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Genetics

ईजीएफपी की संवैधानिक अभिव्यक्ति के साथ लीशमैनिया प्रजाति उपभेदों का विकास

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/64939
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 1,3, 1,3, 1,3
1Centro de Biología Celular y Molecular de Enfermedades, Instituto de Investigaciones Científicas y Servicios de Alta Tecnología (INDICASAT-AIP), 2Departamento de Medios y Creativo, Instituto de Investigaciones Científicas y Servicios de Alta Tecnología (INDICASAT-AIP), 3Sistema Nacional de Investigación-Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SNI-SENACYT)
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम पीएलईएक्सएसवाई प्रणाली का उपयोग करके एक स्थिर एकीकृत ट्रांसजीन के रूप में ईजीएफपी के लिए जीन को व्यक्त करने वाले एल पैनामेंसिस और एल डोनोवानी उपभेदों को उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली पद्धति का वर्णन करते हैं। ट्रांसक्रिप्टेड परजीवियों को कमजोर पड़ने को सीमित करके क्लोन किया गया था, और दोनों प्रजातियों में उच्चतम प्रतिदीप्ति तीव्रता वाले क्लोन को ड्रग स्क्रीनिंग परख में आगे उपयोग के लिए चुना गया था।

Abstract

लीशमैनिया जीनस के प्रोटोजोआ परजीवी लीशमैनियासिस का कारण बनते हैं, परिवर्तनीय नैदानिक अभिव्यक्तियों के साथ एक बीमारी जो दुनिया भर में लाखों लोगों को प्रभावित करती है। डोनोवानी के संक्रमण के परिणामस्वरूप घातक आंत की बीमारी हो सकती है। पनामा, कोलंबिया और कोस्टा रिका में, एल पैनामेंसिस त्वचीय और म्यूकोक्यूटेनियस लीशमैनियासिस के अधिकांश रिपोर्ट किए गए मामलों के लिए जिम्मेदार है। आज तक उपलब्ध पद्धतियों के साथ बड़ी संख्या में दवा उम्मीदवारों का अध्ययन करना काफी मुश्किल है, यह देखते हुए कि वे परजीवी के इंट्रासेल्युलर रूपों के खिलाफ यौगिकों की गतिविधि का मूल्यांकन करने या विवो परख में प्रदर्शन करने के लिए बहुत श्रमसाध्य हैं। इस काम में, हम जीन की संवैधानिक अभिव्यक्ति के साथ एल पैनामेंसिस और एल डोनोवानी उपभेदों की पीढ़ी का वर्णन करते हैं जो 18 एस आरआरएनए (एसएसयू) के लिए एन्कोड करने वाले लोकस में एकीकृत एक उन्नत हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) के लिए एन्कोड करता है। जीन एन्कोडिंग ईजीएफपी को एक वाणिज्यिक वेक्टर से प्राप्त किया गया था और इसे समृद्ध करने और बीजीएलII और केपीएनआई एंजाइमों के लिए प्रतिबंध साइटों को जोड़ने के लिए पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) द्वारा प्रवर्धित किया गया था। ईजीएफपी एम्प्लिकॉन को एगारोस जेल शुद्धिकरण द्वारा अलग किया गया था, एंजाइम बीजीएलII और केपीएनI के साथ पचाया गया था, और लीशमैनिया अभिव्यक्ति वेक्टर pLEXSY-sat2.1 में मिलाया गया था जो पहले एंजाइमों के एक ही सेट के साथ पच गया था। क्लोन जीन के साथ अभिव्यक्ति वेक्टर को ई कोलाई में प्रचारित किया गया था, शुद्ध किया गया था, और डालने की उपस्थिति को कॉलोनी पीसीआर द्वारा सत्यापित किया गया था। शुद्ध प्लास्मिड को रैखिक बनाया गया था और इसका उपयोग एल डोनोवानी और एल पैनामेंसिस परजीवी को स्थानांतरित करने के लिए किया गया था। जीन के एकीकरण को पीसीआर द्वारा सत्यापित किया गया था। ईजीएफपी जीन की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन फ्लो साइटोमेट्री द्वारा किया गया था। फ्लोरोसेंट परजीवी को कमजोर पड़ने को सीमित करके क्लोन किया गया था, और फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके उच्चतम प्रतिदीप्ति तीव्रता वाले क्लोन का चयन किया गया था।

Introduction

लीशमैनिया जीनस के प्रोटोजोआ परजीवी लीशमैनियासिस का कारण बनते हैं, जो नैदानिक अभिव्यक्तियों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ एक बीमारी है। यह बीमारी 98 देशों में प्रचलित है, और इसकी वार्षिक घटना 0.9 से 1.6मिलियन मामलों का अनुमान है। लीशमैनिया प्रजातियां जो मनुष्यों के लिए रोगजनक हैं, उन्हें दो उप-वंशों में विभाजित किया गया है, अर्थात् एल। (लीशमैनिया) और एल। (वियानिया)। एल से संबंधित कुछ प्रजातियों के साथ संक्रमण। (लीशमैनिया) उपजीनस, जैसे कि एल डोनोवानी और एल इन्फेंटम, के परिणामस्वरूप आंत का लीशमैनियासिस (वीएल) हो सकता है, जोअनुपचारित छोड़ दिए जाने पर घातक है। एल से संबंधित प्रजातियां। (वियानिया) उप-जीनस मध्य और दक्षिण अमेरिका में त्वचीय लीशमैनियासिस (सीएल) और म्यूकोक्यूटेनियस लीशमैनियासिस (एमसीएल) के अधिकांश मामलों से जुड़े हैं, विशेष रूप से पनामा, कोलंबिया और कोस्टा रिका में, एल पैनामेंसिस इन नैदानिक प्रस्तुतियों का मुख्य एटियलॉजिकल एजेंट है।

मौजूदा एंटी-लीशमैनिया कीमोथेरेपी जिसमें पेंटावेलेंट एंटीमोनियल, मिल्टेफॉसिन और एम्फोटेरिसिन बी जैसी दवाएं शामिल हैं, अत्यधिक विषाक्त और महंगी हैं। इसके अलावा, हाल के दशकों के दौरान दवा प्रतिरोध में वृद्धि को उन कारकों में जोड़ा गया हैजो दुनिया भर में रोगियों के प्रभावी उपचार में हस्तक्षेप करते हैं। दवा संवेदनशीलता के संबंध में जीनस लीशमैनिया की प्रजातियों में पर्याप्त अंतर प्रदर्शित किए गए हैं, खासकर नई और पुरानी दुनिया की प्रजातियों 6,7 के बीच। इन कारणों से, प्रजाति-विशिष्ट दृष्टिकोणों पर विशेष ध्यान देते हुए, नई एंटी-लीशमैनिया दवाओं की पहचान और विकास के प्रयासों को निर्देशित करना आवश्यक है। पारंपरिक पद्धतियों के साथ दवा उम्मीदवारों के बड़े पुस्तकालयों का अध्ययन करना काफी मुश्किल है, यह देखते हुए कि ये पद्धतियां इंट्रासेल्युलर एमेस्टिगोट्स के खिलाफ यौगिकों की गतिविधि का मूल्यांकन करने या विवो प्रयोगों में प्रदर्शन करने के लिए बहुत श्रमसाध्य हैं। इसलिए, नई तकनीकों को विकसित करना आवश्यक हो गया है जो इन नुकसानों को कम करते हैं, जिसमें रिपोर्टर जीन का कार्यान्वयन और उच्च-सामग्री फेनोटाइपिक स्क्रीनिंग परखका विकास शामिल है।

रिपोर्टर जीन के उपयोग ने दवा स्क्रीनिंग प्रक्रिया की दक्षता को बढ़ाने की क्षमता दिखाई है क्योंकि यह उच्च-थ्रूपुट और विवो परख के विकास की सुविधा प्रदान करता है। विभिन्न शोध समूहों द्वारा कई रिपोर्टर जीन ों को व्यक्त करने वाले पुनः संयोजक लीशमैनिया परजीवी उत्पन्न किए गए हैं। रिपोर्टर जीन, जैसे β-गैलेक्टोसिडेस, β-लैक्टामेज़, और लूसिफेरेस, एपिसोमल वैक्टर का उपयोग करके कई लीशमैनिया प्रजातियों में पेश किए गए हैं, जो परजीवी10,11,12,13,14,15 के अतिरिक्त और इंट्रा-सेलुलर रूपों में दवा स्क्रीनिंग के लिए सीमित उपयोगिता दिखाते हैं।. इन दृष्टिकोणों में एपिसोमल निर्माण के उन्मूलन से बचने के लिए संस्कृति में एक मजबूत चयनात्मक दबाव की आवश्यकता होती है, साथ ही रिपोर्टर जीन की गतिविधि को प्रकट करने के लिए अतिरिक्त अभिकर्मकों का उपयोग भी होता है। इसके विपरीत, ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) और इसके संस्करण, एन्हांस्ड ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) का उपयोग इन विट्रो ड्रग स्क्रीनिंग परख के लिए बड़ी संख्या में ट्रांसजेनिक लीशमैनिया उपभेदों की पीढ़ी में उनके लचीलेपन और संवेदनशीलता के साथ-साथ फ्लो साइटोमेट्री या फ्लोरोमेट्री15 का उपयोग करके स्क्रीनिंग प्रक्रिया को स्वचालित करने की संभावना के कारण किया गया है। 16,17,18,19. आशाजनक परिणामों के बावजूद, इन ट्रांसजेनिक उपभेदों की संस्कृतियां उनके प्रतिदीप्ति स्तरों में अत्यधिक विषम थीं, क्योंकि जीएफपी जीन की प्रतियों की संख्या सभी परजीवियों में समान नहीं थी। इसके अलावा, प्रतिदीप्ति को बनाए रखने के लिए संस्कृति में परजीवियों पर निरंतर चयनात्मक दबाव की आवश्यकता होती है, क्योंकि जीएफपी जीन को एपिसोमल निर्माण में पेश किया गया था।

पहले बताए गए कारणों के लिए, कई प्रयासों ने स्थिर पुनः संयोजक उपभेदों के उत्पादन के लिए नई पद्धतियों को विकसित करने पर ध्यान केंद्रित किया है। इन प्रयासों ने ज्यादातर राइबोसोमल लोकी में रिपोर्टर जीन के एकीकरण पर भरोसा किया है, जो राइबोसोमल जीन20 की उच्च प्रतिलेखन दर का लाभ उठाते हैं। एल. इन्फेंटम और एल. एमेज़ोनेंसिस के उपभेदों को β-गैलेक्टोसाइडेज 21, आईएफपी 1.4, आईआरएफपी22 और टीडीटोमेटो23 के लिए जीन कोडिंग को एकीकृत करके उत्पन्न किया गया है, और दवा स्क्रीनिंग परख में उनकी उपयोगिता के लिए उनका मूल्यांकन किया गया है। डोनोवानी उपभेदों को विकसित किया गया है जो24,25 के समरूप पुनर्संयोजन के माध्यम से 18 एस राइबोसोमल आरएनए लोकस (एसएसयू लोकस) में अपने कोडिंग जीन को एकीकृत करके जीएफपी को संवैधानिक रूप से व्यक्त करते हैं; उन्होंने ट्रांसमिटेड आबादी में स्थिर और सजातीय जीएफपी अभिव्यक्ति दिखाई, जिसमें इंट्रासेल्युलर एमेस्टिगोट्स 24,25 शामिल थे, और उन्हें ड्रग स्क्रीनिंगपरख 24,25,26 में सफलतापूर्वक लागू किया गया था। बोलहासनी एट अल.27 ने एल मेजर और एल इन्फेंटम के उपभेदों को विकसित किया, जो जीएफपी को एक एकीकृत ट्रांसजीन के रूप में व्यक्त करते हैं। उन्होंने एकीकरण वेक्टर pLEXSY का उपयोग किया, जिसे मूल रूप से मेजबान28 के रूप में L. tarentolae का उपयोग करके एक प्रणाली में प्रोटीन की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति के लिए डिज़ाइन किया गया था। PLEXSY-GFP वेक्टर विभिन्न लीशमैनिया उपभेदों की पीढ़ी के लिए बहुत कुशल साबित हुआ है जो जीएफपी 24,25,27,29,30 को संवैधानिक रूप से व्यक्त करता है। इन परजीवियों में, प्रतिदीप्ति सजातीय है और इंट्रासेल्युलर रूपों में बनाए रखा जाता है,संक्रमित चूहों के फुटपैड घावों में पता लगाने में सक्षम होता है।

इस काम में, हम पीएलईएक्सएसवाई प्रणाली का उपयोग करके एक एकीकृत ट्रांसजीन के रूप में ईजीएफपी के लिए जीन एन्कोडिंग को व्यक्त करने वाले एल पैनामेंसिस और एल डोनोवानी उपभेदों को उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली पद्धति का वर्णन करते हैं। इस प्रक्रिया के माध्यम से उत्पन्न उपभेदों का उपयोग हमारी प्रयोगशाला में दवा-स्क्रीनिंग परख करने के लिए किया जाता है जो प्राकृतिक और सिंथेटिक मूल के अणुओं की संभावित एंटी-लीशमैनिया गतिविधि का मूल्यांकन करते हैं।

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Protocol

नमूनों को बाँझ रखने के लिए, परजीवी संस्कृति से जुड़े सभी चरणों को जैव सुरक्षा स्तर 2 (बीएसएल -2) हुड के अंदर या स्थानीय स्वास्थ्य और सुरक्षा नियमों के अनुसार किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल का एक ग्राफिकल सारांश चित्रा 1 में पाया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: pLEXSY-2.1 वेक्टर परिवार का उपयोग करके ईजीएफपी-व्यक्त करने वाले एल पैनामेंसिस और एल डोनोवानी परजीवी उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल की सारांश योजना। लेख में वर्णित सभी छह प्रमुख खंडों को यहां दर्शाया गया है। 1) pLEXSY-2.1 वेक्टर में eGPP जीन का प्रवर्धन और सम्मिलन: लक्ष्य जीन को प्रवर्धित किया जाता है, एंजाइम KpnI और BglII के लिए मान्यता साइटों को जोड़ता है, और eGPP एम्प्लिकॉन और pLEXSY प्लास्मिड दोनों को क्रमिक रूप से T4 लिगेज के साथ बाद के बंधाव के लिए दोनों एंजाइमों के साथ पचाया जाता है। 2) pLEXSY अभिव्यक्ति प्लास्मिड का रैखिककरण: pLEXSY + eGPP निर्माण को 7-8 kbp अभिव्यक्ति कैसेट के रैखिककरण और शुद्धिकरण के लिए SwaI के साथ पचाया जाता है। 3) अभिकर्मक और 4) पॉलीक्लोनल चयन: लीशमैनिया प्रोमैस्टिगोट्स को इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा अभिव्यक्ति कैसेट के साथ स्थानांतरित किया जाता है और पुनः संयोजक परजीवियों के एंटीबायोटिक चयन के लिए संस्कृति में वापस रखा जाता है। फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से परजीवी प्रतिदीप्ति की पुष्टि की जाती है। 5) जीनोमिक एकीकरण की पुष्टि और 6) कमजोर पड़ने को सीमित करके क्लोनिंग: पीएलईएक्सवाई-ईजीएफपी अभिव्यक्ति कैसेट के एकीकरण की पुष्टि नैदानिक पीसीआर द्वारा की जाती है, जिसमें अभिव्यक्ति कैसेट में फॉरवर्ड प्राइमर हाइब्रिडिंग और अभिव्यक्ति कैसेट में अनुपस्थित क्रोमोसोमल अनुक्रम के लिए रिवर्स प्राइमर हाइब्रिडिंग का उपयोग किया जाता है। कमजोर पड़ने को सीमित करके क्लोनिंग द्वारा फ्लोरोसेंट परजीवियों के लिए ट्रांसक्रिप्टेड संस्कृतियों को समृद्ध किया जा सकता है, और उच्चतम औसत फ्लोरोसेंट तीव्रता वाले क्लोन को आगे के अनुप्रयोगों के लिए चुना जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

1. pLEXSY-2.1 वेक्टर में eGPP जीन का प्रवर्धन और सम्मिलन

  1. ईजीएफपी जीन का प्रवर्धन
    नोट: चूंकि यह प्रोटोकॉल लीशमैनिया प्रजातियों के क्रोमोसोमल 18 एस आरआरएनए लोकस (एसएसयू) में अभिव्यक्ति कैसेट के एकीकरण के बाद लक्ष्य प्रोटीन की संवैधानिक अभिव्यक्ति के लिए पीएलईएक्सवाई -2.1 वेक्टर परिवार (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करता है, पहला कदम ईजीएफपी जीन में प्रतिबंध साइटों वाले अनुक्रमों को पेश करना है जो पीएलईएक्सवाई -2.1 वैक्टर में इसके सम्मिलन की अनुमति देते हैं। इस मामले में, जैसा कि ईजीएफपी को केवल साइटोसोलिक रूप से व्यक्त करने की आवश्यकता होती है, एंजाइम बीजीएलII और केपीएनI के लिए प्रतिबंध साइटों को क्रमशः ईजीएफपी जीन के 5 ' और 3 ' सिरों में जोड़ा गया था। केपीएनआई के साथ क्लोनिंग के परिणामस्वरूप लक्ष्य प्रोटीन का संलयन छह अवशेषों के सी-टर्मिनल पॉलीहिस्टिडाइन टैग में होता है, इसके बाद रुचि के प्रोटीन के आगे शुद्धिकरण के लिए पीएलईएक्सवाई -2.1 प्लास्मिड में एन्कोड किया गया एक स्टॉप कोडन होता है। इस कारण से, रिवर्स प्राइमर अनुक्रम में स्टॉप कोडन नहीं होता है।
    1. ईजीएफपी के लिए प्लास्मिड स्रोत के आधार पर, एनईबीकटर (http://tools.neb.com/NEBcutter/index.php3) 31 जैसे प्रतिबंध विश्लेषण उपकरण का उपयोग करके लक्ष्य अनुक्रम का विश्लेषण करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि इसमें क्लोनिंग (बीजीएलII और केपीएनI) या एसडब्ल्यूएआई के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रतिबंध एंजाइमों के लिए आंतरिक साइटें नहीं हैं, जो अभिकर्मक से पहले वेक्टर रैखिककरण के लिए उपयोग किया जाने वाला एंजाइम है।
    2. बीजीएलII और KPNI प्रतिबंध अनुक्रमों वाले ईजीएफपी प्रवर्धन के लिए आगे और रिवर्स प्राइमरों को डिजाइन करें। एक उदाहरण के रूप में, इस प्रोटोकॉल के लिए ईजीएफपी स्रोत पीईजीएफपी-एन 1-1 एक्स प्लास्मिड32 था, और प्राइमर अनुक्रम बोल्हासनी एट अल .27 द्वारा रिपोर्ट किए गए थे:
      फॉरवर्ड प्राइमर (ईजीएफपी 1): 5'-एटीजीएटीटीसीएएजीएटीसीटीएटीजीटीजीएजीएजीजीजी-3' (बोल्ड में बीजीएलद्वितीय प्रतिबंध साइट)।
      रिवर्स प्राइमर (ईजीएफपी 2): 5'-जीसीटीसीटीएजीएटीएजीएटीजीजीटीएसीसी सीटीटीजीटीएसीएजीटीसीजीटीसी-3 ' (केपीएनआई प्रतिबंध साइट बोल्ड में)।
    3. कोडिंग अनुक्रम के संरक्षण को सुनिश्चित करने के लिए उच्च-निष्ठा पोलीमरेज़ का उपयोग करके लक्ष्य जीन को बढ़ाएं। एक उदाहरण के रूप में, प्राइमर ईजीएफपी 1 और ईजीएफपी 2 के लिए, पीसीआर साइक्लिंग प्रोटोकॉल चलाएं जैसा कि बोलहासनी एट अल .27 द्वारा रिपोर्ट किया गया है। 94 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट का प्रारंभिक विकृतीकरण चलाएं, इसके बाद 94 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के 30 चक्र, 57 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस और 72 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट चलाएं। 72 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट का अंतिम विस्तार चरण चलाएं। 0.2 μM की अंतिम एकाग्रता पर प्राइमरों को जोड़ें।
    4. एक पारंपरिक पीसीआर उत्पाद शुद्धिकरण किट, या मानक सोडियम एसीटेट और इथेनॉल वर्षा का उपयोग करके टुकड़े को शुद्ध करें, जैसा कि कहीं और वर्णितहै।
  2. pLEXSY-2.1 अभिव्यक्ति वेक्टर में eGPP का सम्मिलन
    1. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, बीजीएलII और KPNI का उपयोग करके ईजीएफपी-पीसीआर उत्पाद के सिरों को ट्रिम करें।
      1. सबसे पहले, निर्माता के निर्देशों के अनुसार, सबसे कम नमक सांद्रता (इस मामले में, केपीएनआई) की आवश्यकता वाले एंजाइम के लिए प्रतिक्रिया सेट करें, और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      2. फिर, 100 mM NaCl और BGLII की 10 इकाइयाँ जोड़ें और 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। प्रतिक्रिया को शुद्ध करें, जैसा कि चरण 1.1.4 में वर्णित है।
    2. चरण 1.2.1 में वर्णित अनुक्रमिक पाचन प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, बीजीएलII और KPNI के साथ pLEXSY अभिव्यक्ति वेक्टर को पचाएं।
    3. 1: 3 (वेक्टर: सम्मिलित) के दाढ़ अनुपात का उपयोग करके टी 4 लिगेज के साथ पीएलईएक्सएसवाई वेक्टर और ईजीएफपी जीन को अलग करें। संक्षेप में 100 एनजी पचे हुए पीएलईएक्सवाई और 28 एनजी पचे हुए ईजीएफपी उत्पाद को 20 μL प्रतिक्रिया में जोड़ें जिसमें 1x और 3 यूनिट टी 4 डीएनए लिगेज की अंतिम एकाग्रता पर लिगेज बफर होता है। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    4. मानक परिवर्तन प्रोटोकॉल33 का उपयोग करके चरण 1.2.3 में प्राप्त बंधाव उत्पाद के साथ सक्षम ई कोलाई कोशिकाओं, जैसे एक्सएल -10, डीएच 5 ए या डीएच 10 बी को बदलें। लुइरा-बर्टानी (एलबी) -एम्पीसिलीन एगर में परिवर्तित कोशिकाओं को प्लेट करें और पुनः संयोजक क्लोन का चयन करने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें (पीएलईएक्सएसवाई प्लास्मिड ई कोलाई में 37 डिग्री सेल्सियस की तुलना में 30 डिग्री सेल्सियस पर अधिक स्थिर होते हैं)।
    5. कॉलोनी पीसीआर द्वारा प्लास्मिड में सम्मिलित की उपस्थिति के लिए स्क्रीन।
      1. अलग-अलग कॉलोनियों को चुनें, न्यूक्लियस-मुक्त पानी के 20 μL में पुन: निलंबित करें, 15 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें, और कॉलोनी पीसीआर के लिए डीएनए टेम्पलेट के रूप में लाइसेट का 1 μL लें। चरण 1.1.2 (इस उदाहरण में, ईजीएफपी 1) में वर्णित ईजीएफपी प्रवर्धन के लिए फॉरवर्ड प्राइमर का उपयोग करें, और रिवर्स प्राइमर29 के रूप में प्राइमर ए 264 (5'-कैटटागागागागाजीटीएसीजीटीएएजीएएजी-3') का उपयोग करें।
      2. प्राइमर ए 264 को पीएलईएक्सवाई -2.1 अभिव्यक्ति वैक्टर में डालने के स्टॉप कोडन के बाद 80 बीपी को नष्ट करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। एक उदाहरण के रूप में, प्राइमर जोड़ी ईजीएफपी 1 + ए 264 के लिए, पीसीआर साइक्लिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करें जिसमें 94 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट का प्रारंभिक विकृतीकरण शामिल है, इसके बाद 94 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के 30 चक्र, 50 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस और 72 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट शामिल हैं। 72 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट का अंतिम विस्तार चरण चलाएं। प्राइमरों को 0.2 μM की अंतिम एकाग्रता पर जोड़ा जाता है।
        नोट: इस प्राइमर सेट का उपयोग करने वाला अपेक्षित उत्पाद 859 बीपी लंबा है। प्राइमरों ईजीएफपी 1 और ए 264 के लिए एनीलिंग साइटों को चित्र 2 में दर्शाया गया है।
    6. वाणिज्यिक प्लास्मिड अलगाव किट या मानक क्षारीय वर्षा33 का उपयोग करके बाद के अभिकर्मक के लिए एक सकारात्मक क्लोन से शुद्ध प्लास्मिड डीएनए तैयार करें। प्लास्मिड / पॉजिटिव क्लोन के न्यूनतम 10 μg के अलगाव के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर की संस्कृति के 50 मिलीलीटर का उपयोग करें।

2. पीएलईएक्सएसवाई अभिव्यक्ति प्लास्मिड का रैखिककरण।

  1. स्वआई (मान्यता साइट: 5'-एटीटीएएटी -3') के साथ पाचन के लिए शुद्ध pLEXSY-eGPP प्लास्मिड के कम से कम 10 μg का उपयोग करें। 25 डिग्री सेल्सियस पर 3-4 घंटे के लिए पचाएं और 20 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी-निष्क्रिय करें।
  2. परिणामी टुकड़ों को अलग करने के लिए अगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन में पाचन उत्पाद चलाएं। यह पाचन दो टुकड़े उत्पन्न करेगा, एक 2.9 केबीपी टुकड़ा ई कोलाई में प्रतिकृति और चयन के लिए आवश्यक तत्वों का प्रतिनिधित्व करता है, और एक 7-8 केबीपी टुकड़ा रैखिक अभिव्यक्ति कैसेट का प्रतिनिधित्व करता है।
  3. एक वाणिज्यिक एगारोस जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करके अभिव्यक्ति कैसेट को शुद्ध करें।

3. इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा एल पैनामेंसिस और एल डोनोवानी का अभिकर्मक।

नोट: लीशमैनिया संस्कृति का प्रदर्शन किया जाता है जैसा कि कहीं और वर्णितहै। इस उदाहरण में, एल पैनामेंसिस और एल डोनोवानी प्रोमैस्टिगोट्स को श्नाइडर के कीट माध्यम में संवर्धित किया गया था, 20% (वी / वी) भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 50 μg / mL जेंटामाइसिन के साथ पूरक किया गया था, और 26 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था।

  1. परजीवी संस्कृतियों को तब तक विकसित करें जब तक कि प्रति अभिकर्मक लगभग 4 x 107 परजीवी का उपयोग करने के लिए पर्याप्त लॉग-चरण या प्रारंभिक स्थिर-चरण प्रोमैस्टिगोट न हों। स्थिर चरण तक पहुंचने से पहले प्रति कल्चर फ्लास्क अधिकतम सेल घनत्व लीशमैनिया प्रजातियों के आधार पर भिन्न हो सकता है और उपभेदों को प्रयोगशाला स्थितियों के लिए कितनी अच्छी तरह अनुकूलित किया जाता है। यदि आवश्यक हो तो कई संस्कृति फ्लास्क की सामग्री पूल करें।
  2. कमरे के तापमान (आरटी) पर 3 मिनट के लिए 2,000 x g पर परजीवी संस्कृति को सेंट्रीफ्यूज करें।
  3. 1 x 108 परजीवियों /एमएल की सांद्रता प्राप्त करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस (21 एमएम एचईपीईएस, 137 एमएम एनएसीएल, 5 एमएम केसीएल, 0.7 एमएम एनए2एचपीओ4, और 6 एमएम ग्लूकोज; पीएच 7.5)27) पर इलेक्ट्रोपोरेशन बफर में गोली को फिर से निलंबित करें। 10 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
    नोट: इलेक्ट्रोपोरेशन बफर को उपयोग से पहले फ़िल्टर करके निष्फल किया जाना चाहिए।
  4. समानांतर में, 2-10 μg रैखिक pLEXSY-eGPP के साथ प्री-चिल ट्यूब अधिकतम 50 μL पानी या 10 mM tris बफर (pH 8.0) और d = 2 mm के इलेक्ट्रोपोरेशन क्यूवेट में निर्माण करते हैं।
  5. रैखिक प्लास्मिड के साथ ट्यूब में 350 μL पूर्व-ठंडा परजीवी जोड़ें और पूरे 400 μL को बर्फ पर इलेक्ट्रोपोरेशन क्यूवेट में स्थानांतरित करें। समानांतर में, एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्लास्मिड डीएनए के बिना परजीवी कोशिकाओं को इलेक्ट्रोपोरेट करें।
  6. इन दो प्रोटोकॉल में से एक का उपयोग करके इलेक्ट्रोपोरेट:
    घातीय क्षय: 450 वी, 450 μF, एक नाड़ी।
    समय स्थिरांक: 450 वी, टी = 3.5 एमएस, एक नाड़ी।
    नोट: ये प्रोटोकॉल पीसी और सीई मॉड्यूल के साथ एक वाणिज्यिक जीन पल्सर (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके चलाए गए थे।
  7. क्यूवेट को 10 मिनट के लिए बर्फ पर वापस रखें और इलेक्ट्रोपोरेटेड परजीवियों को उचित संस्कृति माध्यम के 5 एमएल में स्थानांतरित करें। इस उदाहरण ने श्नाइडर के कीट माध्यम का उपयोग 20% (वी / वी) एफबीएस के साथ पूरक किया। 20 घंटे के लिए 26 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

4. संस्कृति में पॉलीक्लोनल चयन

  1. लगभग 20 घंटे के बाद इलेक्ट्रोपोरेशन, एक माइक्रोस्कोप के तहत संस्कृतियों का निरीक्षण करें। परजीवी आबादी के कम से कम आधे हिस्से को नेत्रहीन रूप से अच्छी आकृति विज्ञान और गतिशीलता दिखानी चाहिए (मीडिया के माध्यम से घूमने वाले फ्लैगेलम के साथ ड्रॉप-जैसे प्रोमैस्टिगोट्स और / या सक्रिय परजीवी समुच्चय बनाना)। उपयोग किए गए pLEXSY प्लास्मिड के आधार पर उपयुक्त चयनात्मक एंटीबायोटिक जोड़ें। इस उदाहरण में, pLEXSY-sat2.1 का उपयोग किया जाता है, जिसमें चयन मार्कर के रूप में स्ट्रेप्टोथ्रिसिन एसिटाइलट्रांसफेरेज़ होता है। इसलिए, 0.1 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता पर चयनात्मक एंटीबायोटिक के रूप में नॉरसेओथ्रिसिन का उपयोग करें।
  2. संस्कृतियों का सूक्ष्म रूप से पालन करें जब तक कि प्लास्मिड डीएनए के साथ और बिना परजीवियों के बीच स्पष्ट अंतर नहीं देखा जाता है।
  3. फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से परजीवी प्रतिदीप्ति को सत्यापित करें।
    1. आरटी पर 3 मिनट के लिए 2,000 x g पर स्थिर-चरण संस्कृति के सेंट्रीफ्यूज 1 मिलीलीटर को पीबीएस में दो बार धोएं और पीबीएस के 1 मिलीलीटर में अंतिम गोली को फिर से निलंबित करें।
      नोट: ईजीएफपी की प्रतिदीप्ति का पता अधिकांश वाणिज्यिक साइटोमीटर के एफएल 1 चैनल में लगाया जा सकता है। आगे और साइड स्कैटर के लिए सेटिंग्स प्राप्त करें, और एफएल 1 चैनल साइटोमीटर के बीच भिन्न हो सकता है। इस उदाहरण के लिए, एक CyFlow space (Sysmex) साइटोमीटर का उपयोग किया गया था।
    2. नमूने चलाएं, 0.5 μL/s की गति से 20,000 घटनाओं को एकत्र करें, और फॉरवर्ड स्कैटर (FSC), साइड स्कैटर (SSC), और फ्लोरेसेंस 1 (FL-1) चैनलों के लिए लाभ मान क्रमशः 225.0, 200.0 और 520.0 के रूप में सेट करें। एफएससी बनाम एसएससी डॉट-प्लॉट में परजीवी आबादी निर्धारित करने के लिए गैर-फ्लोरोसेंट परजीवी के साथ एक नियंत्रण नमूना चलाएं।
    3. परजीवी आबादी वाला एक गेट (जी 1) बनाएं और प्रोमैस्टिगोट्स के ऑटोफ्लोरेसेंस का निर्धारण करने और एफएल -1 चैनल के लिए रेंज गेट (जी 2) सेट करने के लिए उस गेट के माध्यम से एफएल -1 चैनल को फ़िल्टर करें।
    4. प्रतिदीप्ति है या नहीं, यह सत्यापित करने के लिए संक्रमित परजीवी चलाएं। जी 1 में परजीवियों का प्रतिशत रिकॉर्ड करें जो फ्लोरोसेंट हैं और जी 2 में प्रतिदीप्ति तीव्रता का औसत है।

5. जीनोमिक एकीकरण की पुष्टि

नोट: pLEXSY-eGPP अभिव्यक्ति कैसेट के एकीकरण की पुष्टि नैदानिक पीसीआर द्वारा की जा सकती है, अभिव्यक्ति कैसेट के लिए फॉरवर्ड प्राइमर संकरण का उपयोग करके (उपयोग किए गए pLEXSY-2.1 वेक्टर के आधार पर भिन्न होता है) और रिवर्स प्राइमर F3002 (5'-CTGCAGGTTCACCACCACacacCTAC-3') अभिव्यक्ति कैसेट में अनुपस्थित क्रोमोसोमल एसएसयू-फ्लैंकिंग अनुक्रम में संकरण होता है। इस उदाहरण में, F2999 फॉरवर्ड प्राइमर (5'-CCTAGTATGAAGATTTCGGTGATC-3') का उपयोग किया जाता है क्योंकि यह pLEXSY-sat2.1 अभिव्यक्ति कैसेट में संकरण करता है। नैदानिक पीसीआर के लिए एकीकृत अभिव्यक्ति कैसेट और प्राइमर एनीलिंग साइटों का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा 2 में दर्शाया गया है।

  1. पारंपरिक फिनोल/क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण35 या वाणिज्यिक किट के साथ स्थिर-चरण परजीवी संस्कृति के 2-5 मिलीलीटर से जीनोमिक डीएनए को शुद्ध करें।
  2. 94 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के प्रारंभिक विकृतीकरण से युक्त साइक्लिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करके pLEXSY-sat2.1 के लिए नैदानिक पीसीआर करें, इसके बाद 94 डिग्री सेल्सियस पर 30 s के 30 चक्र, 53 डिग्री सेल्सियस पर 30 s और 72 °C पर 1 मिनट का उपयोग करें। 72 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट का अंतिम विस्तार चरण चलाएं। प्राइमरों को 0.2 μM की अंतिम एकाग्रता पर जोड़ा जाता है।

Figure 2
चित्रा 2: एकीकृत अभिव्यक्ति कैसेट का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। Chr-S (ग्रे) के रूप में लेबल किए गए बक्से 18S RRNA लोकस (एसएसयू) के आसन्न क्रोमोसोमल अनुक्रमों का प्रतिनिधित्व करते हैं जिसमें अभिव्यक्ति कैसेट एकीकृत होता है। एकीकृत अभिव्यक्ति कैसेट में एसएसयू लोकस में समरूप पुनर्संयोजन के लिए 5 'और 3' अनुक्रम (नीला), प्रोटीन उत्पादन बढ़ाने के लिए एक अतिरिक्त लीशमैनिया राइबोसोमल प्रमोटर (लाल), ईजीएफपी जीन (हरा), एक चयन मार्कर जीन (पीला), और तीन अअनुवादित क्षेत्र (हल्का ग्रे) शामिल हैं।), अर्थात् यूटीआर 1, 2, और 3, जो ईजीएफपी की अनुकूलित अभिव्यक्ति और लीशमैनिया परजीवी में चयन मार्कर के लिए पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल एमआरएनए प्रसंस्करण के लिए स्प्लिसिंग सिग्नल प्रदान करते हैं। कॉलोनी पीसीआर (चरण 1.2.5) द्वारा सम्मिलित उपस्थिति के सत्यापन के लिए उपयोग किए जाने वाले आगे और रिवर्स प्राइमरों के लिए एनीलिंग साइटों को क्रमशः सीपीसीआर-एफडब्ल्यूडी (ईजीएफपी 1 प्राइमर) और सीपीसीआर-रेव (ए 264 प्राइमर) के रूप में लेबल किए गए काले तीरों द्वारा चिह्नित किया जाता है, जो 859 बीपी उत्पाद को सीमांकित करते हैं। नैदानिक पीसीआर (चरण 5) द्वारा जीनोमिक एकीकरण के सत्यापन के लिए उपयोग किए जाने वाले आगे और रिवर्स प्राइमरों के लिए एनीलिंग साइटों को क्रमशः सैट-एफडब्ल्यूडी (एफ 2999 प्राइमर) और एसएसयू-रेव (एफ 3002 प्राइमर) के रूप में लेबल किए गए काले तीरों द्वारा चिह्नित किया जाता है, जो 2,271 बीपी उत्पाद को सीमांकित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

6. कमजोर पड़ने को सीमित करके क्लोनिंग (वैकल्पिक)

  1. फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से प्रतिदीप्ति की पुष्टि के बाद, पांच प्रोमैस्टिगोट्स / एमएल36 की एकाग्रता पर पुनः संयोजक परजीवियों का कमजोर पड़ने की तैयारी करें।
  2. 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में इस तनुकरण के 100 μL जोड़ें। इस तरह, प्लेटों को 0.5 प्रोमैस्टिगोट्स / कुएं के औसत घनत्व पर बीज दिया जाता है, जो यह सुनिश्चित करता है कि कुछ कुओं को एक ही परजीवी प्राप्त होता है, जबकि प्रति कुएं36 में एक से अधिक परजीवी होने की संभावना कम हो जाती है।
  3. प्लेट को कम से कम 12 घंटे के लिए बिना हिलाए छोड़ दें। जब तक परजीवी वृद्धि वाले कुओं का पता नहीं लगाया जाता है, तब तक 100x के न्यूनतम आवर्धन पर प्लेट का सूक्ष्म रूप से पालन करें।
  4. जब एक प्लेट वेल परजीवियों से भरा होता है, तो 5 एमएल कल्चर को टीका लगाने के लिए सामग्री का उपयोग करें। इसमें 1-2 सप्ताह लगते हैं।
  5. जब क्लोन-बीज वाली संस्कृतियां स्थिर चरण तक पहुंच जाती हैं, तो फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके प्रतिदीप्ति को सत्यापित करें, जैसा कि चरण 4.3 में वर्णित है। फ्लोरोसेंट परजीवी के प्रतिशत और एफएल -1 चैनल में मापी गई औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता के आधार पर आगे इन विट्रो और विवो परख में उपयोग किए जाने वाले क्लोन का चयन करें। 98% -99% फ्लोरोसेंट परजीवी के साथ क्लोन का लक्ष्य रखें और उच्चतम औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता वाले लोगों का चयन करें।

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Representative Results

pLEXSY-eGPP निर्माण और सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं को बदलने के बाद, eGPP सम्मिलित के साथ निर्माण वाली कॉलोनियां धारा 1.2 (चित्रा 3A) में वर्णित कॉलोनी पीसीआर चलाने के बाद लगभग 859 बीपी उत्पाद उत्पन्न करेंगी। स्वआई का उपयोग करके सकारात्मक कॉलोनियों से शुद्ध प्लास्मिड के कुल पाचन को जेल वैद्युतकणसंचलन में दो विशिष्ट टुकड़े देने चाहिए, एक 2.9 केबीपी टुकड़ा जो प्लेक्ससी वेक्टर का हिस्सा है जिसमें ई कोलाई में प्रतिकृति और चयन के लिए सभी आवश्यक तत्व होते हैं, और एक 7-8 केपीबी टुकड़ा रैखिक अभिव्यक्ति कैसेट का प्रतिनिधित्व करता है जिसका उपयोग अभिकर्मक के लिए किया जाता है (चित्रा 3 बी)।

अभिकर्मक के बाद, पॉलीक्लोनल चयन ज्यादातर गुणात्मक रूप से किया जाता है। एंटीबायोटिक दवाओं के साथ चयन के दौरान परजीवी संस्कृतियों की स्थिति की सूक्ष्म रूप से निगरानी की जाती है, जिससे परजीवी आकृति विज्ञान और गतिशीलता पर विशेष ध्यान दिया जाता है। संक्रमित परजीवियों की संस्कृति की सफल वसूली के बाद, ईजीएफपी को प्रभावी ढंग से व्यक्त करने वालों को फ्लो साइटोमीटर (चित्रा 4 ए) के एफएल -1 चैनल में पाया जाना चाहिए; अभिकर्मक क्षमता विभिन्न लीशमैनिया प्रजातियों के बीच भिन्न हो सकती है। इस काम में, पॉलीक्लोनल चयन के बाद, फ्लो साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण किए गए एल डोनोवानी परजीवी के 98.44% एल पैनामेंसिस (चित्रा 4 बी) के 82.00% की तुलना में फ्लोरोसेंट थे। यदि pLEXSY-eGPP अभिव्यक्ति कैसेट को एसएसयू लोकस में सफलतापूर्वक एकीकृत किया गया है, तो धारा 5 (चित्रा 4 सी) में वर्णित नैदानिक पीसीआर चलाने के बाद 2.3 kbp उत्पाद देखा जाना चाहिए। ये परिणाम सुनिश्चित करते हैं कि पुनः संयोजक परजीवी प्राप्त होते हैं जो ईजीएफपी को एक एकीकृत ट्रांसजीन के रूप में संवैधानिक रूप से व्यक्त करते हैं और परजीवी संस्कृति के बाद के मार्गों में स्थिर रहेंगे।

कमजोर पड़ने को सीमित करके क्लोनिंग कम अभिकर्मक क्षमता के साथ फ्लोरोसेंट परजीवी आबादी के संवर्धन की अनुमति देता है, जैसे कि एल पैनामेंसिस, साथ ही उच्चतम प्रतिदीप्ति तीव्रता वाले क्लोन का चयन। इस काम में उपयोग की जाने वाली लीशमैनिया प्रजातियों में से प्रत्येक के लिए चार क्लोन प्राप्त किए गए थे (तालिका 1), अर्थात् एल पैनामेंसिस के लिए एलपैन-ए 7, एफ 11, एफ 12, और एच 2, और एल डोनोवानी के लिए एलडॉन-सी 1, जी 4, एफ 2, और एच 1। फ्लोरोसेंट परजीवी के उच्चतम प्रतिशत वाले क्लोन (Lpan-F11 = 95.74%); Ldon-C1 = 99.16% और औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (Lpan-F11 = 35.63 सापेक्ष फ्लोरोसेंट इकाइयाँ [RFU]; एलडीओएन-सी 1 = 14.12 आरएफयू) को दवा स्क्रीनिंग परख में आगे उपयोग के लिए चुना गया था।

Figure 3
चित्रा 3: अभिकर्मक के लिए pLEXSY-eGPP निर्माण की तैयारी के प्रतिनिधि परिणाम। (ए) कॉलोनी पीसीआर के प्रतिनिधि परिणाम। लेन 1: 1 केबी सीढ़ी (आधार जोड़े में इकाइयां); लेन 2, 10, और 12: ईजीएफपी सम्मिलित की उपस्थिति के लिए नकारात्मक नमूने; लेन 3-9 और 13-14: ईजीएफपी सम्मिलित की उपस्थिति के लिए सकारात्मक नमूने। (बी) स्वआई लेन 1: 1 केबी सीढ़ी (आधार जोड़े में इकाइयां) के साथ रैखिककरण के परिणाम; लेन 2-4: ईजीएफपी डालने की उपस्थिति के लिए सकारात्मक तीन अलग-अलग कॉलोनियों से शुद्ध प्लास्मिड की पाचन प्रतिक्रियाएं। ई कोलाई में प्रतिकृति और चयन के लिए आवश्यक तत्वों का प्रतिनिधित्व करने वाला 2.9 केबीपी टुकड़ा, और रैखिक अभिव्यक्ति कैसेट का प्रतिनिधित्व करने वाला 7-8 केपीबी टुकड़ा देखा जाता है। दोनों जैल 1% की एग्रोज एकाग्रता पर तैयार किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ईजीएफपी अभिव्यक्ति की पुष्टि और अभिव्यक्ति कैसेट के क्रोमोसोमल सम्मिलन के प्रतिनिधि परिणाम। (ए) एफएल -1 चैनल में फ्लो साइटोमेट्री हिस्टोग्राम। लाल: ईजीएफपी के बिना जंगली प्रकार की कोशिकाएं; ईजीएफपी व्यक्त करने वाली 82.00% आबादी के साथ ट्रांसक्रिप्टेड एल पैनामेंसिस परजीवी। (बी) एल पैनामेंसिस (एलपैन -1) और एल डोनोवानी (एलडीओएन -1) के बीच अभिकर्मक परिणामों की तुलना। पॉलीक्लोनल चयन के बाद एल पैनामेंसिस (82.00%) की तुलना में एल डोनोवानी (98.44%) में एक उच्च अभिकर्मक दक्षता देखी गई। (सी) जीनोमिक एकीकरण की पुष्टि के लिए पीसीआर के परिणाम। एल: 100 बीपी सीढ़ी (आधार जोड़े में इकाइयां); पैनामेंसिस के चार अलग-अलग क्लोनों के नमूने एसएसयू लोकस में pLEXSY-Sat2.1 एकीकरण के लिए एक विशिष्ट 2.3 kbp उत्पाद दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्रजातियां क्लोन कोड फ्लोरोसेंट परजीवी का प्रतिशत औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता *
एल पैनामेंसिस। Lpan-A7 90.00 24.70
Lpan-F11 95.74 35.63
Lpan-F12 92.85 34.44
Lpan-H2 85.00 20.66
एल डोनोवानी Ldon-C1 99.16 14.12
Ldon-G4 99.21 13.96
Ldon-F2 97.96 11.67
Ldon-H1 98.97 12.90

तालिका 1: कमजोर पड़ने को सीमित करके प्राप्त क्लोन। इस काम में उपयोग की जाने वाली लीशमैनिया प्रजातियों में से प्रत्येक के लिए कमजोर पड़ने को सीमित करके चार क्लोन प्राप्त किए गए थे। प्रत्येक क्लोन के लिए फ्लोरोसेंट परजीवी का प्रतिशत और औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता की सूचना दी जाती है। * प्रतिदीप्ति सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयों (आरएफयू) में व्यक्त की जाती है।

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Discussion

कई प्रोटोजोआ परजीवियों में विभिन्न रिपोर्टर जीन के फायदे और नुकसान का अध्ययन किया गया है। उनमें से, जीएफपी और ईजीएफपी आंतरिक रूप से फ्लोरोसेंट हैं और आसान मात्रा और इमेजिंग की अनुमति देते हैं। इन प्रोटीनों की फ्लोरोसेंट गतिविधि को फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी, फ्लोरिमेट्री या फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके न्यूनतम हेरफेर के साथ पता लगाया जा सकता है। जीएफपी-व्यक्त एल उत्पन्न करने के लिए कुछ अध्ययन किए गए हैं। पुरानी दुनिया लीशमैनिया प्रजातियों15,16,18,24 में रिपोर्टर जीन के रूप में जीएफपी और उनके डेरिवेटिव की प्रदर्शित मजबूती के बावजूद (वियानिया) उपभेद। वैरेला एट अल .37 ने एल पैनामेंसिस उपभेदों को विकसित किया जो जीएफपी को एपिसोमल ट्रांसजीन के रूप में व्यक्त करते हैं। एक्सनिक प्रोमैस्टिगोट्स और इंट्रासेल्युलर एमेस्टिगोट्स दोनों के फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण ने दवा स्क्रीनिंग परख के लिए इन परजीवियों की उपयोगिता को दिखाया। हालांकि, प्रतिदीप्ति बहुत विषम थी, और संक्रमित आबादी में फ्लोरोसेंट परजीवी की संख्या एंटीबायोटिक ट्यूनिकामाइसिन के साथ निरंतर चयनात्मक दबाव पर निर्भर थी। ये तथ्य दवा-स्क्रीनिंग परख के लिए इंट्रासेल्युलर एमेस्टिगोट्स के रूप में इन परजीवियों का उपयोग करने को प्रतिबंधित करते हैं, यह देखते हुए कि ट्यूनिकामाइसिन को संक्रमित मैक्रोफेज38 में नहीं जोड़ा जा सकता है, जिससे इंट्रासेल्युलर एमेस्टिगोट्स की आबादी में कम प्रतिदीप्ति वाले परजीवी मौजूद होते हैं जो संक्रमित मैक्रोफेज की मात्रा का निर्धारण कर सकते हैं।

पीएलईएक्सएसवाई जैसे वैक्टर का उपयोग समरूपपुनर्संयोजन के माध्यम से ट्रांसजेन के एकीकरण के माध्यम से लीशमैनिया प्रजाति परजीवी के स्थिर संशोधन के लिए एक शक्तिशाली और विश्वसनीय उपकरण का गठन करता है। PLEXSY कैसेट को 18S RRNA लोकस (एसएसयू) में एकीकृत किया जाता है, जिसका प्रतिलेखन आरएनए पोलीमरेज़ I मजबूत प्रमोटर के नियंत्रण में होता है, जिससे उच्च प्रतिलेखन दर20 होती है। इस प्रणाली का उपयोग लक्ष्य प्रोटीन27 की स्थिर और सजातीय अभिव्यक्ति की अनुमति देने के लिए साबित हुआ है। ये विशेषताएं ईजीएफपी की अभिव्यक्ति और संक्रमित कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति के समरूप स्तर के साथ इंट्रासेल्युलर परख में इसके उपयोग के साथ-साथ मुराइन मॉडल में प्रयोगात्मक संक्रमण के लिए इसके उपयोग का पक्ष लेती हैं। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले pLEXSY-2.1 वेक्टर परिवार को अभिव्यक्ति कैसेट के सामने एक अतिरिक्त लीशमैनिया राइबोसोमल प्रमोटर के साथ डिज़ाइन किया गया है, जिससे प्रोटीन उत्पादन29,30 बढ़ जाता है।

इस प्रोटोकॉल में, इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम हैं। सबसे पहले, लक्ष्य जीन की क्लोनिंग एक उच्च-निष्ठा पोलीमरेज़33 का उपयोग करके की जानी चाहिए, और क्लोनिंग के लिए बीजीएलII / KpnI संयोजन का उपयोग करते समय अनुक्रमिक पाचन प्रोटोकॉल का उपयोग करके लक्ष्य डीएनए और अभिव्यक्ति वेक्टर का पाचन किया जाना चाहिए। उत्तरार्द्ध इसलिए है क्योंकि कोई बफर नहीं है जिसमें बीजीएलII और KPNI दोनों इष्टतम गतिविधि प्रदर्शित करते हैं, हालांकि दोनों एंजाइम एक ही तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) पर बेहतर रूप से सक्रिय होते हैं। दूसरे, ई कोलाई में परिवर्तन के बाद पुनः संयोजक क्लोन का चयन 30 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए, क्योंकि ई कोलाई28,29 में इस तापमान पर पीएलईएक्सवाई प्लास्मिड अधिक स्थिर होते हैं। इसके अतिरिक्त, एल पैनामेंसिस और एल डोनावानी की वृद्धि दर काफी अलग हो सकती है। इस लेख में वर्णित प्रयोगों के प्रदर्शन के दौरान, एल पैनामेंसिस को आमतौर पर स्थिर चरण तक पहुंचने में अधिक समय लगा। विभिन्न प्रयोगशालाओं में वृद्धि दर भी तनाव से तनाव में भिन्न हो सकती है; इसलिए, इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए आवश्यक परजीवी एकाग्रता तक पहुंचने के लिए आवश्यक समय के अनुमान के लिए प्रयोगशाला उपभेदों की वृद्धि दर को चिह्नित करना आवश्यक है। इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए बोलहासनी एट अल.27 द्वारा रिपोर्ट किए गए बफर का उपयोग करना एक महत्वपूर्ण संशोधन है जो मूल जेना बायोसाइंस प्रोटोकॉल द्वारा सुझाए गए कल्चर माध्यम में प्रत्यक्ष इलेक्ट्रोपोरेशन की तुलना में इलेक्ट्रोपोरेटेड परजीवियों के अस्तित्व को काफी बढ़ाता है। पॉलीक्लोनल चयन के दौरान, चयनात्मक एंटीबायोटिक जोड़ने से पहले इलेक्ट्रोपोरेटेड संस्कृतियों को बढ़ने न देना बेहद महत्वपूर्ण है; अन्यथा, गैर-पुनः संयोजक परजीवी पुनःसंयोजक लोगों से आगे निकल जाएंगे। एंटीबायोटिक प्रतिरोधी पुनः संयोजक परजीवी और एक स्पष्ट नकारात्मक नियंत्रण की एक टर्बिड संस्कृति प्राप्त करने के लिए उपयुक्त एंटीबायोटिक के साथ ताजा माध्यम में एक या दो लगातार मार्ग (1:10 इनोकुलम) लगेंगे। पहले एंटीबायोटिक जोड़ने के 5 दिनों के भीतर मार्ग किया जाना चाहिए। अंत में, एल पैनामेंसिस और एल डोनोवानी24,37 के बीच पीएलईएक्सएसवाई अभिव्यक्ति कैसेट के अभिकर्मक और एकीकरण की दक्षता में विशेष रूप से अंतर हैं। डोनोवानी में पॉलीक्लोनल चयन के बाद फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से विश्लेषण की गई कुल आबादी का लगभग 98% प्रतिदीप्ति दिखाता है, एल पैनासिस में, फ्लोरोसेंट परजीवी का प्रतिशत लगभग 80% है। इस कारण से, कमजोर पड़ने को सीमित करके क्लोनिंग का वैकल्पिक चरण एक संशोधन है जो ज्यादातर एल पैनामेंसिस आबादी प्राप्त करने के लिए आवश्यक है जहां फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से विश्लेषण किए गए 95% से अधिक परजीवी फ्लोरोसेंट हैं। pLEXSY प्लास्मिड का उपयोग लीशमैनिया प्रजातियों के जीनोमिक संशोधन तक सीमित है, क्योंकि वे मूल रूप से प्रोटीन उत्पादन प्लेटफार्मों28 के रूप में L. tarentola का उपयोग करने के लिए डिज़ाइन किए गए थे। यद्यपि PLEXSY ने L. tarentolae21,24,27 से अलग कई लीशमैनिया प्रजातियों में काम करना साबित कर दिया है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि pLEXSY प्लास्मिड में पुनर्संयोजन साइटें काम करेंगी, एक नई लीशमैनिया प्रजाति के साथ काम करते समय एसएसयू अनुक्रम के संरक्षण को सत्यापित करना महत्वपूर्ण है।

इस लेख में वर्णित विधि ईजीएफपी या रुचि के किसी अन्य रिपोर्टर की संवैधानिक और स्थिर अभिव्यक्ति के साथ पुनः संयोजक लीशमैनिया परजीवी के उत्पादन की अनुमति देती है। इन परजीवियों में, प्रतिदीप्ति सजातीय है, और इसे इंट्रासेल्युलर रूपों में बनाए रखा जाता है। इसलिए, इस प्रक्रिया के माध्यम से उत्पन्न उपभेदों का उपयोग प्राकृतिक और सिंथेटिक मूल के अणुओं की संभावित एंटी-लीशमैनिया गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए उच्च-थ्रूपुट दवा-स्क्रीनिंग परख को मानकीकृत करने के लिए किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को सेक्रेटेरिया नेशनल डी सिएनसिया, टेक्नोलोगिया ई इनोवेसिओन (एसईएनएसीवाईटी), पनामा, अनुदान संख्या एनआई -177-2016, और सिस्तेमा नेशनल डी इन्वेस्टिगासिओन (एसएनआई), पनामा, अनुदान संख्या एसएनआई-169-2018, एसएनआई-008-2022, और एसएनआई-060-2022 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 Well Microplates Corning CLS3340 Flat bottom clear, black polystyrene, sterile, lid
Agarose Sigma-Aldrich A4718
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A8351 BioXtra, suitable for cell culture
BglII restriction enzyme New England BioLabs R0144S 2,000 units. 10,000 units/mL
Cell Culture Flasks Corning CLS430168 Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal)
ChemiDoc Imaging System Bio-Rad 17001401
CyFlow Space Sysmex Not available
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7021 powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5%
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F7524
Gel Loading Buffer Sigma-Aldrich G2526  The rate of migration varies with gel composition. Dilute 1:3 to 1:6 with sample before loading.
Gene Pulser Xcell Electroporation System Bio-Rad 1652660 The system is composed of a main unit, two accessory modules, the capacitance extender (CE module) and the pulse controller (PC module), and a ShockPod cuvette chamber.
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes Bio-Rad 1652086 Pkg of 50, 0.2 cm–gap sterile electroporation cuvette, for use with the Gene Pulser and MicroPulser Systems, for mammalian and other eukaryotic cells
Gentamicin solution Sigma-Aldrich G1397 50 mg/mL in deionized water, liquid, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture
GoTaq Long PCR Master Mix Promega M4021
HEPES solution Sigma-Aldrich H0887 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Inverted microscope Olympus IXplore Standard
KpnI-HF restriction enzyme New England BioLabs R3142S 4,000 units. 20,000 units/mL
LB Broth with agar Sigma-Aldrich L3147 Highly-referenced nutrient-rich microbial growth powder medium with Agar, suitable for regular E.coli culture.
LB Broth  Sigma-Aldrich L2542 Liquid microbial growth medium
Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System Bio-Rad 1640300 Mini horizontal electrophoresis system, includes 8- and 15-well combs, 7 cm x 10 cm UV-transparent tray
pEGFP-N1-1x Addgene 172281 Expressing eGFP mRNA fused with 1 tandem repeat of a 50-base sequence
pLEXSYcon2.1 expression kit Jena Bioscience EGE-1310sat Contains integrative constitutive expression vector pLEXSY-sat2.1. Antibiotic selection of transfectants with Nourseothricin (NTC, clonNAT). Contains all primers for diagnostic PCRs and sequencing.
Potassium Chloride Millipore 529552 Molecular Biology Grade - CAS 7447-40-7 - Calbiochem
PureYield Plasmid Miniprep System Promega A1222 Up to 15 μg of Transfection-Ready Plasmid from 3 mL cultures.
Schneider′s Insect Medium Sigma-Aldrich S0146 Medium used in our laboratory for culturing Leishmania.
SOC Medium Sigma-Aldrich S1797
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014 for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥99% (titration)
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich RDD038 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, ≥99.0%, free-flowing, Redi-Dri
SwaI restriction enzyme New England BioLabs R0604S 2,000 units. 10,000 units/mL
Syringe filters Corning CLS431212 regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm, pore size 0.2 μm
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096 Thermal cycler system, includes 96-well thermal cycler, power cord, tube support ring
T4 DNA Ligase Promega M1801 Joins two DNA strands with cohesive or blunt ends
Tris-Borate-EDTA buffer Sigma-Aldrich T4415 BioReagent, suitable for electrophoresis, 10× concentrate
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1120
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Promega A9285
XL10-Gold Ultracompetent Cells Agilent 200317 XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL. Features the kanamycin-resistance gene on the F' episome, for extremely demanding cloning in chloramphenicol-resistant vectors. Efficiency: > 5 x 10 9 transformants/µg pUC18 DNA.

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References

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जेनेटिक्स अंक 194
ईजीएफपी की संवैधानिक अभिव्यक्ति के साथ <em>लीशमैनिया</em> प्रजाति उपभेदों का विकास
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Carrasco, J., Chang, J. H., Pineda,… More

Carrasco, J., Chang, J. H., Pineda, L., Quintero, I., Giovani, R., Spadafora, C., Lleonart, R., Restrepo, C. M. Development of Leishmania Species Strains with Constitutive Expression of eGFP. J. Vis. Exp. (194), e64939, doi:10.3791/64939 (2023).

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