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Biology

विच्छेदन, हिस्टोलॉजिकल प्रोसेसिंग, और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण Murine Supraclavicular ब्राउन वसा ऊतक

Published: March 29, 2024 doi: 10.3791/66475
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,2, 1
1Children's Nutrition Research Center, Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine, 2Department of BioSciences, Rice University

Summary

यहां, हम murine supraclavicular brown वसा ऊतक के हिस्टोलॉजिकल और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण को विदारक और प्रदर्शन करने के लिए एक व्यावहारिक प्रक्रिया प्रदान करते हैं।

Abstract

ब्राउन वसा ऊतक (बीएटी) -मध्यस्थता थर्मोजेनेसिस चयापचय के नियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और इसकी आकृति विज्ञान और कार्य चूहों और मनुष्यों में पर्यावरणीय उत्तेजनाओं से बहुत प्रभावित हो सकता है। वर्तमान में, murine interscapular BAT (iBAT), जो चूहों के ऊपरी पृष्ठीय फ्लैंक में दो स्कैपुला के बीच स्थित है, BAT फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए अनुसंधान प्रयोगशालाओं द्वारा उपयोग किया जाने वाला मुख्य BAT डिपो है। हाल ही में, चूहों में कुछ पहले अज्ञात बैट डिपो की पहचान की गई थी, जिसमें मानव सुप्राक्लेविकुलर ब्राउन वसा ऊतक के अनुरूप एक भी शामिल था। आईबीएटी के विपरीत, म्यूरिन सुप्राक्लेविकुलर ब्राउन एडिपोज टिश्यू (एससीबीएटी) गर्दन की मध्यवर्ती परत में स्थित होता है और इस प्रकार इसे आसानी से एक्सेस नहीं किया जा सकता है।

नए पहचाने गए माउस स्कैट के अध्ययन को सुविधाजनक बनाने के लिए, यहां प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल है जो प्रसवोत्तर और वयस्क चूहों से बरकरार एससीबीएटी को विच्छेदन करने के चरणों का विवरण देता है। अन्य वसा डिपो के सापेक्ष scBAT के छोटे आकार के कारण, प्रक्रियाओं को विशेष रूप से scBAT प्रसंस्करण के लिए संशोधित और अनुकूलित किया गया है। इन संशोधनों के बीच ऊतक संग्रह के दौरान एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए जमे हुए scBAT नमूनों की सटीकता और homogenization बढ़ाने के लिए बाद qPCR विश्लेषण की दक्षता बढ़ाने के लिए है. इन अनुकूलन के साथ, की पहचान, रूपात्मक उपस्थिति, और scBAT के आणविक लक्षण वर्णन चूहों में निर्धारित किया जा सकता है.

Introduction

अमेरिका और दुनिया भर में मोटापे की बढ़ती व्यापकता अपने एटियलजि को समझने और संभावित उपचार 1,2 की पहचान करने में बहुत रुचि प्रज्वलित किया है. वसा ऊतक चयापचय में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और वसा ऊतक के विकृति से मोटापे का विकास हो सकता है। आम तौर पर, दो प्रकार के वसा ऊतक, सफेद और भूरे रंग के वसा ऊतक होते हैं। जबकि सफेद वसा ऊतक (वाट) रासायनिक ऊर्जा स्टोर और अंतःस्रावी कारकों का स्राव कर सकते हैं, ब्राउन वसा ऊतक (बैट) गर्मी उत्पन्न करने और ठंड 3,4 में शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए रासायनिक ऊर्जा का उपयोग कर सकते हैं. इस अनूठी क्षमता के कारण, बैट की सक्रियता भी ऊर्जा व्यय में वृद्धि कर सकती है और इंसुलिन संवेदनशीलता में सुधार कर सकतीहै।

बैट गैर-कंपकंपी थर्मोजेनेसिस के माध्यम से अपने कार्य को पूरा करता है, प्रोटीन 1 (यूसीपी 1) 6 को अनकपलिंग द्वारा मध्यस्थता की गई प्रक्रिया। चूहों और मनुष्यों सहित स्तनधारियों के पास बैट की अलग-अलग मात्रा होती है। बैट का शास्त्रीय दृष्टिकोण यह है कि ये वसा ऊतक वयस्क मनुष्यों की तुलना में चूहों और शिशुओं में अधिक प्रचुर मात्रा में हैं। iBAT, स्कैपुला के बीच ऊपरी पृष्ठीय फ्लैंक में स्थित है, चूहों में सबसे अधिक अध्ययन किया गया बैट डिपो है। रेडियोसोटोप इमेजिंग और बायोप्सी परीक्षणों को लागू करके, हाल के अध्ययनों ने वयस्क मनुष्यों में कई बैट डिपो की पहचान की। उनमें से कुछ, गहरी गर्दन और supraclavicular क्षेत्र में पाया डिपो सहित, पहले चूहों या अन्य मॉडल जानवरों 7,8,9,10,11 में पहचान नहीं की गई थी. इन बैट डिपो में, scBAT वयस्क मनुष्यों में सबसे अधिक बार देखा जाने वाला डिपो है। मनुष्यों में इन नए पाए गए बैट डिपो की उत्पत्ति और आणविक योगदान को बेहतर ढंग से समझने के लिए, चूहों में समकक्ष डिपो की पहचान करना आवश्यक है जो आनुवंशिक और आणविक जोड़तोड़ को इन डिपो की कार्यात्मक भूमिका का पता लगाने और परीक्षण करने की अनुमति देते हैं। इस प्रकार, हम और दूसरों ने चूहों में विभिन्न शारीरिक स्थानों में कुछ पहले अज्ञात बैट डिपो की पहचान की, जिसमें एससीबीएटी12,13, थोरैसिक पेरिवास्कुलर बैट 14,15, पेरिरेनल बैट16, और पेरियाओर्टिक बैट17 शामिल हैं। माउस scBAT शारीरिक रूप से मानव scBAT जैसा दिखता है और रूपात्मक रूप से शास्त्रीय iBAT जैसा दिखता है, UCP112 के उच्च स्तर को व्यक्त करता है।

माउस iBAT के विपरीत, जिसे आसानी से विच्छेदित किया जा सकता है, scBAT माउस गर्दन की मध्यवर्ती परत में, लार ग्रंथियों के नीचे और बाहरी जुगुलर नस के साथ स्थित है। हिस्टोलॉजिकल और आणविक विश्लेषण के लिए इस डिपो का अलगाव चुनौतीपूर्ण हो सकता है। यहां, हम प्रसवोत्तर और वयस्क चूहों से scBAT को विदारक करने और ऊतक विज्ञान और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए इस डिपो को संसाधित करने की प्रक्रिया का विस्तार से वर्णन करते हैं।

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Protocol

पशु प्रक्रियाओं को बायलर कॉलेज ऑफ मेडिसिन में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी प्रक्रियाएं 3 सप्ताह और 3 महीने की उम्र के C57BL/6J नर चूहों पर की गईं। विच्छेदन से पहले, सभी चूहों को अनुमोदित कृंतक कार्बन डाइऑक्साइड इच्छामृत्यु प्रक्रिया का उपयोग करके इच्छामृत्यु दी गई थी। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, अभिकर्मकों और उपकरणों से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. scBAT का विच्छेदन

  1. कार्यक्षेत्र पर माउस शव रखें और 70% इथेनॉल के साथ सर्जिकल कैंची और सुपरफाइन बिंदु संदंश को साफ करें।
  2. फर गीला और फर संदूषण को कम करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ माउस की उदर गर्दन स्प्रे.
  3. हंसली के साथ एक द्विपक्षीय चीरा, लगभग 1.5 सेमी, बनाओ।
  4. पिछले चीरा के सिरों से, कानों की ओर अनुदैर्ध्य रूप से कटौती, लगभग 1 सेमी लंबा। यह गर्दन के चारों ओर एक वर्ग यू-आकार का चीरा (चित्रा 1 ए, बी) बनाएगा।
    नोट: scBAT गर्दन की मध्यवर्ती परत में स्थित है। त्वचा, चमड़े के नीचे के वसा ऊतक और लार ग्रंथियों से बनी सतही परत इस चरण के दौरान उजागर होती है। मध्यवर्ती परत, scBAT के साथ, गले की नसों और गर्दन की मांसपेशियों में होती है। गर्दन की गहरी परत, जिसमें गहरी गर्दन बैट और धमनी और गले की नसें होती हैं, कंकाल की मांसपेशी को हटाकर उजागर होती हैं।
  5. माउस को एक विदारक माइक्रोस्कोप के नीचे रखें और उजागर गर्दन को फोकस(चित्रा 1सी)में लाएं।
    नोट: यह जोड़ा कदम ऊतक संग्रह की सटीकता को बहुत बढ़ाता है, जो कि स्कैबैट के छोटे आकार को देखते हुए आवश्यक है।
  6. संदंश के साथ दूर कटे हुए त्वचा वर्गों उठाने से लार ग्रंथियों पूरी तरह से बेनकाब.
  7. सर्जिकल कैंची और संदंश का उपयोग करके, हंसली के आसपास के ऊतक को लार ग्रंथियों को जोड़ने वाले ऊतक को डिस्कनेक्ट करें और एक दूसरे को।
  8. लार ग्रंथियों को उठाकर scBAT डिपो का पर्दाफाश करें। बाहरी जुगुलर नस के साथ बैट की तलाश करें और संभवतः लार ग्रंथियों के नीचे से जुड़ा हुआ है। इसे इसके नारंगी रंग से पहचानें, जो आसपास के ऊतक के खिलाफ खड़ा है।
  9. संदंश के साथ लक्ष्य वसा ऊतक पकड़ो और धीरे लार ग्रंथियों से दूर छील.
  10. एक बार लार ग्रंथियों से अलग हो जाने के बाद, बाहरी जुगुलर नस और गर्दन की मांसलता से scBAT को डिस्कनेक्ट करना जारी रखें जब तक कि गर्दन के दोनों ओर डिपो को पूरा हटाया नहीं जा सकता।
  11. विदारक माइक्रोस्कोप (चित्रा 1 डी, ई) के तहत प्रत्येक विच्छेदित scBAT नमूना का निरीक्षण करें, किसी भी शेष संयोजी ऊतक को हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें।
  12. फॉस्फेट-बफर खारा समाधान (पीबीएस) के 10 एमएल युक्त एक गिलास जगमगाहट शीशी में प्रत्येक नमूना रखें और माइक्रोस्कोप के नीचे से माउस को हटा दें।

2. प्रसंस्करण और हेमटोक्सिलिन और ईोसिन (एच एंड ई) scBAT का धुंधला हो जाना ( चित्र 2A में सचित्र)

  1. पीबीएस (चरण 1.12) को 10 एमएल ठंडे 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ बदलें और शीशी को न्यूटेटर पर रखें, एससीबीएटी को ठीक करने के लिए रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर रॉकिंग।
    नोट: छिड़काव निर्धारण प्रसवोत्तर में लागू किया जा सकता है, विशेष रूप से वयस्क चूहों, जब immunohistochemistry विश्लेषण के लिए आगे की प्रक्रिया की जरूरत है.
  2. अगले दिन, एक बाँझ हस्तांतरण विंदुक के साथ शीशी से पीएफए समाधान को हटा दें और इसे पीबीएस के 10-15 एमएल के साथ बदलें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए एक nutator और चट्टान पर शीशी रखें. पीबीएस को 0.85% खारा समाधान के साथ बदलें और कमरे के तापमान पर एक और 30 मिनट के लिए रॉकिंग जारी रखें।
    नोट: खारा समाधान DEPC-उपचारित पानी (RNase मुक्त) में 0.85% खारा (NaCl) w/v है। पीबीएस को इस और निम्नलिखित चरण में खारा समाधान के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
  3. एक हस्तांतरण विंदुक के साथ 0.85% खारा निकालें और शीशी के लिए 70% इथेनॉल/0.85% खारा समाधान के 10 एमएल जोड़ें। शीशी को 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में रात भर या पैराफिन एम्बेडिंग के लिए तैयार होने तक स्टोर करें।
    नोट: पीबीएस का उपयोग किया जा सकता है यदि 0.85% खारा उपलब्ध नहीं है। scBAT आसान सेक्शनिंग और बेहतर संरक्षित ऊतक आकृति विज्ञान के लिए जितनी जल्दी हो सके संसाधित किया जाना चाहिए.
  4. पैराफिन एम्बेडिंग से पहले, ऊतक से पानी निकालने के लिए इथेनॉल एक्सचेंजों की एक श्रृंखला के माध्यम से एससीबीएटी को निर्जलित करें।
    1. शुरू करने के लिए, एक हस्तांतरण विंदुक के साथ शीशी से 70% इथेनॉल / 0.85% खारा निकालें और 95% निर्जलीकरण शराब के 10-15 एमएल जोड़ें, 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक न्यूटेटर पर शीशी रॉकिंग। इस चरण को एक बार दोहराएं।
      नोट: इथेनॉल का उपयोग निर्जलीकरण शराब समाधान के स्थान पर किया जा सकता है।
    2. इसके बाद, 95% निर्जलीकरण अल्कोहल को 100% निर्जलीकरण अल्कोहल के 10-15 एमएल के साथ बदलें और 1 घंटे के लिए न्यूटेटर पर रॉकिंग जारी रखें। नए 100% निर्जलीकरण अल्कोहल के साथ फिर से भरना और शीशी में scBAT की मात्रा के आधार पर कई घंटों या रात भर रॉक करना जारी रखें।
  5. एम्बेडिंग के लिए scBAT साफ़ करने के लिए, शीशी में टोल्यूनि के 10 एमएल जोड़ें और एक न्यूटेटर पर रॉकिंग जारी रखें जब तक कि scBAT पारदर्शी न हो, लगभग 6-8 घंटे।
    नोट: संतोषजनक समाशोधन प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय की अवधि scBAT के आकार पर निर्भर है। सुबह तुरंत समाशोधन शुरू करने की सिफारिश की जाती है ताकि दोपहर में घुसपैठ और एम्बेडिंग हो सके।
  6. पैराफिन मोम में scBAT एम्बेड करने के लिए, टोल्यूनि को हटा दें और शीशी में पिघला हुआ घुसपैठ पैराफिन मोम के 10 एमएल जोड़ें। शीशी को 1 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में रखें। इस चरण को नए मोम के साथ दोहराएं।
    नोट: एम्बेडिंग शुरू होने से पहले रात भर ओवन में मोम छर्रों को पिघलाना शुरू करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि मोम पूरी तरह से तरल है।
  7. घुसपैठ पैराफिन मोम को एम्बेडिंग पैराफिन मोम के साथ बदलें और शीशी को 1 घंटे के लिए एक ही तापमान पर रखें। इस चरण को एक बार दोहराएं।
    नोट: घुसपैठ चरण बाधित किया जा सकता है और बाद में जारी रखा जा सकता है. ओवन से शीशी निकालें और इसे जारी रखने के लिए तैयार होने तक कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  8. ऊतक को पहले एक ऊतक एम्बेडिंग मोल्ड में रखकर एम्बेड करें, मोल्ड में पिघला हुआ एम्बेडिंग मोम जोड़ें, और ऊतक को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत पुन: पेश करें। फिर, मोम के शीर्ष पर एक एम्बेडिंग कैसेट जगह है और यह भर गया है और एम्बेडिंग टोपी मोम ब्लॉक करने के लिए बांधा जाता है जब तक यह के शीर्ष पर एम्बेडिंग मोम डालना जारी है. धातु मोल्ड को हटाने से पहले मोम को सख्त और सिकुड़ने देने के लिए ब्लॉक को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में स्थानांतरित करें।
  9. 5-6 माइक्रोन18 की मोटाई के लिए एक माइक्रोटोम के साथ एससीबीएटी को खंड, माइक्रोस्कोप स्लाइड प्रति तीन से चार खंड, और ऊतक वर्गों को सुचारू करने की अनुमति देने के लिए ~ 42 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म पैराफिन अनुभाग फ्लोटेशन स्नान में रखें।
  10. अनुभागों को स्लाइड में स्थानांतरित करें और स्लाइड्स को फ्लोटेशन बाथ के खिलाफ सीधा रखें ताकि पानी स्लाइड से टपक सके।
  11. एक स्टेनलेस धुंधला रैक के लिए स्लाइड स्थानांतरण और रात भर सूखी करने के लिए एक स्लाइड सुखाने बेंच पर रैक जगह.
    नोट: पैराफिन स्लाइड को आगे की प्रक्रिया प्राप्त करने से पहले कमरे के तापमान पर लंबे समय तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  12. एच एंड ई धुंधलाप्रदर्शन 19. शुरू करने के लिए, एक धुंधला रैक में स्लाइड जगह है, तो 40 एस के लिए xylene के साथ एक धुंधला जार में रैक जगह है. इस चरण को एक बार दोहराएं।
    नोट: यदि पैराफिन अभी भी दो चरणों के बाद दिखाई दे रहा है, तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि यह जारी रखने से पहले पूरी तरह से भंग न हो जाए।
  13. ऊतक को फिर से हाइड्रेट करने के लिए, स्लाइड रैक को दो 20 एस चरणों के लिए 100% निर्जलीकरण अल्कोहल से भरे एक धुंधला जार में रखें, इसके बाद 95% निर्जलीकरण अल्कोहल में 15 एस चरण, और डीडीएच2ओ में अंतिम 15 एस कुल्ला।
  14. परमाणु धुंधला प्राप्त करने के लिए 75 एस के लिए हेमटोक्सिलिन समाधान से भरे एक धुंधला पकवान में स्लाइड रखें, फिर 45 एस के लिए डीडीएच2ओ के साथ एक धुंधला पकवान में स्लाइड कुल्ला।
    नोट: वांछित दाग रंग के आधार पर समय समायोजित किया जा सकता है।
  15. 15 एस के लिए एचसीएल-इथेनॉल समाधान से भरे धुंधला पकवान में स्लाइड को डुबोकर धुंधला अंतर करें, फिर स्लाइड को 15 एस के लिए एक और डीडीएच2ओ कुल्ला में स्थानांतरित करें।
    नोट: एचसीएल-इथेनॉल समाधान एक प्रकाशित विधि19 के अनुसार तैयार किया जाता है।
  16. साइटोप्लाज्मिक धुंधला के लिए, स्लाइड को 15 एस के लिए ईओसिन वाई काउंटरस्टेन समाधान में रखें।
  17. तीन अनुक्रमिक 95% निर्जलीकरण शराब समाधान चरणों में प्रत्येक 15 एस के लिए स्लाइड डुबकी द्वारा ऊतक निर्जलीकरण, तो दो अनुक्रमिक 100% निर्जलीकरण शराब स्नान-15 एस के लिए पहली और 45 एस के लिए दूसरा निर्जलीकरण खत्म करने के लिए.
  18. अंत में, कार्बनिक सॉल्वैंट्स के लिए ऊतक reacclimate करने के लिए 45 एस के लिए एक xylene स्नान करने के लिए स्लाइड हस्तांतरण. इस चरण के बाद, धुंधला पूरा हो गया है; समाधान से ऊतक निकालें.
  19. प्रत्येक स्लाइड के लिए बढ़ते माध्यम लागू करें और यह एक रासायनिक धूआं हुड के अंदर coverslip. इमेजिंग से पहले रात भर सूखा। इमेजिंग परिणाम चित्रा 2 बी में दिखाए जाते हैं।

3. scBAT का जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण

  1. ऊतक संग्रह (पीस)
    1. scBAT विदारक करने के बाद, तुरंत एक microcentrifuge ट्यूब में ऊतक डाल, एक बाँझ सुई के साथ ट्यूब के शीर्ष में एक छेद प्रहार, और तरल नाइट्रोजन में तस्वीर फ्रीज.
      नोट: यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल के प्रमुख चरणों को चित्रा 3 ए में चित्रित किया गया है। तरल नाइट्रोजन में छोड़ने से पहले ट्यूब के शीर्ष में एक छेद पोक करना अचानक दबाव परिवर्तन के कारण ट्यूब को फटने से रोकता है।
    2. तरल नाइट्रोजन के साथ एक प्लास्टिक बीकर भरें और भिगोने के लिए एक मूसल और पतली रंग छोड़ दें.
      नोट: ऊतक को विगलन से रोकने के लिए पूरी प्रक्रिया के दौरान, तरल नाइट्रोजन के तापमान के करीब, सभी उपकरणों और ऊतक के नमूनों के तापमान को यथासंभव ठंडा रखना महत्वपूर्ण है। पिघला हुआ वसा ऊतक बहुत पक्षपाती होता है और पाउडर को अधिक चुनौतीपूर्ण बनाता है। उपयोग करने से तुरंत पहले केवल तरल नाइट्रोजन स्नान से उपकरण और नमूने हटा दें।
    3. एक समय में एक स्नैप जमे हुए ऊतक नमूना ले लो और मोर्टार में अपने microcentrifuge ट्यूब से डालना.
    4. मोर्टार में थोड़ी मात्रा में तरल नाइट्रोजन डालें, फिर मूसल का उपयोग जमे हुए ऊतक को तब तक पीसने के लिए करें जब तक कि यह पूरी तरह से चूर्णित न हो जाए।
      नोट: यदि ऊतक किसी भी बिंदु पर नरम या चिपचिपा होने लगता है, तो यह पिघलना है; मोर्टार में अधिक तरल नाइट्रोजन डालो।
    5. ध्यान से परिमार्जन और microcentrifuge ट्यूब में वापस pulverized ऊतक हस्तांतरण करने के लिए पतली रंग का प्रयोग करें. मोर्टार में तरल नाइट्रोजन डालो, जबकि एक स्पैटुला के साथ स्थानांतरित करने से पहले ऊतक के बचे हुए बिट्स को इकट्ठा करने के लिए स्क्रैप करें। स्थानांतरण चरणों को दोहराएं जब तक कि सभी ऊतक मोर्टार से हटा नहीं दिए जाते।
    6. पीसने के लिए अगले नमूने को डंप करने से पहले एक हल्के कर्तव्य ऊतक वाइपर और 70% इथेनॉल के साथ मोर्टार को साफ करें। पाउडर ऊतक को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में लंबे समय तक स्टोर करें।
  2. कुल आरएनए अलगाव
    1. तैयारी
      1. RNase को हटाने के लिए 70% इथेनॉल और सतह decontaminant दोनों के साथ कार्यक्षेत्र, पिपेट, टिप धारकों, और ट्यूब रैक साफ करें.
      2. 4 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने के लिए अपकेंद्रित्र मशीन चलाएं।
      3. क्षालन समाधान को 70 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
      4. प्रति नमूना डीएनएसई कमजोर पड़ने के समाधान के 75 माइक्रोन के साथ पुनर्गठित डीएनएसई I के 5 माइक्रोन को मिलाकर डीएनएसई I को पतला करें। उपयोग होने तक DNase I घोल को बर्फ पर रखें।
    2. प्रक्रिया
      1. प्रत्येक नमूने के लिए, दो माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब, दो कॉलम होल्डिंग ट्यूब (दो कैपलेस ग्रेजुएटेड माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब), और एक बाध्यकारी मिनी कॉलम लेबल करें।
      2. प्रत्येक नमूने में आरएनए अलगाव समाधान के 500 माइक्रोन जोड़ें और 30 एस के लिए एक गोली मूसल मोटर का उपयोग करके सोनिकेट करें।
      3. प्रत्येक नमूने के लिए एक सिरिंज प्राप्त करें और ऊतक को आगे बढ़ाने के लिए 10x ऊपर और नीचे पिपेट करें। सुनिश्चित करें कि सिरिंजिंग के बाद कोई ठोस दिखाई दे रहे हैं.
      4. क्लोरोफॉर्म और भंवर के 250 माइक्रोन कभी कभी जबकि नमूने कमरे के तापमान पर सेते हैं के लिए 5 मिनट इंतजार कर जोड़ें.
      5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 21,000 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
      6. शीर्ष जलीय भाग को एक नई माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और 70% इथेनॉल (~ 500 माइक्रोन) के बराबर मात्रा जोड़ें।
        नोट: शीर्ष जलीय भाग स्पष्ट होना चाहिए, नीचे लाल आरएनए अलगाव समाधान होना चाहिए, और दो परतों के बीच कुछ अवांछित ठोस होना चाहिए।
      7. नए लाइसेट के 500 माइक्रोन को बाध्यकारी कॉलम में स्थानांतरित करें। 60 s के लिए 18,000 × g पर अपकेंद्रित्र और फिर छानना त्यागें।
      8. बाध्यकारी स्तंभ में सभी शाही सेना पाने के लिए शेष lysate के साथ पिछले कदम को दोहराएँ.
      9. बाध्यकारी स्तंभ में कम-स्ट्रिंग धोने के 700 माइक्रोन जोड़ें, 30 एस के लिए अपकेंद्रित्र, और छानना त्यागें।
      10. प्रत्येक बाध्यकारी कॉलम में पतला DNase I के 80 माइक्रोन जोड़ें। कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं.
      11. उच्च कठोरता धोने के 700 माइक्रोन जोड़ें, 30 एस के लिए अपकेंद्रित्र, और छानना त्यागें।
      12. कम कठोरता धोने के 700 माइक्रोन जोड़ें, 60 एस के लिए अपकेंद्रित्र, और छानना त्यागें।
      13. बाध्यकारी कॉलम को 2एन डी नए कैपलेस कॉलम होल्डिंग ट्यूब और 2 मिन के लिए अपकेंद्रित्र में ले जाएं ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि सभी तरल पदार्थ बाध्यकारी कॉलम से हटा दिए गए हैं।
      14. बाध्यकारी स्तंभों को एक नई माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में ले जाएं और गर्म क्षालन समाधान के 30 माइक्रोन जोड़ें। 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
      15. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के तल पर एल्यूटेड आरएनए इकट्ठा करने के लिए 2 मिन के लिए अपकेंद्रित्र।
      16. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके कुल आरएनए एकाग्रता को मापें।
        नोट: यदि कुल आरएनए शुद्धता कम है, तो 2.0 से नीचे 260/280 मूल्य या 1.8 से नीचे 260/230 मूल्य द्वारा इंगित किया गया है, तो चरण 3.2.2.12 के बाद, नमूने एक बार फिर कम कठोरता धोने के साथ धोया जा सकता है इसके बाद चरण 3.2.2.13 के साथ जारी रखने से पहले 80% इथेनॉल के साथ धोया जा रहा है।
      17. आरएनए को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें।
    3. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (RT)
      1. एक पीसीआर ट्यूब पट्टी में, एक अलग अच्छी तरह से प्रत्येक आरएनए नमूने के लिए कुल 8 माइक्रोन के लिए डीईपीसी-उपचारित पानी में पतला कुल आरएनए का 0.5-1 माइक्रोग्राम जोड़ें।
        नोट: रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए उपयोग किए जाने वाले आरएनए की मात्रा को निर्माता के निर्देशों के अनुसार ऊपर या नीचे बढ़ाया जा सकता है।
      2. पीसीआर ट्यूब में प्रत्येक नमूने में 1 माइक्रोन ओलिगो डीटी और 1 माइक्रोन डीएनटीपी जोड़ें। सुनिश्चित करें कि कुल मात्रा नमूना प्रति 10 माइक्रोन है।
      3. पीसीआर ट्यूब पट्टी को थर्मोसाइक्लर में रखें और इसे अनिश्चित काल तक 4 डिग्री सेल्सियस के बाद 5 मिन के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
      4. 65 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के बाद, पीसीआर ट्यूब पट्टी बाहर ले और कम से कम 2 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब जगह. बर्फ पर इनक्यूबेशन के बाद, पांच अभिकर्मकों को जोड़ें: 5x फर्स्ट-स्ट्रैंड बफर के 4 माइक्रोन, 25 एमएम एमजीसीएल2 के 2 माइक्रोन, 0.1 एम डीटीटी के 2 माइक्रोन, आरएएनएसई अवरोधक के 1 माइक्रोन, और प्रत्येक नमूने में रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस के 1 माइक्रोन। सुनिश्चित करें कि कुल मात्रा अब नमूना प्रति 20 माइक्रोन है।
      5. पीसीआर ट्यूब पट्टी को थर्मोसाइक्लर में वापस रखें और कार्यक्रम को 50 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस, फिर 5 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस, फिर अनिश्चित काल तक 4 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
      6. एक बार जब कार्यक्रम 4 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच जाता है, तो पट्टी को बाहर निकालें और राइबोन्यूक्लिएज एच (आरएनएसई एच) के 1 माइक्रोन जोड़ें।
        नोट: RNase H का उपयोग RT प्रतिक्रिया में किसी भी शेष RNA टेम्पलेट को हटाने के लिए किया जाता है; इस चरण से, वांछित आरएनए को पहले से ही सीडीएनए में परिवर्तित किया जाना चाहिए।
      7. पट्टी को थर्मोसाइक्लर में वापस रखें और 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस चलाएं और फिर अनिश्चित काल तक 4 डिग्री सेल्सियस।
      8. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पूरा हो गया है; स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके सीडीएनए एकाग्रता को मापें।
      9. सीडीएनए को 250 एनजी/माइक्रोन तक पतला करें; सीडीएनए को -80 डिग्री सेल्सियस या -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें।
    4. मात्रात्मक पीसीआर (qPCR)
      1. 96 अच्छी तरह से qPCR प्लेट पर हर प्राइमर और नमूना की स्थिति को व्यवस्थित करने के लिए एक स्प्रेडशीट बनाओ.
        नोट: प्राइमरों में से एक को ब्याज के अन्य सभी जीनों की अभिव्यक्ति को सामान्य करने के लिए एक संदर्भ जीन होना चाहिए, जैसे कि 36 बी 4।
      2. प्रत्येक "प्राइमर + नमूना" संयोजन के लिए एक प्राइमर मास्टर मिश्रण बनाएं। प्रत्येक क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया के लिए अच्छी तरह से, आणविक जीवविज्ञान ग्रेड पानी के 3 माइक्रोन, क्यूपीसीआर एंजाइम मास्टर मिश्रण के 5 माइक्रोन, आगे प्राइमर के 0.5 माइक्रोन, और रिवर्स प्राइमर के 0.5 माइक्रोन जोड़ें, जो प्रति प्रतिक्रिया 9 माइक्रोन तक जोड़ता है। प्रति प्रतिक्रिया कुल 10 माइक्रोन बनाने के लिए प्रति प्रतिक्रिया सीडीएनए के 1 माइक्रोन को अच्छी तरह से जोड़ें।
        नोट: मानक प्रत्येक "प्राइमर + नमूना" संयोजन के लिए तीन तकनीकी प्रतिकृतियां हैं, इसलिए प्रत्येक मास्टर मिश्रण उपरोक्त मात्रा का 4x होना चाहिए।
      3. प्रत्येक प्राइमर मास्टर मिश्रण करने के लिए प्रत्येक प्रतिकृति के लिए सीडीएनए के 1 माइक्रोन जोड़ें. यदि प्रत्येक मास्टर मिश्रण 4x है, तो प्रत्येक नमूना सीडीएनए के 4 माइक्रोन को अपने स्वयं के लेबल ट्यूब में पिपेट करें।
      4. अंत में, प्रत्येक प्रतिक्रिया के पिपेट 10 माइक्रोन स्प्रेडशीट द्वारा निर्धारित पदों में 96-अच्छी तरह से क्यूपीसीआर प्लेट में मिलाएं।
      5. एक मोटी चिपकने वाला सील के साथ थाली सील, और फिर 2 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर 450 × ग्राम पर 96 अच्छी तरह से थाली अपकेंद्रित्र.
        नोट: यह महत्वपूर्ण है कि थर्मोसाइक्लिंग के दौरान नमूनों को वाष्पित करने से बचने के लिए प्लेट को पूरी तरह से सील कर दिया गया है। प्लेट पर सील को दबाने के लिए लाइट-ड्यूटी टिशू वाइपर का उपयोग करें, खासकर किनारों।
      6. प्लेट को रीयल-टाइम पीसीआर इंस्ट्रूमेंट में चलाएं। निर्माता के निर्देशों के अनुसार पीसीआर प्रतिक्रिया कार्यक्रम: 50 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट, 95 डिग्री सेल्सियस पर एक और 2 मिनट के बाद, और अंत में 95 डिग्री सेल्सियस पर 15 एस के 40 चक्र और 60 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस। क्यूपीसीआर जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के परिणाम चित्रा 3 बी में दिखाए गए हैं।

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Representative Results

आईबीएटी के विपरीत, जो दो स्कैपुला के बीच पीठ के चमड़े के नीचे की परत में स्थित है, एससीबीएटी गर्दन की मध्यवर्ती परत में स्थित है, जो कंकाल की मांसपेशियों और लार ग्रंथि की परतों के बीच गहराई तक फैली हुई है क्योंकि यह बाहरी जुगुलर शिरा(चित्रा 1ए)के साथ बढ़ता है। scBAT को विच्छेदित करना iBAT जितना सीधा नहीं है। यहां, हम प्रसवोत्तर और वयस्क चूहों (चित्रा 1 बी, सी) से बरकरार एससीबीएटी को विदारक करने के लिए महत्वपूर्ण चरणों सहित एक विस्तृत प्रक्रिया प्रदान करते हैं। प्रदान प्रोटोकॉल का उपयोग गर्दन खोलने के बाद, scBAT की एक पतली परत एक विदारक खुर्दबीन के तहत पहचाना जा सकता है और संदंश की एक जोड़ी के साथ जुड़े लार ग्रंथि और बाहरी जुगुलर नस से बंद छील (चित्रा 1 डी, ई). डिपो की आकृति विज्ञान का आकलन करने के लिए, हौसले से पृथक scBAT प्रदान की प्रसंस्करण प्रक्रिया एक पहले से प्रकाशित एच एंड ई धुंधला प्रक्रिया19 (चित्रा 2 ए) के साथ संयुक्त का उपयोग कर संसाधित किया गया था. जैसा कि चित्र 2 बी में दिखाया गया है, एससीबीएटी में बैट डिपो के विशिष्ट ऊतक संरचनाएं होती हैं और स्वस्थ प्रसवोत्तर और वयस्क चूहों में कई छोटे, बहुकोणीय आदिपोसाइट्स से बना होता है। एससीबीएटी में जीन अभिव्यक्ति के स्तर का आकलन करने के लिए, आरएनए को प्रदान की गई प्रक्रियाओं (चित्रा 3ए)का उपयोग करके अलग-अलग एससीबीएटी डिपो से निकाला गया था। ब्याज की जीन की अभिव्यक्ति के स्तर तो मानक आरटी क्यूपीसीआर विधियों(चित्रा 3ए)द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. जैसा कि चित्र 3B में दिखाया गया है, ScBAT फ़ंक्शन की मध्यस्थता में शामिल जीन के अंतर अभिव्यक्ति स्तर, जिसमें Pparg, BAT विकास का मास्टर नियामक शामिल है; Fabp4 और Glut4, दो पोषक तत्व ट्रांसपोर्टर; और Ucp1 और Ppargc1a, थर्मोजेनेसिस में शामिल दो जीन, आसानी से निर्धारित किए जा सकते हैं। तुलना के लिए, आरएनए को पृथक आईबीएटी से निकाला गया था, और ऊपर सूचीबद्ध जीन की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन प्रदान की गई प्रक्रियाओं (चित्रा 3ए)का उपयोग करके किया गया था। इन जीनों की अभिव्यक्ति का स्तर इन दो डिपो के बीच अपेक्षाकृत समान है। (चित्रा 3 बी)।

Figure 1
चित्र 1: scBAT का शारीरिक स्थान और इसके विच्छेदन की प्रक्रिया। (ए) गर्दन की मध्यवर्ती परत में scBAT का स्थान। (बी) त्वचा को हटाने से पहले और बाद में गर्दन की सतही परत। स्केल बार = 250 माइक्रोन। बिंदीदार पीली रेखाएं उस क्षेत्र को रेखांकित करती हैं जिसे यू-आकार का चीरा बनाने के बाद उजागर किया जाना चाहिए। (सी)विच्छेदन के दौरान दृश्य स्पष्टता बढ़ाने के लिए एक विदारक माइक्रोस्कोप के नीचे रखा एक माउस शव की छवि. (डी, ई) एससीबीएटी से पहले और बाद में गर्दन की मध्यवर्ती परत की प्रतिनिधि छवियों को 3 सप्ताह और 3 महीने की आयु के चूहों से हटा दिया जाता है। स्केल बार = 250 माइक्रोन। बिंदीदार पीली रेखाएं द्विपक्षीय scBAT डिपो को उजागर करती हैं; n = 2. संक्षिप्ताक्षर: scBAT = supraclavicular भूरे रंग के वसा ऊतक; एसएफआई = सतही परत; एसजी = लार ग्रंथि; tr = श्वासनली; jv = बाहरी जुगुलर नस; sm = कंकाल की मांसपेशी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एच एंड ई धुंधला के लिए प्रसंस्करण scBAT। (ए) फ्लोचार्ट एच एंड ई धुंधला के लिए scBAT प्रसंस्करण के प्रमुख चरणों को दर्शाता है। ऊतक को विच्छेदित करने के बाद, यह क्रमिक रूप से तय, निर्जलित, एम्बेडेड, खंडित और दागदार होता है। (बी)3 सप्ताह और 3 महीने की आयु के चूहों से एच एंड ई-दाग वाले एससीबीएटी की प्रतिनिधि छवियां; प्रत्येक विकासात्मक चरण के लिए n = 3; स्केल बार = कम आवर्धन छवियों के लिए 250 माइक्रोन; स्केल बार = उच्च आवर्धन छवियों के लिए 50 माइक्रोन। संक्षिप्ताक्षर: scBAT = supraclavicular भूरे रंग के वसा ऊतक; पीएफए = पैराफॉर्मलडिहाइड; H&E = hematoxylin और eosin। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए एससीबीएटी से आरएनए की तैयारी। (ए) फ्लोचार्ट आरएनए अलगाव के चरणों को दर्शाता है और एससीबीएटी जीन अभिव्यक्ति का आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण करता है। अपने छोटे आकार और नरम बनावट के कारण, scBAT डिपो को फ्रीज करना और इसे तरल नाइट्रोजन में पीसना सफल आरएनए अलगाव के लिए महत्वपूर्ण है। (बी) 3 महीने की आयु के पुरुष चूहों से अलग किए गए scBAT और iBAT में Pparg, Fabp4, Glut4, Ucp1, और Ppargc1a सहित मार्कर जीन की सापेक्ष अभिव्यक्ति, n = 5। डेटा को एसईएम ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है 36 बी 4 सामान्यीकरण के लिए हाउसकीपिंग जीन के रूप में इस्तेमाल किया गया था। संक्षिप्ताक्षर: scBAT = supraclavicular भूरे रंग के वसा ऊतक; RT-qPCR = रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-मात्रात्मक PCR; LN2 = तरल नाइट्रोजन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हम एच एंड ई और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए scBAT विदारक और प्रसंस्करण के लिए प्रक्रियाओं में विस्तार से प्रस्तुत करते हैं। क्योंकि scBAT गर्दन की मध्यवर्ती परत में रहता है और बड़ी नसों के साथ स्थित होता है, इस डिपो के अलगाव के लिए सटीक तकनीक की आवश्यकता होती है। विशेष रूप से, डिपो के एक स्पष्ट दृश्य प्राप्त करने के लिए, हम गर्दन खोला गया है के बाद एक विदारक खुर्दबीन के तहत माउस रखने की सिफारिश. लार ग्रंथि और आसपास की नसों से scBAT छीलने के लिए superfine बिंदु संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करना, देखभाल नसों पंचर से बचने के लिए लिया जाना चाहिए. अत्यधिक रक्तस्राव से scBAT का पता लगाना अधिक कठिन हो सकता है। एच एंड ई धुंधला के लिए scBAT प्रक्रिया करने के लिए, हम 4% पीएफए, निर्जलीकरण अल्कोहल, और एक कार्बनिक विलायक, टोल्यूनि, ऊतक प्रसंस्करण के लिए के उपयोग को शामिल करने के लिए मामूली संशोधनों के साथ एक प्रकाशित प्रोटोकॉल19 के उपयोग अनुकूलित के रूप में प्रोटोकॉल अनुभाग में दिखाया गया है. पूरी प्रक्रिया को पूरा करने के लिए ~ 6 दिन लगते हैं, और एच एंड ई दाग स्लाइड धुंधला के पूरा होने के बाद अगले दिन imaged किया जा सकता है.

प्रारंभिक सामग्री के रूप में आरएनए का उपयोग करके आरटी-क्यूपीसीआर वसा ऊतक जीव विज्ञान के क्षेत्र में जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली विधि है। क्योंकि आईबीएटी की तुलना में एससीबीएटी अपेक्षाकृत छोटा बैट डिपो है, जीन अभिव्यक्ति के लिए पर्याप्त आरएनए प्राप्त करना मुश्किल हो सकता है। आरएनए उपज बढ़ाने के लिए, हम प्रोटोकॉल अनुभाग में उल्लिखित अनुक्रमिक lysate तैयारी कदम लागू करने की सिफारिश, एक मूसल और मोर्टार का उपयोग कर ऊतक पाउडर से शुरू, जबकि जमे हुए. इस लाइसेट तैयारी विधि का उपयोग करके, हमने एक वयस्क माउस से एससीबीएटी के जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए एक उच्च-उपज और उच्च गुणवत्ता वाला आरएनए नमूना सफलतापूर्वक प्राप्त किया है। इस लाइसेट तैयारी विधि को प्रोटीन लाइसिस बफर के उपयोग के साथ पश्चिमी सोख्ता के लिए एससीबीएटी से उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटीन लाइसेट्स प्राप्त करने के लिए भी लागू किया जा सकता है।

माउस iBAT का उपयोग करके, शोधकर्ताओं ने थर्मोजेनेसिस और चयापचय में बैट फ़ंक्शन के बारे में पर्याप्त ज्ञान प्राप्त किया है। चूहों और मनुष्यों में कुछ पहले से अपरिचित बैट डिपो की हालिया पहचान, जिसमें एससीबीएटी भी शामिल है, ने चूहों और वयस्क मनुष्यों में बैट के शारीरिक योगदान को पूरी तरह से समझने से पहले अधिक अध्ययन की आवश्यकता का खुलासा किया। विशेष रूप से, थर्मोजेनेसिस और क्षेत्रीय या पूरे शरीर के चयापचय में इन नए पाए गए बैट डिपो की उत्पत्ति, कार्यों और भागीदारी को रोशन करने वाले अध्ययन वारंट हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

यह काम एनआईएच के एनआईडीडीके द्वारा अवार्ड नंबर R01DK116899, यूएसडीए/एआरएस अवार्ड नंबर 3092-51000-064-000D के तहत और बायलर कॉलेज ऑफ मेडिसिन कार्डियोवास्कुलर रिसर्च इंस्टीट्यूट से एक पायलट अवार्ड द्वारा समर्थित है। बायोरेंडर का उपयोग करके फ़्लोचार्ट का उत्पादन किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
95% Dehydrant Alcohol (Flex 95) Epredia 8201
100% Dehydrant Alcohol (Flex 100) Epredia 8101
96-well PCR plate Bio-Rad MLL9601
Aurum Binding Mini Column Bio-Rad 7326826
Aurum High Stringency Wash Bio-Rad 7326803
Aurum Low Stringency Wash Bio-Rad 7326804
Base Molds (for embedding) Tissue-Tek 4122
BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2" Becton Dickinson 305167
C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad 1840148
Capless Microcentrifuge Tubes 2 mL Fisherbrand 02-681-453
Centrifuge  Eppendorf 5430R
CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument Bio-Rad 12011319
Chloroform Thermo Scientific Chemicals 383760010
Cytoseal 60 Low-viscosity mounting medium Epredia 83104
DEPC-Treated Water Ambion AM 9906
Dissecting Microscope Nikon SMZ1500
DNase Dilution Solution Bio-Rad 7326805
DNase I Bio-Rad 7326828
dNTPs Invitrogen 18427013
Elution solution Bio-Rad 7326801
EM 400 embedding medium paraffin Leica Biosystems 3801320
Eosin Y (0.5% w/v) RICCA 2858-16
Formula R Infiltration medium paraffin Leica Biosystems 3801470
Genemark Nutator Gyromixer 349 Bio Express S-3200-2
Gill #3 Hematoxylin Sigma-Aldrich GHS332-1L
HCl (for HCL-Ethanol) Fisher Chemical A142212
IP VI Embedding Cassettes Leica Biosystems 39LC-550-5-L
Koptec's Pure Ethanol - 200 Proof (for 70% Ethanol) Decon Labs V1001
MgCl2 (25 mM) Thermo Fisher Scientific R0971
Microcentrifuge Tubes 1.7 mL Avantor 87003-294
Microseal 'B' Seals (adhseive seals) Bio-Rad MSB1001
Microtome Leica Biosystems RM2245
Molecular Biology Grade Water Corning 46-000-CM
Mortar Coors Tek Thomas Scientific 60310
NaCl (for 0.85% saline) Fisher Bioreagents BP358-212
NanoDrop Spectrophotometer NanoDrop Technologies ND-1000 UV/Vis
Oligo dT Invitrogen 18418020
Paraffin Section Flotation Bath Boekel Scientific 14792V
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich P6148-500G
PCR Tube Strip Avantor 76318-802
Pestle by Coors Tek Thomas Scientific 60311
Pestle Pellet Motor Kimble 749540-0000
Phosphate Buffer Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537-500ML
Precision Model 19 Vacuum Oven  Thermo Fisher Scientific CAT# 51221162
Primer: 36B4  (forward) 10 μM
5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’		 Chen lab Oligo database
Primer: 36B4 (reverse) 10 μM
5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’		 Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (forward) 10 μM
5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’		 Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM
5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’		 Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM
5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’		 Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM
5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’		 Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (forward) 10 μM
5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’		 Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (reserve) 10 μM
5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’		 Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM
5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’		 Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM
5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’		 Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (forward) 10 μM
5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’		 Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM
5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’		 Chen lab Oligo database
RNA isolation solution (PureZol) Bio-Rad 7326880
RNase Away (surface decontaminant) Thermo Scientific 1437535
RNase H NEB M0297S
Rnase inhibitor (RNase Out) Invitrogen 10777019
Scintillation Vial (glass) Electron Microscopy Sciences 72632
Slide drying bench  Electrothermal (Cole-Parmer) MH6616
Stainless staining rack Electron Microscopy Sciences 70312-54
Stereo microscope (for embedding) Olympus SZ51
Sugical scissors McKesson 43-1-104
Superfine point Straight Dissecting Forceps Avantor 82027-402
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT)  Invitrogen 18080044
SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mL Terumo 100281
SYBR Green (qPCR enzyme master mixture) Applied Biosystems A25778
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars) Electron Microscopy Sciences SKU: 62540-01
Toluene Fisher Chemical T324-1
Transfer pipette Avantor 414004-005
Xylene Fisher Chemical X3P-1GAL

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References

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विच्छेदन, हिस्टोलॉजिकल प्रोसेसिंग, और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण Murine Supraclavicular ब्राउन वसा ऊतक
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Waterstraat, M. G., Wang, Z., Kogiso, M., Caballero-Juarez, R., Chen, M. H. Dissection, Histological Processing, and Gene Expression Analysis of Murine Supraclavicular Brown Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (205), e66475, doi:10.3791/66475 (2024).

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