van epitheliale en mesenchymale PC3 prostaatkanker cellen12 evenals de opkomst van de drug-resistentie polyploïde reus kankercellen met behulp van de epitheliale PC3 cellijn13. Terwijl we de toepassing van dit platform om te begrijpen van de spatiotemporele dynamiek van epitheliale PC3 en mesenchymale prostaatkanker cellen onder een spannings gradiënt van docetaxel presenteren, kan het microfluïdische systeem gemakkelijk worden toegepast op elke combinatie van cellijnen en middelen (d.w.z. drugs, nutriënten, zuurstof) gradiënten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fabricage van microfluïdisch apparaat
- Genereer het gewenste microfluïdische patroon met behulp van een lay-outontwerpsoftware (Zie aanvullende materialen).
- Fabriceren van de photomask. Zie de tabel met materialen voor meer informatie.
- Met behulp van een Laser schrijver, schrijf het patroon op een soda-kalk glasplaat gecoat met 100 nm CR en 500 nm van fotoresist AZ1518.
- Ontwikkel de fotoresist met Developer AZ300MIF voor 60 s.
- Etch de chroom zonder bescherming van de fotoresist met behulp van CR-7 chroom Etchant.
- Strip rest fotoresist met behulp van een fotoresist stripper bij 70 °c gedurende 45 min.
- Patroon van de photoresist. Zie de tabel met materialen voor meer informatie.
- Spin Coat HMDS op silicium wafer bij 4000 rpm voor 40 s.
- Spin Coat fotoresist AZ4330 op silicium wafer bij 4000 rpm voor 40 s.
- Zacht bakken van de silicium wafer bij 95 °C voor 60 s.
- Gebruik de mask aligner om UV bloot te stellen aan de silicium wafer.
- Ontwikkel de fotoresist met Developer AZ300MIF voor 4 min.
- Voer DRIE etsen uit. Zie de tabel met materialen voor meer informatie.
- Dry-etch de wafer patroon met de fotoresist met behulp van een silicium diep reactieve Ion etsen (drie) systeem voor 100 μm diepte.
- Strip de fotoresist af met aceton en plasma etch met een plasma etcher.
- Wafer oxidatie en silanisatie. Zie de tabel met materialen voor meer informatie.
- Voer thermische oxidatie uit op de geëtste silicium wafer in een oven bij 1100 °C gedurende 1 uur.
- Wacht tot de silicium wafer afkoelen en plaats de wafer in een exsiccator met een paar druppels trichloro-1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl-silaan (PFOTS) die in een kleine container in de buurt van de wafer zijn druipt.
- Pomp de druk van de exsiccator tot 0,5 ATM bij kamertemperatuur gedurende 60 min. De silicium wafer mal moet hydrofoob worden na de juiste silanisatie, die kan worden getest door het toevoegen van verschillende druppels water op de wafer.
- Zachte lithografie. Zie de tabel met materialen voor meer informatie.
- Meng pre-polymeer en cross-linker (van polymethylsiloxaan (PDMS) Kit) bij een 10:1 per gewichtsverhouding.
- Giet de gemengde pdm's om een 10 mm film in hoogte te maken op de gesilaneerde glaswol Silicon wafer Mold.
- Degas het resulterende PDMS-silicium wafer systeem in een exsiccator gedurende 30 min tot 1 uur.
- Incuberen de PDMS-silicium wafer in een incubator van 70 °C 's nachts om de PDM'S te genezen.
- Pel de PDMS-film, zodra de PDMS is genezen, voorzichtig van de silicium wafer.
- Met behulp van biopsie naalden, Punch door-gaten bij de inlaat poorten op basis van de locatie van het patroon op de PDMS en gebruik maken van een circulaire punch te snijden chips 27 mm in diameter.
- PDMS laag binding.
- Warmte genezing twee stapels van 27 mm PDMS cilinders (zonder patroon), die zal worden de reservoir laag en de capping laag van het apparaat.
- Knip twee cirkels van 7 mm rond de inhammen op de reservoir laag en gebruik een biopsie naald om door gaten te perforeren bij de inlaat poorten op de aftop slaag.
- BIND drie stapels PDM'S (gedessineerde stapel, reservoir laag, capping Layer) met zuurstof plasma behandeling.
- Met de biopsie naald, Punch door-gaten bij de uitgangen en de middelste poort van het apparaat.
2. voorbereiding van media en cellijn
- Voorbereiden van media voor het kweken van PC3 cellijnen, met inbegrip van PC3-EMT en PC3-EPI: Meng RPMI 1640 medium met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1x antibioticum-antimycotic. Genereer cellijnen zoals eerder beschreven14.
Opmerking: PC3 cellijnen worden gehandhaafd in de bovenstaande media in bevoficeerde incubatoren bij 37 ° c met 5% Co2. Splits cellen en subcultuur elke 3 dagen, voordat ze 100% confluency bereiken. - Transfect cellijnen met cytoplasmatische-gelabelde fluorescerende markers voor betere visualisatie, zoals eerder beschreven12, zodanig dat PC3-EMT spreekt cytoplasmatische GFP en PC3-epi drukt cytoplasmatische mcherry. Merk op dat de technologie ook compatibel is met fluorescerende gelabelde cellen en brightfield Imaging van niet-gelabelde cellen.
3. experimentele opstelling
- Fabricage van metalen plaathouder
- Fabriceren van een plaathouder die voldoende is om gelijktijdig gas-permeabele cultuur gerechten voor parallelle experimenten te houden door verspanen of 3D-printen. Het 3D CAD-bestand ("3-well plate. FCStd ) u vinden op GitHub als referentie (https://github.com/kechihl/3-well-plate).
- Schroef de componenten van de houder (Figuur 2) met een schroevendraaier los. Desinfecteer de componenten via UV-blootstelling gedurende ten minste 1 uur en laat in een steriele omgeving.
Opmerking: de houder is ontworpen om aanzienlijke voorwaarden te bieden voor thermisch evenwicht en ideale gassamenstellingen, met gaskanaal inlaten die de luchtstroom mogelijk maken. Meer informatie is te vinden in ons vorige werk12. - Bereid tot drie gasdoorlatbare cultuur gerechten, waarvan het celkweek membraan relatief flexibel is.
- Cellijn zaaien
- 24 uur voor aanvang van het experiment, oogst PC3-EPI en PC3-EMT cellen door trypsinisatie voor 5 min. Voeg voorverwarmde kweekmedia toe, vervolgens Centrifugeer bij 150 x g gedurende 3 minuten en gooi het supernatant weg.
- Tel cellen van elke PC3-EPI en PC3-EMT met behulp van een hemocytometer en isoleren van een totaal van 2,5 x 104 van elk celtype voor elk gas-permeable cultuur gerecht.
- Meng en respendeer de twee celtypen in 2 mL cultuur media en zaai de cellen in elk van de gasdoorlatbare kweek schaal.
- Laat de hele plaathouder 's nachts in de incubator staan om de cellen te bevestigen.
- Desinfecteer de PDMS-apparaten via UV-blootstelling gedurende ten minste 1 uur en laat in een steriele omgeving.
- Thermische controle-eenheid en gastoevoersysteem instellen
- Zoals weergegeven in Figuur 3, stelt u een gastoevoersysteem in dat bestaat uit zowel co2 -als O2 -regeleenheden, een gaspomp, een gasmengkamer, een luchtbevochtiger of een bubbler, en drie afzonderlijke sets van gaskleppen en Drukmeters. Meer informatie is te vinden in ons vorige werk12.
- Stel de CO2 -en O2 -controle-eenheden zodanig in dat ze de mengsnelheid van het gas van de co2 -en N2 -tanks en de O2 -bron aanpassen. Als alternatief zou een gastoevoersysteem dat gas biedt onder normoxia-toestand zou werken.
- Zorg ervoor dat het gas dat in de mengkamer wordt gecombineerd en bevochtigd door een bubbler zodanig dat de relatieve vochtigheid wordt verhoogd tot 85% (zoals afgelezen van een relatieve vochtigheids monitor) en dat het gas leidt tot drie onafhankelijke gaskleppen met Drukmeters om Controleer en bewaak de gasstroom in de plaathouder.
- Plaats de volledige plaathouder in een on-stage incubatie thermische regeleenheid met aparte verwarmings subeenheden voor de deksel en de bodemplaat, met alle eenheden ingesteld op 37 °C. Zie de tabel met materialen voor meer informatie.
- Installatie van microfluïdisch apparaat. Zie de tabel met materialen voor meer informatie.
- Vaststellen dat de gedetailleerde componenten van de 3-goed-plaathouder in orde zijn, zoals in Figuur 2. Elk van de drie putten zijn identiek en onafhankelijk, met een paar gaskanalen voor elke put. Elke put bezit een gas-permeable cultuur schotel houder, een PDMS chip houder, een glazen raamhouder, en een paar 35 mm glasramen. Deze componenten kunnen worden geassembleerd met behulp van de gemonteerde schroeven.
Let op: de glazen ramen zorgen ervoor dat er een thermisch geïsoleerde ruimte is tussen de gasdoorlatbare kweek membraan en de put zodanig dat er geen watercondensatie optreedt als gevolg van temperatuurverschillen op de interface. Merk op dat de 3 putten onafhankelijk zijn, en 3 experimenten afzonderlijk kunnen worden gedaan. - Pre-warm kweekmedium bij 37 °C en Degas in een vacuümkamer gedurende 20 min.
- Behandel de chips van de PDMS met behulp van een zuurstof plasma systeem voor 30 s om de hydrofiliciteit te behouden.
- Stel het spuitsysteem in. Laad twee spuiten langzaam met groeimedia en andere twee spuiten met gewenste reagens van belang (media, media met drug, enz.). Verbind elke afzonderlijke spuit met een 50 cm slang (0,020 "x 0.060" OD) door een 23 G doseernaald in één holle stalen pen. Steek een holle stalen pin in het andere uiteinde van de slang.
- Prime de slang en steek de stalen pin in elke PDMS chip door de capping laag. Vul de reservoir laag en Bevochtig het patroon van de PDMS patroon laag met media. De reservoir-laag werkt als een on-chip Bubble-Trap om te voorkomen dat luchtbellen in het microfluïdische patroon geraken.
- Laad een spuit van 1 mL met kweekmedia. Sluit de spuit aan op een 5 cm slang (0,020 "x 0.060" OD) door een 23 G doseernaald in één holle stalen pen. Steek een holle stalen pin in het andere uiteinde van de slang en maak de slang priem.
- Steek de holle stalen pin in het midden gat van de chip, waar overmatige media kunnen worden geëxtraheerd uit de chip later tijdens het chip Seal proces.
- Omdat elk PDMS-apparaat 4 10 mL-spuiten op een spuitpomp moet laden, laadt u 2 10 mL spuiten per chip in het voorwaartse dek. Plaats de twee andere spuiten in het opname deck van het spuitsysteem.
- Plaats de chip direct bovenop de gasdoorlatbare kweek membranen (met cellen die al aan de membranen zijn gehecht). Om te voorkomen dat het verankeren van micro bubbels in het microfluïdische patroon, Doseer 1 mL voorverwarmde en ontgast media in de gasdoorlatende kweek schaal van 35 mm vóór de assemblage, en zorg ervoor dat de chip het vloeistofoppervlak benadert met een Kantelhoek van 15 graden.
- Klem de gasdoorlatbare kweek schaal en de put in de gasdoorlatbare kweek schotel houder voor elke chip, met de PDMS-chip houder die het PDMS-apparaat naar beneden duwt.
- Plak een vel van een sealer bovenop het PDMS-apparaat en klem met de PDMS-chip houder om te voorkomen dat de chip uitdroogt.
- Stel het Media debiet rond de array in op 20 μL/h.
- Stel de hele plaat in de on-stage incubator op de gemotoriseerde fase van een omgekeerde Microscoop. Sluit het gastoevoersysteem aan op de gaskanalen en druk het gas-permeabele cultuur membraan tegen de geïnstalleerde PDMS-chip aan om de afdichting van het apparaat te garanderen. Houd de meter druk bij 0,2 psi (1,4 x 104 PA).
- Extract langzaam overmatige media in de chip met behulp van de 1-mL spuit uit het middengat. Observeer de chip onder de Microscoop tijdens het uitpakken van media en Stop vervolgens met uitpakken wanneer de chip is verzegeld. Spaan afdichting moet duidelijk zijn, omdat een deel van de cellen door de micro-structuren zou worden verpletterd.
- Sluit de temperatuursensor van de on-stage incubator aan op de 3-well plaat en stel deze in op 37 °C.
- Vaststellen dat de gedetailleerde componenten van de 3-goed-plaathouder in orde zijn, zoals in Figuur 2. Elk van de drie putten zijn identiek en onafhankelijk, met een paar gaskanalen voor elke put. Elke put bezit een gas-permeable cultuur schotel houder, een PDMS chip houder, een glazen raamhouder, en een paar 35 mm glasramen. Deze componenten kunnen worden geassembleerd met behulp van de gemonteerde schroeven.
4. timelapse-beeldvorming met één cel
- Stel imaging software in met behulp van een omgekeerde Microscoop voor time-lapse-beeld verwerving. Merk op dat een omgekeerde fluorescerende Microscoop met volledig gemotoriseerde x-y stage, focus knop, sluiter en filter kubussen vereist is voor een EA-experiment.
- Configureer software voor het verkrijgen van afbeeldingen over twee kanalen met een 10x vergroting voor elke chip met automatische beeld stiksels na één ronde autofocus. Houd er rekening mee dat automatische correctie systemen zoals perfect focus geen bevredigende beeldkwaliteit garanderen. Het is meer aanbevolen voor het genereren van een aangepaste focus oppervlak voor lange termijn beeld verwerving op basis van ofwel autofocus of handmatige focus over de chip.
- Maak elk uur beelden en laat het experiment draaien op de tijdschaal van weken. Bewaak de beeldkwaliteit dagelijks en werk indien nodig het scherpstel oppervlak bij.
- Bereid de PDMS-chip en de gasdoorlatbare kweek schaal voor op daaropvolgende immunofluorescentie analyse, zoals eerder beschreven13.
5. beeldverwerking en-analyse
- Post-experimentele verwerking
- Converteer afbeeldingen naar TIFF-formaat voorbeeld verwerking en metingen met behulp van Fiji/ImageJ.
- Comprimeer TIFF-bestanden voor eenvoudige verdere beeldverwerking.
- Fiji/ImageJ-analyse
- Om cellen te identificeren, achtergrond aftrekken en deeltjes analyse uit te voeren om fluorescerende heldere vlekken te identificeren voor detectie van de cellocatie en automatische celtelling.
- Gebruik plugins (handmatige tracking, chemotaxis, migratie tool, Trackmate) om celmotiliteit en migratie te analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Validatie van optimale celgroei op chip
Een belangrijk doel van het experiment platform is het reproduceren van belangrijke componenten en interacties in een complexe tumor micro omgeving op een uitgebreide manier, maar toch eenvoudig genoeg om kwantitatieve, betrouwbare en reproduceerbaar gegevens te leveren. Dit doel kan alleen worden bereikt als we de volledige controle hebben over de fysische en biochemische omgevingsfactoren. We moeten de ongewenste factoren uitsluiten of een manier uitzoeken om de oncontroleerbare factoren in het kwantitatieve model op te nemen om het bevolkings gedrag correct te interpreteren.
De eerste test is om een optimale celgroei op het apparaat te garanderen. Het celproliferatie percentage op het apparaat moet identiek zijn aan of vergelijkbaar zijn met hun groeiprofiel in de conventionele celcultuur. Als een bewijs van principe, menselijke prostaatkanker cellijn PC3 cellen werden gekweekt in de PDMS chip zonder de aanwezigheid van externe stress. Deze cellen waren fluorescerend-gelabeld in het cytoplasma, zodat we konden observeren en kwantificeren van de populatie van cellen met behulp van omgekeerde fluorescerende microscopie. Cellen samenvloeiing, gedefinieerd als het gebied dat door cellen bedekt, werd gemeten bij elke micro habitat op verschillende tijdframes gegeven een geselecteerde intensiteits drempel op de fluorescerende afbeeldingen met behulp van Fiji15. De groeicurven van cellen op elke gekozen positie worden uitgezet in Figuur 4. De gekozen posities zijn verspreid over de chip, van de regio in de buurt van de Apex van de media-instroom tot de Apex dicht bij de media.
De groeicurves in Figuur 4B zijn goed uitgelijnd en suggereren de identicaliteit van het celproliferatie profiel als een functie van positie over de chip. De aanvankelijke helling van de curven onthult het proliferatie percentage. De verdubbelingstijd voor cellen in het apparaat is ongeveer 24 uur, zoals weergegeven in Figuur 4B van tijd 0 tot 24 uur, wat hetzelfde is als de verdubbelingstijd in conventioneel cultureware13. Daarom concluderen we dat zonder de aanwezigheid van een externe bron van stress, de fysische en biochemische factoren uniform worden verdeeld, wat leidt tot de homogene en geoptimaliseerde celgroei van tijd 50 tot 100 uur.
We beschouwden verder de mogelijkheid om de celdynamiek tussen subpopulaties in een micro-omgeving te kwantificeren. GFP-uitdrukken PC3-EMT en de mCherry-uitdrukken PC3-EPI cellijnen werden co-gekweekt in de EA zoals weergegeven in Figuur 5. Celsamen vloeiing, gedefinieerd als het percentage van het gebied dat door de cellen wordt bedekt, wordt gemeten als de indicatie van de grootte van de populatie. Vanaf 40% samenvloeiing groeide de co-cultuur binnen 3 dagen volledig Confluent Health. Interessant is dat we de progressie van elk fenotype in de micro omgeving kunnen observeren. Terwijl de groeicurve van totale samenvloeiing is in de vorm van logistieke groeimodel, de bevolking van PC3-EMT bleef uitbreiden en PC3-EPI werd onderdrukt in de asymptotische fase.
Demonstratie van de celmotiliteits test in een gemengde populatie
Celmotiliteit is een belangrijk fenotypisch gedrag. De beweeglijkheid verdeling van een populatie kan informatie verschaffen over de fysieke interactie van cellen, de mechanische eigenschappen van de lokale micro-omgeving, en kan soms worden geanalyseerd als een indicatie van epigenetische variatie van cellen. Gezien het feit dat ons verbeterde celcultuurplatform bijna continue beeldvorming toelaat, maximaliseert het voordeel van een fijne temporele resolutie het potentieel van het volgen van één cel in een heterogene populatie.
We gebruiken de plugin TrackMate16 in Fiji (http://Fiji.SC) met aangepaste macro om het Volg proces te implementeren en te automatiseren. TrackMate stelt de gebruiker in staat om een tracking algoritme te implementeren en aan te passen met behulp van een scripttaal uit de Fiji script editor. Het Volg proces is onderverdeeld in een reeks stappen: de segmentatie-, filtering-en deeltjeskoppelende processen.
Zoals weergegeven in Figuur 6B, hebben we een "wond genezings test" uitgevoerd als demonstratie om celcollectieve migratie en celcelinteractie te bestuderen. PC3-EPI en PC3-EMT cellen werden dicht geseeid in het midden van het apparaat en mochten vrijelijk migreren naar lege regio. Het genormaliseerde histogram van de snelheid van beide fenotypes wordt uitgezet in Figuur 6C. De snelheid van PC3-EMT was significant hoger dan PC3-EPI door een factor van 1.8 x, die consistent is met het feit dat het mesenchymale fenotype fungeert als een onderdeel van cutane wondgenezing met uitzonderlijk vermogen om te migreren in tegenstelling tot de relatief stationaire epitheliale fenotype.
Verder, om de progressie van de celmotiliteit in een stressvrije omgeving te observeren, hebben we een lange-termijn co-cultuur van PC3-epi en PC3-EMT uitgevoerd met uniforme initiële zaaien dichtheid en bijgehouden de verdeling van de celsnelheid variërend met de tijd. Zoals getoond in Figuur 7A, B, na 6 dagen van de cultuur, als cellen bereikte hogere samenvloeiing, de verdelingen van de celsnelheid voor beide fenotypes die naar de linker staarten.
We kunnen de verhouding van het aantal PC3-EPI naar PC3-EMT in elk klasse-interval vergelijken. Zoals weergegeven in Figuur 7C, ongeacht de dagen van de cultuur of dichtheid van cellen, pc3-EMT gedomineerd de High-Speed regio terwijl PC3-epi bezet de lage snelheid zone. Hoewel de algehele snelheid aanzienlijk daalde voor beide fenotypes, bleef PC3-EMT motiel en werd minder beïnvloed door de verdruk van de micro omgeving zoals weergegeven in Figuur 7D. De gemiddelde snelheid van PC3-EPI daalde rond 40% terwijl die van PC3-EMT alleen gedaald 14%.
Er zijn verschillende factoren die van invloed kunnen zijn op de verdeling van de celsnelheid en de gemiddelde snelheid, zoals de vervechtheid van de bevolking. Continue celtracking en monitoring over alle subpopulatie is essentieel om de progressie van fenotypische gedrag te begrijpen. Als we bijvoorbeeld het niveau van de mesenchymale status van een niet-gelabelde subpopulatie willen kwantificeren, zou het meer informatief zijn om niet alleen de verdeling van de fysieke hoeveelheid (bijv. Velocity) van de geïnteresseerde subpopulatie te verwerven als een functie van tijd, maar ook die van de rest van de bestaande subpopulatie van cellen.
Figuur 1: de spuitpomp-aangedreven microfluïdische EA-chip. A) het microfluïdisch apparaat heeft twee afzonderlijke middelgrote inlaten, twee uitgangen en één centrale poort voor het zaaien of onttrekken van cellen aan een overmatig medium. Merk op dat tussen de medium inlaten en de celkweek arrays, een paar serpentine kanalen die het medium in staat stellen om de atmosfeer te laten doorgaan onder het gasdoorlaterende membraan. B) de opwekking van gradiënt. De spuiten pompen het medium met ~ 0,1 mm fluoresceïne en geen fluoresceïne respectievelijk in de chip door de 2 middelgrote inhammen aan de rechterkant, geëxtraheerd uit de chip op de 2 middelgrote uitgangen aan de linkerkant. De concentratie van fluoresceïne is evenredig met de intensiteit van het fluorescentie signaal, en wordt geprofileerd in de buurt van de middelgrote inhammen/uitgangen a en in de buurt van het centrum b. afbeelding gereproduceerd met toestemming van Lin et al. 201712. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: de componenten van de aangepaste 3 goed sample plaat. a) het hoofdgedeelte van 3 goed plaat; b) een paar gaskanalen die een geconditioneerde atmosfeer laten inpompen en uitblazen via de septa bij de ingang van de gaskanalen; c) een O-ring die is ontworpen om de ruimte tussen de goed plaat en het gas-permeabele cultuur gerecht te dichten; d) de gasdoorlatbare kweek schaal met een diameter van 35 mm; e) de schotel houder; f) het PDMS-apparaat; g) de houders van een PDMS-chip; h) de dubbellaagse glazen ramen van 35 mm, ontworpen om thermische isolatie te behouden en condensatie van water te voorkomen; i) glazen raamhouder; j) verwarmings kussentjes; k) temperatuursensor; l) de zelfklevende sealer die ervoor zorgt dat de chip niet uitdroogt. Afbeelding gereproduceerd met toestemming van Lin et al. 201712. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: de schematische figuur van de experimentele opstelling. De opzet van het experiment, met inbegrip van het gasvoorzienings systeem, de aansluiting van de gaskanalen, de gemiddelde toevoer verbinding en het beeldvormings systeem. Afbeelding gereproduceerd met toestemming van Lin et al. 201712. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: groeicurven van PC3 in de EA zonder stress. PC3 werden gekweekt in EA zonder de aanwezigheid van externe stress. A) patroon van EA met positielabels. B) groeicurves van PC3 op de gekozen posities in termen van celsamenvloeiing. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: de co-cultuur van PC3-epi en PC3-EMT in de EA zonder stress. PC3-EPI (rood) en PC3-EMT (groen) werden co-gekweekt in de EA zonder de aanwezigheid van externe stress. A) overlay van twee fluorescerende kanalen bij t = 0 h.B) fluorescerende afbeelding genomen bij t = 95 h. (C) groeicurven in termen van celsamenvloeiing. De samenvloeiing van cellen van elk celtype werd gemeten op de gehele chip. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt de gemiddelde celsamenvloeiing op 3 opeenvolgende tijdpunten die worden ingenomen met intervallen van 15 minuten. De foutbalken geven de standaarddeviatie van de celsamenvloeiing aan op de drie opeenvolgende tijdpunten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: celmotiliteits test in een gemengde populatie. Het aantonen van de prestaties van één cel volgen in een gemengde populatie. (A) een demonstratie van hoe cellen worden gedetecteerd door Laplacian van Gaussiaanse (LoG) segmentatie. De cirkels geven de locatie aan van cellen die zijn gedetecteerd door het LoG-algoritme. De gedetecteerde cellen zijn gekoppeld van frame naar frame op basis van het lineaire toewijzings probleem om de beweeglijkheid van de cel te kwantificeren. (B) de "wondgenezing assay" van PC3-epi en PC3-EMT co-cultuur experiment. Cellen werden lokaal geseeid tot 100% samenvloeiing met een duidelijke grens in het midden. Na de installatie van de EA-chip werden cellen waargenomen om te migreren via de habitat array zoals aangegeven door de witte pijlen. C) genormaliseerde histogram van de beweeglijkheid van de cel. PC3-EMT is sneller dan PC3-EPI door een factor van 1.8 x. De foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van 5 experiment samples. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: de motiliteits test van een lange-termijn co-cultuur van PC3-epi en PC3-EMT. Een lange-termijn co-cultuur van PC3-epi en PC3-EMT met uniforme initiële zaaien dichtheid. De verdeling van de celsnelheid varieert met de tijd. A) genormaliseerde verdeling van de celsnelheid op dag 2. B) de genormaliseerde verdeling van de celsnelheid op dag 6. (C) verhouding van het aantal PC3-epi naar PC3-EMT in elk klasseinterval. (D) gemiddelde snelheid van PC3-epi en PC3-EMT als functie van de tijd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Conventionele celcultuur werd bijna een eeuw geleden ontwikkeld en blijft het meest gebruikte preklinische model in biomedisch onderzoek, ondanks het bewezen beperkte vermogen om klinische resultaten in kanker17te voorspellen. Diermodellen bieden de hoogste fysiologische relevantie en redelijke genetische gelijkenis met de mens, maar hebben al lang erkend aanzienlijke beperkingen te hebben in het voorspellen van menselijke resultaten18. Onder alle bestaande preklinische modellen lijken microfluïdische kanker-op-chip modellen de meest veelbelovende kandidaat te zijn om aan de onvervulde behoefte in kankeronderzoek9,19,20te voldoen. De huidige kanker-op-chip-modellen hebben echter nog een platform dat in staat is om belangrijke componenten en interacties te reproduceren om een tumor micro-omgeving op een uitgebreide manier na te bootsen, maar toch eenvoudig genoeg om betrouwbare en reproduceerbaar kwantitatieve gegevens te bieden. Onze representatieve gegevens tonen aan dat onze microfluïdische celkweek technologie stabiele fysische en biochemische condities biedt voor lange-termijn celkweek in heterogene micro omgevingen. Dit multifunctionele platform maakt een verfijnde aanpassing van een tijdsafhankelijke chemische gradiënt en een omgevings gassamenstelling mogelijk. Het platform is draagbaar en compatibel met de meeste fluorescerende omgekeerde microscopen voor real-time beeldvorming met hoge resolutie, die multidimensionale informatie van cellen biedt als een functie van de tijd, inclusief celmorfologie, populatiedynamiek, cel motiliteit en Celmigratie op één celniveau.
Vergeleken met ons vorige werk11, merken we op dat deze drukverzegelende verpakkings-en assemblage methode voor ons microfluïdisch apparaat tal van downstream-experiment capaciteiten mogelijk maakt (BIJV. FACS, lokale metaboliet extractie, subklonale populaties expansie, als, DNA/RNA-vis, enz.) complementair aan de timelapse-beelden die tijdens de experimenten zijn gemaakt. Deze mogelijkheid om cellen van specifieke locaties in een heterogene cultuur te verwijderen, is een belangrijke voorschot in vergelijking met eerdere apparaten, waarbij het afdichtingsoppervlak naar een chip moest worden verwijderd voordat men toegang kon krijgen tot de cultuur11. Verder, zelfs in dat geval, de handeling van het verwijderen van de afdekking aanzienlijk verstoord de cultuur, zodat de lokale testen van cellen op een enkele tot weinig habitat niveaus was niet mogelijk. Dergelijke gelokaliseerde extractie was mogelijk in ons geval te wijten aan de zachte "hersluitbare" aard van de flexibele gas-permeabele membraan.
Er zijn verschillende kritieke stappen in het gepresenteerde protocol. Allereerst, om een lange termijn experiment met stabiele fluïdische dynamiek te initiëren, moeten micro bubbels zoveel mogelijk worden vermeden. Daarom is het belangrijk om het kweekmedium (stap 3.4.2) voor te verwarmen en te degassen voordat u de media in de spuiten laadt. Het manipuleren van media laden en doseren moet langzaam en voorzichtig gebeuren om Bubble vorming te voorkomen. Het PDMS-patroon moet worden behandeld met zuurstof plasma (stap 3.4.3) voordat verbinding wordt gemaakt met het toevoersysteem voor kweekmedia. De behandeling van zuurstof plasma zorgt voor de hydrofiliciteit van het PDMS-oppervlak en vermindert de kans op microbubble-entrapping aanzienlijk. In stap 3.4.7., bij het plaatsen van de chip bovenop de celkweek membraan, de PDMS chip moet het vloeistofoppervlak benaderen met een 15 graden kantelhoek om zich te ontdoen van de bubbels (indien van een) op het vloeibare oppervlak in de kweek schotel. Ten tweede vereist de drukverzegelings methode een stabiel gastoevoersysteem dat het celkweek membraan onder druk zet. De druk moet worden ingesteld tussen 0,2 tot 0,6 psi. Druklager dan 0,2 psi is onvoldoende voor spaan afdichting. Boven 1,2 psi, een aanzienlijke hoeveelheid gas zou doordringen door het membraan en het genereren van bubbels binnen het microfluïdische patroon. We merken op dat als de componenten van de metalen 3-well plaat niet goed gemonteerd zijn (inclusief de plaat behuizing, de gasdoorlatbare kweek schotel houder, een PDMS chip houder, een glazen raamhouder, O-ringen en een paar 35 mm glasramen), men zou gaslekkage identificeren als de drukmeting zou onontvankelijk zijn voor de toename van de gasstroom. Het lekprobleem kan eenvoudig worden opgelost door een lektest uit te voeren en vervolgens de componenten opnieuw te monteren.
De belangrijkste vorm van gegevens die zijn verkregen met het gebruik van de EA-technologie is door middel van Imaging. Zoals eerder vermeld, kan de EA-technologie op elke omgekeerde Microscoop worden geïnstalleerd. Echter, om de voordelen van het systeem volledig te benutten, is het sterk aanbevolen om het systeem te installeren op een omgekeerde fluorescerende Microscoop uitgerust met een volledig gemotoriseerde x-y stage, gemotoriseerde scherpstel knop, gemotoriseerde sluiter en gemotoriseerde filter kubus. Houd er ook rekening mee dat een perfecte focus mogelijk niet garant staat voor een bevredigende beeldkwaliteit. We raden u aan een beeldvormings software te gebruiken die multi-dimensionale beeld verwerving en aangepast Imaging script mogelijk maakt. De afbeeldingen goed gefocust houden kan uitdagend zijn zonder een periodieke (elke 24 uur of 48 uur) autofocus opdracht, die een aangepast scherpstel oppervlak heeft gegenereerd tijdens de beeldverwervings cyclus.
De gepresenteerde microfluïdische EA-technologie is geïmplementeerd om de aanpassing en evolutie dynamiek in prostaatkanker celmetaopulaties onder een chemotherapeutische stress landschap12te bestuderen. We hebben ook aangetoond dat de opkomst van drugs resistentie polyploïde reusachtige kankercellen in deze tumor-achtige heterogene micro-ecologie, waaruit blijkt dat het milieu heterogeniteit gecombineerd met Celmigratie binnen tumor populatie zou leiden tot amplificatie op de opkomst van resistente fenotypes13. Met de mogelijkheid om het gedrag van gemengde tumor celpopulaties onder goed gecontroleerde spannings gradiënten te controleren en te bewaken, kan onze microfluïdische EA-technologie ook dienen als een platform om regelgevings mechanismen te bestuderen en de fenotypische transformatie die betrokken is bij EMT in de context van kanker therapeutische strategieën21. Tot slot kan de gepresenteerde verpakkingsmethode voor drukverzegelingen ook worden geïmplementeerd in andere microfluïdische systemen die de verfijnde aanpassing van de samenstelling van het gas en de downstream-experiment capaciteiten vereisen. Zo werd dezelfde verpakkingsmethode gebruikt om verschillende microfluïdische patronen op te nemen om te bestuderen hoe bacteriële bevolkings golven door fysieke barrières worden verspreid22.
Samenvattend zijn de collectieve bevolkings dynamiek kwalitatief verschillend van gedragingen met één cel. De microfluïdische EA-technologie maakt de kwantitatieve studie van de evolutionaire dynamiek en fenotypische gedragingen individueel en collectief mogelijk als functie van de tijd. Deze technologie kan een fysiologisch relevant in vitro model voor kankeronderzoek opleveren, en mogelijk voor preklinische Geneesmiddelenontwikkeling en-screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten gedeclareerd.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NSF PHY-1659940.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringes | BD | 14-823-16E | |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | 1x anti-anti |
| AZ 300 MIF | Merck KGaA | 18441123163 | Photoresist developer |
| AZ1518 | Merck KGaA | AZ1518 | Photoresist |
| AZ4330 | Merck KGaA | AZ4330 | Photoresist |
| Cr Chromium Etchant | Sigma-Aldrich | 651826 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation | 10437028 | |
| Heidelberg DWL 66+ laserwriter | Heidelberg Instruments | DWL66+ | Writing photomask |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | 379212 | For photoresist adhesion enhancement |
| Hollow steel pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard |
| ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame | ibidi | 10929 | On-stage incubator |
| Luer-Lok 23 G dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A684 | To connect syringes and tubings |
| Lumox dish 35 | Sarstedt | 94.6077.331 | Gas-permeable cell culture dish |
| Microposit Remover 1165 | Dow Electronic Materials | Microposit Remover 1165 | Photoresist stripper |
| Microseal B Adhesive Sealer | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | Adhesive sealer |
| O-Ring (for Lumox plate sealing) | McMaster-Carr | 9452K114 | Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70 |
| O-Ring (for bottom glass window sealing) | McMaster-Carr | 9452K74 | Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70 |
| Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System | Plasmatic Systems, Inc | Plasma-Preen | Oxygen plasma system |
| RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | 11875-093 | |
| Samco RIE800iPB DRIE | Samco | RIE800iPB | Deep reactive-ion etching system |
| Suss MA6 mask aligner | SUSS MicroTec | MA6 | Mask aligner |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | PDMS elastomer |
| TePla M4L plasma etcher | PVA TePla | M4L | Plasma etcher |
| Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) | Sigma-Aldrich | 448931 | For silicon wafer silanization |
| Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) | Cole-Parmer | EW-06419-01 | Tubings for media delivery |
References
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
- Lambert, G., et al. An analogy between the evolution of drug resistance in bacterial communities and malignant tissues. Nature Reviews Cancer. 11 (5), 375-382 (2011).
- Tannock, I. F., Lee, C. M., Tunggal, J. K., Cowan, D. S., Egorin, M. J. Limited penetration of anticancer drugs through tumor tissue: a potential cause of resistance of solid tumors to chemotherapy. Clinical Cancer Research. 8 (3), 878-884 (2002).
- Grantab, R. H., Tannock, I. F. Penetration of anticancer drugs through tumour tissue as a function of cellular packing density and interstitial fluid pressure and its modification by bortezomib. BMC Cancer. 12, 214 (2012).
- Fu, F., Nowak, M. A., Bonhoeffer, S. Spatial Heterogeneity in Drug Concentrations Can Facilitate the Emergence of Resistance to Cancer Therapy. PLoS Computational Biology. 11 (3), e1004142 (2015).
- Bogorad, M. I., et al.
- Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
- Caballero, D., Blackburn, S. M., De Pablo, M., Samitier, J., Albertazzi, L. Tumour-vessel-on-a-chip models for drug delivery. Lab on a Chip. 17 (22), 3760-3771 (2017).
- Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
- Wu, A., et al. Ancient hot and cold genes and chemotherapy resistance emergence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10467-10472 (2015).
- Lin, K. C., et al. Epithelial and mesenchymal prostate cancer cell population dynamics on a complex drug landscape. Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 045001 (2017).
- Lin, K. C., et al. The role of heterogeneous environment and docetaxel gradient in the emergence of polyploid, mesenchymal and resistant prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (2), 97-108 (2019).
- Roca, H., et al. Transcription factors OVOL1 and OVOL2 induce the mesenchymal to epithelial transition in human cancer. PloS One. 8 (10), e76773 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tinevez, J. Y., et al. Trackmate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
- Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly of Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
- Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nature Reviews Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
- Bogorad, M. I., DeStefano, J., Karlsson, J., Wong, A. D., Gerecht, S., Searson, P. C.
- Zañudo, J. G. T., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).
- Morris, R. J., et al. Bacterial population solitary waves can defeat rings of funnels. New Journal of Physics. 19 (3), 035002 (2017).
