Summary
Här beskriver vi den metod som används för att generera L. panamensis och L. donovani-stammar som uttrycker genen för eGFP som en stabil integrerad transgen med hjälp av pLEXSY-systemet. Transfekterade parasiter klonades genom att begränsa utspädningen, och kloner med den högsta fluorescensintensiteten hos båda arterna valdes ut för vidare användning i läkemedelsscreeninganalyser.
Abstract
Protozoa parasiter av släktet Leishmania orsakar leishmaniasis , en sjukdom med varierande kliniska manifestationer som drabbar miljontals människor över hela världen. Infektion med L. donovani kan leda till dödlig visceral sjukdom. I Panama, Colombia, och Costa Rica, L. panamensis är ansvarig för de flesta av de rapporterade fall av kutan och mukokutan leishmaniasis. Att studera ett stort antal läkemedelskandidater med de metoder som hittills finns tillgängliga är ganska svårt, eftersom de är mycket mödosamma för att utvärdera aktiviteten hos föreningar mot intracellulära former av parasiten eller för att utföra in vivo-analyser . I detta arbete beskriver vi genereringen av L. panamensis och L. donovani-stammar med konstitutivt uttryck av genen som kodar för ett förbättrat grönt fluorescerande protein (eGFP) integrerat i lokus som kodar för 18S rRNA (ssu). Genen som kodar för eGFP erhölls från en kommersiell vektor och amplifierades genom polymeraskedjereaktion (PCR) för att berika den och lägga till restriktionsställen för BglII- och KpnI-enzymerna. eGFP-amplikonen isolerades genom agarosgelrening, spjälkades med enzymerna BglII och KpnI och ligerades till Leishmania-uttrycksvektorn pLEXSY-sat2.1 som tidigare spjälkats med samma uppsättning enzymer. Uttrycksvektorn med den klonade genen förökades i E. coli, renades och närvaron av insatsen verifierades med koloni-PCR. Den renade plasmiden linjäriserades och användes för att transfektera parasiterna L. donovani och L . panamensis. Integrationen av genen verifierades med PCR. Uttrycket av eGFP-genen utvärderades med flödescytometri. Fluorescerande parasiter klonades genom att begränsa utspädningen, och kloner med den högsta fluorescensintensiteten valdes med hjälp av flödescytometri.
Introduction
Protozoa parasiter av släktet Leishmania orsakar leishmaniasis, en sjukdom med ett brett spektrum av kliniska manifestationer. Denna sjukdom är utbredd i 98 länder, och dess årliga incidens uppskattas till 0,9 till 1,6 miljoner fall1. Leishmania-arter som är patogena för människor är uppdelade i två undergenera, nämligen L. (Leishmania) och L. (Viannia). Infektion med vissa arter som tillhör L. (Leishmania) subgenus, såsom L. donovani och L. infantum, kan resultera i visceral leishmaniasis (VL), som är dödlig om den lämnas obehandlad2. Arter som tillhör L. (Viannia) subgenus är associerade med de flesta fall av kutan leishmaniasis (CL) och mukokutan leishmaniasis (MCL) i Central- och Sydamerika, särskilt i Panama, Colombia och Costa Rica, med L. panamensis som det huvudsakliga etiologiska medlet för dessa kliniska presentationer 3,4.
Befintlig anti-leishmania kemoterapi som innehåller läkemedel såsom pentavalenta antimonials, miltefosin och amfotericin B är mycket giftigt och dyrt. Dessutom har ökad läkemedelsresistens under de senaste decennierna lagts till de faktorer som stör effektiv behandling av patienter över hela världen5. Betydande skillnader har visats mellan arter av släktet Leishmania i förhållande till läkemedelskänslighet, särskilt mellan Nya och Gamla världens arter 6,7. Av dessa skäl är det nödvändigt att rikta ansträngningarna för att identifiera och utveckla nya läkemedel mot leishmani, med särskild uppmärksamhet på artspecifika tillvägagångssätt. Att studera stora bibliotek av läkemedelskandidater med traditionella metoder är ganska svårt, eftersom dessa metoder är mycket mödosamma för att utvärdera aktiviteten hos föreningar mot intracellulära amastigoter eller för att utföra in vivo-experiment 8; Därför har det varit nödvändigt att utveckla nya tekniker som minskar dessa nackdelar, inklusive implementering av rapportgener och utveckling av fenotypiska screeninganalyser med högt innehåll9.
Användningen av reportergener har visat potentialen att öka effektiviteten i läkemedelsscreeningprocessen eftersom det underlättar utvecklingen av high-throughput och in vivo-analyser. Rekombinanta Leishmania-parasiter som uttrycker flera rapportgener har genererats av olika forskargrupper. Reportergener, såsom β-galaktosidas, β-laktamas och luciferas, har introducerats i flera Leishmania-arter med hjälp av episomala vektorer, vilket visar begränsad användbarhet för läkemedelsscreening i extra- och intracellulära former av parasiten 10,11,12,13,14,15. Dessa tillvägagångssätt har begränsningen att kräva ett starkt selektivt tryck i kulturen för att undvika eliminering av den episomala konstruktionen, liksom användningen av ytterligare reagens för att avslöja reportergenens aktivitet. Omvänt har det gröna fluorescerande proteinet (GFP) och dess variant, det förbättrade gröna fluorescerande proteinet (eGFP), använts vid generering av ett stort antal transgena Leishmania-stammar för in vitro-screeninganalyser på grund av deras flexibilitet och känslighet, liksom möjligheten att automatisera screeningprocessen med flödescytometri eller fluorometri15, 16,17,18,19. Trots lovande resultat var kulturer av dessa transgena stammar mycket heterogena i sina fluorescensnivåer, eftersom antalet kopior av GFP-genen inte var detsamma i alla parasiter. Vidare krävde upprätthållande av fluorescens konstant selektivt tryck på parasiterna i odling, eftersom GFP-genen infördes i en episomal konstruktion.
Av de skäl som nämnts tidigare har många ansträngningar fokuserat på att utveckla nya metoder för att producera stabila rekombinanta stammar. Dessa ansträngningar har mestadels förlitat sig på integrationen av reportergener i ribosomala loci, och utnyttjat de högre transkriptionshastigheterna för ribosomala gener20. Stammar av L. infantum och L. amazonensis har genererats efter att ha integrerat generna som kodar för β-galaktocidas 21, IFP 1.4, iRFP22 och tdTomato23, och de har utvärderats för deras användbarhet i läkemedelsscreeninganalyser. Olika grupper har utvecklat L. donovani-stammar som uttrycker GFP konstitutivt genom att integrera dess kodande gen i 18S ribosomalt RNA-lokus (ssu-lokus) genom homolog rekombination24,25; de visade stabilt och homogent GFP-uttryck i den transfekterade populationen, inklusive intracellulära amastigoter 24,25, och de implementerades framgångsrikt i läkemedelsscreeninganalyser24,25,26. Bolhassani et al.27 utvecklade stammar av L. major och L. infantum som uttrycker GFP som en integrerad transgen. De använde integrationsvektorn pLEXSY, ursprungligen utformad för transgent uttryck av proteiner i ett system med L. tarentolae som värd28. pLEXSY-GFP-vektorn har visat sig vara mycket effektiv för generering av olika Leishmania-stammar som konstitutivt uttrycker GFP 24,25,27,29,30. I dessa parasiter är fluorescens homogen och upprätthålls i de intracellulära formerna, som kan detekteras i fotplatteskador hos infekterade möss27.
I detta arbete beskriver vi den metod som används för att generera L. panamensis och L. donovani-stammar som uttrycker genen som kodar för eGFP som en integrerad transgen med hjälp av pLEXSY-systemet. De stammar som genereras genom denna process används i vårt laboratorium för att utföra läkemedelsscreeninganalyser som utvärderar den potentiella anti-leishmania-aktiviteten hos molekyler av naturligt och syntetiskt ursprung.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
För att hålla proverna sterila bör alla steg som involverar parasitodling utföras inuti en huva för biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2) eller enligt lokala hälso- och säkerhetsbestämmelser. En grafisk sammanfattning av detta protokoll finns i figur 1.
Figur 1: Sammanfattande schema för protokollet för generering av eGFP-uttryckande L. panamensis och L. donovani-parasiter med användning av vektorfamiljen pLEXSY-2.1. Alla sex huvudavsnitt som beskrivs i artikeln visas här. 1) Amplifiering och införande av eGFP-genen i pLEXSY-2.1-vektorn: målgenen amplifieras och igenkänningsställen för enzymerna KpnI och BglII läggs till, och både eGFP-amplikonen och pLEXSY-plasmiden spjälkas sekventiellt med båda enzymerna för efterföljande ligering med T4-ligas. 2) Linjärisering av pLEXSY-uttrycksplasmiden: pLEXSY + eGFP-konstruktionen smälts med SwaI för linjärisering och rening av 7-8 kbp-uttryckskassetten. 3) Transfektion och 4) polyklonalt urval: Leishmania promastigotes transfekteras med uttrycket kassett genom elektroporering och sätts tillbaka i kultur för antibiotika urval av rekombinanta parasiter. Parasitfluorescens bekräftas genom flödescytometri. 5) Bekräftelse av genomisk integration och 6) kloning genom begränsning av utspädning: integration av pLEXSY-eGFP-uttryckskassetten bekräftas med diagnostisk PCR, med användning av en framåtriktad primer som hybridiserar till uttryckskassetten och en omvänd primer som hybridiserar till en kromosomal sekvens som saknas i uttryckskassetten. Transfekterade kulturer kan anrikas för fluorescerande parasiter genom kloning genom att begränsa utspädningen, och kloner med de högsta genomsnittliga fluorescerande intensiteterna kan väljas för ytterligare tillämpningar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
1. Amplifiering och införande av eGFP-genen i pLEXSY-2.1-vektorn
- Amplifiering av eGFP-genen
OBS: Eftersom detta protokoll använder vektorfamiljen pLEXSY-2.1 (se Materialförteckning) för konstitutivt uttryck av målproteiner efter integrationen av expressionskassetten i kromosomalt 18S rRNA-lokus (ssu) hos Leishmania-arter , är det första steget att introducera sekvenserna i eGFP-genen som innehåller restriktionsställena som tillåter dess införande i pLEXSY-2.1-vektorer. Eftersom eGFP endast behöver uttryckas cytosoliskt tillsattes restriktionsställena för enzymerna BglII och KpnI i 5'- respektive 3'-ändarna av eGFP-genen. Kloning med KpnI resulterar i fusion av målproteinet till en C-terminal polyhistidintagg med sex rester, följt av ett stoppkodon kodat i pLEXSY-2.1-plasmiden för ytterligare rening av proteinet av intresse. Av denna anledning innehåller den omvända primersekvensen inte ett stoppkodon.- Beroende på plasmidkällan för eGFP, analysera målsekvensen med hjälp av ett restriktionsanalysverktyg som NEBcutter (http://tools.neb.com/NEBcutter/index.php3)31 för att se till att den inte innehåller interna platser för restriktionsenzymerna som används för kloning (BglII och KpnI) eller för SwaI, vilket är enzymet som används för vektorlinjärisering före transfektion.
- Konstruera framåt- och bakåtprimers för eGFP-amplifiering innehållande restriktionssekvenserna BglII och KpnI. Som ett exempel var eGFP-källan för detta protokoll pEGFP-N1-1X plasmid32, och primersekvenserna var de som rapporterats av Bolhassani et al.27:
Framåtriktad primer (EGFP1): 5'-ATGATATCAAGATCTATGGTGAGCAAGGGC-3' (BglII-restriktionsställe i fetstil).
Omvänd primer (EGFP2): 5'-GCTCTAGATTAGGTACCCTTGTACAGCTCGTC-3' (KpnI-begränsningsplats i fetstil). - Förstärk målgenen med hjälp av ett högkvalitativt polymeras för att säkerställa bevarandet av den kodande sekvensen. Som ett exempel, för primrarna EGFP1 och EGFP2, kör PCR-cykelprotokollet som rapporterats av Bolhassani et al.27. Kör en inledande denaturering på 2 min vid 94 °C, följt av 30 cykler på 30 s vid 94 °C, 30 s vid 57 °C och 1 min vid 72 °C. Kör ett sista förlängningssteg på 10 min vid 72 °C. Tillsätt primrarna vid en slutlig koncentration av 0,2 μM.
- Rena fragmentet med hjälp av en konventionell PCR-produktreningssats eller standardutfällning av natriumacetat och etanol, enligt beskrivningen på annan plats33.
- Införande av eGFP i uttrycksvektorn pLEXSY-2.1
- Trimma ändarna på eGFP-PCR-produkten med BglII och KpnI enligt tillverkarens anvisningar.
- Ställ först in reaktionen för det enzym som kräver den lägsta saltkoncentrationen (i detta fall KpnI) enligt tillverkarens anvisningar och inkubera vid 37 °C i 1 timme.
- Tillsätt sedan 100 mM NaCl och 10 enheter BglII och inkubera i 15 minuter. Rena reaktionen enligt beskrivningen i steg 1.1.4.
- Smält pLEXSY-uttrycksvektorn med BglII och KpnI enligt det sekventiella digestionsprotokoll som beskrivs i steg 1.2.1.
- Ligate pLEXSY-vektorn och eGFP-genen med T4-ligas med ett molförhållande på 1:3 (vector:insert). Tillsätt kortfattat 100 ng smält pLEXSY och 28 ng smält eGFP-produkt till en 20 μl-reaktion innehållande ligasbuffert vid en slutlig koncentration av 1x och 3 enheter T4-DNA-ligas. Inkubera över natten vid 4 °C.
- Transformera kompetenta E. coli-celler , såsom XL-10, DH5α eller DH10B, med ligeringsprodukten erhållen i steg 1.2.3 med hjälp av standardtransformationsprotokoll33. Platta de transformerade cellerna i Luira-Bertani (LB)-ampicillinagar och inkubera i 24 timmar vid 30 °C för att välja rekombinanta kloner (pLEXSY-plasmider är stabilare i E. coli vid 30 °C än vid 37 °C).
- Skärm för närvaron av insatsen i plasmiderna med koloni PCR.
- Välj enskilda kolonier, suspendera på nytt i 20 μl nukleasfritt vatten, värm vid 95 °C i 15 minuter och ta 1 μl av lysatet som DNA-mall för koloni-PCR. Använd den framåtriktade primern för eGFP-amplifiering, som beskrivs i steg 1.1.2 (i detta exempel, EGFP1) och primern A264 (5'-CATCTATAGAGAAGTACACGTAAAAG-3') som en omvänd primer29.
- Primern A264 är utformad för att glödga 80 bp efter stoppkodonet för insatsen i pLEXSY-2.1-uttrycksvektorer. Som ett exempel, för primerparet EGFP1 + A264, använd ett PCR-cykelprotokoll bestående av en initial denaturering på 2 min vid 94 °C, följt av 30 cykler på 30 s vid 94 °C, 30 s vid 50 °C och 1 min vid 72 °C. Kör ett sista förlängningssteg på 10 min vid 72 °C. Primrarna tillsätts vid en slutlig koncentration av 0,2 μM.
OBS: Den förväntade produkten som använder denna primeruppsättning är 859 bp lång. Glödgningsställena för primrarna EGFP1 och A264 visas i figur 2.
- Bered renat plasmid-DNA från en positiv klon för efterföljande transfektion med hjälp av en kommersiell plasmidisoleringssats eller alkalisk standardutfällning33. Använd 50 ml av en nattkultur vid 30 °C för isolering av minst 10 μg plasmid/positiv klon.
- Trimma ändarna på eGFP-PCR-produkten med BglII och KpnI enligt tillverkarens anvisningar.
2. Linjärisering av pLEXSY-expressionsplasmiden
- Använd minst 10 μg renad pLEXSY-eGFP-plasmid för uppslutning med SwaI (igenkänningsställe: 5'-ATTTAAAT-3'). Röta i 3-4 timmar vid 25 °C och värmeinaktivera vid 65 °C i 20 minuter.
- Kör matsmältningsprodukten i agarosgelelektrofores för att separera de resulterande fragmenten. Denna matsmältning kommer att generera två fragment, ett 2,9 kbp-fragment som representerar de element som är nödvändiga för replikering och urval i E. coli och ett 7-8 kbp-fragment som representerar den linjäriserade uttryckskassetten.
- Rena uttryckskassetten med hjälp av en kommersiell agarosgelextraktionssats.
3. Transfektion av L. panamensis och L. donovani genom elektroporering
NOTERA: Leishmaniakulturen utförs på det sätt som beskrivs på annan plats34. I detta exempel odlades L. panamensis och L. donovani promastigotes i Schneiders insektsmedium, kompletterat med 20% (v/v) fetalt bovint serum (FBS) och 50 μg/ml gentamicin och inkuberades vid 26 °C.
- Odla parasitkulturerna tills det finns tillräckligt med logfaspromastigoter eller tidiga stationära faspromastigoter för att använda cirka 4 x 107 parasiter per transfektion. Den maximala celldensiteten per odlingskolv innan den stationära fasen når kan variera beroende på Leishmania-arten och hur väl stammarna är anpassade till laboratorieförhållandena. Slå samman innehållet i flera odlingskolvar om så krävs.
- Centrifugera parasitkulturen vid 2 000 x g i 3 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Återsuspendera pelleten i elektroporationsbuffert vid 4 °C (21 mM HEPES, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,7 mMNa2HPO4 och 6 mM glukos; pH 7,5)27 för att få en koncentration på 1 x 108 parasiter/ml. Lägg på is i 10 min.
OBS: Elektroporeringsbufferten måste steriliseras genom filtrering före användning. - Parallellt konstrueras förkylrör med 2-10 μg linjäriserad pLEXSY-eGFP i en maximal volym på 50 μL vatten eller 10 mM trisbuffert (pH 8,0) och elektroporeringskyvetter på d = 2 mm.
- Tillsätt 350 μL förkylda parasiter till röret med linjäriserad plasmid och överför hela 400 μL till elektroporeringskyvetten på is. Parallellt, elektroporera parasitcellerna utan plasmid-DNA som en negativ kontroll.
- Elektroporat med hjälp av ett av dessa två protokoll:
Exponentiellt sönderfall: 450 V, 450 μF, en puls.
Tidskonstant: 450 V, T = 3,5 ms, en puls.
OBS: Dessa protokoll kördes med hjälp av en kommersiell genpulser (Table of Materials) med PC- och CE-moduler. - Sätt tillbaka kyvetten på is i 10 minuter och överför de elektroporerade parasiterna till 5 ml av lämpligt odlingsmedium. Detta exempel använde Schneiders insektsmedium kompletterat med 20% (v/v) FBS. Inkubera vid 26 °C i 20 timmar.
4. Polyklonalt urval i kulturen
- Cirka 20 timmar efter elektroporering, observera kulturerna under ett mikroskop. Minst hälften av parasitpopulationen bör uppvisa visuellt god morfologi och motilitet (droppliknande promastigoter med oscillerande flagellum som rör sig genom mediet och/eller bildar aktiva parasitaggregat). Tillsätt lämpligt selektivt antibiotikum beroende på vilken pLEXSY-plasmid som används. I detta exempel används pLEXSY-sat2.1, som innehåller streptotricinacetyltransferas som selektionsmarkör. Använd därför nourseothricin som ett selektivt antibiotikum vid en koncentration på 0,1 mg/ml.
- Följ kulturerna mikroskopiskt tills en tydlig skillnad mellan parasiterna elektroporerade med och utan plasmid-DNA ses.
- Verifiera parasitens fluorescens genom flödescytometri.
- Centrifugera 1 ml av den stationära faskulturen vid 2 000 x g i 3 minuter vid rumstemperatur. Tvätta två gånger i PBS och suspendera den slutliga pelleten igen i 1 ml PBS.
OBS: Fluorescensen av eGFP kan detekteras i FL1-kanalen hos de flesta kommersiella cytometrar. Förstärkningsinställningar för framåt- och sidospridning, och FL1-kanalen kan variera mellan cytometrar. I detta exempel användes en CyFlow-rymdcytometer (Sysmex). - Kör proverna, samla in 20 000 händelser med en hastighet av 0,5 μl/s och ställ in förstärkningsvärdena för kanalerna framåt spridning (FSC), sidospridning (SSC) och fluorescens 1 (FL-1) som 225,0, 200,0 respektive 520,0. Kör ett kontrollprov med icke-fluorescerande parasiter för att bestämma parasitpopulationen i ett FSC- kontra SSC-punktdiagram.
- Skapa en grind (G1) som innehåller parasitpopulationen och filtrera FL-1-kanalen genom den grinden för att bestämma autofluorescensen hos promastigoter och ställa in en intervallgrind (G2) för FL-1-kanalen.
- Kör de transfekterade parasiterna för att verifiera om det finns fluorescens. Registrera procentandelen parasiter i G1 som är fluorescerande och medelvärdet av fluorescensintensiteten i G2.
- Centrifugera 1 ml av den stationära faskulturen vid 2 000 x g i 3 minuter vid rumstemperatur. Tvätta två gånger i PBS och suspendera den slutliga pelleten igen i 1 ml PBS.
5. Bekräftelse av genomisk integration
OBS: Integrationen av pLEXSY-eGFP-uttryckskassetten kan bekräftas med diagnostisk PCR, med användning av en framåtriktad primer som hybridiserar till uttryckskassetten (varierar beroende på vilken pLEXSY-2.1-vektor som används) och den omvända primern F3002 (5'-CTGCAGGTTCACCTACAGCTAC-3') som hybridiserar till en kromosomal ssu-flankeringssekvens som saknas i uttryckskassetten. I det här exemplet används F2999 framåtprimer (5'-CCTAGTATGAAGATTTCGGTGATC-3') när den hybridiseras i pLEXSY-sat2.1-uttryckskassetten. En schematisk representation av de integrerade uttryckskassett- och primerglödgningsställena för diagnostisk PCR visas i figur 2.
- Rena det genomiska DNA:t från 2-5 ml av en parasitkultur i stationär fas genom konventionell fenol/kloroformextraktion35 eller med ett kommersiellt kit.
- Utför diagnostisk PCR för pLEXSY-sat2.1 med hjälp av ett cykelprotokoll bestående av en initial denaturering på 2 minuter vid 94 °C, följt av 30 cykler på 30 s vid 94 °C, 30 s vid 53 °C och 1 min vid 72 °C. Kör ett sista förlängningssteg på 10 min vid 72 °C. Primrarna tillsätts vid en slutlig koncentration av 0,2 μM.
Figur 2: Schematisk representation av kassetten med integrerade uttryck. Lådor märkta som Chr-S (grå) representerar de intilliggande kromosomala sekvenserna av 18S rRNA-locus (ssu) i vilken uttryckskassetten är integrerad. Den integrerade expressionskassetten består av 5'- och 3'-sekvenser (blå) för homolog rekombination i ssu-lokus , en ytterligare Leishmania ribosompromotor (röd) för förbättrad proteinproduktion, eGFP-genen (grön), en selektionsmarkörgen (gul) och tre oöversatta regioner (ljusgrå), nämligen utr1, 2 och 3, som tillhandahåller splitsningssignalerna för posttranskriptionell mRNA-bearbetning för optimerat uttryck av eGFP och selektionsmarkören i Leishmania-parasiter . Glödgningsställen för framåt- och bakåtprimers som används för verifiering av skärets närvaro med koloni-PCR (steg 1.2.5) markeras med de svarta pilarna märkta som cpcr-fwd (EGFP1-primer) respektive cpcr-rev (A264-primer), som avgränsar en 859 bp-produkt. Glödgningsställena för framåt- och bakåtprimers som används för verifiering av genomisk integration genom diagnostisk PCR (steg 5) markeras med de svarta pilarna märkta som sat-fwd (F2999 primer) respektive ssu-rev (F3002 primer), som avgränsar en 2,271 bp produkt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
6. Kloning genom begränsning av utspädning (frivillig uppgift)
- Efter bekräftelse av fluorescens genom flödescytometri, bereds en spädning av rekombinanta parasiter i en koncentration av fem promastigoter/ml36.
- Tillsätt 100 μL av denna utspädning i varje brunn på en platta med 96 brunnar. På detta sätt sås plattorna med en genomsnittlig densitet på 0,5 promastigotes / brunn, vilket säkerställer att vissa brunnar får en enda parasit samtidigt som sannolikheten för att ha mer än en parasit per brunn36 minimeras.
- Lämna plattan ostörd i minst 12 timmar. Följ plattan mikroskopiskt med en minsta förstoring på 100x tills brunnar med parasittillväxt detekteras.
- När en plattbrunn är full av parasiter, använd innehållet för att inokulera en 5 ml kultur. Detta tar 1-2 veckor.
- När klonfröade kulturer når den stationära fasen, verifiera fluorescensen med flödescytometri, såsom beskrivs i steg 4.3. Välj de kloner som ska användas för vidare in vitro - och in vivo-tester baserat på procentandelen fluorescerande parasiter och den genomsnittliga fluorescensintensiteten uppmätt i FL-1-kanalen. Sikta på kloner med 98% -99% fluorescerande parasiter och välj de med den högsta genomsnittliga fluorescensintensiteten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter att ha byggt pLEXSY-eGFP-konstruktionen och transformerat kompetenta E. coli-celler kommer kolonier som innehåller konstruktionen med eGFP-insatsen att generera en produkt på cirka 859 bp efter att ha kört den koloni-PCR som beskrivs i avsnitt 1.2 (figur 3A). Total nedbrytning av den renade plasmiden från positiva kolonier med användning av SwaI bör ge två karakteristiska fragment i gelelektrofores, ett 2,9 kbp-fragment som är den del av PLEXSY-vektorn som innehåller alla nödvändiga element för replikation och selektion i E. coli, och ett 7-8 kpb-fragment som representerar den linjäriserade uttryckskassetten som används för transfektion (figur 3B).
Efter transfektion görs det polyklonala urvalet mestadels kvalitativt. Parasitkulturernas status under urval med antibiotika övervakas mikroskopiskt, vilket ger särskild uppmärksamhet åt parasitmorfologi och rörlighet. Efter framgångsrik återhämtning av en kultur av transfekterade parasiter bör de som effektivt uttrycker eGFP detekteras i FL-1-kanalen i en flödescytometer (figur 4A); transfektionseffektiviteten kan variera mellan olika Leishmania-arter . I detta arbete, efter polyklonalt urval, var 98,44% av L. donovani-parasiterna analyserade med flödescytometri fluorescerande i jämförelse med 82,00% av L. panamensis (figur 4B). Om pLEXSY-eGFP-uttryckskassetten framgångsrikt har integrerats i ssu-lokusen ska en 2,3 kbit/ s-produkt observeras efter körning av diagnostisk PCR som beskrivs i avsnitt 5 (figur 4C). Dessa resultat säkerställer att rekombinanta parasiter erhålls som konstitutivt uttrycker eGFP som en integrerad transgen och förblir stabila i efterföljande passager av parasitkulturen.
Kloning genom begränsning av utspädning möjliggör anrikning av den fluorescerande parasitpopulationen med lägre transfektionseffektivitet, såsom L. panamensis, samt val av kloner med de högsta fluorescensintensiteterna. Fyra kloner erhölls för var och en av Leishmania-arterna som användes i detta arbete (tabell 1), nämligen Lpan-A7, F11, F12 och H2 för L. panamensis och Ldon-C1, G4, F2 och H1 för L. donovani. Kloner med den högsta andelen fluorescerande parasiter (Lpan-F11 = 95,74%; Ldon-C1 = 99,16 %) och genomsnittlig fluorescensintensitet (Lpan-F11 = 35,63 relativa fluorescerande enheter [RFU]; Ldon-C1 = 14,12 RFU) valdes för vidare användning i läkemedelsscreeninganalyser.
Figur 3: Representativa resultat av beredningen av pLEXSY-eGFP-konstruktionen för transfektion. (A) Representativa resultat av kolonin PCR. Lane 1: 1 kb stege (enheter i baspar); Körfälten 2, 10 och 12: Negativa prover för förekomst av eGFP-insatsen. Körfälten 3–9 och 13–14: positiva prover för förekomst av eGFP-insatsen. (B) Resultat av linjäriseringen med SwaI. Lane 1: 1 kb stege (enheter i baspar); Bana 2-4: Digestionsreaktioner hos plasmider renade från tre olika kolonier positiva för närvaron av eGFP-insatsen. Ett 2,9 kbp-fragment som representerar de element som är nödvändiga för replikering och urval i E. coli och ett 7-8 kpb-fragment som representerar den linjäriserade uttryckskassetten observeras. Båda gelerna framställdes vid en agaroskoncentration av 1%. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa resultat av bekräftelse av eGFP-uttryck och kromosomal insättning av uttryckskassetten . (A) Histogram för flödescytometri i FL-1-kanalen. Röd: vildtypsceller utan eGFP; Blå: transfekterade L. panamensis parasiter med 82,00% av befolkningen som uttrycker eGFP. (B) Jämförelse av transfektionsresultat mellan L. panamensis (Lpan-1) och L. donovani (Ldon-1). En högre transfektionseffektivitet observerades hos L. donovani (98,44 %) än hos L. panamensis (82,00 %) efter polyklonalt urval. (C) Resultat av PCR för bekräftelse av genomisk integration. L: 100 bp stege (enheter i baspar); banor 1-4: prover från fyra olika kloner av L. panamensis som visar en karakteristisk 2,3 kbp-produkt för pLEXSY-sat2.1-integration i ssu-locus . Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Art | Klona kod | Procentandel fluorescerande parasiter | Genomsnittlig fluorescensintensitet* |
| L. panamensis | LPAN-A7 | 90.00 | 24.70 |
| LPAN-F11 | 95.74 | 35.63 | |
| LPAN-F12 | 92.85 | 34.44 | |
| LPAN-H2 | 85.00 | 20.66 | |
| L. donovani | Ldon-C1 | 99.16 | 14.12 |
| Ldon-G4 | 99.21 | 13.96 | |
| Ldon-F2 | 97.96 | 11.67 | |
| Ldon-H1 | 98.97 | 12.90 |
Tabell 1: Kloner erhållna genom begränsning av utspädning. Fyra kloner erhölls genom att begränsa utspädningen för var och en av Leishmania-arterna som användes i detta arbete. Procentandel fluorescerande parasiter och genomsnittlig fluorescensintensitet rapporteras för varje klon. *Fluorescens uttrycks i relativa fluorescensenheter (RFU).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fördelarna och nackdelarna med olika reportergener har studerats i flera protozoa parasiter. Bland dem är GFP och eGFP i sig fluorescerande och möjliggör enkel kvantifiering och avbildning. Den fluorescerande aktiviteten hos dessa proteiner kan detekteras med minimal manipulation med hjälp av fluorescensmikroskopi, fluorimetri eller flödescytometri. Få studier har utförts för att generera GFP-uttryckande L. (Viannia) stammar, trots den påvisade robustheten hos GFP och deras derivat som reportergener i Gamla världens Leishmania-arter 15,16,18,24. Varela et al.37 utvecklade L. panamensis-stammar som uttrycker GFP som en episomal transgen. Flödescytometrianalys av både axeniska promastigoter och intracellulära amastigoter visade användbarheten av dessa parasiter för läkemedelsscreeninganalyser. Fluorescensen var dock mycket heterogen och antalet fluorescerande parasiter i den transfekterade populationen var beroende av konstant selektivt tryck med antibiotikumet tunicamycin. Dessa fakta begränsar användningen av dessa parasiter som intracellulära amastigoter för läkemedelsscreeninganalyser, med tanke på att tunicamycin inte kan tillsättas infekterade makrofager38, vilket lämnar parasiter med låg fluorescens närvarande i populationen av intracellulära amastigoter som kan snedvrida kvantifieringen av infekterade makrofager.
Användningen av vektorer som pLEXSY utgör ett kraftfullt och tillförlitligt verktyg för stabil modifiering av Leishmania-artparasiter genom integration av transgener med hjälp av homolog rekombination28. pLEXSY-kassetten är integrerad i 18S rRNA-locus (ssu), vars transkription är under kontroll av RNA-polymeras I stark promotor, vilket leder till högre transkriptionshastigheter20. Användningen av detta system har visat sig möjliggöra stabilt och homogent uttryck av målproteinet27. Dessa egenskaper gynnar uttrycket av eGFP och dess användning i intracellulära analyser med homogena nivåer av fluorescens i infekterade celler, liksom dess användning för experimentella infektioner i murina modeller. Vektorfamiljen pLEXSY-2.1 som används i detta protokoll har utformats med en extra Leishmania ribosomal promotor framför uttryckskassetten, vilket förbättrar proteinproduktionen 29,30.
I detta protokoll finns det flera kritiska steg för att uppnå optimala resultat. För det första bör kloning av målgenen utföras med användning av ett polymeras33 med hög trohet, och uppslutning av mål-DNA och expressionsvektorn bör göras med hjälp av ett sekventiellt matsmältningsprotokoll när BglII/KpnI-kombinationen används för kloning. Det senare beror på att det inte finns någon buffert där både BglII och KpnI uppvisar optimal aktivitet, även om båda enzymerna är optimalt aktiva vid samma temperatur (37 °C). För det andra bör selektionen av rekombinanta kloner efter omvandling i E. coli utföras vid 30 °C, eftersom pLEXSY-plasmider är mer stabila vid denna temperatur i E. coli28,29. Dessutom, tillväxttakten för L. panamensis och L. donavani kan vara ganska olika. Under utförandet av experimenten som beskrivs i denna artikel tog L. panamensis vanligtvis längre tid att nå den stationära fasen. Tillväxttakten kan också variera från stam till stam i olika laboratorier; Därför är det nödvändigt att karakterisera tillväxthastigheterna för laboratoriestammarna för uppskattning av den tid som krävs för att nå den parasitkoncentration som krävs för elektroporering. Att använda bufferten som rapporterats av Bolhassani et al.27 för elektroporering är en viktig modifiering som avsevärt ökar överlevnaden av de elektroporerade parasiterna jämfört med direkt elektroporering i ett odlingsmedium, vilket föreslås av det ursprungliga Jena Bioscience-protokollet. Under polyklonalt urval är det extremt viktigt att inte låta de elektroporerade kulturerna växa över innan det selektiva antibiotikumet tillsätts; Annars kommer icke-rekombinanta parasiter att växa ut de rekombinanta27. Det kommer att ta en eller två på varandra följande passager (1:10 inokulum) i färskt medium med lämpligt antibiotikum för att få en grumlig kultur av antibiotikaresistenta rekombinanta parasiter och en tydlig negativ kontroll. Passager bör göras inom 5 dagar efter den första antibiotikatillsatsen. Slutligen finns det märkbara skillnader i effektiviteten av transfektion och integration av pLEXSY-uttryckskassetten mellan L. panamensis och L. donovani24,37. Medan i L. donovani nästan 98% av den totala befolkningen analyseras genom flödescytometri efter polyklonalt urval visar fluorescens, i L. panamesis, andelen fluorescerande parasiter är cirka 80%. Av denna anledning är det valfria steget kloning genom att begränsa utspädning en modifiering som oftast krävs för att erhålla en L. panamensis-population där mer än 95% av parasiterna analyserade genom flödescytometri är fluorescerande. Användningen av pLEXSY-plasmider är begränsad till genomisk modifiering av Leishmania-arter, eftersom de ursprungligen utformades för att använda L. tarentolae som proteinproduktionsplattformar28. Även om pLEXSY har visat sig fungera i flera Leishmania-arter som skiljer sig från L. tarentolae21,24,27, är det viktigt att verifiera bevarandet av ssu-sekvensen när man arbetar med en ny Leishmania-art för att säkerställa att rekombinationsställen i pLEXSY-plasmiden fungerar.
Metoden som beskrivs i denna artikel möjliggör produktion av rekombinanta Leishmania-parasiter med ett konstitutivt och stabilt uttryck av eGFP eller någon annan rapportör av intresse. I dessa parasiter är fluorescens homogen och den upprätthålls i intracellulära former. Därför kan stammar som genereras genom denna process användas för standardisering av läkemedelsscreeninganalyser med hög genomströmning för att utvärdera den potentiella anti-leishmania-aktiviteten hos molekyler av naturligt och syntetiskt ursprung.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT), Panamá, bidragsnummer NI-177-2016, och Sistema Nacional de Investigación (SNI), Panamá, bidragsnummer SNI-169-2018, SNI-008-2022 och SNI-060-2022.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Microplates | Corning | CLS3340 | Flat bottom clear, black polystyrene, sterile, lid |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A8351 | BioXtra, suitable for cell culture |
| BglII restriction enzyme | New England BioLabs | R0144S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Cell Culture Flasks | Corning | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad | 17001401 | |
| CyFlow Space | Sysmex | Not available | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5% |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Gel Loading Buffer | Sigma-Aldrich | G2526 | The rate of migration varies with gel composition. Dilute 1:3 to 1:6 with sample before loading. |
| Gene Pulser Xcell Electroporation System | Bio-Rad | 1652660 | The system is composed of a main unit, two accessory modules, the capacitance extender (CE module) and the pulse controller (PC module), and a ShockPod cuvette chamber. |
| Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes | Bio-Rad | 1652086 | Pkg of 50, 0.2 cm–gap sterile electroporation cuvette, for use with the Gene Pulser and MicroPulser Systems, for mammalian and other eukaryotic cells |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg/mL in deionized water, liquid, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| GoTaq Long PCR Master Mix | Promega | M4021 | |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Inverted microscope | Olympus | IXplore Standard | |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3142S | 4,000 units. 20,000 units/mL |
| LB Broth with agar | Sigma-Aldrich | L3147 | Highly-referenced nutrient-rich microbial growth powder medium with Agar, suitable for regular E.coli culture. |
| LB Broth | Sigma-Aldrich | L2542 | Liquid microbial growth medium |
| Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad | 1640300 | Mini horizontal electrophoresis system, includes 8- and 15-well combs, 7 cm x 10 cm UV-transparent tray |
| pEGFP-N1-1x | Addgene | 172281 | Expressing eGFP mRNA fused with 1 tandem repeat of a 50-base sequence |
| pLEXSYcon2.1 expression kit | Jena Bioscience | EGE-1310sat | Contains integrative constitutive expression vector pLEXSY-sat2.1. Antibiotic selection of transfectants with Nourseothricin (NTC, clonNAT). Contains all primers for diagnostic PCRs and sequencing. |
| Potassium Chloride | Millipore | 529552 | Molecular Biology Grade - CAS 7447-40-7 - Calbiochem |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | Up to 15 μg of Transfection-Ready Plasmid from 3 mL cultures. |
| Schneider′s Insect Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | Medium used in our laboratory for culturing Leishmania. |
| SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥99% (titration) |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | RDD038 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, ≥99.0%, free-flowing, Redi-Dri |
| SwaI restriction enzyme | New England BioLabs | R0604S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Syringe filters | Corning | CLS431212 | regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm, pore size 0.2 μm |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | Thermal cycler system, includes 96-well thermal cycler, power cord, tube support ring |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | Joins two DNA strands with cohesive or blunt ends |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | BioReagent, suitable for electrophoresis, 10× concentrate |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9285 | |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL. Features the kanamycin-resistance gene on the F' episome, for extremely demanding cloning in chloramphenicol-resistant vectors. Efficiency: > 5 x 10 9 transformants/µg pUC18 DNA. |
References
- Alvar, J., et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PLoS One. 7 (5), e35671 (2012).
- Franssen, S. U., et al. Global genome diversity of the Leishmania donovani complex. eLife. 9, e51243 (2020).
- Saldaña, A., et al. Clinical cutaneous leishmaniasis rates are associated with household Lutzomyia gomezi, Lu. Panamensis, and Lu. trapidoi abundance in Trinidad de Las Minas, western Panama. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 88 (3), 572-574 (2013).
- Ramírez, J. D., et al. Taxonomy, diversity, temporal and geographical distribution of Cutaneous Leishmaniasis in Colombia: A retrospective study. Scientific Reports. 6, 28266 (2016).
- Ponte-Sucre, A., et al. Drug resistance and treatment failure in leishmaniasis: A 21st century challenge. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), e0006052 (2017).
- Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. Current scenario of drug development for leishmaniasis. Indian Journal of Medical Research. 123 (3), 399-410 (2006).
- Croft, S. L., Yardley, V., Kendrick, H. Drug sensitivity of Leishmania species: some unresolved problems. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 96, S127-S129 (2002).
- Sereno, D., Cordeiro da Silva, A., Mathieu-Daude, F., Ouaissi, A. Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures. Parasitology International. 56 (1), 3-7 (2007).
- Don, R., Ioset, J. R. Screening strategies to identify new chemical diversity for drug development to treat kinetoplastid infections. Parasitology. 141 (1), 140-146 (2014).
- Sereno, D., Roy, G., Lemesre, J. L., Papadopoulou, B., Ouellette, M. DNA transformation of Leishmania infantum axenic amastigotes and their use in drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1168-1173 (2001).
- Roy, G., et al. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. infections in macrophages and in animal models. Molecular and Biochemical Parasitology. 110 (2), 195-206 (2000).
- Lang, T., Goyard, S., Lebastard, M., Milon, G. Bioluminescent Leishmania expressing luciferase for rapid and high throughput screening of drugs acting on amastigote-harbouring macrophages and for quantitative real-time monitoring of parasitism features in living mice. Cellular Microbiology. 7 (3), 383-392 (2005).
- Ashutosh, G. S., Ramesh, S. S., Goyal, N. Use of Leishmania donovani field isolates expressing the luciferase reporter gene in in vitro drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (9), 3776-3783 (2005).
- Buckner, F. S., Wilson, A. J. Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania amastigotes grown in macrophages. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 72 (5), 600-605 (2005).
- Okuno, T., Goto, Y., Matsumoto, Y., Otsuka, H., Matsumoto, Y. Applications of recombinant Leishmania amazonensis expressing egfp or the beta-galactosidase gene for drug screening and histopathological analysis. Experimental Animals. 52 (2), 109-118 (2003).
- Kamau, S. W., Grimm, F., Hehl, A. B. Expression of green fluorescent protein as a marker for effects of antileishmanial compounds in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3654-3656 (2001).
- Singh, N., Dube, A. Short report: fluorescent Leishmania: application to anti-leishmanial drug testing. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 71 (4), 400-402 (2004).
- Dube, A., Singh, N., Sundar, S., Singh, N. Refractoriness to the treatment of sodium stibogluconate in Indian kala-azar field isolates persist in in vitro and in vivo experimental models. Parasitology Research. 96 (4), 216-223 (2005).
- Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. A microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein. Parasitology Research. 89 (4), 266-271 (2003).
- Boucher, N., McNicoll, F., Dumas, C., Papadopoulou, B. RNA polymerase I-mediated transcription of a reporter gene integrated into different loci of Leishmania. Molecular and Biochemical Parasitology. 119 (1), 153-158 (2002).
- da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity. Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).
- Calvo-Álvarez, E., et al. Infrared fluorescent imaging as a potent tool for in vitro, ex vivo and in vivo models of visceral leishmaniasis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003666 (2015).
- García-Bustos, M. F., et al. Development of a fluorescent assay to search new drugs using stable tdtomato-leishmania, and the selection of galangin as a candidate with anti-leishmanial activity. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 666746 (2021).
- Singh, N., Gupta, R., Jaiswal, A. K., Sundar, S., Dube, A. Transgenic Leishmania donovani clinical isolates expressing green fluorescent protein constitutively for rapid and reliable ex vivo drug screening. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (2), 370-374 (2009).
- De Rycker, M., et al. Comparison of a high-throughput high-content intracellular Leishmania donovani assay with an axenic amastigote assay. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (7), 2913-2922 (2013).
- Peña, I., et al. New compound sets identified from high throughput phenotypic screening against three kinetoplastid parasites: an open resource. Scientific Reports. 5, 8771 (2015).
- Bolhassani, A., et al. Fluorescent Leishmania species: development of stable GFP expression and its application for in vitro and in vivo studies. Experimental Parasitology. 127 (3), 637-645 (2011).
- Breitling, R., et al. Non-pathogenic trypanosomatid protozoa as a platform for protein research and production. Protein Expression and Purification. 25 (2), 209-218 (2002).
- Pulido, S. A., et al. Improvement of the green fluorescent protein reporter system in Leishmania spp. for the in vitro and in vivo screening of antileishmanial drugs. Acta Tropica. 122 (1), 36-45 (2012).
- Bastos, M. S. E., et al. Achievement of constitutive fluorescent pLEXSY-egfp Leishmania braziliensis and its application as an alternative method for drug screening in vitro. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (2), 155-159 (2017).
- Vincze, T., Posfai, J., Roberts, R. J. NEBcutter: A program to cleave DNA with restriction enzymes. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3688-3691 (2003).
- Chen, M., et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).
- Green, M., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
- Santarém, N., et al. The impact of distinct culture media in Leishmania infantum biology and infectivity. Parasitology. 141 (2), 192-205 (2014).
- Medina-Acosta, E., Cross, G. A. Rapid isolation of DNA from trypanosomatid protozoa using a simple "mini-prep" procedure. Molecular and Biochemical Parasitology. 59 (2), 327-329 (1993).
- Ye, M., Wilhelm, M., Gentschev, I., Szalay, A. A modified limiting dilution method for monoclonal stable cell line selection using a real-time fluorescence imaging system: a practical workflow and advanced applications. Methods and Protocols. 4 (1), 16 (2021).
- Varela, M. R. E., et al. Leishmania (Viannia) panamensis: an in vitro assay using the expression of GFP for screening of antileishmanial drug. Experimental Parasitology. 122 (2), 134-139 (2009).
- Komura, T., et al. ER stress induced impaired TLR signaling and macrophage differentiation of human monocytes. Cellular Immunology. 282 (1), 44-52 (2013).
