Summary
在这里，我们描述了用于生成使用pLEXSY系统将eGFP基因表达为稳定整合转基因的L. panamensis 和 L. donovani 菌株的方法。通过限制稀释来克隆转染的寄生虫，并选择两种物种中荧光强度最高的克隆进一步用于药物筛选测定。
Abstract
利什曼原虫属的原生动物寄生 虫引起利什 曼病，这是一种具有不同临床表现的疾病，影响着全世界数百万人。 多诺瓦尼乳杆菌 感染可导致致命的内脏疾病。在巴拿马、哥伦比亚和哥斯达黎加， 帕纳梅斯乳杆菌 是大多数报告的皮肤和皮肤黏膜利什曼病病例的原因。使用迄今为止可用的方法研究大量候选药物是相当困难的，因为它们对于评估化合物对寄生虫细胞内形式的活性或进行 体内 测定非常费力。在这项工作中，我们描述了 L. panamensis 和 L. donovani 菌株的产生，其基因的组成性表达编码增强的绿色荧光蛋白（eGFP）整合到编码18S rRNA（ssu）的位点中。编码eGFP的基因是从商业载体中获得的，并通过聚合酶链反应（PCR）扩增以富集它并为 BglII和 KpnI酶添加限制性位点。通过琼脂糖凝胶纯化分离eGFP扩增子，用 酶BglII和 KpnI消化，并连接到先前用同一组酶消化的 利什曼原虫 表达载体pLEXSY-sat2.1中。将具有克隆基因的表达载体在 大肠杆菌中繁殖，纯化，并通过集落PCR验证插入片段的存在。纯化的质粒被线性化并用于转染 多诺瓦尼乳杆菌 和 白曲霉 寄生虫。通过PCR验证了该基因的整合。通过流式细胞术评估eGFP基因的表达。通过限制稀释法克隆荧光寄生虫，并使用流式细胞术选择荧光强度最高的克隆。
Introduction
利什曼原虫属的原生动物寄生虫引起利什曼病，这是一种具有广泛临床表现的疾病。该病在98个国家流行，年发病率估计为90万至160万例1。对人类具有致病性的利什曼原虫分为两个亚属，即L。（利什曼原虫）和L.（维亚尼亚）。感染属于L的一些物种。（利什曼原虫）亚属，如多诺瓦尼乳杆菌和婴儿利什曼病，可能导致内脏利什曼病（VL），如果不及时治疗，这是致命的2。属于L的物种。（Viannia）亚属与中美洲和南美洲的大多数皮肤利什曼病（CL）和皮肤黏膜利什曼病（MCL）病例有关，特别是在巴拿马、哥伦比亚和哥斯达黎加，帕纳美军团菌是这些临床表现的主要病因3,4。
现有的抗利什曼原虫化疗包括五价锑、米替福辛和两性霉素 B 等药物，毒性高且价格昂贵。此外，近几十年来耐药性的增加已成为干扰全球患者有效治疗的因素5。利什曼原虫属物种之间在药物敏感性方面存在实质性差异，特别是在新世界和旧世界物种之间 6,7。由于这些原因，有必要努力确定和开发新的抗利什曼原虫药物，特别注意针对特定物种的方法。使用传统方法研究大型候选药物库非常困难，因为这些方法对于评估化合物对细胞内无鞭毛体的活性或进行体内实验非常费力8;因此，有必要开发减少这些缺点的新技术，包括报告基因的实施和高内涵表型筛选测定的开发9。
报告基因的使用已经显示出提高药物筛选过程效率的潜力，因为它促进了高通量和体内测定的开发。表达几种报告基因的重组利什曼原虫寄生虫已由各种研究小组产生。报告基因，如β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶和荧光素酶，已被引入几种利什曼原虫物种，使用游离体载体，显示出在寄生虫的细胞外和细胞内形式的药物筛选中的效用有限 10,11,12,13,14,15.这些方法的局限性在于需要在培养中具有强大的选择压力以避免消除游离体构建体，以及使用额外的试剂来揭示报告基因的活性。相反，绿色荧光蛋白（GFP）及其变体增强型绿色荧光蛋白（eGFP）已被用于产生大量转基因利什曼原虫菌株，用于体外药物筛选测定，因为它们具有灵活性和灵敏度，以及使用流式细胞术或荧光测定法自动化筛选过程的可能性15，16,17,18,19.尽管结果有希望，但这些转基因菌株的培养物在荧光水平上具有高度异质性，因为所有寄生虫中GFP基因的拷贝数并不相同。此外，保持荧光需要对培养物中的寄生虫施加恒定的选择压力，因为GFP基因是在游离体构建体中引入的。
由于上述原因，许多努力都集中在开发生产稳定重组菌株的新方法上。这些努力主要依赖于将报告基因整合到核糖体位点中，利用核糖体基因的较高转录率20。已经产生了婴儿乳杆菌和亚马逊乳杆菌菌株，整合了编码β-半乳糖杀灭酶21、IFP 1.4、iRFP22 和 tdTomato23 的基因，并且已经评估了它们在药物筛选测定中的有用性。不同的小组已经开发出多诺瓦尼乳杆菌菌株，通过同源重组将其编码基因整合到18S核糖体RNA位点（ssu位点）中，从而形成表达GFP;它们在转染的人群中显示出稳定和均匀的GFP表达，包括细胞内无鞭毛体24,25，并且它们在药物筛选测定中成功实施24,25,26。Bolhassani等人27开发了表达GFP的重杆菌和婴儿乳杆菌菌株作为整合的转基因。他们使用了整合载体pLEXSY，最初设计用于在使用L. tarentoale作为宿主的系统中蛋白质的转基因表达28。pLEXSY-GFP载体已被证明对于生成组成型表达GFP 24,25,27,29,30的不同利什曼原虫菌株非常有效。在这些寄生虫中，荧光是均匀的，并以细胞内形式维持，能够在感染小鼠的脚垫病变中检测到27。
在这项工作中，我们描述了用于生成L. panamensis 和 L. donovani 菌株的方法，这些菌株使用pLEXSY系统将编码eGFP的基因作为整合的转基因。通过此过程产生的菌株在我们的实验室中用于进行药物筛选测定，以评估天然和合成来源分子的潜在抗利什曼原虫活性。
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Protocol
为了保持样本无菌，所有涉及寄生虫培养的步骤都应在生物安全2级（BSL-2）罩内或根据当地健康和安全法规进行。该协议的图形摘要可在 图1中找到。
图 1：使用 pLEXSY-2.1 载体家族生成表达 eGFP 的 L. panamensis 和 L. donovani 寄生虫的方案摘要方案。 本文中描述的所有六个主要部分都在这里描述。1）扩增并将eGFP基因插入pLEXSY-2.1载体：扩增靶基因，添加酶 KpnI和 BglII的识别位点，eGFP扩增子和pLEXSY质粒与两种酶顺序消化，随后与T4连接酶连接。2）pLEXSY表达质粒的线性化：pLEXSY + eGFP构建体用 SwaI消化，用于7-8 kbp表达盒的线性化和纯化。3）转染和4）多克隆选择： 利什曼原虫 前鞭毛体通过电穿孔与表达盒转染，并放回培养物中，用于重组寄生虫的抗生素选择。通过流式细胞术确认寄生虫荧光。5）确认基因组整合和6）通过限制稀释进行克隆：pLEXSY-eGFP表达盒的整合通过诊断PCR确认，使用与表达盒杂交的正向引物和与表达盒中不存在的染色体序列杂交的反向引物。通过限制稀释的克隆，转染的培养物可以富集荧光寄生虫，并且可以选择平均荧光强度最高的克隆进行进一步应用。 请点击此处查看此图的大图。
1. 扩增并将eGFP基因插入pLEXSY-2.1载体
- eGFP基因的扩增
注意：由于该协议使用pLEXSY-2.1载体家族（参见材料表）在将表达盒整合到利什曼原虫物种的染色体18S rRNA位点（ssu）后用于靶蛋白的组成表达，第一步是在eGFP基因中引入包含限制性位点的序列，允许其插入pLEXSY-2.1载体。在这种情况下，由于eGFP只需要细胞质表达，因此将酶BglII和KpnI的限制性位点分别添加到eGFP基因的5'和3'末端。用KpnI克隆导致靶蛋白融合到六个残基的C端聚组氨酸标签中，然后在pLEXSY-2.1质粒中编码终止密码子，以进一步纯化目标蛋白。因此，反向引物序列不包含终止密码子。- 根据eGFP的质粒来源，使用NEBcutter （http://tools.neb.com/NEBcutter/index.php3）31 等限制性分析工具分析靶序列，以确保其不包含用于克隆的限制性内切酶（BglII和 KpnI）或Swa I的内部位点， SwaI是转染前用于载体线性化的酶。
- 设计用于 eGFP 扩增的正向和反向引物，其中包含 BglII 和 KpnI 限制性内切序列。例如，该协议的eGFP来源是pEGFP-N1-1X质粒32，引物序列是Bolhassani等人27报告的引物序列：
正向引物（EGFP1）：5'-ATGATATCAAGATCTATGGTGAGCAAGGGC-3'（BglII限制性位点以粗体显示）。
反向引物（EGFP2）：5'-GCTCTAGATTAGGTACCCTTGTACAGCTCGTC-3'（KpnI限制性位点以粗体显示）。 - 使用高保真聚合酶扩增靶基因，以确保编码序列的保存。例如，对于引物EGFP1和EGFP2，运行Bolhassani等人报告的PCR循环方案27。在94°C下运行2分钟的初始变性，然后在94°C下运行30个周期，在57°C下运行30秒，在72°C下运行1分钟。 在72°C下运行10分钟的最终延伸步骤。 加入终浓度为0.2μM的引物。
- 使用常规PCR产物纯化试剂盒或标准乙酸钠和乙醇沉淀纯化片段，如其他部分33所述。
- 将 eGFP 插入 pLEXSY-2.1 表达载体中
- 按照制造商的说明，使用 BglII 和 KpnI 修剪 eGFP-PCR 产品的末端。
- 首先，根据制造商的说明，为需要最低盐浓度（在这种情况下为 KpnI）的酶设置反应，并在37°C下孵育1小时。
- 然后，加入100mM NaCl和10单位 的BglII并孵育15分钟。纯化反应，如步骤1.1.4所述。
- 按照步骤 1.2.1 中描述的顺序消化方案，使用 BglII 和 KpnI 消化 pLEXSY 表达载体。
- 使用1：3的摩尔比将pLEXSY载体和eGFP基因与T4连接酶连接起来（载体：插入）。将 100 ng 消化的 pLEXSY 和 28 ng 消化的 eGFP 产物短暂加入含有连接酶缓冲液的 20 μL 反应中，终浓度为 1x 和 3 单位的 T4 DNA 连接酶。在4°C孵育过夜。
- 使用标准转化方案33在步骤1.2.3中获得的连接产物转化感受态大肠杆菌细胞，例如XL-10，DH5α或DH10B。将转化的细胞接种在Luira-Bertani（LB）-氨苄青霉素琼脂中，并在30°C下孵育24小时以选择重组克隆（pLEXSY质粒在30°C下在大肠杆菌中比在37°C下更稳定）。
- 通过集落PCR筛选质粒中插入片段的存在。
- 挑选单个菌落，重悬于20μL无核酸酶水中，在95°C下加热15分钟，并取1μL裂解物作为用于菌落PCR的DNA模板。使用步骤1.1.2中所述的正向引物进行eGFP扩增（在本例中为 EGFP1）和引物A264（5'-CATCTATAGAGAAGTACACGTAAAAG-3'）作为反向引物29。
- 引物A264设计用于在pLEXSY-2.1表达载体中插入片段的终止密码子后退火80 bp。例如，对于引物对 EGFP1 + A264，使用PCR循环方案，包括在94°C下初始变性2分钟，然后在94°C下进行30个30秒的循环，在50°C下30秒，在72°C下1分钟。 在72°C下运行10分钟的最终延伸步骤。 以0.2μM的终浓度加入引物。
注意：使用此底漆套装的预期产品长度为 859 bp。引物 EGFP1 和A264的退火位点如图 2所示。
- 从阳性克隆中制备纯化的质粒DNA，以便使用市售质粒分离试剂盒或标准碱性沉淀33进行后续转染。在30°C下使用50mL过夜培养物分离至少10μg质粒/阳性克隆。
- 按照制造商的说明，使用 BglII 和 KpnI 修剪 eGFP-PCR 产品的末端。
2. pLEXSY表达质粒的线性化
- 使用至少 10 μg 纯化的 pLEXSY-eGFP 质粒用 SwaI 进行消化（识别位点：5'-ATTTAAAT-3'）。在25°C下消化3-4小时，并在65°C下热灭活20分钟。
- 在琼脂糖凝胶电泳中运行消化产物以分离所得片段。这种消化将产生两个片段，一个2.9 kbp片段代表 大肠杆菌复制和选择所需的元素，一个7-8 kbp片段代表线性表达盒。
- 使用商业琼脂糖凝胶提取试剂盒纯化表达盒。
3. 电穿孔转染白曲霉和多诺瓦尼乳杆菌
注： 利什曼原虫 培养如别处所述进行34.在本例中，在施耐德昆虫培养基中培养 Panamensis 和 L. donovani 前鞭毛体，补充20%（v / v）胎牛血清（FBS）和50μg/ mL庆大霉素，并在26°C下孵育。
- 培养寄生虫培养物，直到有足够的对数期或早期固定期前鞭毛体，每次转染使用大约 4 x 107 个寄生虫。到达固定相之前，每个培养瓶的最大细胞密度可能因 利什曼原虫 种类以及菌株对实验室条件的适应程度而异。如果需要，合并多个培养瓶的内容物。
- 在室温（RT）下以2,000× g 离心寄生虫培养物3分钟。
- 将沉淀重悬于4°C（21mM HEPES，137 mM NaCl，5 mM KCl，0.7 mM Na2HPO4和6 mM葡萄糖;pH 7.5）27 的电穿孔缓冲液中，以获得1 x 108 个寄生虫/ mL的浓度。放在冰上10分钟。
注意：电穿孔缓冲液在使用前必须通过过滤进行灭菌。 - 同时，在最大体积为 50 μL 的水或 10 mM tris 缓冲液 （pH 8.0） 和 d = 2 mm 的电穿孔比色皿中构建含有 2-10 μg 线性化 pLEXSY-eGFP 的预冷管。
- 将 350 μL 预冷寄生虫加入带有线性化质粒的试管中，并将整个 400 μL 转移到冰上的电穿孔比色皿中。同时，电穿孔没有质粒DNA的寄生虫细胞作为阴性对照。
- 使用以下两种方案之一进行电穿孔：
指数衰减：450 V，450 μF，一个脉冲。
时间常数：450 V，T = 3.5 ms，一个脉冲。
注意：这些协议是使用带有PC和CE模块的商业基因脉冲发生器（材料表）运行的。 - 将比色皿放回冰上10分钟，并将电穿孔寄生虫转移到5mL的适当培养基中。这个例子使用了施耐德的昆虫培养基，并补充了20%（v / v）FBS。在26°C孵育20小时。
4. 培养中的多克隆选择
- 电穿孔后约20小时，在显微镜下观察培养物。至少一半的寄生虫种群应表现出视觉良好的形态和运动性（带有振荡鞭毛的液滴状前鞭毛在介质中移动和/或形成活跃的寄生虫聚集体）。根据所使用的pLEXSY质粒添加适当的选择性抗生素。在本例中，使用pLEXSY-sat2.1，其含有链蓼氨酸乙酰转移酶作为选择标记。因此，使用诺苏里辛作为浓度为 0.1 mg/mL 的选择性抗生素。
- 显微镜下跟踪培养物，直到看到有和没有质粒DNA电穿孔的寄生虫之间的明显差异。
- 通过流式细胞术验证寄生虫荧光。
- 在室温下以 2,000 x g 离心 1 mL 固定相培养物 3 分钟。 在 PBS 中洗涤两次，并将最终沉淀重悬于 1 mL PBS 中。
注意：eGFP的荧光可以在大多数商业细胞仪的FL1通道中检测到。正向和侧向散射的增益设置以及 FL1 通道可能因细胞仪而异。在本例中，使用了CyFlow空间（Sysmex）细胞仪。 - 运行样品，以0.5μL/s的速度收集20,000个事件，并将前向散射（FSC）、侧向散射（SSC）和荧光1（FL-1）通道的增益值分别设置为225.0、200.0和520.0。使用非荧光寄生虫运行对照样品，以确定FSC与SSC点图中的寄生虫种群。
- 创建一个包含寄生虫种群的门（G1），并通过该门过滤FL-1通道，以确定前鞭毛体的自发荧光，并为FL-1通道设置范围门（G2）。
- 运行转染的寄生虫以验证是否有荧光。记录G1中荧光寄生虫的百分比和G2中荧光强度的平均值。
- 在室温下以 2,000 x g 离心 1 mL 固定相培养物 3 分钟。 在 PBS 中洗涤两次，并将最终沉淀重悬于 1 mL PBS 中。
5. 确认基因组整合
注意：pLEXSY-eGFP表达盒的整合可以通过诊断PCR确认，使用与表达盒杂交的前向引物（取决于所使用的pLEXSY-2.1载体）和反向引物F3002（5'-CTGCAGGTTCACCTACTACACTAC-3'）杂交到表达盒中不存在的染色体 ssu侧翼序列。在本例中，F2999正向引物（5'-CCTAGTATGAAGATTTCGGTGATC-3'）在pLEXSY-sat2.1表达盒中杂交时使用。用于诊断PCR的集成表达盒和引物退火位点的示意图如图 2所示。
- 通过常规苯酚/氯仿提取35 或使用商业试剂盒从 2-5 mL 的固定期寄生虫培养物中纯化基因组 DNA。
- 使用循环方案对pLEXSY-sat2.1进行诊断PCR，该方案包括在94°C下初始变性2分钟，然后在94°C下进行30个周期，在53°C下30秒，在72°C下1分钟。 在72°C下运行10分钟的最终延伸步骤。 以0.2μM的终浓度加入引物。
图 2：集成表达盒的示意图。 标记为Chr-S（灰色）的框表示18S rRNA位点（ssu）的相邻染色体序列，表达盒被整合到其中。整合表达盒由 5' 和 3' 序列（蓝色）组成，用于同源重组为 ssu 位点，额外的 利什曼原虫 核糖体启动子（红色）用于增强蛋白质生成，eGFP 基因（绿色）、选择标记基因（黄色）和三个非翻译区域（浅灰色），即UTR1、2和3，它们为转录后mRNA处理提供剪接信号，以优化 利什曼原 虫中eGFP和选择标记的表达。用于通过菌落PCR（步骤1.2.5）验证插入片段存在的正向和反向引物的退火位点分别用标记为cpcr-fwd（EGFP1引物）和cpcr-rev（A264引物）的黑色箭头标记，其分隔为859 bp产物。用于通过诊断PCR（步骤5）验证基因组整合的正向和反向引物的退火位点分别由标记为sat-fwd（F2999引物）和ssu-rev（F3002引物）的黑色箭头标记，它们划定了2,271 bp产物。 请点击此处查看此图的大图。
6. 通过限制稀释进行克隆（可选）
- 通过流式细胞术确认荧光后，制备浓度为5个前鞭毛/ mL36的重组寄生虫稀释液。
- 将 100 μL 该稀释液加入 96 孔板的每个孔中。以这种方式，板以0.5个前鞭毛体/孔的平均密度接种，这确保了某些孔接收单个寄生虫，同时最大限度地减少了每孔具有多个寄生虫的可能性36。
- 将板不受干扰至少12小时。以最小100倍的放大倍数显微镜跟踪板，直到检测到寄生虫生长的孔。
- 当板孔中充满寄生虫时，使用内容物接种 5 mL 培养物。这需要1-2周。
- 当克隆接种的培养物到达固定相时，使用流式细胞术验证荧光，如步骤4.3中所述。根据荧光寄生虫的百分比和在FL-1通道中测量的平均荧光强度，选择要用于进一步体 外 和 体内 测定的克隆。瞄准具有98%-99%荧光寄生虫的克隆，并选择具有最高平均荧光强度的克隆。
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Representative Results
在构建pLEXSY-eGFP构建体并转化感受态 大肠杆菌 细胞后，含有带有eGFP插入片段的构建体的菌落将在运行第1.2节所述的集落PCR后产生约859 bp产物（图3A）。使用 SwaI从阳性菌落中纯化的质粒的全消化应在凝胶电泳中得到两个特征片段，一个2.9 kbp片段，是PLEXSY载体的一部分，其中包含在 大肠杆菌中复制和选择的所有必要元件，以及一个7-8 kpb片段代表用于转染的线性表达盒（图3B）。
转染后，多克隆选择主要是定性的。用抗生素选择期间对寄生虫培养物的状态进行显微镜监测，特别注意寄生虫形态和运动。成功恢复转染寄生虫培养物后，应在流式细胞仪的FL-1通道中检测有效表达eGFP的寄生虫（图4A）;不同利 什曼原虫 种属的转染效率可能有所不同。在这项工作中，经过多克隆选择，通过流式细胞术分析的98.44%的 多诺瓦尼乳杆菌 寄生虫具有荧光，而 白曲霉菌 的荧光率为82.00%（图4B）。如果pLEXSY-eGFP表达盒已成功整合到 ssu 位点中，则应在运行第5节中所述的诊断PCR后观察2.3 kbp产物（图4C）。这些结果确保获得的重组寄生虫将eGFP组成型表达为整合的转基因，并将在寄生虫培养物的后续传代中保持稳定。
通过限制稀释进行克隆可以富集转染效率较低的荧光寄生虫群体，例如Panamensis乳杆菌，以及选择具有最高荧光强度的克隆。本工作中使用的每种利什曼原虫物种都获得了四个克隆（表1），即Lpan-A7，F11，F12和H2用于L. panamensis，Ldon-C1，G4，F2和H1用于L. donovani。荧光寄生虫百分比最高的克隆（Lpan-F11 = 95.74%;Ldon-C1 = 99.16%）和平均荧光强度（Lpan-F11 = 35.63 相对荧光单位 [RFU];Ldon-C1 = 14.12 RFU）被选择进一步用于药物筛选测定。
图3：制备用于转染的pLEXSY-eGFP构建体的 代表性结果。 （A）菌落PCR的代表性结果。车道 1：1 kb 梯子（碱基对中的单位）;泳道 2、10 和 12：存在 eGFP 插入片段的阴性样本;泳道 3-9 和 13-14：存在 eGFP 插入片段的阳性样品。（B） 使用 SwaI. 车道 1 线性化的结果：1 kb 梯形图（碱基对中的单位）;泳道2-4：从三个不同的菌落纯化的质粒的消化反应，这些菌落对eGFP插入片段的存在呈阳性。观察到一个2.9 kbp片段代表 大肠杆菌复制和选择所需的元素，以及一个7-8 kpb片段代表线性化表达盒。两种凝胶均以1%的琼脂糖浓度制备。 请点击此处查看此图的大图。
图4：确认eGFP表达和表达盒染色体插入的代表性结果 。 （A）FL-1通道中的流式细胞术直方图。红色：不含eGFP的野生型细胞;蓝色：转染的 帕纳梅斯乳杆菌 寄生虫，82.00%的人群表达eGFP。（B） 帕纳蒙斯乳杆菌 （Lpan-1）和 多诺瓦尼乳杆菌 （Ldon-1）之间的转染结果比较。多克隆选择后， 多诺瓦尼乳杆菌 的转染效率（98.44%）高于 白曲霉 （82.00%）。（C）用于确认基因组整合的PCR结果。L：100 bp阶梯（碱基对中的单位）;泳道 1-4：来自四个不同克隆的 L. panamensis 样品显示 pLEXSY-sat2.1 整合到 SSU 位点的特征性 2.3 kbp 产物。 请点击此处查看此图的大图。
| 物种 | 克隆代码 | 荧光寄生虫的百分比 | 平均荧光强度* |
| 帕纳蒙斯乳杆菌 | 泛-A7 | 90.00 | 24.70 |
| Lpan-F11 | 95.74 | 35.63 | |
| 泛-F12 | 92.85 | 34.44 | |
| 泛-H2 | 85.00 | 20.66 | |
| L.多诺瓦尼 | Ldon-C1 | 99.16 | 14.12 |
| Ldon-G4 | 99.21 | 13.96 | |
| Ldon-F2 | 97.96 | 11.67 | |
| Ldon-H1 | 98.97 | 12.90 |
表1：通过限制稀释获得的克隆。 通过限制对本工作中使用的每种 利什曼原虫 物种的稀释，获得了四个克隆。报告每个克隆的荧光寄生虫百分比和平均荧光强度。*荧光以相对荧光单位（RFU）表示。
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Discussion
已经在几种原生动物寄生虫中研究了各种报告基因的优缺点。其中，GFP和eGFP具有固有荧光，易于定量和成像。这些蛋白质的荧光活性可以使用荧光显微镜、荧光测定法或流式细胞术进行最少的操作来检测。很少有研究用于产生表达GFP的L。（Viannia）菌株，尽管GFP及其衍生物作为旧世界利什曼原虫物种15,16,18,24的报告基因具有健壮性。Varela等人37开发了将GFP表达为游离体转基因的L. panamensis菌株。轴突前鞭毛体和细胞内无鞭毛体的流式细胞术分析表明这些寄生虫可用于药物筛选测定。然而，荧光非常异质，转染人群中荧光寄生虫的数量取决于抗生素银霉素的恒定选择压力。这些事实限制了将这些寄生虫用作细胞内无鞭毛体进行药物筛选测定，因为图尼霉素不能添加到受感染的巨噬细胞38中，使细胞内无鞭毛虫群体中存在低荧光的寄生虫，这可能会偏倚受感染巨噬细胞的定量。
使用pLEXSY等载体是一种强大而可靠的工具，可通过同源重组整合转基因来稳定修饰利什曼原虫寄生虫28。将pLEXSY盒整合到18S rRNA位点（ssu）中，其转录在RNA聚合酶I强启动子的控制下，导致更高的转录率20。该系统的使用已被证明允许目标蛋白27的稳定和均匀表达。这些特征有利于eGFP的表达及其在感染细胞中具有均匀荧光水平的细胞内测定中的使用，以及其在小鼠模型中用于实验感染。本协议中使用的pLEXSY-2.1载体家族在表达盒前面设计了一个额外的利什曼原虫核糖体启动子，增强了蛋白质的产生29,30。
在该协议中，有几个关键步骤可以获得最佳结果。首先，应使用高保真聚合酶33进行靶基因的克隆，当使用BglII/KpnI组合进行克隆时，应使用顺序酶切方案对靶DNA和表达载体进行消化。后者是因为没有缓冲液使BglII和KpnI表现出最佳活性，尽管两种酶在相同温度（37°C）下具有最佳活性。其次，大肠杆菌转化后重组克隆的选择应在30°C下进行，因为pLEXSY质粒在该温度下大肠杆菌28,29更稳定。此外，L. panamensis和L. donavani的生长速度可能完全不同。在本文描述的实验过程中，帕纳蒙斯乳杆菌通常需要更长的时间才能达到固定相。不同实验室的生长速率也可能因菌株而异;因此，有必要表征实验室菌株的生长速率，以估计达到电穿孔所需的寄生虫浓度所需的时间。使用Bolhassani等人报告的缓冲液进行电穿孔是一项重要的修改，与在培养基中直接电穿孔相比，与原始耶拿生物科学协议所建议的那样，显着提高了电穿孔寄生虫的存活率。在多克隆选择过程中，在添加选择性抗生素之前，不要让电穿孔培养物过度生长是非常重要的;否则，非重组寄生虫将超过重组寄生虫27。需要连续传代一次或两次（1：10接种）到含有适当抗生素的新鲜培养基中，以获得抗生素抗性重组寄生虫的浑浊培养物和明确的阴性对照。应在首次添加抗生素后 5 天内进行传代。最后，在pLEXSY表达盒的转染和整合效率方面，白乳杆菌和多诺瓦尼乳杆菌24,37之间存在显著差异。在多诺瓦尼乳杆菌中，在多克隆选择后通过流式细胞术分析的总人群中，几乎98%显示出荧光，而在白乳杆菌中，荧光寄生虫的百分比约为80%。出于这个原因，通过限制稀释进行克隆的可选步骤是一种修饰，主要用于获得白曲霉菌群体，其中通过流式细胞术分析的95%以上的寄生虫是荧光的。pLEXSY质粒的使用仅限于利什曼原虫物种的基因组修饰，因为它们最初设计用于使用塔伦托拉乳杆菌作为蛋白质生产平台28。尽管pLEXSY已被证明在几种与L. tarentolae21,24,27不同的利什曼原虫物种中起作用，但在处理新的利什曼原虫物种时，验证ssu序列的保守性以确保pLEXSY质粒中的重组位点有效非常重要。
本文中描述的方法允许产生具有eGFP或任何其他感兴趣的报告基因的组成性和稳定表达的重组 利什曼原 虫寄生虫。在这些寄生虫中，荧光是均匀的，并且以细胞内形式维持。因此，通过该过程产生的菌株可用于标准化高通量药物筛选测定，以评估天然和合成来源分子的潜在抗利什曼原虫活性。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作由巴拿马国家科学、技术和创新秘书处（SENACYT）资助，批准号为NI-177-2016，巴拿马国家研究系统（SNI），授权号为SNI-169-2018，SNI-008-2022和SNI-060-2022。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Microplates | Corning | CLS3340 | Flat bottom clear, black polystyrene, sterile, lid |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A8351 | BioXtra, suitable for cell culture |
| BglII restriction enzyme | New England BioLabs | R0144S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Cell Culture Flasks | Corning | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad | 17001401 | |
| CyFlow Space | Sysmex | Not available | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5% |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Gel Loading Buffer | Sigma-Aldrich | G2526 | The rate of migration varies with gel composition. Dilute 1:3 to 1:6 with sample before loading. |
| Gene Pulser Xcell Electroporation System | Bio-Rad | 1652660 | The system is composed of a main unit, two accessory modules, the capacitance extender (CE module) and the pulse controller (PC module), and a ShockPod cuvette chamber. |
| Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes | Bio-Rad | 1652086 | Pkg of 50, 0.2 cm–gap sterile electroporation cuvette, for use with the Gene Pulser and MicroPulser Systems, for mammalian and other eukaryotic cells |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg/mL in deionized water, liquid, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| GoTaq Long PCR Master Mix | Promega | M4021 | |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Inverted microscope | Olympus | IXplore Standard | |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3142S | 4,000 units. 20,000 units/mL |
| LB Broth with agar | Sigma-Aldrich | L3147 | Highly-referenced nutrient-rich microbial growth powder medium with Agar, suitable for regular E.coli culture. |
| LB Broth | Sigma-Aldrich | L2542 | Liquid microbial growth medium |
| Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad | 1640300 | Mini horizontal electrophoresis system, includes 8- and 15-well combs, 7 cm x 10 cm UV-transparent tray |
| pEGFP-N1-1x | Addgene | 172281 | Expressing eGFP mRNA fused with 1 tandem repeat of a 50-base sequence |
| pLEXSYcon2.1 expression kit | Jena Bioscience | EGE-1310sat | Contains integrative constitutive expression vector pLEXSY-sat2.1. Antibiotic selection of transfectants with Nourseothricin (NTC, clonNAT). Contains all primers for diagnostic PCRs and sequencing. |
| Potassium Chloride | Millipore | 529552 | Molecular Biology Grade - CAS 7447-40-7 - Calbiochem |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | Up to 15 μg of Transfection-Ready Plasmid from 3 mL cultures. |
| Schneider′s Insect Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | Medium used in our laboratory for culturing Leishmania. |
| SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥99% (titration) |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | RDD038 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, ≥99.0%, free-flowing, Redi-Dri |
| SwaI restriction enzyme | New England BioLabs | R0604S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Syringe filters | Corning | CLS431212 | regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm, pore size 0.2 μm |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | Thermal cycler system, includes 96-well thermal cycler, power cord, tube support ring |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | Joins two DNA strands with cohesive or blunt ends |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | BioReagent, suitable for electrophoresis, 10× concentrate |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9285 | |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL. Features the kanamycin-resistance gene on the F' episome, for extremely demanding cloning in chloramphenicol-resistant vectors. Efficiency: > 5 x 10 9 transformants/µg pUC18 DNA. |
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