Summary
Nous présentons un modèle microfluidique de cancer sur puce, la technologie « Accélérateur d'évolution », qui fournit une plate-forme contrôlable pour des études quantitatives à long terme en temps réel de la dynamique du cancer dans des conditions environnementales bien définies à une cellule unique niveau. Cette technologie devrait servir de modèle in vitro pour la recherche fondamentale ou le développement de médicaments précliniques.
Abstract
La culture cellulaire conventionnelle demeure le modèle préclinique le plus fréquemment utilisé, malgré sa capacité limitée prouvée de prédire les résultats cliniques dans le cancer. Des modèles microfluidiques de cancer sur puce ont été proposés pour combler le fossé entre les cultures 2D conventionnelles trop simplifiées et les modèles animaux plus compliqués, qui ont une capacité limitée de produire des résultats quantitatifs fiables et reproductibles. Ici, nous présentons un modèle microfluidique de cancer-sur-puce qui reproduit des composants clés d'un microenvironnement complexe de tumeur d'une manière complète, mais est assez simple pour fournir des descriptions quantitatives robustes de la dynamique de cancer. Ce modèle microfluidique de cancer-sur-puce, le « accélérateur d'évolution, » décompose une grande population de cellules cancéreuses dans un éventail interconnecté de microenvironnements de tumeur tout en générant un paysage hétérogène de stress chimiothérapeutique. La progression et la dynamique évolutive du cancer en réponse au gradient de drogue peuvent être surveillées pendant des semaines en temps réel, et de nombreuses expériences en aval peuvent être effectuées complémentaires aux images en time-lapse prises au cours des expériences.
Introduction
Le cancer est de plus en plus reconnu comme un écosystème complexe qui dépend non seulement de la dysrégulation continue des populations de cellules mutées, mais aussi des interactions vitales entre les cellules cancéreuses et le microenvironnement hôte. En ce sens, le cancer évolue sur un paysage adaptatif qui se manifeste par une combinaison de facteurs, y compris un microenvironnement tumoral hétérogène et un crosstalk avec une variété de cellules hôtes, qui contribuent toutes à des pressions sélectives pour d'autres changements épigénétiques1,2,3. Dans le contexte des tumeurs solides, la distribution inégale des produits chimiothérapeutiques et d'autres gradients de ressources contribue à leur hétérogénéité moléculaire et peut jouer un rôle dans le développement de la résistance aux médicaments, augmentation de l'angiogenèse à une tumeur particulière sous-populations, et même métastasis4,5,6. Les études conventionnelles de culture cellulaire 2D in vitro, tout en possédant une capacité expérimentale pratique à grande échelle, fournissent des conditions de champ moyen, uniformes et fixes, souvent dépourvues du contrôle environnemental spatial et temporel précis nécessaire pour imiter la dynamique tumorale in vivo. Ainsi, il est nécessaire de modèles ex vivo plus représentatifs pour reproduire le microenvironnement tumoral avant les modèles animaux dans le pipeline de développement de médicaments afin d'une meilleure prédiction de la progression du cancer ainsi que des réponses aux médicaments dans le stress dynamique Paysages. Des microfluidiques ont été proposés pour combler l'écart entre les études de culture cellulaire 2D et les études animales in vivo plus complexes qui pourraient ne pas être en mesure de soutenir les études quantitatives contrôlables7,8,9.
Un système in vitro idéal pour caractériser la dynamique des cellules cancéreuses devrait posséder la capacité de générer un microenvironnement hétérogène pour imiter les réponses cellulaires adaptatives qui peuvent avoir lieu dans une tumeur, ainsi que permettre l'observation de ces dynamiques à un résolution unicellulaire. Dans cet article, nous décrivons une plate-forme de culture cellulaire microfluidique, un dispositif basé sur le PDMS appelé « accélérateur d'évolution » (EA), qui permet des études in vitro parallèles de la dynamique des cellules cancéreuses à la résolution cellulaire avec l'acquisition de données en temps réel sur le cours de semaines, tout en maintenant de façon stable des gradients de stress à travers le paysage culturel. La conception de cette plate-forme est basée sur nos travaux précédents, dans lesquels la dynamique évolutive des organismes dans une métapopulation peut être accélérée10,11. Plus précisément, dans un groupe de populations spatialement séparées qui interagissent à un certain niveau, lorsqu'elles sont exposées à un paysage de stress hétérogène, les espèces les plus aptes peuvent dominer plus rapidement dans une population locale que celle d'une grande population uniforme. Les espèces avantageuses migrent ensuite vers les microhabitats voisins à la recherche de ressources et d'espace, et finissent par dominer toute la population. Comme le montre la figure 1, le modèle de la puce EA microfluidique est composé de (i) une paire de canaux serpentins qui fournissent une circulation médiatique fraîche et construisent des conditions limites fixes pour la diffusion chimique, et (ii) la région de culture cellulaire hexagonale qui se compose de 109 chambres hexagonales interconnectées et 24 chambres semi-hexagonales au centre, ressemblant à une structure en nid d'abeilles. La puce est de 100 m de profondeur. Les canaux médiatiques et la région de la culture cellulaire sont reliés à de petites fentes (environ 15 m de large), qui empêchent le flux direct des médias et le stress de cisaillement qui en résulte dans la zone de culture cellulaire, tout en permettant aux produits chimiques de se diffuser à travers de petites fentes et d'échanger des nutriments, déchets métaboliques, etc. La génération de gradients chimiques est démontrée dans la figure 1B, où un canal média contient 0,1 mM de fluorescéine tandis que l'autre canal est exempt de fluorescéine. Les cellules sont cultivées sur une membrane perméable au gaz, encapsulées par les microstructures par la pression arrière positive sur la membrane contre la puce. Les composants du support de l'appareil sont illustrés dans la figure 2, et la configuration expérimentale est illustrée dans la figure 3, où la culture est maintenue sur un microscope inversé à 37 oC, avec une humidité relative supérieure à 85 %, et conditionnée sous composition du gaz normoxia.
Ce système fournit une observation détaillée des interactions cellulaires localisées par l'intermédiaire de canaux lumineux et fluorescents et permet des essais en aval résolus spatialement tels que l'immunofluorescence, la tache occidentale, ou la spectrométrie de masse. Nous avons déjà démontré comme preuve de principe de ce modèle microfluidique de cancer-sur-puce sur la co-culture à long terme des cellules cancéreuses de la prostate de PC3 épithélial et mésenchymal12 aussi bien que l'émergence du géant polyploïde de drogue-résistance cellules cancéreuses utilisant la lignée cellulaire épithéliale PC313. Tandis que nous présentons l'application de cette plate-forme pour comprendre la dynamique spatiotemporale des cellules épithéliales DE CANCER de la prostate et de la prostate mésenchymale sous un gradient de stress du docétaxel, le système microfluidique peut être facilement appliqué à n'importe quelle combinaison des lignées cellulaires et les gradients de ressources (c.-à-d. médicaments, nutriments, oxygène).
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Protocol
1. Fabrication d'un dispositif microfluidique
- Générer le modèle microfluidique souhaité à l'aide d'un logiciel de conception de mise en page (voir Matériaux supplémentaires).
- Fabriquez le photomasque. Voir tableau des matériaux pour plus de détails.
- Utilisant un auteur de laser, écrivez le modèle sur une plaque en verre de soude-lime enduite de 100 nm de Cr et 500 nm de photoresist AZ1518.
- Développer le photoresist avec le développeur AZ300MIF pour 60 s.
- Etch loin le chrome sans protection contre le photoresist à l'aide cr-7 Chromium Etchant.
- Dénuder le photoresist résiduel à l'aide d'une décapante photorésistante à 70 oC pendant 45 min.
- Modèle de la photoresist. Voir tableau des matériaux pour plus de détails.
- Spin coat HMDS sur plaquette de silicium à 4000 tr/min pour 40 s.
- Spin coat photoresist AZ4330 sur plaquette de silicium à 4000 tr/min pour 40 s.
- Cuire doucement la plaquette de silicium à 95 oC pour 60 s.
- Utilisez l'aligneur de masque pour exposer les UV à la plaquette de silicium.
- Développer le photoresist avec le développeur AZ300MIF pour 4 min.
- Effectuer la gravure DRIE. Voir tableau des matériaux pour plus de détails.
- Sécher la plaquette modelée avec le photoresist à l'aide d'un système de gravure à ion réactif profond de silicium (DRIE) pour 100 m de profondeur.
- Dénuder le photoresist avec de l'acétone et de l'équaire de plasma avec un écheron à plasma.
- Oxydation et silanisation des gaufrettes. Voir tableau des matériaux pour plus de détails.
- Effectuer l'oxydation thermique sur la plaquette de silicium gravée dans un four à 1100 oC pendant 1 h.
- Attendez que la plaquette de silicium refroidisse, puis placez la plaquette dans un dessiccateur avec quelques gouttes de trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) égouttédans dans un petit récipient près de la plaquette.
- Pomper la pression du dessiccateur à 0,5 atm à température ambiante pendant 60 min. Le moule de gaufrette de silicium devrait devenir hydrophobe après la silanisation appropriée, qui peut être examinée en ajoutant plusieurs gouttelettes d'eau sur la plaquette.
- Lithographie douce. Voir tableau des matériaux pour plus de détails.
- Mélanger le kit pré-polymère et cross-linker (à partir du kit de polyméthylsiloxane (PDMS) à un rapport de 10:1 par poids.
- Verser le PDMS mélangé pour créer un film de 10 mm de hauteur sur le moule silanisé de plaquette de silicium.
- Décorez le système de gaufrettes PDMS-silicium qui en résulte dans un dessiccateur de 30 min à 1 h.
- Incuber la plaquette de silicium PDMS dans un incubateur de 70 oC pendant la nuit pour guérir le PDMS.
- Une fois que le PDMS est guéri, épluchez soigneusement le film PDMS de la plaquette de silicium.
- À l'aide d'aiguilles de biopsie, percer des trous dans les ports d'entrée en fonction de l'emplacement du motif sur le PDMS et utiliser un poinçon circulaire pour couper des copeaux de 27 mm de diamètre.
- Liaison de couche PDMS.
- Traitement de la chaleur deux piles de 27 mm pDMS cylindres (sans motifs), qui deviendra la couche réservoir et la couche de plafonnement de l'appareil.
- Découpez deux cercles de 7 mm autour des bras de mer sur la couche du réservoir et utilisez une aiguille de biopsie pour percer les trous dans les ports d'entrée de la couche de plafonnement.
- Associez trois piles de PDMS (pile à motifs, couche réservoir, couche de plafonnement) avec un traitement plasmatique à l'oxygène.
- Avec l'aiguille de biopsie, percer les trous aux prises et au port central de l'appareil.
2. Préparation des médias et des lignes cellulaires
- Préparer les médias pour la culture des lignées cellulaires PC3, y compris PC3-EMT et PC3-EPI: mélanger RPMI 1640 milieu avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1x antibiotique-antimycotique. Générer des lignées cellulaires comme décrit précédemment14.
REMARQUE : Les lignées cellulaires PC3 sont maintenues dans les milieux ci-dessus dans des incubateurs humidifiés à 37 oC avec 5 % de CO2. Cellules divisées et sous-culture tous les 3 jours, avant qu'elles n'atteignent 100% de confluence. - Lignes de cellules transfect avec des marqueurs fluorescents cytoplasmiques marqués pour une meilleure visualisation, comme décrit précédemment12, tel que PC3-EMT exprime GFP cytoplasmique et PC3-EPI exprime mCherry cytoplasmique. Notez que la technologie est également compatible avec toutes les cellules fluorescentes ainsi que l'imagerie brightfield de cellules non étiquetées.
3. Configuration expérimentale
- Fabrication du support de plaque en métal
- Fabriquer un porte-plaque qui est suffisant pour contenir simultanément des plats de culture perméables au gaz pour des expériences parallèles par l'usinage ou l'impression 3D. Le fichier CAO 3D ("3-bien plaque. FCStd") peut être trouvé sur GitHub comme référence (https://github.com/kechihl/3-well-plate).
- Dévisser les composants du support (Figure 2) avec un tournevis. Désinfecter les composants par exposition aux UV pendant au moins 1 h et laisser dans un environnement stérile.
REMARQUE : Le support est conçu pour fournir des conditions substantielles pour l'équilibre thermique et les compositions idéales de gaz, avec des entrées de canal de gaz qui permettent le flux d'air. Plus de détails peuvent être trouvés dans notre travail précédent12. - Préparez jusqu'à trois plats de culture perméables au gaz, dont la membrane de culture cellulaire est relativement flexible.
- Ensemencement de ligne de cellules
- 24 heures avant le début de l'expérience, récolter les cellules PC3-EPI et PC3-EMT par trypsinisation pendant 5 min. Ajouter les supports de culture préchauffés, puis centrifuger à 150 x g pendant 3 min et jeter le supernatant.
- Compter les cellules de chaque PC3-EPI et PC3-EMT à l'aide d'un hémocytomètre et isoler un total de 2,5 x 104 de chaque type de cellule pour chaque plat de culture perméable au gaz.
- Mélanger et resuspendre les deux types de cellules dans 2 ml de culture et semer les cellules dans chacun des plats de culture perméables au gaz.
- Laisser le support entier de plaque dans l'incubateur pendant la nuit pour que les cellules se fixent.
- Désinfecter les dispositifs PDMS par exposition aux UV pendant au moins 1 h et laisser dans un environnement stérile.
- Mise en place d'une unité de contrôle thermique et d'un système d'approvisionnement en gaz
- Comme le montre la figure 3, mettre en place un système d'approvisionnement en gaz qui se compose à la fois d'unités de contrôle CO2 et O2, d'une pompe à essence, d'une chambre de mélange de gaz, d'un humidificateur ou d'un bulleur, et de trois ensembles distincts de soupapes de gaz et de jauges de pression. Plus de détails peuvent être trouvés dans notre travail précédent12.
- Mettre en place les unités de contrôle CO2 et O2 de telle sorte qu'elles ajustent le taux de mélange du gaz des réservoirs DE CO2 et N2 et de la source O2. Alternativement, tout système d'approvisionnement en gaz qui fournit du gaz en état de normoxie fonctionnerait.
- Assurez-vous que le gaz qui est combiné dans la chambre de mélange et humidifié par un bulleur de sorte que l'humidité relative est augmentée jusqu'à 85% (comme lu à partir d'un moniteur d'humidité relative) et que le gaz conduit à trois vannes de gaz indépendantes avec des jauges de pression afin de contrôler et surveiller le débit de gaz dans le porte-plaque.
- Placer le support entier de la plaque dans une unité de contrôle thermique d'incubation sur scène avec des sous-unités de chauffage séparées pour le couvercle et la plaque inférieure, toutes les unités étant fixées à 37 oC. Voir tableau des matériaux pour plus de détails.
- Installation d'un dispositif microfluidique. Voir tableau des matériaux pour plus de détails.
- Identifier que les composants détaillés du porte-plaque à 3 puits sont en ordre, comme dans la figure 2. Chacun des trois puits est identique et indépendant, avec une paire de canaux de gaz pour chaque puits. Chaque puits possède un porte-plat de culture perméable au gaz, un porte-puces PDMS, un porte-fenêtre en verre et une paire de fenêtres en verre de 35 mm. Ces composants peuvent être assemblés à l'aide des vis ajustées.
REMARQUE : Les vitres s'assurent qu'il y a un espace thermiquement isolé entre la membrane de culture perméable au gaz et le puits de sorte qu'aucune condensation d'eau ne se produise en raison des différences de température à l'interface. Notez que les 3 puits sont indépendants, et 3 expériences peuvent être faites séparément. - Pré-chauffer le milieu de culture à 37 oC et les dégazer dans une chambre à vide pendant 20 min.
- Traiter les puces PDMS à l'aide d'un système plasma d'oxygène pour 30 s afin de maintenir l'hydrophilie.
- Configurez le système de seringues. Chargez lentement deux seringues avec des supports de croissance et deux autres seringues avec le réactif d'intérêt désiré (médias, médias avec la drogue, etc.). Connectez chaque seringue individuelle à un tube de 50 cm (0,020 po x 0,060 po) par une aiguille distributrice de 23 G dans une goupille en acier creux. Insérer une goupille creuse en acier à l'autre extrémité du tube.
- Primer le tube et insérer la goupille d'acier dans chaque puce PDMS à travers la couche de plafonnement. Remplissez la couche réservoir et mouillez le modèle de couche PDMS avec des supports. La couche de réservoir fonctionne comme un piège à bulles sur puce pour empêcher les bulles d'air d'entrer dans le modèle microfluidique.
- Chargez une seringue de 1 ml avec des supports culturels. Connectez la seringue à un tube de 5 cm (0,020 po x 0,060 po) par une aiguille distributrice de 23 G dans une goupille en acier creux. Insérez une goupille creuse en acier à l'autre extrémité du tube et amorcez le tube.
- Insérez la goupille creuse en acier dans le trou central de la puce, où un support excessif peut être extrait de la puce plus tard pendant le processus d'étanchéité des copeaux.
- Comme chaque appareil PDMS nécessite quatre seringues de 10 ml chargées sur une pompe à seringues, chargez deux seringues de 10 ml par puce dans le pont avant. Placez les deux autres seringues dans le pont de retrait du système de seringues.
- Placez la puce directement sur les membranes de culture perméables au gaz (avec des cellules déjà adhérées aux membranes). Afin d'éviter d'piéger les microbulles dans le modèle microfluidique, distribuez 1 ml de support préchauffé et dégazé dans le plat de culture perméable au gaz de 35 mm avant l'assemblage, puis assurez-vous que la puce s'approche de la surface liquide avec un angle d'inclinaison de 15 degrés.
- Clamp le plat de culture perméable au gaz et le puits dans le porte-vaisselle de culture perméable au gaz pour chaque puce, avec le support de puce PDMS poussant le dispositif PDMS vers le bas.
- Collez une feuille d'un scelleur sur le dessus de l'appareil PDMS et pincez-la avec le support de la puce PDMS afin d'empêcher la puce de se dessécher.
- Définir le débit des médias autour du tableau pour qu'il soit de 20 l/h.
- Placez la plaque entière dans l'incubateur sur scène sur le stade motorisé d'un microscope inversé. Connectez le système d'approvisionnement en gaz aux canaux de gaz et pressurisez la membrane de culture perméable au gaz contre la puce PDMS installée pour assurer l'étanchéité de l'appareil. Maintenir la pression de la jauge à 0,2 psi (1,4 x 104 Pa).
- Extraire lentement les milieuis excessifs dans la puce à l'aide de la seringue de 1 ml du trou central. Observez la puce sous le microscope tout en extrayant le support, puis arrêtez d'extraire lorsque la puce est scellée. L'étanchéité des copeaux devrait être évidente puisqu'une partie des cellules serait écrasée par les microstructures.
- Connectez l'unité de détection de température de l'incubateur sur scène à la plaque de 3 puits et fixez-la à 37 oC.
- Identifier que les composants détaillés du porte-plaque à 3 puits sont en ordre, comme dans la figure 2. Chacun des trois puits est identique et indépendant, avec une paire de canaux de gaz pour chaque puits. Chaque puits possède un porte-plat de culture perméable au gaz, un porte-puces PDMS, un porte-fenêtre en verre et une paire de fenêtres en verre de 35 mm. Ces composants peuvent être assemblés à l'aide des vis ajustées.
4. Imagerie en accéléré à cellule unique
- Configurez un logiciel d'imagerie utilisant un microscope inversé pour l'acquisition d'images en time-lapse. Notez qu'un microscope fluorescent inversé avec stade x-y entièrement motorisé, bouton de mise au point, obturateur et cubes de filtre est nécessaire pour une expérience EA.
- Configurer un logiciel pour acquérir des images sur deux canaux à 10x grossissement pour chaque puce avec l'image automatique de couture après un tour de mise au point automatique. Sachez que les systèmes de correction automatique comme Perfect Focus ne garantissent pas une qualité d'image satisfaisante. Il est plus recommandé de générer une surface de mise au point personnalisée pour l'acquisition d'images à long terme basée sur l'autofocus ou la mise au point manuelle à travers la puce.
- Prenez des images toutes les heures et laissez l'expérience se dérouler sur l'échelle de temps des semaines. Surveillez la qualité de l'image sur une base quotidienne et mettez à jour la surface de mise au point si nécessaire.
- Préparer la puce PDMS et le plat de culture perméable au gaz pour l'analyse immunofluorescente ultérieure, comme décrit précédemment13.
5. Traitement et analyse d'images
- Traitement post-expérimental
- Convertir les images en format TIFF pour le traitement et les mesures d'images en utilisant Fidji/ImageJ.
- Compresser les fichiers TIFF pour faciliter le traitement d'images.
- Analyse Fidji/ImageJ
- Pour identifier les cellules, effectuez l'analyse de soustraction et de particules de fond pour identifier les points lumineux fluorescents pour la détection de localisation cellulaire et le comptage automatique des cellules.
- Utilisez des plugins (Manual Tracking, Chemotaxis, Migration Tool, Trackmate) pour analyser la motilité cellulaire et la migration.
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Representative Results
Validation de la croissance cellulaire optimale sur puce
L'un des principaux objectifs de la plate-forme expérimentale est de reproduire les composants clés et les interactions dans un microenvironnement tumoral complexe d'une manière globale, mais assez simple pour fournir des données quantitatives, fiables et reproductibles. Cet objectif ne peut être atteint que si nous avons le plein contrôle des facteurs environnementaux physiques et biochimiques. Nous devons soit exclure les facteurs indésirables, soit trouver un moyen d'intégrer les facteurs incontrôlables dans le modèle quantitatif pour interpréter correctement les comportements de la population.
Le premier test est d'assurer une croissance optimale des cellules sur l'appareil. Le taux de prolifération cellulaire sur l'appareil doit être identique ou comparable à leur profil de croissance dans la culture cellulaire conventionnelle. Comme preuve de principe, les cellules PC3 humaines de ligne de cancer de la prostate ont été cultivées dans la puce de PDMS sans la présence du stress externe. Ces cellules ont été fluorescentes dans le cytoplasme afin que nous puissions observer et quantifier la population de cellules à l'aide de la microscopie fluorescente inversée. La confluence des cellules, définie comme la zone couverte par les cellules, a été mesurée à chaque microhabitat à des périodes différentes donné un seuil d'intensité sélectionné sur les images fluorescentes en utilisant Fidji15. Les courbes de croissance des cellules à chaque position choisie sont tracées à la figure 4. Les positions choisies sont dispersées à travers la puce, de la région près de l'apex de l'afflux de médias à l'apex près des médias.
Les courbes de croissance de la figure 4B sont bien alignées, ce qui suggère l'identique du profil de prolifération cellulaire en fonction de la position à travers la puce. La pente initiale des courbes révèle le taux de prolifération. Le temps de doublement pour les cellules dans l'appareil est d'environ 24 heures comme le montre la figure 4B du temps 0 à 24 heures, ce qui est le même que le temps de doublement dans les logiciels culturels conventionnels13. Par conséquent, nous concluons que sans la présence d'une source externe de stress, les facteurs physiques et biochimiques sont uniformément répartis, conduisant à la croissance cellulaire homogène et optimisée de 50 à 100 heures.
Nous avons également examiné la capacité de quantifier la dynamique cellulaire entre les sous-populations dans un microenvironnement. Les lignées cellulaires PC3-EMT exprimant le GFP et les lignées cellulaires PC3-EPI exprimant mCherry ont été co-cultivées dans l'EE, comme le montre la figure 5. La confluence cellulaire, définie comme le pourcentage de surface couverte par les cellules, est mesurée comme l'indication de la taille de la population. À partir de 40% de confluence, la co-culture s'est développée entièrement confluent en 3 jours. Fait intéressant, nous pouvons observer la progression de chaque phénotype dans le microenvironnement. Tandis que la courbe de croissance de la confluence totale est sous forme de modèle de croissance logistique, la population de PC3-EMT a continué à augmenter et PC3-EPI a été supprimée dans la phase asymptotique.
Démonstration de l'analyse de la motilité cellulaire dans une population mixte
La motilité cellulaire est un comportement phénotypique important. La répartition de la motilité d'une population peut fournir des informations sur l'interaction physique des cellules, les propriétés mécaniques du microenvironnement local, et peut parfois être analysée comme une indication de la variation épigénétique des cellules. Étant donné que notre plate-forme améliorée de culture cellulaire permet une imagerie presque continue, l'avantage d'avoir une résolution temporelle fine maximise le potentiel du suivi des cellules individuelles dans une population hétérogène.
Nous utilisons le plugin TrackMate16 à Fidji (http://fiji.sc) avec macro personnalisé pour implémenter et automatiser le processus de suivi. TrackMate permet à l'utilisateur d'implémenter et de personnaliser un algorithme de suivi à l'aide d'un langage de script de l'éditeur de script Fidji. Le processus de suivi est divisé en une série d'étapes : les processus de segmentation, de filtrage et de liaison des particules.
Comme le montre la figure 6B, nous avons effectué un « effort de guérison des plaies » comme démonstration pour étudier la migration collective cellulaire et l'interaction cellule-cellule. Les cellules PC3-EPI et PC3-EMT ont été densément ensemiées au centre de l'appareil et ont été autorisées à migrer librement vers la région vide. L'histogramme normalisé de la vitesse des deux phénotypes est tracé dans la figure 6C. La vitesse de PC3-EMT était significativement plus élevée que PC3-EPI par un facteur de 1.8x, qui est compatible avec le fait que le phénotype mésenchymal sert de composant de la cicatrisation des plaies cutanées avec une capacité exceptionnelle de migrer par opposition à la comparaillecomparable phénotype épithélial stationnaire.
En outre, afin d'observer la progression de la motilité cellulaire dans un environnement sans stress, nous avons effectué une co-culture à long terme de PC3-EPI et PC3-EMT avec une densité d'ensemencement initiale uniforme et suivi la distribution de la vitesse cellulaire variant avec le temps. Comme le montre la figure 7A,B, après 6 jours de culture, alors que les cellules atteignaient une confluence plus élevée, les distributions de la vitesse cellulaire pour les deux phénotypes se penchaient vers la queue gauche.
Nous pouvons comparer le rapport entre pc3-EPI et PC3-EMT dans chaque intervalle de classe. Comme le montre la figure 7C, indépendamment des jours de culture ou de densité des cellules, PC3-EMT dominait la région à grande vitesse tandis que LE PC3-EPI occupait la zone à basse vitesse. Bien que la vitesse globale ait diminué de façon significative pour les deux phénotypes, PC3-EMT est restée motile et a été affectée moins par l'encombrement du microenvironnement comme le montre la figure 7D. La vitesse moyenne de PC3-EPI a chuté d'environ 40% tandis que celle de PC3-EMT n'a baissé que de 14%.
Il existe plusieurs facteurs qui peuvent influer sur la répartition de la vitesse cellulaire et la vitesse moyenne, comme l'encombrement de la population. Le suivi et la surveillance cellulaires continus sur l'ensemble de la sous-population sont essentiels pour comprendre la progression du comportement phénotypique. Par exemple, si nous voulons quantifier le niveau du statut mésenchymal d'une sous-population non étiquetée, il serait plus instructif d'acquérir non seulement la distribution de la quantité physique (p. ex., la vitesse) de la sous-population intéressée en fonction de temps, mais aussi celui de tout le reste de la sous-population coexistante de cellules.
Figure 1 : La puce EA microfluidique à pompe à seringues. (A) Le dispositif microfluidique a deux entrées moyennes séparées, deux prises, et un port central pour l'ensemencement cellulaire ou l'extraction du milieu excessif. Notez qu'entre les entrées moyennes et les réseaux de culture cellulaire, une paire de canaux serpentins qui permettent au milieu d'ajuster avec l'atmosphère passée sous la membrane perméable au gaz. (B) La génération de gradient. Les seringues pompent le milieu avec 0,1 mm de fluorescéine et pas de fluorescéine respectivement dans la puce à travers les 2 entrées moyennes sur la droite, extraitde de la puce aux 2 prises moyennes sur la gauche. La concentration de fluorescéine est proportionnelle à l'intensité du signal de fluorescence, et est profilée près des entrées/sorties moyennes a et près du centre b. Figure reproduite avec la permission de Lin et al. 201712. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Les composants de la plaque personnalisée de 3 puits. (a) le corps principal de 3 plaques de puits; b) une paire de canaux de gaz qui permettent d'inscanner l'atmosphère conditionnée et de s'évacuer par la septa à l'entrée des canaux de gaz; c) un anneau O conçu pour sceller l'espace entre la plaque du puits et le plat de culture perméable au gaz; d) le plat de culture perméable au gaz de 35 mm de diamètre; (e) le porte-vaisselle; (f) le dispositif PDMS; (g) les détenteurs de puces PDMS; h) les vitres en verre de 35 mm à double couche conçues pour maintenir l'isolation thermique et prévenir la condensation de l'eau; (i) porte-fenêtre en verre; (j) coussins chauffants; (k) capteur de température; (l) le scellant adhésif adhésif qui empêche la puce de sécher. Figure reproduite avec la permission de Lin et coll. 201712. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : La figure schématique de la configuration expérimentale. La configuration de l'expérience, y compris le système d'approvisionnement en gaz, la connexion des canaux de gaz, la connexion d'approvisionnement moyen et le système d'imagerie. Figure reproduite avec la permission de Lin et coll. 201712. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Courbes de croissance de PC3 dans l'EE sans stress. PC3 ont été cultivés dans L'EE sans la présence de stress externe. (A) Modèle d'EA avec étiquettes de position. (B) Courbes de croissance de PC3 aux positions choisies en termes de confluence cellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : La co-culture de PC3-EPI et de PC3-EMT dans l'EE sans stress. PC3-EPI (rouge) et PC3-EMT (vert) ont été co-cultivés dans l'EE sans la présence de stress externe. (A) La mise au point de deux canaux fluorescents à t ' 0 h. (B) Image fluorescente prise à 95 h. (C) Courbes de croissance en termes de confluence cellulaire. La confluence cellulaire de chaque type de cellule a été mesurée sur l'ensemble de la puce. Chaque point de données représente la confluence cellulaire moyenne à 3 points de temps consécutifs pris à intervalles de 15 min. Les barres d'erreur représentent l'écart standard de la confluence cellulaire aux 3 points de temps consécutifs. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Analyse de la motilité cellulaire dans une population mixte. La démonstration de la performance de suivi d'une seule cellule dans une population mixte. (A) Une démonstration de la façon dont les cellules sont détectées par la segmentation laplacienne de Gaussian (LoG). Les cercles indiquent l'emplacement des cellules détectées par l'algorithme LoG. Les cellules détectées sont liées d'un cadre à l'autre en fonction du problème d'affectation linéaire pour quantifier la motilité cellulaire. (B) L'« analyse de guérison de blessure » de l'expérience de co-culture PC3-EPI et PC3-EMT. Les cellules ont été ensetcées localement jusqu'à 100% de confluence avec une limite claire au centre. Après l'installation de la puce EA, on a observé que les cellules migrent à travers le réseau de microhabitats, comme l'indiquent les flèches blanches. (C) Histogramme normalisé de la motilité cellulaire. PC3-EMT est plus rapide que PC3-EPI par un facteur de 1.8x. Les barres d'erreur représentent l'écart standard de 5 échantillons d'expérience. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7 : Le résultat de la motilité d'une co-culture à long terme de PC3-EPI et PC3-EMT. Une co-culture à long terme de PC3-EPI et PC3-EMT avec une densité d'ensemencement initiale uniforme. La répartition de la vitesse des cellules varie avec le temps. (A) Répartition normalisée de la vitesse cellulaire le jour 2. (B) La répartition normalisée de la vitesse cellulaire le jour 6. (C) Ratio du nombre de PC3-EPI à PC3-EMT dans chaque intervalle de classe. (D) Vitesse moyenne de PC3-EPI et PC3-EMT en fonction du temps. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
La culture cellulaire conventionnelle a été développée il y a près d'un siècle et demeure le modèle préclinique le plus fréquemment utilisé dans la recherche biomédicale, malgré sa capacité limitée prouvée de prédire les résultats cliniques dans le cancer17. Les modèles animaux offrent la plus grande pertinence physiologique et la similitude génétique raisonnable avec les humains, mais ont longtemps été reconnus pour avoir des limites significatives dans la prévision des résultats humains18. Parmi tous les modèles précliniques existants, les modèles microfluidiques de cancer-sur-puce semblent être le candidat le plus prometteur pour satisfaire le besoin non satisfait dans la recherche sur le cancer9,19,20. Cependant, les modèles actuels de cancer-sur-puce n'ont pas encore offert une plate-forme qui est capable de reproduire les composants clés et les interactions pour imiter un microenvironnement de tumeur d'une manière complète, mais assez simple pour fournir des données quantitatives fiables et reproductibles. Nos données représentatives démontrent que notre technologie de culture cellulaire microfluidique fournit des conditions physiques et biochimiques stables pour la culture cellulaire à long terme dans des microenvironnements hétérogènes. Cette plate-forme multifonctionnelle permet l'ajustement sophistiqué d'un gradient chimique dépendant du temps ainsi que la composition du gaz ambiant. La plate-forme est portable et compatible à la plupart des microscopes fluorescents inversés pour l'imagerie en temps réel à haute résolution, qui offre des informations multidimensionnelles des cellules en fonction du temps, y compris la morphologie cellulaire, la dynamique des populations, les cellules motilité et la migration cellulaire au niveau d'une seule cellule.
Par rapport à nos travaux précédents11, nous notons que cette méthode d'emballage et d'assemblage d'étanchéité sous pression pour notre dispositif microfluidique permet de nombreuses capacités d'expérimentation en aval (par exemple, FACS, extraction locale de métabolites, populations sous-clonales expansion, IF, ADN/ARN FISH, etc.) complémentaux des images en time-lapse prises au cours des expériences. Cette capacité d'enlever des cellules à des endroits spécifiques dans une culture hétérogène est une avancée majeure par rapport aux dispositifs antérieurs, où la surface d'étanchéité à une puce a dû être enlevée avant que l'on puisse accéder à la culture11. De plus, même dans ce cas, l'acte d'enlever la couverture a considérablement perturbé la culture de sorte que l'essai local des cellules sur un seul à peu de niveaux d'habitat n'était pas possible. Une telle extraction localisée était possible dans notre cas en raison de la nature douce « refermable » de la membrane flexible perméable au gaz.
Il y a plusieurs étapes critiques dans le protocole présenté. Tout d'abord, pour initier une expérience à long terme avec une dynamique fluide stable, les microbulles doivent être évitées autant que possible. Par conséquent, il est important de préréchauffer et de dégazer le milieu de culture (étape 3.4.2) avant de charger le support dans les seringues. La manipulation du chargement et de la distribution des médias doit être effectuée lentement et doucement pour empêcher la formation de bulles. Le modèle de PDMS devrait être traité avec le plasma d'oxygène (étape 3.4.3) avant de se connecter au système d'approvisionnement de médias de culture. Le traitement du plasma d'oxygène assure l'hydrophilie de la surface du PDMS et réduit considérablement la possibilité de piégeage de microbulles. Dans l'étape 3.4.7., en plaçant la puce sur le dessus de la membrane de culture cellulaire, la puce PDMS devrait s'approcher de la surface liquide avec un angle d'inclinaison de 15 degrés pour se débarrasser des bulles (le cas échéant) sur la surface liquide à l'intérieur du plat de culture. Deuxièmement, la méthode d'étanchéité à la pression nécessite un système stable d'approvisionnement en gaz qui met la membrane de la culture cellulaire sous pression. La pression doit être fixée entre 0,2 et 0,6 psi. La pression inférieure à 0,2 psi est insuffisante pour l'étanchéité des copeaux. Au-dessus de 1,2 psi, une quantité importante de gaz imprégnerait la membrane et générerait des bulles dans le modèle microfluidique. Nous notons que si les composants de la plaque métallique à 3 puits ne sont pas correctement assemblés (y compris le corps de la plaque, le porte-plat de culture perméable au gaz, un porte-copeaux PDMS, un porte-fenêtres en verre, des anneaux O et une paire de vitres de 35 mm), on pourrait identifier les fuites de gaz comme la lecture de pression serait insensible à l'augmentation du flux de gaz. Le problème de fuite peut être résolu simplement en faisant un test de fuite et en réassemblant ensuite les composants.
La principale forme de données acquises avec l'utilisation de la technologie EA est l'imagerie. Comme mentionné précédemment, la technologie EA peut être installée sur n'importe quel microscope inversé. Cependant, pour exploiter pleinement les avantages du système, il est fortement recommandé d'installer le système sur un microscope fluorescent inversé équipé d'un stade x-y entièrement motorisé, d'un bouton de mise au point motorisé, d'un obturateur motorisé et d'un cube de filtre motorisé. Aussi, sachez que Perfect Focus pourrait ne pas garantir une qualité d'image satisfaisante. Nous vous suggérons d'utiliser un logiciel d'imagerie qui permet l'acquisition d'images multidimensionnelles et un script d'imagerie personnalisé. Garder les images bien ciblées pourrait être difficile sans une commande d'autofocus périodique (toutes les 24 heures ou 48 heures), qui a généré une surface de mise au point personnalisée pendant le cycle d'acquisition d'image.
La technologie d'EE microfluidique présentée a été mise en œuvre pour étudier la dynamique d'adaptation et d'évolution dans les métapopulations de cellules cancéreuses de la prostate sous un paysage de stress chimiothérapeutique12. Nous avons également démontré l'émergence des cellules cancéreuses géantes polyploïdes de résistance de drogue dans cette micro-écologie hétérogène tumeur-comme, montrant que l'hétérogénéité environnementale combinée avec la migration de cellules dans la population de tumeur causerait l'amplification sur l'émergence de phénotypes résistants13. Avec la capacité de commander et de surveiller les comportements des populations mixtes de cellules de tumeur sous des gradients bien contrôlés de stress, notre technologie microfluidique d'EE peut également servir de plate-forme pour étudier des mécanismes de régulation et la transformation phénotypique impliquée dans EMT dans le cadre des stratégies thérapeutiques contre le cancer21. Enfin, la méthode d'emballage d'étanchéité à la pression présentée peut également être mise en œuvre dans d'autres systèmes microfluidiques qui nécessitent un ajustement sophistiqué de la composition du gaz ambiant ainsi que des capacités d'expérience en aval. Par exemple, la même méthode d'emballage a été utilisée pour incorporer différents modèles microfluidiques afin d'étudier comment les ondes bactériennes de population se propagent à travers les barrières physiques22.
En résumé, la dynamique collective des populations est qualitativement différente des comportements unicellulaires. La technologie d'EE microfluidique permet l'étude quantitative de la dynamique évolutive et des comportements phénotypiques individuellement et collectivement en fonction du temps. Cette technologie peut présenter un modèle in vitro plus pertinent sur le plan physiologique pour la recherche sur le cancer, et potentiellement pour le développement et le dépistage de médicaments précliniques.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêts n'a été déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par NSF PHY-1659940.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringes | BD | 14-823-16E | |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | 1x anti-anti |
| AZ 300 MIF | Merck KGaA | 18441123163 | Photoresist developer |
| AZ1518 | Merck KGaA | AZ1518 | Photoresist |
| AZ4330 | Merck KGaA | AZ4330 | Photoresist |
| Cr Chromium Etchant | Sigma-Aldrich | 651826 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation | 10437028 | |
| Heidelberg DWL 66+ laserwriter | Heidelberg Instruments | DWL66+ | Writing photomask |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | 379212 | For photoresist adhesion enhancement |
| Hollow steel pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard |
| ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame | ibidi | 10929 | On-stage incubator |
| Luer-Lok 23 G dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A684 | To connect syringes and tubings |
| Lumox dish 35 | Sarstedt | 94.6077.331 | Gas-permeable cell culture dish |
| Microposit Remover 1165 | Dow Electronic Materials | Microposit Remover 1165 | Photoresist stripper |
| Microseal B Adhesive Sealer | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | Adhesive sealer |
| O-Ring (for Lumox plate sealing) | McMaster-Carr | 9452K114 | Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70 |
| O-Ring (for bottom glass window sealing) | McMaster-Carr | 9452K74 | Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70 |
| Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System | Plasmatic Systems, Inc | Plasma-Preen | Oxygen plasma system |
| RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | 11875-093 | |
| Samco RIE800iPB DRIE | Samco | RIE800iPB | Deep reactive-ion etching system |
| Suss MA6 mask aligner | SUSS MicroTec | MA6 | Mask aligner |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | PDMS elastomer |
| TePla M4L plasma etcher | PVA TePla | M4L | Plasma etcher |
| Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) | Sigma-Aldrich | 448931 | For silicon wafer silanization |
| Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) | Cole-Parmer | EW-06419-01 | Tubings for media delivery |
References
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