Summary
Ici, nous fournissons une procédure pratique pour disséquer et effectuer des analyses histologiques et d’expression génique du tissu adipeux brun supraclaviculaire murin.
Abstract
La thermogenèse médiée par le tissu adipeux brun (MTD) joue un rôle important dans la régulation du métabolisme, et sa morphologie et sa fonction peuvent être grandement influencées par les stimuli environnementaux chez la souris et l’homme. Actuellement, la MTD interscapulaire murine (iBAT), qui est située entre deux omoplates dans le flanc dorsal supérieur des souris, est le principal dépôt de MTD utilisé par les laboratoires de recherche pour étudier la fonction des MTD. Récemment, quelques dépôts de MTD jusqu’alors inconnus ont été identifiés chez la souris, dont un analogue au tissu adipeux brun supraclaviculaire humain. Contrairement à iBAT, le tissu adipeux brun supraclaviculaire murin (scBAT) est situé dans la couche intermédiaire du cou et n’est donc pas accessible aussi facilement.
Pour faciliter l’étude des scBAT de souris nouvellement identifiées, un protocole détaillant les étapes de dissection des scBAT intactes de souris postnatales et adultes est présenté. En raison de la petite taille du scBAT par rapport aux autres dépôts adipeux, les procédures ont été modifiées et optimisées spécifiquement pour le traitement du scBAT. Parmi ces modifications, il y a l’utilisation d’un microscope à dissection pendant le prélèvement de tissus pour augmenter la précision et l’homogénéisation des échantillons de scBAT congelés afin d’augmenter l’efficacité de l’analyse qPCR ultérieure. Grâce à ces optimisations, l’identification, l’apparence morphologique et la caractérisation moléculaire du scBAT peuvent être déterminées chez la souris.
Introduction
La prévalence croissante de l’obésité aux États-Unis et dans le monde a suscité un grand intérêt pour la compréhension de son étiologie et l’identification de traitements potentiels 1,2. Le tissu adipeux joue un rôle essentiel dans le métabolisme, et la dérégulation du tissu adipeux peut entraîner le développement de l’obésité. Généralement, il existe deux types de tissus adipeux, le tissu adipeux blanc et le tissu adipeux brun. Alors que le tissu adipeux blanc (WAT) peut stocker de l’énergie chimique et sécréter des facteurs endocriniens, le tissu adipeux brun (BAT) peut utiliser l’énergie chimique pour générer de la chaleur et maintenir la température corporelle dans le froid 3,4. En raison de cette capacité unique, l’activation de la BAT peut également augmenter la dépense énergétique et améliorer la sensibilité à l’insuline5.
La MTD exerce sa fonction par thermogenèse sans frisson, un processus médié par le découplage de la protéine 1 (UCP1)6. Les mammifères, y compris les souris et les humains, possèdent des quantités variables de MTD. La vision classique de la MTD est que ces tissus adipeux sont plus abondants chez les souris et les nourrissons que chez les humains adultes. iBAT, situé dans le flanc dorsal supérieur entre les omoplates, est le dépôt de BAT le plus étudié chez la souris. En appliquant des tests d’imagerie radio-isotopique et de biopsie, des études récentes ont identifié plusieurs dépôts de MTD chez l’homme adulte. Certains d’entre eux, y compris les dépôts trouvés dans le cou profond et la région sus-claviculaire, n’avaient pas été identifiés auparavant chez la souris ou d’autres animaux modèles 7,8,9,10,11. Parmi ces dépôts MTD, le scBAT est le dépôt le plus fréquemment observé chez l’homme adulte. Pour mieux comprendre l’origine et la contribution moléculaire de ces dépôts BAT nouvellement découverts chez l’homme, il est essentiel d’identifier des dépôts équivalents chez la souris qui permettent des manipulations génétiques et moléculaires pour retracer et tester le rôle fonctionnel de ces dépôts. Ainsi, nous et d’autres avons identifié quelques dépôts BAT jusqu’alors inconnus dans différents emplacements anatomiques chez la souris, notamment scBAT12,13, thoracique périvasculaire BAT14,15, périrénal BAT16 et périaortique BAT17. Le scBAT de souris ressemble anatomiquement au scBAT humain et morphologiquement à l’iBAT classique, exprimant des niveaux élevés d’UCP112.
Contrairement à l’iBAT de souris, qui peut être facilement disséquée, la scBAT est située dans la couche intermédiaire du cou de la souris, sous les glandes salivaires et le long de la veine jugulaire externe. L’isolement de ce dépôt pour les analyses histologiques et moléculaires peut être difficile. Nous décrivons ici en détail la procédure de dissection des souris postnatales et adultes et le traitement de ce dépôt pour l’histologie et l’analyse de l’expression génique.
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Protocol
Les procédures animales ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Baylor College of Medicine. Toutes les procédures ont été effectuées sur des souris mâles C57BL/6J âgées de 3 semaines et 3 mois. Avant la dissection, toutes les souris ont été euthanasiées en utilisant la procédure d’euthanasie approuvée au dioxyde de carbone chez les rongeurs. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et instruments utilisés dans ce protocole.
1. Dissection de scBAT
- Placez la carcasse de la souris sur l’établi et nettoyez les ciseaux chirurgicaux et la pince à pointe ultrafine avec de l’éthanol à 70 %.
- Vaporisez le cou ventral de la souris avec de l’éthanol à 70 % pour mouiller la fourrure et minimiser la contamination de la fourrure.
- Faites une incision bilatérale, d’environ 1,5 cm, le long des clavicules.
- À partir des extrémités de l’incision précédente, coupez longitudinalement vers les oreilles, d’environ 1 cm de long. Cela formera une incision carrée en forme de U autour du cou (Figure 1A,B).
REMARQUE : scBAT se trouve dans la couche intermédiaire du cou. La couche superficielle, composée de la peau, du tissu adipeux sous-cutané et des glandes salivaires, est exposée au cours de cette étape. La couche intermédiaire, avec scBAT, contient les veines jugulaires et les muscles du cou. La couche profonde du cou, contenant les MTD profondes du cou et les veines artérielles et jugulaires, est exposée en enlevant le muscle squelettique. - Placez la souris sous un microscope à dissection et faites la mise au point sur le cou exposé (Figure 1C).
REMARQUE : Cette étape supplémentaire augmente considérablement la précision du prélèvement des tissus, nécessaire compte tenu de la petite taille du scBAT. - Exposez complètement les glandes salivaires en soulevant les sections de peau incisées avec une pince.
- À l’aide de ciseaux chirurgicaux et de pinces, déconnectez le tissu reliant les glandes salivaires au tissu autour des clavicules et entre elles.
- Exposez les dépôts scBAT en soulevant les glandes salivaires. Recherchez la BAT le long de la veine jugulaire externe et peut-être reliée à la face inférieure des glandes salivaires. Identifiez-le par sa couleur orangée, qui se détache des tissus environnants.
- Tenez le tissu adipeux cible avec une pince et retirez-le doucement des glandes salivaires.
- Une fois détaché des glandes salivaires, continuez à déconnecter le scBAT de la veine jugulaire externe et de la musculature du cou jusqu’à ce que les dépôts de chaque côté du cou puissent être retirés entiers.
- Inspectez chaque échantillon de scBAT disséqué au microscope à dissection (Figure 1D, E), à l’aide d’une pince pour retirer tout tissu conjonctif restant.
- Placer chaque échantillon dans un flacon à scintillation en verre contenant 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et retirer la souris de sous le microscope.
2. Traitement et coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) des scBAT (illustré à la figure 2A)
- Remplacer le PBS (étape 1.12) par 10 mL de paraformaldéhyde (PFA) froid à 4 % et placer le flacon sur un nutator, en le balançant à 4 °C pendant la nuit pour fixer le scBAT.
REMARQUE : La fixation par perfusion peut être appliquée chez les souris postnatales, en particulier chez les souris adultes, lorsqu’un traitement supplémentaire pour une analyse immunohistochimique est nécessaire. - Le lendemain, retirer la solution de PFA du flacon à l’aide d’une pipette de transfert stérile et la remplacer par 10 à 15 mL de PBS. Placez le flacon sur un nutator et faites basculer pendant 30 min à température ambiante. Remplacez le PBS par une solution saline à 0,85 % et continuez à basculer pendant encore 30 minutes à température ambiante.
REMARQUE : La solution saline est une solution saline à 0,85 % (NaCl) p/v dans de l’eau traitée au DEPC (sans RNase). Le PBS peut être remplacé par la solution saline à cette étape et à l’étape suivante. - Retirer la solution saline à 0,85 % à l’aide d’une pipette de transfert et ajouter 10 ml de solution saline à 70 % d’éthanol et à 0,85 % dans le flacon. Conservez le flacon au réfrigérateur à 4 °C pendant la nuit ou jusqu’à ce qu’il soit prêt à être intégré à la paraffine.
REMARQUE : Le PBS peut être utilisé si une solution saline à 0,85 % n’est pas disponible. La scBAT doit être traitée dès que possible pour faciliter la coupe et mieux préserver la morphologie des tissus. - Avant l’enrobage de paraffine, déshydrater la protéine scBAT par une série d’échanges d’éthanol pour éliminer l’eau des tissus.
- Pour commencer, retirez 70 % d’éthanol et 0,85 % de solution saline du flacon à l’aide d’une pipette de transfert et ajoutez 10 à 15 ml d’alcool déshydrant à 95 %, en faisant basculer le flacon sur un nutator à température ambiante pendant 1 h. Répétez cette étape une fois.
REMARQUE : L’éthanol peut être utilisé à la place des solutions d’alcool déshydrant. - Ensuite, remplacez l’alcool déshydrant à 95 % par 10 à 15 ml d’alcool déshydrant à 100 % et continuez à vous balancer sur un nutator pendant 1 h. Remplissez avec de l’alcool déshydrant à 100 % neuf et continuez à basculer pendant plusieurs heures ou toute la nuit, selon la quantité de scBAT dans le flacon.
- Pour commencer, retirez 70 % d’éthanol et 0,85 % de solution saline du flacon à l’aide d’une pipette de transfert et ajoutez 10 à 15 ml d’alcool déshydrant à 95 %, en faisant basculer le flacon sur un nutator à température ambiante pendant 1 h. Répétez cette étape une fois.
- Pour éliminer le scBAT pour l’enrobage, ajouter 10 mL de toluène dans le flacon et continuer à basculer sur un nutator jusqu’à ce que le scBAT soit transparent, environ 6 à 8 h.
REMARQUE : Le temps nécessaire pour obtenir un nettoyage satisfaisant dépend de la taille du scBAT. Il est recommandé de commencer le déblaiement immédiatement le matin afin que l’infiltration et l’enrobage puissent avoir lieu l’après-midi. - Pour intégrer le scBAT dans la cire de paraffine, retirez le toluène et ajoutez 10 ml de cire de paraffine d’infiltration fondue dans le flacon. Placez le flacon dans un four à 65 °C pendant 1 h. Répétez cette étape avec de la nouvelle cire.
REMARQUE : Commencez à faire fondre les granulés de cire dans un four pendant la nuit avant de commencer l’enrobage pour vous assurer que la cire est complètement liquide. - Remplacez la cire de paraffine d’infiltration par de la cire de paraffine d’enrobage et placez le flacon à la même température pendant 1 h. Répétez cette étape une fois.
REMARQUE : L’étape d’infiltration peut être interrompue et reprise plus tard. Sortez le flacon du four et conservez-le à température ambiante jusqu’au moment de continuer. - Enfoncez le tissu en le plaçant d’abord dans un moule d’enrobage de tissu, ajoutez de la cire d’enrobage fondue au moule et réorientez le tissu sous un stéréomicroscope. Ensuite, placez une cassette d’enrobage sur la cire et continuez à verser de la cire d’enrobage par-dessus jusqu’à ce qu’elle soit pleine et que le capuchon d’enrobage soit fixé au bloc de cire. Transférez le bloc au réfrigérateur à 4 °C pendant la nuit pour laisser la cire durcir et rétrécir avant de retirer le moule métallique.
- Sectionner le scBAT avec un microtome d’une épaisseur de 5-6 μm18, trois à quatre coupes par lame de microscope, et placer dans un bain de flottaison chaud en paraffine à ~42 °C pour permettre aux coupes de tissu de se lisser.
- Transférez les sections sur les toboggans et placez les toboggans à la verticale contre le bain de flottaison pour permettre à l’eau de s’égoutter des toboggans.
- Transférez les lames sur un support de coloration en acier inoxydable et placez le support sur un banc de séchage des lames pour sécher pendant la nuit.
REMARQUE : Les lames de paraffine peuvent être stockées à long terme à température ambiante avant un traitement ultérieur. - Effectuez la coloration H&E19. Pour commencer, placez les lames dans un support de coloration, puis placez le support dans un pot de coloration avec du xylène pendant 40 s. Répétez cette étape une fois.
REMARQUE : Si la paraffine est toujours visible après les deux étapes, attendez qu’elle soit complètement dissoute avant de continuer. - Pour réhydrater le tissu, placez le support de diapositives dans un bocal de coloration rempli d’alcool déshydrant à 100 % pendant deux étapes de 20 secondes, suivies d’une étape de 15 s dans de l’alcool déshydrant à 95 % et d’un dernier rinçage de 15 s à l’aide ddH2O.
- Placer les lames dans un récipient de coloration rempli de solution d’hématoxyline pendant 75 s pour obtenir une coloration nucléaire, puis rincer les lames dans un récipient de coloration avec du ddH2O pendant 45 s.
REMARQUE : Le temps peut être ajusté en fonction de la couleur de teinture souhaitée. - Différencier la coloration en trempant les lames dans un plat de coloration rempli de solution HCl-éthanol pendant 15 s, puis transférer les lames dans un autre rinçage ddH2O pendant 15 s.
NOTA : La solution HCl-éthanol est préparée selon une méthode publiée19. - Pour la coloration cytoplasmique, placez la lame dans une solution de contre-coloration à l’éosine Y pendant 15 s.
- Déshydrater le tissu en plongeant les lames pendant 15 s chacune en trois étapes séquentielles de solution d’alcool déshydrant à 95 %, puis deux bains séquentiels d’alcool déshydrant à 100 % - le premier pendant 15 s et le second pendant 45 s - pour terminer la déshydratation.
- Enfin, transférez les lames dans un bain de xylène pendant 45 s pour réacclimater le tissu aux solvants organiques. Après cette étape, la coloration est terminée ; Retirez le tissu de la solution.
- Appliquez le milieu de montage sur chaque lame et glissez-la à l’intérieur d’une hotte chimique. Sécher pendant la nuit avant l’imagerie. Les résultats d’imagerie sont présentés à la figure 2B.
3. Analyse de l’expression génique de scBAT
- Prélèvement de tissus (broyage)
- Après avoir disséqué le scBAT, placez immédiatement le tissu dans un tube de microcentrifugation, percez un trou dans le haut du tube avec une aiguille stérile et congelez-le dans de l’azote liquide.
REMARQUE : Les principales étapes du protocole décrites ici sont illustrées à la figure 3A. Percer un trou dans le haut du tube avant de le plonger dans de l’azote liquide empêche le tube d’éclater en raison du changement soudain de pression. - Remplissez un bécher en plastique d’azote liquide et laissez tremper un pilon et une spatule fine.
REMARQUE : Il est important de maintenir la température de tous les outils et échantillons de tissus aussi froide que possible, proche de la température de l’azote liquide, pendant toute la procédure pour éviter que les tissus ne dégèlent. Le tissu adipeux décongelé est très adhérent et rend le poudrage plus difficile. Ne retirez les outils et les échantillons des bains d’azote liquide qu’immédiatement avant utilisation. - Prenez un échantillon de tissu congelé à la fois et versez-le de son tube de microcentrifugation dans le mortier.
- Ajoutez une petite quantité d’azote liquide au mortier, puis utilisez le pilon pour broyer le tissu congelé jusqu’à ce qu’il soit complètement pulvérisé.
REMARQUE : Si le tissu commence à devenir mou ou collant à un moment donné, il dégèle ; Versez plus d’azote liquide dans le mortier. - Utilisez la spatule fine pour gratter soigneusement et transférer le tissu pulvérisé dans le tube de microcentrifugation. Versez de l’azote liquide dans le mortier tout en grattant pour recueillir les morceaux de tissu restants avant de transférer avec une spatule. Répétez les étapes de transfert jusqu’à ce que tout le tissu soit retiré du mortier.
- Nettoyez le mortier avec un chiffon léger et de l’éthanol à 70 % avant de jeter l’échantillon suivant à broyer. Conservez le mouchoir en poudre au congélateur à -80 °C à long terme.
- Après avoir disséqué le scBAT, placez immédiatement le tissu dans un tube de microcentrifugation, percez un trou dans le haut du tube avec une aiguille stérile et congelez-le dans de l’azote liquide.
- Isolement de l’ARN total
- Préparation
- Nettoyez l’établi, les pipettes, les porte-embouts et les portoirs de tubes avec de l’éthanol à 70 % et un décontaminant de surface pour éliminer la RNase.
- Faites fonctionner la centrifugeuse pour atteindre 4 °C.
- Réchauffer la solution d’élution à 70 °C.
- Diluer la DNase I en mélangeant 5 μL de DNase I reconstituée avec 75 μL de solution de dilution de DNase par échantillon. Placez la solution de DNase I sur de la glace jusqu’à utilisation.
- Procédure
- Pour chaque échantillon, étiqueter deux tubes de microcentrifugation, deux tubes de maintien de colonne (deux tubes de microcentrifugation gradués sans bouchon) et une mini-colonne de liaison.
- Ajouter 500 μL de solution d’isolement d’ARN à chaque échantillon et sonicate à l’aide d’un pilon à granulés pendant 30 s.
- Prenez une seringue pour chaque échantillon et pipetez de haut en bas 10 fois pour lyser davantage le tissu. Assurez-vous qu’aucun solide n’est visible après la seringue.
- Ajouter 250 μL de chloroforme et vortex de temps en temps en attendant 5 min que les échantillons incuberaient à température ambiante.
- Centrifuger à 21 000 × g pendant 20 min à 4 °C.
- Transférez la partie aqueuse supérieure dans un nouveau tube de microcentrifugation et ajoutez une quantité équivalente d’éthanol à 70 % (~500 μL).
REMARQUE : La partie aqueuse supérieure doit être claire, la partie inférieure doit être la solution d’isolement d’ARN rouge et entre les deux couches doit se trouver des solides indésirables. - Transférer 500 μL du nouveau lysat dans la colonne de liaison. Centrifuger à 18 000 × g pendant 60 s puis jeter le filtrat.
- Répétez l’étape précédente avec le lysat restant pour obtenir tout l’ARN dans la colonne de liaison.
- Ajouter 700 μL de lavage à faible rigueur dans la colonne de liaison, centrifuger pendant 30 s et jeter le filtrat.
- Ajouter 80 μL de DNase I diluée dans chaque colonne de liaison. Incuber 15 min à température ambiante.
- Ajouter 700 μL de lavage à haute rigueur, centrifuger pendant 30 s et jeter le filtrat.
- Ajouter 700 μL de lavage à faible rigueur, centrifuger pendant 60 s et jeter le filtrat.
- Déplacez les colonnes de liaison dans le 2ème tube de retenue de colonne sans bouchon et centrifugez pendant 2 minutes pour vous assurer que tous les liquides sont retirés de la colonne de liaison.
- Déplacer les colonnes de liaison dans un nouveau tube de microcentrifugation et ajouter 30 μL de solution d’élution réchauffée. Incuber à température ambiante pendant 1 min.
- Centrifuger pendant 2 min pour recueillir l’ARN élué au fond du tube de la microcentrifugation.
- Mesurez la concentration totale d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre.
NOTA : Si la pureté totale de l’ARN est faible, indiquée par une valeur de 260/280 inférieure à 2,0 ou une valeur de 260/230 inférieure à 1,8, les échantillons peuvent être lavés une fois de plus avec un lavage à faible rigueur suivi d’un lavage à 80 % d’éthanol avant de passer à l’étape 3.2.2.13. - Conservez l’ARN dans un congélateur à -80 °C.
- Transcription inverse (RT)
- Dans une bandelette de tube PCR, ajouter 0,5 à 1 μg d’ARN total dilué dans de l’eau traitée au DEPC à un total de 8 μL pour chaque échantillon d’ARN dans un puits différent.
REMARQUE : La quantité d’ARN utilisée pour la transcription inverse peut être augmentée ou diminuée selon les instructions du fabricant. - Ajouter 1 μL d’oligo dT et 1 μL de dNTP à chaque échantillon dans le tube de PCR. S’assurer que le volume total est de 10 μL par échantillon.
- Placez la bandelette de tube PCR dans un thermocycleur et réglez-la à 65 °C pendant 5 minutes, puis à 4 °C indéfiniment.
- Après 5 min à 65 °C, retirez la bandelette de la sonde PCR et placez la sonde sur de la glace pendant au moins 2 min. Après l’incubation sur glace, ajouter cinq réactifs : 4 μL de tampon 5x First-Strand, 2 μL de 25 mM de MgCl2, 2 μL de DTT 0,1 M, 1 μL d’inhibiteur de RNase et 1 μL de transcriptase inverse à chaque échantillon. Assurez-vous que le volume total est maintenant de 20 μL par échantillon.
- Replacez la bandelette de tube PCR dans le thermocycleur et réglez le programme à 50 °C pendant 50 min, puis à 85 °C pendant 5 min, puis à 4 °C indéfiniment.
- Une fois que le programme atteint 4 °C, retirez la bandelette et ajoutez 1 μL de ribonucléase H (RNase H).
REMARQUE : La RNase H est utilisée pour éliminer tout modèle d’ARN restant dans la réaction RT ; à cette étape, l’ARN souhaité devrait déjà être converti en ADNc. - Remettez la bande dans le thermocycleur et faites fonctionner 37 °C pendant 20 minutes, puis 4 °C indéfiniment.
- La transcription inverse est terminée ; mesurer la concentration d’ADNc à l’aide d’un spectrophotomètre.
- Diluer l’ADNc à 250 ng/μL ; conservez l’ADNc dans un congélateur à -80 °C ou -20 °C.
- Dans une bandelette de tube PCR, ajouter 0,5 à 1 μg d’ARN total dilué dans de l’eau traitée au DEPC à un total de 8 μL pour chaque échantillon d’ARN dans un puits différent.
- PCR quantitative (qPCR)
- Faites une feuille de calcul pour organiser la position de chaque amorce et échantillon sur la plaque qPCR à 96 puits.
REMARQUE : L’une des amorces doit être un gène de référence pour normaliser l’expression de tous les autres gènes d’intérêt, tels que 36B4. - Préparez un mélange principal d’apprêt pour chaque combinaison « apprêt + échantillon ». À chaque puits de réaction qPCR, ajoutez 3 μL d’eau de biologie moléculaire, 5 μL de mélange enzymatique qPCR, 0,5 μL d’amorce directe et 0,5 μL d’amorce inverse, ce qui représente 9 μL par réaction. Ajouter 1 μL d’ADNc par réaction pour obtenir un total de 10 μL par réaction.
REMARQUE : La norme est d’avoir trois répétitions techniques pour chaque combinaison « apprêt + échantillon », de sorte que chaque mélange principal doit être 4 fois supérieur aux quantités ci-dessus. - Ajouter 1 μL d’ADNc pour chaque répétition à chaque mélange maître d’amorces. Si chaque mélange maître est 4x, pipeter 4 μL de chaque échantillon d’ADNc dans leur propre tube marqué.
- Enfin, pipeter 10 μL de chaque mélange réactionnel dans la plaque qPCR à 96 puits dans les positions déterminées par la feuille de calcul.
- Sceller la plaque avec un joint adhésif épais, puis centrifuger la plaque à 96 puits à 450 × g à 20 °C pendant 2 min.
REMARQUE : Il est essentiel que la plaque soit entièrement scellée pour éviter que les échantillons ne s’évaporent pendant le thermocyclage. Utilisez des chiffons légers pour appuyer le joint sur la plaque, en particulier sur les bords. - Exécutez la plaque dans un instrument de PCR en temps réel. Programmez la réaction PCR selon les instructions du fabricant : 2 min à 50 °C, suivi de 2 min à 95 °C, et enfin de 40 cycles de 15 s à 95 °C et 30 s à 60 °C. Les résultats de l’analyse de l’expression génique qPCR sont présentés dans la figure 3B.
- Faites une feuille de calcul pour organiser la position de chaque amorce et échantillon sur la plaque qPCR à 96 puits.
- Préparation
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Representative Results
Contrairement à l’iBAT, qui est situé dans la couche sous-cutanée du dos entre deux omoplates, le scBAT est situé dans la couche intermédiaire du cou, s’étendant profondément entre les couches de muscle squelettique et la glande salivaire lorsqu’il se développe le long de la veine jugulaire externe (Figure 1A). La dissection de scBAT n’est pas aussi simple que l’iBAT. Nous fournissons ici une procédure détaillée comprenant des étapes cruciales pour disséquer des scBAT intacts de souris postnatales et adultes (Figure 1B,C). Après avoir ouvert le cou à l’aide du protocole fourni, une fine couche de scBAT peut être identifiée au microscope à dissection et décollée de la glande salivaire et de la veine jugulaire externe connectées à l’aide d’une paire de pinces (Figure 1D,E). Pour évaluer la morphologie du dépôt, des scBAT fraîchement isolés ont été traités en utilisant la procédure de traitement fournie combinée à une procédure de coloration H&Epubliée précédemment 19 (Figure 2A). Comme le montre la figure 2B, scBAT possède des structures tissulaires typiques des dépôts BAT et est composé de nombreux petits adipocytes multiloculaires chez les souris postnatales et adultes en bonne santé. Pour évaluer les niveaux d’expression génique dans le scBAT, l’ARN a été extrait de dépôts scBAT isolés en utilisant les procédures fournies (Figure 3A). Les niveaux d’expression des gènes d’intérêt peuvent ensuite être évalués par des méthodes RT-qPCR standard (Figure 3A). Comme le montre la figure 3B, les niveaux d’expression différentiels des gènes impliqués dans la médiation de la fonction scBAT, y compris Pparg, le régulateur principal du développement de la BAT ; Fabp4 et Glut4, deux transporteurs de nutriments ; et Ucp1 et Ppargc1a, deux gènes impliqués dans la thermogenèse, peuvent être facilement déterminés. À titre de comparaison, l’ARN a été extrait d’iBAT isolé, et l’expression des gènes énumérés ci-dessus a également été évaluée à l’aide des procédures fournies (figure 3A). Les niveaux d’expression de ces gènes sont relativement similaires entre ces deux dépôts. (Figure 3B).
Figure 1 : Emplacement anatomique du scBAT et processus de sa dissection. (A) Emplacement du scBAT dans la couche intermédiaire du cou. (B) La couche superficielle du cou avant et après l’enlèvement de la peau. Barre d’échelle = 250 μm. Des lignes jaunes pointillées délimitent la zone qui doit être exposée après avoir fait l’incision en forme de U. (C) Image d’une carcasse de souris placée sous un microscope à dissection pour augmenter la clarté visuelle pendant la dissection. (D, E) Images représentatives de la couche intermédiaire du cou avant et après le retrait de scBAT chez des souris âgées de 3 semaines et 3 mois. Barre d’échelle = 250 μm. Des lignes jaunes pointillées délimitent les dépôts scBAT bilatéraux exposés ; n = 2. Abréviations : scBAT = tissu adipeux brun supraclaviculaire ; SFI = couche superficielle ; SG = glande salivaire ; tr = trachée ; jv = veine jugulaire externe ; SM = muscle squelettique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Traitement de la scBAT pour la coloration H&E. (A) Organigramme illustrant les principales étapes du traitement de la scBAT pour la coloration H&E. Après avoir disséqué le tissu, il est fixé séquentiellement, déshydraté, intégré, sectionné et coloré. (B) Images représentatives de scBAT colorées à l’H&E provenant de souris âgées de 3 semaines et 3 mois ; n = 3 pour chaque stade de développement ; barre d’échelle = 250 μm pour les images à faible grossissement ; barre d’échelle = 50 μm pour les images à fort grossissement. Abréviations : scBAT = tissu adipeux brun supraclaviculaire ; PFA = paraformaldéhyde ; H&E = hématoxyline et éosine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Préparation de l’ARN à partir de scBAT pour l’analyse de l’expression génique. (A) Organigramme illustrant les étapes de l’isolement de l’ARN et de l’analyse RT-qPCR de l’expression du gène scBAT. En raison de sa petite taille et de sa texture douce, la congélation instantanée du dépôt de scBAT et son broyage dans de l’azote liquide est cruciale pour réussir l’isolement de l’ARN. (B) Expression relative des gènes marqueurs, y compris Pparg, Fabp4, Glut4, Ucp1 et Ppargc1a, dans scBAT et iBAT isolés de souris mâles âgées de 3 mois, n = 5. Les données sont présentées sous forme de ± moyenne SEM. 36B4 a été utilisé comme gène d’entretien pour la normalisation. Abréviations : scBAT = tissu adipeux brun supraclaviculaire ; RT-qPCR = transcription inverse-PCR quantitative ; LN2 = azote liquide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans ce protocole, nous présentons en détail les procédures de dissection et de traitement des scBAT pour les analyses H&E et d’expression génique. Comme le scBAT réside dans la couche intermédiaire du cou et se trouve le long des grosses veines, l’isolement de ce dépôt nécessite une technique précise. Plus précisément, pour avoir une vue claire du dépôt, nous recommandons de placer la souris sous un microscope à dissection après l’ouverture du cou. À l’aide d’une paire de pinces à pointe ultrafine pour décoller les scBAT de la glande salivaire et des veines environnantes, il faut prendre soin d’éviter de percer les veines. Un saignement excessif peut rendre plus difficile la localisation du scBAT. Pour traiter les scBAT pour la coloration H&E, nous avons adapté l’utilisation d’un protocole publié19 avec de légères modifications pour inclure l’utilisation de PFA à 4 %, d’alcools déshydrants et d’un solvant organique, le toluène, pour le traitement des tissus, comme indiqué dans la section sur le protocole. L’ensemble de la procédure prend ~6 jours et les lames colorées H&E peuvent être imagées le lendemain après la fin de la coloration.
La RT-qPCR utilisant l’ARN comme matériau de départ est la méthode la plus fréquemment utilisée pour l’analyse de l’expression génique dans le domaine de la biologie du tissu adipeux. Comme le scBAT est un dépôt BAT relativement petit par rapport à l’iBAT, il peut être difficile d’obtenir suffisamment d’ARN pour l’expression des gènes. Pour augmenter le rendement en ARN, nous recommandons d’appliquer les étapes de préparation séquentielle du lysat comme indiqué dans la section protocole, en commençant par poudrer le tissu à l’aide d’un pilon et d’un mortier pendant la congélation. En utilisant cette méthode de préparation de lysat, nous avons réussi à obtenir un échantillon d’ARN à haut rendement et de haute qualité pour l’analyse de l’expression génique du scBAT d’une souris adulte. Cette méthode de préparation de lysat peut également être appliquée pour obtenir des lysats de protéines de haute qualité à partir de scBAT pour le western blot avec l’utilisation d’un tampon de lyse des protéines.
En utilisant l’iBAT de souris, les chercheurs ont acquis des connaissances substantielles sur la fonction des MTD dans la thermogenèse et le métabolisme. L’identification récente de quelques dépôts de MTD jusqu’alors non reconnus chez la souris et l’homme, y compris scBAT, a révélé la nécessité d’études supplémentaires avant de pouvoir comprendre pleinement la contribution physiologique de la MTD chez la souris et l’homme adulte. En particulier, des études éclairant les origines, les fonctions et l’implication de ces dépôts MTD nouvellement découverts dans la thermogenèse et le métabolisme régional ou du corps entier sont justifiées.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par le NIDDK du NIH sous le numéro d’attribution R01DK116899, l’USDA/ARS sous le numéro d’attribution 3092-51000-064-000D et un prix pilote de l’Institut de recherche cardiovasculaire du Baylor College of Medicine. Les organigrammes ont été produits à l’aide de BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 95% Dehydrant Alcohol (Flex 95) | Epredia | 8201 | |
| 100% Dehydrant Alcohol (Flex 100) | Epredia | 8101 | |
| 96-well PCR plate | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Aurum Binding Mini Column | Bio-Rad | 7326826 | |
| Aurum High Stringency Wash | Bio-Rad | 7326803 | |
| Aurum Low Stringency Wash | Bio-Rad | 7326804 | |
| Base Molds (for embedding) | Tissue-Tek | 4122 | |
| BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2" | Becton Dickinson | 305167 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1840148 | |
| Capless Microcentrifuge Tubes 2 mL | Fisherbrand | 02-681-453 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument | Bio-Rad | 12011319 | |
| Chloroform | Thermo Scientific Chemicals | 383760010 | |
| Cytoseal 60 Low-viscosity mounting medium | Epredia | 83104 | |
| DEPC-Treated Water | Ambion | AM 9906 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| DNase Dilution Solution | Bio-Rad | 7326805 | |
| DNase I | Bio-Rad | 7326828 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427013 | |
| Elution solution | Bio-Rad | 7326801 | |
| EM 400 embedding medium paraffin | Leica Biosystems | 3801320 | |
| Eosin Y (0.5% w/v) | RICCA | 2858-16 | |
| Formula R Infiltration medium paraffin | Leica Biosystems | 3801470 | |
| Genemark Nutator Gyromixer 349 | Bio Express | S-3200-2 | |
| Gill #3 Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS332-1L | |
| HCl (for HCL-Ethanol) | Fisher Chemical | A142212 | |
| IP VI Embedding Cassettes | Leica Biosystems | 39LC-550-5-L | |
| Koptec's Pure Ethanol - 200 Proof (for 70% Ethanol) | Decon Labs | V1001 | |
| MgCl2 (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R0971 | |
| Microcentrifuge Tubes 1.7 mL | Avantor | 87003-294 | |
| Microseal 'B' Seals (adhseive seals) | Bio-Rad | MSB1001 | |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2245 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 46-000-CM | |
| Mortar Coors Tek | Thomas Scientific | 60310 | |
| NaCl (for 0.85% saline) | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop Technologies | ND-1000 UV/Vis | |
| Oligo dT | Invitrogen | 18418020 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Boekel Scientific | 14792V | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | |
| PCR Tube Strip | Avantor | 76318-802 | |
| Pestle by Coors Tek | Thomas Scientific | 60311 | |
| Pestle Pellet Motor | Kimble | 749540-0000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Precision Model 19 Vacuum Oven | Thermo Fisher Scientific | CAT# 51221162 | |
| Primer: 36B4 (forward) 10 μM 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: 36B4 (reverse) 10 μM 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (forward) 10 μM 5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM 5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM 5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM 5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (forward) 10 μM 5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (reserve) 10 μM 5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (forward) 10 μM 5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM 5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| RNA isolation solution (PureZol) | Bio-Rad | 7326880 | |
| RNase Away (surface decontaminant) | Thermo Scientific | 1437535 | |
| RNase H | NEB | M0297S | |
| Rnase inhibitor (RNase Out) | Invitrogen | 10777019 | |
| Scintillation Vial (glass) | Electron Microscopy Sciences | 72632 | |
| Slide drying bench | Electrothermal (Cole-Parmer) | MH6616 | |
| Stainless staining rack | Electron Microscopy Sciences | 70312-54 | |
| Stereo microscope (for embedding) | Olympus | SZ51 | |
| Sugical scissors | McKesson | 43-1-104 | |
| Superfine point Straight Dissecting Forceps | Avantor | 82027-402 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT) | Invitrogen | 18080044 | |
| SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mL | Terumo | 100281 | |
| SYBR Green (qPCR enzyme master mixture) | Applied Biosystems | A25778 | |
| Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars) | Electron Microscopy Sciences | SKU: 62540-01 | |
| Toluene | Fisher Chemical | T324-1 | |
| Transfer pipette | Avantor | 414004-005 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL |
References
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