Summary
In dieser Arbeit beschreiben wir die Methodik, die zur Generierung von L. panamensis- und L . donovani-Stämmen verwendet wird, die das Gen für eGFP als stabiles integriertes Transgen unter Verwendung des pLEXSY-Systems exprimieren. Transfizierte Parasiten wurden unter Begrenzung der Verdünnung kloniert, und Klone mit der höchsten Fluoreszenzintensität in beiden Spezies wurden für die weitere Verwendung in Wirkstoff-Screening-Assays ausgewählt.
Abstract
Protozoen-Parasiten der Gattung Leishmania verursachen Leishmaniose , eine Krankheit mit unterschiedlichen klinischen Manifestationen, von der weltweit Millionen von Menschen betroffen sind. Eine Infektion mit L. donovani kann zu einer tödlichen viszeralen Erkrankung führen. In Panama, Kolumbien und Costa Rica ist L. panamensis für die meisten gemeldeten Fälle von kutaner und mukokutaner Leishmaniose verantwortlich. Die Untersuchung einer großen Anzahl von Wirkstoffkandidaten mit den bisher verfügbaren Methoden ist recht schwierig, da sie sehr aufwendig sind, um die Aktivität von Verbindungen gegen intrazelluläre Formen des Parasiten zu bewerten oder In-vivo-Assays durchzuführen. In dieser Arbeit beschreiben wir die Generierung von L. panamensis - und L. donovani-Stämmen mit konstitutiver Expression des Gens, das für ein verstärktes grün fluoreszierendes Protein (eGFP) kodiert, das in den Locus integriert ist, der für 18S rRNA (ssu) kodiert. Das Gen, das für eGFP kodiert, wurde aus einem kommerziellen Vektor gewonnen und durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert, um es anzureichern und Restriktionsstellen für die Enzyme BglII und KpnI hinzuzufügen. Das eGFP-Amplikon wurde durch Agarose-Gel-Reinigung isoliert, mit den Enzymen BglII und KpnI verdaut und in den Leishmania-Expressionsvektor pLEXSY-sat2.1 ligiert, der zuvor mit dem gleichen Enzymsatz verdaut worden war. Der Expressionsvektor mit dem klonierten Gen wurde in E. coli vermehrt, gereinigt und das Vorhandensein des Inserts mittels Kolonie-PCR verifiziert. Das gereinigte Plasmid wurde linearisiert und zur Transfektion von L. donovani - und L. panamensis-Parasiten verwendet. Die Integration des Gens wurde mittels PCR nachgewiesen. Die Expression des eGFP-Gens wurde mittels Durchflusszytometrie untersucht. Fluoreszierende Parasiten wurden unter Begrenzung der Verdünnung kloniert, und Klone mit der höchsten Fluoreszenzintensität wurden mittels Durchflusszytometrie ausgewählt.
Introduction
Protozoische Parasiten der Gattung Leishmania verursachen Leishmaniose, eine Krankheit mit einem breiten Spektrum klinischer Manifestationen. Diese Krankheit ist in 98 Ländern verbreitet und ihre jährliche Inzidenz wird auf 0,9 bis 1,6 Millionen Fälle geschätzt1. Leishmania-Arten, die für den Menschen pathogen sind, werden in zwei Untergattungen unterteilt, nämlich L. (Leishmanien) und L. (Viannia). Infektion mit einigen Arten, die zur L. Untergattungen (Leishmania), wie L. donovani und L. infantum, können zu viszeraler Leishmaniose (VL) führen, die unbehandelt tödlich verläuft2. Arten, die zur L. (Viannia) sind mit den meisten Fällen von kutaner Leishmaniose (CL) und mukokutaner Leishmaniose (MCL) in Mittel- und Südamerika, insbesondere in Panama, Kolumbien und Costa Rica, assoziiert, wobei L. panamensis der wichtigste ätiologische Erreger dieser klinischen Erscheinungsformen ist 3,4.
Die bestehende Chemotherapie gegen Leishmanien, die Medikamente wie fünfwertige Antimonia, Miltefosin und Amphotericin B umfasst, ist hochgiftig und teuer. Darüber hinaus sind in den letzten Jahrzehnten erhöhte Arzneimittelresistenzen zu den Faktoren hinzugekommen, die die wirksame Behandlung von Patienten weltweit beeinträchtigen5. Zwischen den Arten der Gattung Leishmania wurden erhebliche Unterschiede in Bezug auf die Arzneimittelempfindlichkeit nachgewiesen, insbesondere zwischen Arten der Neuen und der Alten Welt 6,7. Aus diesen Gründen ist es notwendig, die Anstrengungen auf die Identifizierung und Entwicklung neuer Medikamente gegen Leishmanien zu richten, wobei den speziesspezifischen Ansätzen besondere Aufmerksamkeit zu widmen ist. Die Untersuchung großer Bibliotheken von Wirkstoffkandidaten mit herkömmlichen Methoden ist recht schwierig, da diese Methoden sehr mühsam sind, um die Aktivität von Verbindungen gegen intrazelluläre Amastigoten zu bewerten oder In-vivo-Experimente durchzuführen8; Daher war es notwendig, neue Techniken zu entwickeln, die diese Nachteile verringern, einschließlich der Implementierung von Reportergenen und der Entwicklung von phänotypischen High-Content-Screening-Assays9.
Die Verwendung von Reportergenen hat gezeigt, dass sie das Potenzial haben, die Effizienz des Wirkstoff-Screening-Prozesses zu erhöhen, da sie die Entwicklung von Hochdurchsatz- und In-vivo-Assays erleichtert. Rekombinante Leishmania-Parasiten, die mehrere Reportergene exprimieren, wurden von verschiedenen Forschungsgruppen erzeugt. Reportergene wie β-Galactosidase, β-Lactamase und Luciferase wurden in mehrere Leishmania-Spezies unter Verwendung episomaler Vektoren eingeführt und zeigen einen begrenzten Nutzen für das Wirkstoff-Screening in extra- und intrazellulären Formen des Parasiten 10,11,12,13,14,15. Diese Ansätze haben die Einschränkung, dass sie einen starken Selektionsdruck in der Kultur erfordern, um die Eliminierung des episomalen Konstrukts zu vermeiden, sowie die Verwendung zusätzlicher Reagenzien, um die Aktivität des Reportergens aufzudecken. Umgekehrt wurden das grün fluoreszierende Protein (GFP) und seine Variante, das verstärkte grün fluoreszierende Protein (eGFP), aufgrund ihrer Flexibilität und Sensitivität sowie der Möglichkeit, den Screening-Prozess mittels Durchflusszytometrie oder Fluorometrie zu automatisieren, bei der Generierung einer großen Anzahl transgener Leishmania-Stämme für In-vitro-Wirkstoff-Screening-Assays verwendet15, 16,17,18,19. Trotz vielversprechender Ergebnisse waren die Kulturen dieser transgenen Stämme sehr heterogen in ihren Fluoreszenzwerten, da die Anzahl der Kopien des GFP-Gens nicht bei allen Parasiten gleich war. Darüber hinaus erforderte die Aufrechterhaltung der Fluoreszenz einen konstanten Selektionsdruck auf die Parasiten in der Kultur, da das GFP-Gen in einem episomalen Konstrukt eingeführt wurde.
Aus den oben genannten Gründen haben sich viele Bemühungen auf die Entwicklung neuer Methoden zur Herstellung stabiler rekombinanter Stämme konzentriert. Diese Bemühungen stützten sich hauptsächlich auf die Integration von Reportergenen in ribosomale Loci, wobei die höheren Transkriptionsraten ribosomaler Gene genutzt wurden20. Es wurden Stämme von L. infantum und L. amazonensis erzeugt, die die Gene integriert haben, die für β-Galactocidase21, IFP 1.4, iRFP22 und tdTomato23 kodieren, und sie wurden auf ihre Nützlichkeit in Wirkstoff-Screening-Assays untersucht. Verschiedene Gruppen haben L. donovani-Stämme entwickelt, die GFP konstitutiv exprimieren, indem sie ihr kodierendes Gen durch homologe Rekombination in den ribosomalen RNA-Locus 18S (ssu-Locus) integrieren24,25; Sie zeigten eine stabile und homogene GFP-Expression in der transfizierten Population, einschließlich intrazellulärer Amastigoten 24,25, und sie wurden erfolgreich in Wirkstoff-Screening-Assays implementiert24,25,26. Bolhassani et al.27 entwickelten Stämme von L. major und L. infantum, die GFP als integriertes Transgen exprimieren. Sie verwendeten den Integrationsvektor pLEXSY, der ursprünglich für die transgene Expression von Proteinen in einem System mit L. tarentolae als Wirt entwickelt wurde28. Der pLEXSY-GFP-Vektor hat sich als sehr effizient für die Generierung verschiedener Leishmania-Stämme erwiesen, die GFP 24,25,27,29,30 konstitutiv exprimieren. Bei diesen Parasiten ist die Fluoreszenz homogen und bleibt in den intrazellulären Formen erhalten, so dass sie in Fußballenläsionen infizierter Mäuse nachgewiesen werdenkann 27.
In dieser Arbeit beschreiben wir die Methodik, die zur Generierung von L. panamensis - und L. donovani-Stämmen verwendet wird, die das für eGFP kodierende Gen als integriertes Transgen unter Verwendung des pLEXSY-Systems exprimieren. Die durch diesen Prozess erzeugten Stämme werden in unserem Labor für die Durchführung von Medikamenten-Screening-Assays verwendet, die die potenzielle Anti-Leishmanie-Aktivität von Molekülen natürlichen und synthetischen Ursprungs bewerten.
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Protocol
Um die Proben steril zu halten, sollten alle Schritte, die eine Parasitenkultur beinhalten, in einer Haube der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) oder gemäß den örtlichen Gesundheits- und Sicherheitsvorschriften durchgeführt werden. Eine grafische Zusammenfassung dieses Protokolls finden Sie in Abbildung 1.
Abbildung 1: Zusammenfassendes Schema des Protokolls zur Generierung von eGFP-exprimierenden L. panamensis- und L. donovani-Parasiten unter Verwendung der pLEXSY-2.1-Vektorfamilie. Alle sechs Hauptabschnitte, die in diesem Artikel beschrieben werden, sind hier dargestellt. 1) Amplifikation und Insertion des eGFP-Gens in den pLEXSY-2.1-Vektor: Das Zielgen wird amplifiziert, wobei die Erkennungsstellen für die Enzyme KpnI und BglII hinzugefügt werden, und sowohl das eGFP-Amplikon als auch das pLEXSY-Plasmid werden sequenziell mit beiden Enzymen für die anschließende Ligation mit T4-Ligase verdaut. 2) Linearisierung des pLEXSY-Expressionsplasmids: Das pLEXSY + eGFP-Konstrukt wird mit SwaI zur Linearisierung und Aufreinigung der 7-8 kbp-Expressionskassette verdaut. 3) Transfektion und 4) polyklonale Selektion: Leishmania-Promastigoten werden mit der Expressionskassette durch Elektroporation transfiziert und zur antibiotischen Selektion rekombinanter Parasiten wieder in Kultur gebracht. Die Fluoreszenz der Parasiten wird durch Durchflusszytometrie bestätigt. 5) Bestätigung der genomischen Integration und 6) Klonierung durch Begrenzung der Verdünnung: Die Integration der pLEXSY-eGFP-Expressionskassette wird durch diagnostische PCR bestätigt, wobei ein Vorwärtsprimer mit der Expressionskassette und ein Reverse-Primer mit einer Chromosomensequenz hybridisiert wird, die in der Expressionskassette fehlt. Transfizierte Kulturen könnten durch Klonen durch Begrenzung der Verdünnung für fluoreszierende Parasiten angereichert werden, und Klone mit den höchsten mittleren Fluoreszenzintensitäten können für weitere Anwendungen ausgewählt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
1. Amplifikation und Insertion des eGFP-Gens in den pLEXSY-2.1-Vektor
- Amplifikation des eGFP-Gens
ANMERKUNG: Da dieses Protokoll die pLEXSY-2.1-Vektorfamilie (siehe Materialtabelle) für die konstitutive Expression von Zielproteinen nach der Integration der Expressionskassette in den chromosomalen 18S rRNA-Locus (ssu) von Leishmania-Spezies verwendet, besteht der erste Schritt darin, die Sequenzen in das eGFP-Gen einzuführen, die die Restriktionsstellen enthalten, die ihre Insertion in pLEXSY-2.1-Vektoren ermöglichen. Da eGFP in diesem Fall nur zytosolisch exprimiert werden muss, wurden die Restriktionsstellen für die Enzyme BglII und KpnI an den 5'- bzw. 3'-Enden des eGFP-Gens hinzugefügt. Die Klonierung mit KpnI führt zur Fusion des Zielproteins mit einem C-terminalen Polyhistidin-Tag aus sechs Resten, gefolgt von einem Stoppcodon, das im pLEXSY-2.1-Plasmid kodiert ist, um das gewünschte Protein weiter aufzureinigen. Aus diesem Grund enthält die umgekehrte Primersequenz kein Stoppcodon.- Abhängig von der Plasmidquelle für eGFP ist die Zielsequenz mit einem Restriktionsanalysewerkzeug wie NEBcutter (http://tools.neb.com/NEBcutter/index.php3)31 zu analysieren, um sicherzustellen, dass sie keine internen Stellen für die für die Klonierung verwendeten Restriktionsenzyme (BglII und KpnI) oder für SwaI, das Enzym, das für die Vektorlinearisierung vor der Transfektion verwendet wird, enthält.
- Entwerfen Sie Vorwärts- und Rückwärtsprimer für die eGFP-Amplifikation, die die Restriktionssequenzen BglII und KpnI enthalten. Zum Beispiel war die eGFP-Quelle für dieses Protokoll das pEGFP-N1-1X-Plasmid32, und die Primersequenzen waren die von Bolhassani et al.27 berichteten:
Vorwärts-Primer (EGFP1): 5'-ATGATATCAAGATCTATGGTGAGCAAGGGC-3' (BglII-Restriktionsstelle in Fettdruck).
Reverse Primer (EGFP2): 5'-GCTCTAGATTAGGTACCCTTGTACAGCTCGTC-3' (KpnI Restriktionsstelle in Fettdruck). - Amplifikation des Zielgens mit einer High-Fidelity-Polymerase, um die Erhaltung der kodierenden Sequenz zu gewährleisten. Führen Sie beispielsweise für die Primer EGFP1 und EGFP2 das PCR-Zyklusprotokoll aus, wie von Bolhassani et al.27 berichtet. Es wird eine anfängliche Denaturierung von 2 Minuten bei 94 °C durchgeführt, gefolgt von 30 Zyklen von 30 s bei 94 °C, 30 s bei 57 °C und 1 min bei 72 °C. Führen Sie einen letzten Verlängerungsschritt von 10 Minuten bei 72 °C durch. Geben Sie die Primer in einer Endkonzentration von 0,2 μM hinzu.
- Reinigen Sie das Fragment unter Verwendung eines herkömmlichen PCR-Produktreinigungskits oder einer Standard-Natriumacetat- und Ethanolfällung, wie an anderer Stelle beschrieben33.
- Insertion des eGFP in den pLEXSY-2.1 Expressionsvektor
- Kürzen Sie die Enden des eGFP-PCR-Produkts mit BglII und KpnI gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Zunächst wird die Reaktion für das Enzym mit der geringsten Salzkonzentration (in diesem Fall KpnI) gemäß den Anweisungen des Herstellers eingestellt und 1 h bei 37 °C inkubiert.
- Dann werden 100 mM NaCl und 10 Einheiten BglII zugegeben und 15 Minuten inkubiert. Reinigen Sie die Reaktion, wie in Schritt 1.1.4 beschrieben.
- Verdauen Sie den pLEXSY-Expressionsvektor mit BglII und KpnI gemäß dem in Schritt 1.2.1 beschriebenen sequentiellen Aufschlussprotokoll.
- Ligatieren Sie den pLEXSY-Vektor und das eGFP-Gen mit der T4-Ligase in einem molaren Verhältnis von 1:3 (Vektor:Insert). 100 ng verdautes pLEXSY und 28 ng verdautes eGFP-Produkt werden kurzzeitig zu einer 20-μl-Reaktion gegeben, die Ligasepuffer in einer Endkonzentration von 1x und 3 Einheiten T4-DNA-Ligase enthält. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Transformieren Sie kompetente E. coli-Zellen , wie XL-10, DH5α oder DH10B, mit dem in Schritt 1.2.3 erhaltenen Ligationsprodukt unter Verwendung von Standardtransformationsprotokollen33. Die transformierten Zellen werden in Luira-Bertani (LB)-Ampicillin-Agar plattiert und 24 Stunden lang bei 30 °C inkubiert, um rekombinante Klone auszuwählen (pLEXSY-Plasmide sind in E. coli bei 30 °C stabiler als bei 37 °C).
- Screening auf das Vorhandensein des Inserts in den Plasmiden mittels Kolonie-PCR.
- Einzelne Kolonien auswählen, in 20 μl nukleasefreiem Wasser resuspendieren, 15 Minuten lang bei 95 °C erhitzen und 1 μl des Lysats als DNA-Vorlage für die Kolonie-PCR entnehmen. Verwenden Sie den in Schritt 1.1.2 beschriebenen Vorwärtsprimer für die eGFP-Amplifikation (in diesem Beispiel EGFP1) und den Primer A264 (5'-CATCTATAGAGAAGTACACGTAAAAG-3') als umgekehrten Primer29.
- Der Primer A264 ist so konzipiert, dass er 80 bp nach dem Stoppcodon des Inserts in pLEXSY-2.1-Expressionsvektoren annealisiert. Verwenden Sie beispielsweise für das Primerpaar EGFP1 + A264 ein PCR-Zyklusprotokoll, das aus einer anfänglichen Denaturierung von 2 Minuten bei 94 °C besteht, gefolgt von 30 Zyklen von 30 s bei 94 °C, 30 s bei 50 °C und 1 min bei 72 °C. Führen Sie einen letzten Verlängerungsschritt von 10 Minuten bei 72 °C durch. Die Primer werden in einer Endkonzentration von 0,2 μM zugegeben.
HINWEIS: Das erwartete Produkt mit diesem Primer-Set ist 859 bp lang. Die Glühstellen für die Primer EGFP1 und A264 sind in Abbildung 2 dargestellt.
- Bereiten Sie die gereinigte Plasmid-DNA aus einem positiven Klon für die anschließende Transfektion unter Verwendung eines handelsüblichen Plasmid-Isolierungskits oder einer alkalischen Standardfällungvor 33. Verwenden Sie 50 ml einer Nachtkultur bei 30 °C zur Isolierung von mindestens 10 μg Plasmid/positivem Klon.
- Kürzen Sie die Enden des eGFP-PCR-Produkts mit BglII und KpnI gemäß den Anweisungen des Herstellers.
2. Linearisierung des pLEXSY-Expressionsplasmids
- Verwenden Sie mindestens 10 μg des gereinigten pLEXSY-eGFP-Plasmids für den Aufschluss mit SwaI (Erkennungsstelle: 5'-ATTTAAAT-3'). 3-4 h bei 25 °C verdauen und bei 65 °C 20 min erhitzen.
- Lassen Sie das Aufschlussprodukt in Agarose-Gelelektrophorese laufen, um die resultierenden Fragmente zu trennen. Dieser Aufschluss erzeugt zwei Fragmente, ein 2,9 kbp großes Fragment, das die für die Replikation und Selektion in E. coli notwendigen Elemente repräsentiert, und ein 7-8 kbp großes Fragment, das die linearisierte Expressionskassette darstellt.
- Reinigen Sie die Expressionskassette mit einem handelsüblichen Agarose-Gel-Extraktionskit.
3. Transfektion von L. panamensis und L. donovani durch Elektroporation
ANMERKUNG: Die Leishmania-Kultur wird wie an anderer Stelle beschriebendurchgeführt 34. In diesem Beispiel wurden L. panamensis und L. donovani Promastigoten in Schneiders Insektenmedium kultiviert, mit 20 % (v/v) fötalem Kälberserum (FBS) und 50 μg/ml Gentamicin ergänzt und bei 26 °C inkubiert.
- Züchten Sie die Parasitenkulturen, bis genügend Promastigoten in der Log-Phase oder in der frühen stationären Phase vorhanden sind, um etwa 4 x 107 Parasiten pro Transfektion zu verwenden. Die maximale Zelldichte pro Kulturkolben vor Erreichen der stationären Phase kann je nach Leishmania-Spezies und wie gut die Stämme an die Laborbedingungen angepasst sind, variieren. Fassen Sie bei Bedarf den Inhalt mehrerer Kulturflaschen zusammen.
- Zentrifugieren Sie die Parasitenkultur bei 2.000 x g für 3 min bei Raumtemperatur (RT).
- Das Pellet wird in einem Elektroporationspuffer bei 4 °C (21 mM HEPES, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,7 mM Na2HPO4 und 6 mM Glukose; pH 7,5)27 resuspendiert, um eine Konzentration von 1 x 108 Parasiten/ml zu erhalten. 10 Min. auf Eis legen.
HINWEIS: Der Elektroporationspuffer muss vor der Verwendung durch Filtern sterilisiert werden. - Parallel dazu konstruieren Pre-Chill-Röhrchen mit 2-10 μg linearisiertem pLEXSY-eGFP in einem maximalen Volumen von 50 μL Wasser oder 10 mM Tris-Puffer (pH 8,0) und Elektroporationsküvetten von d = 2 mm.
- Geben Sie 350 μl vorgekühlte Parasiten in das Röhrchen mit dem linearisierten Plasmid und geben Sie die gesamten 400 μl in die Elektroporationsküvette auf Eis. Parallel dazu werden die Parasitenzellen ohne Plasmid-DNA als Negativkontrolle elektropoliert.
- Elektropolieren Sie mit einem dieser beiden Protokolle:
Exponentieller Zerfall: 450 V, 450 μF, ein Puls.
Zeitkonstante: 450 V, T = 3,5 ms, ein Impuls.
HINWEIS: Diese Protokolle wurden mit einem kommerziellen Genpulser (Table of Materials) mit PC- und CE-Modulen ausgeführt. - Stellen Sie die Küvette für 10 Minuten wieder auf Eis und überführen Sie die elektroporierten Parasiten in 5 ml des geeigneten Nährmediums. In diesem Beispiel wurde Schneiders Insektenmedium verwendet, das mit 20% (v/v) FBS angereichert wurde. 20 h bei 26 °C inkubieren.
4. Polyklonale Selektion in Kultur
- Etwa 20 Stunden nach der Elektroporation werden die Kulturen unter dem Mikroskop beobachtet. Mindestens die Hälfte der Parasitenpopulation sollte eine optisch gute Morphologie und Motilität aufweisen (tropfenförmige Promastigoten mit oszillierendem Flagellum, das sich durch das Medium bewegt und/oder aktive Parasitenaggregate bildet). Fügen Sie je nach verwendetem pLEXSY-Plasmid das geeignete selektive Antibiotikum hinzu. In diesem Beispiel wird pLEXSY-sat2.1 verwendet, das Streptothricin-Acetyltransferase als Selektionsmarker enthält. Verwenden Sie daher Nourseothricin als selektives Antibiotikum in einer Konzentration von 0,1 mg/ml.
- Verfolgen Sie die Kulturen mikroskopisch, bis ein deutlicher Unterschied zwischen den mit und ohne Plasmid-DNA elektroporierten Parasiten zu sehen ist.
- Verifizieren Sie die Fluoreszenz des Parasiten durch Durchflusszytometrie.
- 1 ml der stationären Phasenkultur bei 2.000 x g für 3 min bei RT zentrifugieren. Zweimal in PBS waschen und das endgültige Pellet in 1 ml PBS resuspendieren.
HINWEIS: Die Fluoreszenz von eGFP kann im FL1-Kanal der meisten kommerziellen Zytometer nachgewiesen werden. Die Verstärkungseinstellungen für die Vorwärts- und Seitenstreuung sowie der FL1-Kanal können je nach Zytometer variieren. Für dieses Beispiel wurde ein CyFlow-Raumzytometer (Sysmex) verwendet. - Führen Sie die Proben aus, erfassen Sie 20.000 Ereignisse mit einer Geschwindigkeit von 0,5 μl/s, und legen Sie die Verstärkungswerte für die Kanäle Vorwärtsstreuung (FSC), Seitenstreuung (SSC) und Fluoreszenz 1 (FL-1) auf 225,0, 200,0 bzw. 520,0 fest. Führen Sie eine Kontrollprobe mit nicht-fluoreszierenden Parasiten durch, um die Parasitenpopulation in einem FSC- und SSC-Punktdiagramm zu bestimmen.
- Erzeugen Sie ein Gatter (G1), das die Parasitenpopulation enthält, und filtern Sie den FL-1-Kanal durch dieses Tor, um die Autofluoreszenz von Promastigoten zu bestimmen und ein Bereichsgatter (G2) für den FL-1-Kanal einzustellen.
- Führen Sie die transfizierten Parasiten aus, um zu überprüfen, ob Fluoreszenz vorhanden ist. Notieren Sie den Prozentsatz der fluoreszierenden Parasiten in G1 und die mittlere Fluoreszenzintensität in G2.
- 1 ml der stationären Phasenkultur bei 2.000 x g für 3 min bei RT zentrifugieren. Zweimal in PBS waschen und das endgültige Pellet in 1 ml PBS resuspendieren.
5. Bestätigung der genomischen Integration
ANMERKUNG: Die Integration der pLEXSY-eGFP-Expressionskassette kann durch diagnostische PCR bestätigt werden, wobei ein Vorwärtsprimer verwendet wird, der mit der Expressionskassette hybridisiert (variiert je nach verwendetem pLEXSY-2.1-Vektor) und der umgekehrte Primer F3002 (5'-CTGCAGGTTCACCTACAGCTAC-3'), der zu einer chromosomalen ssu-flankierenden Sequenz hybridisiert, die in der Expressionskassette fehlt. In diesem Beispiel wird der F2999-Forward-Primer (5'-CCTAGTATGAAGATTTCGGTGATC-3') verwendet, da er in der pLEXSY-sat2.1-Expressionskassette hybridisiert. Eine schematische Darstellung der integrierten Expressionskassette und der Primer-Annealing-Stellen für die diagnostische PCR ist in Abbildung 2 dargestellt.
- Reinigen Sie die genomische DNA aus 2-5 ml einer stationären Parasitenkultur durch konventionelle Phenol/Chloroform-Extraktion35 oder mit einem handelsüblichen Kit.
- Die diagnostische PCR für pLEXSY-sat2.1 wird unter Verwendung eines Zyklusprotokolls durchgeführt, das aus einer anfänglichen Denaturierung von 2 Minuten bei 94 °C besteht, gefolgt von 30 Zyklen von 30 s bei 94 °C, 30 s bei 53 °C und 1 min bei 72 °C. Führen Sie einen letzten Verlängerungsschritt von 10 Minuten bei 72 °C durch. Die Primer werden in einer Endkonzentration von 0,2 μM zugegeben.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der integrierten Expressionskassette. Kästchen, die als Chr-S (grau) gekennzeichnet sind, stellen die benachbarten chromosomalen Sequenzen des 18S rRNA-Locus (ssu) dar, in den die Expressionskassette integriert ist. Die integrierte Expressionskassette besteht aus 5'- und 3'-Sequenzen (blau) für die homologe Rekombination in den ssu-Locus , einem zusätzlichen ribosomalen Leishmania-Promotor (rot) für eine verbesserte Proteinproduktion, dem eGFP-Gen (grün), einem Selektionsmarkergen (gelb) und drei nicht translatierten Regionen (hellgrau)), nämlich utr1, 2 und 3, die die Spleißsignale für die posttranskriptionelle mRNA-Prozessierung zur optimierten Expression von eGFP und des Selektionsmarkers in Leishmania-Parasiten liefern. Annealing-Stellen für Vorwärts- und Reverse-Primer, die zur Überprüfung des Insert-Vorhandenseins mittels Kolonie-PCR (Schritt 1.2.5) verwendet werden, sind durch die schwarzen Pfeile gekennzeichnet, die als cpcr-fwd (EGFP1-Primer) bzw. cpcr-rev (A264-Primer) gekennzeichnet sind und ein 859-bp-Produkt abgrenzen. Die Annealing-Stellen für Vorwärts- und Reverse-Primer, die für den Nachweis der genomischen Integration mittels diagnostischer PCR (Schritt 5) verwendet werden, sind durch die schwarzen Pfeile gekennzeichnet, die als sat-fwd (F2999-Primer) bzw. ssu-rev (F3002-Primer) gekennzeichnet sind und ein 2.271-bp-Produkt abgrenzen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
6. Klonen durch Begrenzung der Verdünnung (optional)
- Nach Bestätigung der Fluoreszenz durch Durchflusszytometrie wird eine Verdünnung rekombinanter Parasiten in einer Konzentration von fünf Promastigoten/mlhergestellt 36.
- Geben Sie 100 μl dieser Verdünnung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Auf diese Weise werden die Platten mit einer durchschnittlichen Dichte von 0,5 Promastigoten/Vertiefung ausgesät, wodurch sichergestellt wird, dass einige Vertiefungen einen einzigen Parasiten erhalten, während die Wahrscheinlichkeit minimiert wird, mehr als einen Parasiten pro Vertiefung36 zu haben.
- Lassen Sie den Teller mindestens 12 h ungestört. Verfolgen Sie die Platte mikroskopisch bei einer minimalen Vergrößerung von 100x, bis Vertiefungen mit Parasitenwachstum entdeckt werden.
- Wenn eine Plattenvertiefung voller Parasiten ist, verwenden Sie den Inhalt, um eine 5-ml-Kultur zu impfen. Dies dauert 1-2 Wochen.
- Wenn geklonte Kulturen die stationäre Phase erreichen, überprüfen Sie die Fluoreszenz mit Hilfe der Durchflusszytometrie, wie in Schritt 4.3 beschrieben. Wählen Sie die Klone aus, die für weitere In-vitro - und In-vivo-Assays verwendet werden sollen, basierend auf dem Prozentsatz der fluoreszierenden Parasiten und der mittleren Fluoreszenzintensität, die im FL-1-Kanal gemessen wird. Streben Sie Klone mit 98%-99% fluoreszierenden Parasiten an und wählen Sie diejenigen mit der höchsten mittleren Fluoreszenzintensität aus.
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Representative Results
Nach dem Aufbau des pLEXSY-eGFP-Konstrukts und der Transformation kompetenter E. coli-Zellen erzeugen Kolonien, die das Konstrukt mit dem eGFP-Insert enthalten, nach Durchführung der in Abschnitt 1.2 beschriebenen Kolonie-PCR (Abbildung 3A) ein ca. 859 bp-Produkt. Der vollständige Aufschluss des gereinigten Plasmids aus positiven Kolonien unter Verwendung von SwaI sollte zwei charakteristische Fragmente in der Gelelektrophorese ergeben, ein 2,9 kbp-Fragment, das der Teil des PLEXSY-Vektors ist, der alle notwendigen Elemente für die Replikation und Selektion in E. coli enthält, und ein 7-8 kpb-Fragment, das die linearisierte Expressionskassette darstellt, die für die Transfektion verwendet wird (Abbildung 3B).
Nach der Transfektion erfolgt die polyklonale Selektion überwiegend qualitativ. Der Status der Parasitenkulturen während der Selektion mit Antibiotika wird mikroskopisch überwacht, wobei besonderes Augenmerk auf die Morphologie und Motilität der Parasiten gelegt wird. Nach erfolgreicher Rückgewinnung einer Kultur transfizierter Parasiten sollten diejenigen, die effektiv eGFP exprimieren, im FL-1-Kanal eines Durchflusszytometers nachgewiesen werden (Abbildung 4A). Die Transfektionseffizienz kann zwischen verschiedenen Leishmania-Spezies variieren. In dieser Arbeit waren nach polyklonaler Selektion 98,44 % der mittels Durchflusszytometrie analysierten L. donovani-Parasiten fluoreszierend, verglichen mit 82,00 % der L. panamensis (Abbildung 4B). Wenn die pLEXSY-eGFP-Expressionskassette erfolgreich in den ssu-Locus integriert wurde, sollte nach Durchführung der in Abschnitt 5 beschriebenen diagnostischen PCR (Abbildung 4C) ein 2,3 kbp-Produkt beobachtet werden. Diese Ergebnisse stellen sicher, dass rekombinante Parasiten erhalten werden, die eGFP konstitutiv als integriertes Transgen exprimieren und in nachfolgenden Passagen der Parasitenkultur stabil bleiben.
Das Klonen durch Begrenzung der Verdünnung ermöglicht die Anreicherung der fluoreszierenden Parasitenpopulation mit geringerer Transfektionseffizienz, wie z. B. L. panamensis, sowie die Selektion von Klonen mit den höchsten Fluoreszenzintensitäten. Für jede der in dieser Arbeit verwendeten Leishmania-Spezies wurden vier Klone erhalten (Tabelle 1), nämlich Lpan-A7, F11, F12 und H2 für L. panamensis und Ldon-C1, G4, F2 und H1 für L. donovani. Klone mit dem höchsten Anteil an fluoreszierenden Parasiten (Lpan-F11 = 95,74%; Ldon-C1 = 99,16%) und mittlere Fluoreszenzintensität (Lpan-F11 = 35,63 relative Fluoreszenzeinheiten [RFU]; Ldon-C1 = 14,12 RFU) wurden für die weitere Verwendung in Wirkstoff-Screening-Assays ausgewählt.
Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse der Vorbereitung des pLEXSY-eGFP-Konstrukts für die Transfektion. (A) Repräsentative Ergebnisse der Kolonie-PCR. Spur 1: 1 kb Leiter (Einheiten in Basenpaaren); Spuren 2, 10 und 12: negative Proben auf das Vorhandensein des eGFP-Einsatzes; Bahnen 3-9 und 13-14: Positive Proben auf das Vorhandensein des eGFP-Einsatzes. (B) Ergebnisse der Linearisierung mit SwaI. Spur 1: 1 kb Leiter (Einheiten in Basenpaaren); Spuren 2-4: Verdauungsreaktionen von Plasmiden, die aus drei verschiedenen Kolonien gereinigt wurden, die positiv für das Vorhandensein des eGFP-Inserts sind. Ein 2,9 kbp großes Fragment, das die für die Replikation und Selektion notwendigen Elemente in E. coli repräsentiert, und ein 7-8 kpb großes Fragment, das die linearisierte Expressionskassette repräsentiert, werden beobachtet. Beide Gele wurden in einer Agarosekonzentration von 1% hergestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse der Bestätigung der eGFP-Expression und der chromosomalen Insertion der Expressionskassette . (A) Durchflusszytometrie-Histogramm im FL-1-Kanal. Rot: Wildtyp-Zellen ohne eGFP; Blau: transfizierte L. panamensis-Parasiten , bei denen 82,00 % der Population eGFP exprimieren. (B) Vergleich der Transfektionsergebnisse zwischen L. panamensis (Lpan-1) und L. donovani (Ldon-1). Eine höhere Transfektionseffizienz wurde bei L. donovani (98,44%) als bei L. panamensis (82,00%) nach polyklonaler Selektion beobachtet. (C) Ergebnisse der PCR zur Bestätigung der genomischen Integration. L: 100 bp Leiter (Einheiten in Basenpaaren); Spuren 1-4: Proben von vier verschiedenen Klonen von L. panamensis , die ein charakteristisches 2,3 kbp-Produkt für die Integration von pLEXSY-sat2.1 in den ssu-Locus zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Spezies | Code klonen | Prozentualer Anteil fluoreszierender Parasiten | Mittlere Fluoreszenzintensität* |
| L. panamensis | LPAN-A7 | 90.00 | 24.70 |
| LPAN-F11-KARTON | 95.74 | 35.63 | |
| LPAN-F12-KARTON | 92.85 | 34.44 | |
| Lpan-H2 | 85.00 | 20.66 | |
| L. donovani | Ldon-C1 | 99.16 | 14.12 |
| Ldon-G4 | 99.21 | 13.96 | |
| Ldon-F2 | 97.96 | 11.67 | |
| Ldon-H1 | 98.97 | 12.90 |
Tabelle 1: Klone, die durch Begrenzung der Verdünnung erhalten wurden. Vier Klone wurden durch Begrenzung der Verdünnung für jede der in dieser Arbeit verwendeten Leishmania-Spezies erhalten. Der Prozentsatz der fluoreszierenden Parasiten und die mittlere Fluoreszenzintensität werden für jeden Klon angegeben. *Die Fluoreszenz wird in relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) ausgedrückt.
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Discussion
Die Vor- und Nachteile verschiedener Reportergene wurden an mehreren Protozoen-Parasiten untersucht. Unter ihnen sind GFP und eGFP intrinsisch fluoreszierend und ermöglichen eine einfache Quantifizierung und Bildgebung. Die Fluoreszenzaktivität dieser Proteine kann mit minimaler Manipulation mittels Fluoreszenzmikroskopie, Fluorimetrie oder Durchflusszytometrie nachgewiesen werden. Es wurden nur wenige Studien zur Erzeugung von GFP-exprimierendem L durchgeführt. (Viannia)-Stämmen, trotz der nachgewiesenen Robustheit von GFP und ihren Derivaten als Reportergene in Leishmania-Arten der Alten Welt15,16,18,24. Varela et al.37 entwickelten L. panamensis-Stämme, die GFP als episomales Transgen exprimieren. Die durchflusszytometrische Analyse sowohl von axenischen Promastigoten als auch von intrazellulären Amastigoten zeigte die Nützlichkeit dieser Parasiten für Wirkstoff-Screening-Assays. Die Fluoreszenz war jedoch sehr heterogen, und die Anzahl der fluoreszierenden Parasiten in der transfizierten Population war abhängig von einem konstanten Selektionsdruck mit dem Antibiotikum Tunicamycin. Diese Tatsachen schränken die Verwendung dieser Parasiten als intrazelluläre Amastigoten für Arzneimittel-Screening-Assays ein, da Tunicamycin nicht zu infizierten Makrophagen hinzugefügt werdenkann 38, so dass Parasiten mit geringer Fluoreszenz in der Population intrazellulärer Amastigoten vorhanden sind, die die Quantifizierung infizierter Makrophagen verzerren könnten.
Die Verwendung von Vektoren wie pLEXSY stellt ein leistungsfähiges und zuverlässiges Werkzeug für die stabile Modifikation von Leishmania-Spezies-Parasiten durch die Integration von Transgenen mittels homologer Rekombination dar28. Die pLEXSY-Kassette ist in den 18S rRNA-Locus (ssu) integriert, dessen Transkription unter der Kontrolle des RNA-Polymerase-I-starken Promotors erfolgt, was zu höheren Transkriptionsraten führt20. Es hat sich gezeigt, dass die Verwendung dieses Systems eine stabile und homogene Expression des Zielproteinsermöglicht 27. Diese Eigenschaften begünstigen die Expression von eGFP und seine Verwendung in intrazellulären Assays mit homogenen Fluoreszenzniveaus in infizierten Zellen sowie seine Verwendung für experimentelle Infektionen in Mausmodellen. Die in diesem Protokoll verwendete pLEXSY-2.1-Vektorfamilie wurde mit einem zusätzlichen ribosomalen Leishmania-Promotor vor der Expressionskassette entwickelt, der die Proteinproduktion verbessert29,30.
In diesem Protokoll gibt es mehrere kritische Schritte, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Erstens sollte die Klonierung des Zielgens unter Verwendung einer High-Fidelity-Polymerase33 durchgeführt werden, und der Verdau der Ziel-DNA und des Expressionsvektors sollte unter Verwendung eines sequentiellen Verdausprotokolls erfolgen, wenn die BglII/KpnI-Kombination für die Klonierung verwendet wird. Letzteres liegt daran, dass es keinen Puffer gibt, in dem sowohl BglII als auch KpnI eine optimale Aktivität aufweisen, obwohl beide Enzyme bei der gleichen Temperatur (37 °C) optimal aktiv sind. Zweitens sollte die Selektion rekombinanter Klone nach Transformation in E. coli bei 30 °C erfolgen, da pLEXSY-Plasmide bei dieser Temperatur in E. colistabiler sind 28,29. Darüber hinaus können die Wachstumsraten von L. panamensis und L. donavani sehr unterschiedlich sein. Während der Durchführung der in diesem Artikel beschriebenen Experimente dauerte es in der Regel länger, bis L. panamensis die stationäre Phase erreichte. Die Wachstumsraten können auch von Stamm zu Stamm in verschiedenen Labors variieren. Daher ist es notwendig, die Wachstumsraten der Laborstämme zu charakterisieren, um die Zeit abzuschätzen, die benötigt wird, um die für die Elektroporation erforderliche Parasitenkonzentration zu erreichen. Die Verwendung des von Bolhassani et al.27 berichteten Puffers für die Elektroporation ist eine wichtige Modifikation, die das Überleben der elektroporierten Parasiten im Vergleich zur direkten Elektroporation in einem Kulturmedium signifikant erhöht, wie es das ursprüngliche Jena Bioscience-Protokoll vorschlägt. Bei der polyklonalen Selektion ist es äußerst wichtig, die elektroporierten Kulturen vor der Zugabe des selektiven Antibiotikums nicht überwachsen zu lassen. Andernfalls wachsen die nicht-rekombinanten Parasiten aus den rekombinanten Parasiten heraus27. Es werden ein oder zwei aufeinanderfolgende Passagen (1:10 Inokulum) in frisches Medium mit dem entsprechenden Antibiotikum benötigt, um eine trübe Kultur antibiotikaresistenter rekombinanter Parasiten und eine klare Negativkontrolle zu erhalten. Die Passagen sollten innerhalb von 5 Tagen nach der ersten Antibiotikazugabe durchgeführt werden. Schließlich gibt es deutliche Unterschiede in der Effizienz der Transfektion und Integration der pLEXSY-Expressionskassette zwischen L. panamensis und L. donovani24,37. Während bei L. donovani fast 98% der Gesamtpopulation, die nach polyklonaler Selektion mittels Durchflusszytometrie analysiert wurde, Fluoreszenz aufweisen, liegt der Anteil fluoreszierender Parasiten bei L. panamesis bei etwa 80%. Aus diesem Grund ist der optionale Schritt der Klonierung durch Begrenzung der Verdünnung eine Modifikation, die hauptsächlich erforderlich ist, um eine L. panamensis-Population zu erhalten, bei der mehr als 95 % der durch Durchflusszytometrie analysierten Parasiten fluoreszierend sind. Die Verwendung von pLEXSY-Plasmiden ist auf die genomische Modifikation von Leishmania-Spezies beschränkt, da sie ursprünglich für die Verwendung von L. tarentolae als Proteinproduktionsplattformen entwickelt wurden28. Obwohl sich pLEXSY bei mehreren Leishmania-Spezies bewährt hat, die sich von L. tarentolae21,24,27 unterscheiden, ist es wichtig, die Konservierung der ssu-Sequenz bei der Arbeit mit einer neuen Leishmania-Spezies zu überprüfen, um sicherzustellen, dass die Rekombinationsstellen im pLEXSY-Plasmid funktionieren.
Die in diesem Artikel beschriebene Methode ermöglicht die Herstellung von rekombinanten Leishmania-Parasiten mit einer konstitutiven und stabilen Expression von eGFP oder einem anderen Reporter von Interesse. Bei diesen Parasiten ist die Fluoreszenz homogen und wird in intrazellulären Formen aufrechterhalten. Daher könnten die durch diesen Prozess erzeugten Stämme zur Standardisierung von Hochdurchsatz-Wirkstoff-Screening-Assays verwendet werden, um die potenzielle Anti-Leishmanie-Aktivität von Molekülen natürlichen und synthetischen Ursprungs zu bewerten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT), Panamá, Fördernummer NI-177-2016, und Sistema Nacional de Investigación (SNI), Panamá, Fördernummern SNI-169-2018, SNI-008-2022 und SNI-060-2022 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Microplates | Corning | CLS3340 | Flat bottom clear, black polystyrene, sterile, lid |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A8351 | BioXtra, suitable for cell culture |
| BglII restriction enzyme | New England BioLabs | R0144S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Cell Culture Flasks | Corning | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad | 17001401 | |
| CyFlow Space | Sysmex | Not available | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5% |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Gel Loading Buffer | Sigma-Aldrich | G2526 | The rate of migration varies with gel composition. Dilute 1:3 to 1:6 with sample before loading. |
| Gene Pulser Xcell Electroporation System | Bio-Rad | 1652660 | The system is composed of a main unit, two accessory modules, the capacitance extender (CE module) and the pulse controller (PC module), and a ShockPod cuvette chamber. |
| Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes | Bio-Rad | 1652086 | Pkg of 50, 0.2 cm–gap sterile electroporation cuvette, for use with the Gene Pulser and MicroPulser Systems, for mammalian and other eukaryotic cells |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg/mL in deionized water, liquid, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| GoTaq Long PCR Master Mix | Promega | M4021 | |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Inverted microscope | Olympus | IXplore Standard | |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3142S | 4,000 units. 20,000 units/mL |
| LB Broth with agar | Sigma-Aldrich | L3147 | Highly-referenced nutrient-rich microbial growth powder medium with Agar, suitable for regular E.coli culture. |
| LB Broth | Sigma-Aldrich | L2542 | Liquid microbial growth medium |
| Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad | 1640300 | Mini horizontal electrophoresis system, includes 8- and 15-well combs, 7 cm x 10 cm UV-transparent tray |
| pEGFP-N1-1x | Addgene | 172281 | Expressing eGFP mRNA fused with 1 tandem repeat of a 50-base sequence |
| pLEXSYcon2.1 expression kit | Jena Bioscience | EGE-1310sat | Contains integrative constitutive expression vector pLEXSY-sat2.1. Antibiotic selection of transfectants with Nourseothricin (NTC, clonNAT). Contains all primers for diagnostic PCRs and sequencing. |
| Potassium Chloride | Millipore | 529552 | Molecular Biology Grade - CAS 7447-40-7 - Calbiochem |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | Up to 15 μg of Transfection-Ready Plasmid from 3 mL cultures. |
| Schneider′s Insect Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | Medium used in our laboratory for culturing Leishmania. |
| SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥99% (titration) |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | RDD038 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, ≥99.0%, free-flowing, Redi-Dri |
| SwaI restriction enzyme | New England BioLabs | R0604S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Syringe filters | Corning | CLS431212 | regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm, pore size 0.2 μm |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | Thermal cycler system, includes 96-well thermal cycler, power cord, tube support ring |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | Joins two DNA strands with cohesive or blunt ends |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | BioReagent, suitable for electrophoresis, 10× concentrate |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9285 | |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL. Features the kanamycin-resistance gene on the F' episome, for extremely demanding cloning in chloramphenicol-resistant vectors. Efficiency: > 5 x 10 9 transformants/µg pUC18 DNA. |
References
- Alvar, J., et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PLoS One. 7 (5), e35671 (2012).
- Franssen, S. U., et al. Global genome diversity of the Leishmania donovani complex. eLife. 9, e51243 (2020).
- Saldaña, A., et al. Clinical cutaneous leishmaniasis rates are associated with household Lutzomyia gomezi, Lu. Panamensis, and Lu. trapidoi abundance in Trinidad de Las Minas, western Panama. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 88 (3), 572-574 (2013).
- Ramírez, J. D., et al. Taxonomy, diversity, temporal and geographical distribution of Cutaneous Leishmaniasis in Colombia: A retrospective study. Scientific Reports. 6, 28266 (2016).
- Ponte-Sucre, A., et al. Drug resistance and treatment failure in leishmaniasis: A 21st century challenge. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), e0006052 (2017).
- Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. Current scenario of drug development for leishmaniasis. Indian Journal of Medical Research. 123 (3), 399-410 (2006).
- Croft, S. L., Yardley, V., Kendrick, H. Drug sensitivity of Leishmania species: some unresolved problems. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 96, S127-S129 (2002).
- Sereno, D., Cordeiro da Silva, A., Mathieu-Daude, F., Ouaissi, A. Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures. Parasitology International. 56 (1), 3-7 (2007).
- Don, R., Ioset, J. R. Screening strategies to identify new chemical diversity for drug development to treat kinetoplastid infections. Parasitology. 141 (1), 140-146 (2014).
- Sereno, D., Roy, G., Lemesre, J. L., Papadopoulou, B., Ouellette, M. DNA transformation of Leishmania infantum axenic amastigotes and their use in drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1168-1173 (2001).
- Roy, G., et al. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. infections in macrophages and in animal models. Molecular and Biochemical Parasitology. 110 (2), 195-206 (2000).
- Lang, T., Goyard, S., Lebastard, M., Milon, G. Bioluminescent Leishmania expressing luciferase for rapid and high throughput screening of drugs acting on amastigote-harbouring macrophages and for quantitative real-time monitoring of parasitism features in living mice. Cellular Microbiology. 7 (3), 383-392 (2005).
- Ashutosh, G. S., Ramesh, S. S., Goyal, N. Use of Leishmania donovani field isolates expressing the luciferase reporter gene in in vitro drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (9), 3776-3783 (2005).
- Buckner, F. S., Wilson, A. J. Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania amastigotes grown in macrophages. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 72 (5), 600-605 (2005).
- Okuno, T., Goto, Y., Matsumoto, Y., Otsuka, H., Matsumoto, Y. Applications of recombinant Leishmania amazonensis expressing egfp or the beta-galactosidase gene for drug screening and histopathological analysis. Experimental Animals. 52 (2), 109-118 (2003).
- Kamau, S. W., Grimm, F., Hehl, A. B. Expression of green fluorescent protein as a marker for effects of antileishmanial compounds in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3654-3656 (2001).
- Singh, N., Dube, A. Short report: fluorescent Leishmania: application to anti-leishmanial drug testing. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 71 (4), 400-402 (2004).
- Dube, A., Singh, N., Sundar, S., Singh, N. Refractoriness to the treatment of sodium stibogluconate in Indian kala-azar field isolates persist in in vitro and in vivo experimental models. Parasitology Research. 96 (4), 216-223 (2005).
- Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. A microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein. Parasitology Research. 89 (4), 266-271 (2003).
- Boucher, N., McNicoll, F., Dumas, C., Papadopoulou, B. RNA polymerase I-mediated transcription of a reporter gene integrated into different loci of Leishmania. Molecular and Biochemical Parasitology. 119 (1), 153-158 (2002).
- da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity. Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).
- Calvo-Álvarez, E., et al. Infrared fluorescent imaging as a potent tool for in vitro, ex vivo and in vivo models of visceral leishmaniasis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003666 (2015).
- García-Bustos, M. F., et al. Development of a fluorescent assay to search new drugs using stable tdtomato-leishmania, and the selection of galangin as a candidate with anti-leishmanial activity. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 666746 (2021).
- Singh, N., Gupta, R., Jaiswal, A. K., Sundar, S., Dube, A. Transgenic Leishmania donovani clinical isolates expressing green fluorescent protein constitutively for rapid and reliable ex vivo drug screening. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (2), 370-374 (2009).
- De Rycker, M., et al. Comparison of a high-throughput high-content intracellular Leishmania donovani assay with an axenic amastigote assay. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (7), 2913-2922 (2013).
- Peña, I., et al. New compound sets identified from high throughput phenotypic screening against three kinetoplastid parasites: an open resource. Scientific Reports. 5, 8771 (2015).
- Bolhassani, A., et al. Fluorescent Leishmania species: development of stable GFP expression and its application for in vitro and in vivo studies. Experimental Parasitology. 127 (3), 637-645 (2011).
- Breitling, R., et al. Non-pathogenic trypanosomatid protozoa as a platform for protein research and production. Protein Expression and Purification. 25 (2), 209-218 (2002).
- Pulido, S. A., et al. Improvement of the green fluorescent protein reporter system in Leishmania spp. for the in vitro and in vivo screening of antileishmanial drugs. Acta Tropica. 122 (1), 36-45 (2012).
- Bastos, M. S. E., et al. Achievement of constitutive fluorescent pLEXSY-egfp Leishmania braziliensis and its application as an alternative method for drug screening in vitro. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (2), 155-159 (2017).
- Vincze, T., Posfai, J., Roberts, R. J. NEBcutter: A program to cleave DNA with restriction enzymes. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3688-3691 (2003).
- Chen, M., et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).
- Green, M., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
- Santarém, N., et al. The impact of distinct culture media in Leishmania infantum biology and infectivity. Parasitology. 141 (2), 192-205 (2014).
- Medina-Acosta, E., Cross, G. A. Rapid isolation of DNA from trypanosomatid protozoa using a simple "mini-prep" procedure. Molecular and Biochemical Parasitology. 59 (2), 327-329 (1993).
- Ye, M., Wilhelm, M., Gentschev, I., Szalay, A. A modified limiting dilution method for monoclonal stable cell line selection using a real-time fluorescence imaging system: a practical workflow and advanced applications. Methods and Protocols. 4 (1), 16 (2021).
- Varela, M. R. E., et al. Leishmania (Viannia) panamensis: an in vitro assay using the expression of GFP for screening of antileishmanial drug. Experimental Parasitology. 122 (2), 134-139 (2009).
- Komura, T., et al. ER stress induced impaired TLR signaling and macrophage differentiation of human monocytes. Cellular Immunology. 282 (1), 44-52 (2013).
