Summary
在这里，我们提供了一个实用的程序，用于解剖和执行小鼠锁骨上棕色脂肪组织的组织学和基因表达分析。
Abstract
棕色脂肪组织（BAT）介导的产热在代谢的调节中起着重要作用，其形态和功能在小鼠和人类中受到环境刺激的影响很大。目前，小鼠肩胛间 BAT （iBAT） 位于小鼠上背侧的两个肩胛骨之间，是研究实验室用于研究 BAT 功能的主要 BAT 库。最近，在小鼠中发现了一些以前未知的BAT库，包括一种类似于人类锁骨上棕色脂肪组织的细胞库。与 iBAT 不同，小鼠锁骨上棕色脂肪组织 （scBAT） 位于颈部的中间层，因此不容易进入。
为了促进对新鉴定的小鼠scBAT的研究，本文介绍的方案详细说明了从出生后和成年小鼠中解剖完整scBAT的步骤。由于scBAT的尺寸相对于其他脂肪库较小，因此专门针对处理scBAT的程序进行了修改和优化。这些改进包括在组织采集过程中使用解剖显微镜来提高冷冻scBAT样品的精密度和均质化程度，从而提高后续qPCR分析的效率。通过这些优化，可以在小鼠中确定scBAT的鉴定、形态学外观和分子特征。
Introduction
肥胖症在美国和全球的患病率不断上升，引发了人们对了解其病因和确定潜在治疗方法的极大兴趣1,2。脂肪组织在新陈代谢中起着至关重要的作用，脂肪组织的失调会导致肥胖的发展。一般来说，脂肪组织有两种类型，白色和棕色脂肪组织。白色脂肪组织 （WAT） 可以储存化学能并分泌内分泌因子，而棕色脂肪组织 （BAT） 可以利用化学能产生热量并在寒冷中保持体温 3,4。由于这种独特的能力，BAT 的激活还可以增加能量消耗并提高胰岛素敏感性5。
BAT 通过非颤抖产热发挥其功能，该过程由解偶联蛋白 1 （UCP1） 介导6。哺乳动物，包括小鼠和人类，拥有不同数量的BAT。BAT的经典观点是，这些脂肪组织在小鼠和婴儿中比在成年人类中更丰富。iBAT位于肩胛骨之间的上背侧，是小鼠中研究最多的BAT库。通过应用放射性同位素成像和活检测试，最近的研究在成年人类中发现了几个BAT库。其中一些，包括在颈部深部和锁骨上区域发现的仓库，以前没有在小鼠或其他模式动物中鉴定出来7,8,9,10,11。在这些 BAT 仓库中，scBAT 是成年人中最常见的仓库。为了更好地了解这些新发现的BAT库在人类中的起源和分子贡献，必须确定小鼠体内的等效库，这些库允许遗传和分子操作来追踪和测试这些库的功能作用。因此，我们和其他人在小鼠的不同解剖位置发现了一些以前未知的 BAT 库，包括 scBAT12,13、胸血管周围 BAT14,15、肾周 BAT16 和主动脉周围 BAT17。小鼠scBAT在解剖学上与人类scBAT相似，形态学上与经典iBAT相似，表达高水平的UCP112。
与易于解剖的小鼠 iBAT 不同，scBAT 位于小鼠颈部的中间层、唾液腺下方和颈外静脉。分离该库进行组织学和分子分析可能具有挑战性。在这里，我们详细描述了从出生后和成年小鼠中解剖scBAT并处理该库进行组织学和基因表达分析的过程。
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Protocol
动物程序已获得贝勒医学院机构动物护理和使用委员会的批准。所有程序均在3周龄和3个月大的C57BL / 6J雄性小鼠上进行。在解剖之前，所有小鼠都使用批准的啮齿动物二氧化碳安乐死程序进行安乐死。有关本协议中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参阅材料表。
1. scBAT的解剖
- 将小鼠尸体放在工作台上，用70%乙醇清洁手术剪刀和超细尖镊子。
- 用 70% 乙醇喷洒小鼠的腹颈，以润湿皮毛并最大限度地减少毛皮污染。
- 沿着锁骨做一个约 1.5 厘米的双侧切口。
- 从前一个切口的末端，向耳朵纵向切割，长约1厘米。这将在颈部周围形成一个方形的U形切口（图1A，B）。
注意：scBAT位于颈部的中间层。在此步骤中，由皮肤、皮下脂肪组织和唾液腺组成的表层暴露在外。中间层与scBAT一起包含颈静脉和颈部肌肉。颈部深层，包含颈部深部 BAT 以及动脉和颈静脉，通过去除骨骼肌暴露出来。 - 将小鼠置于解剖显微镜下，使暴露的颈部聚焦（图1C）。
注意：这个增加的步骤大大提高了组织收集的精度，这是必要的，因为scBAT的尺寸很小。 - 用镊子将切开的皮肤部分完全暴露唾液腺。
- 使用手术剪刀和镊子，断开连接唾液腺与锁骨周围组织以及彼此之间的组织。
- 通过抬起唾液腺暴露scBAT库。沿颈外静脉寻找 BAT，并可能连接到唾液腺的下侧。通过其橙色来识别它，在周围组织中脱颖而出。
- 用镊子握住目标脂肪组织，轻轻地将其从唾液腺中剥离。
- 一旦与唾液腺分离，继续断开scBAT与颈外静脉和颈部肌肉组织的连接，直到颈部两侧的仓库可以全部切除。
- 在解剖显微镜下检查每个解剖的scBAT样品（图1D，E），使用镊子去除任何残留的结缔组织。
- 将每个样品放入含有 10 mL 磷酸盐缓冲盐水溶液 （PBS） 的玻璃闪烁瓶中，然后从显微镜下取出小鼠。
2. scBAT的加工和苏木精和伊红（H&E）染色 （ 如图2A所示）
- 用10mL冷的4%多聚甲醛（PFA）代替PBS（步骤1.12），并将小瓶放在螺纹器上，在4°C下摇动过夜以固定scBAT。
注意：当需要进一步处理免疫组化分析时，灌注固定可用于出生后，特别是成年小鼠。 - 第二天，用无菌移液管从小瓶中取出PFA溶液，并用10-15mLPBS代替。将小瓶放在螺纹器上，在室温下摇晃30分钟。用0.85%盐水溶液代替PBS，并在室温下继续摇动30分钟。
注意：盐水溶液在DEPC处理的水（不含RNase）中为0.85%盐水（NaCl） w / v。PBS可以代替本步骤和后续步骤中的盐水溶液。 - 用移液管除去 0.85% 生理盐水，并向小瓶中加入 10 mL 70% 乙醇/0.85% 生理盐水溶液。将小瓶存放在4°C冰箱中过夜或直到准备好嵌入石蜡。
注意：如果没有 0.85% 盐水，则可以使用 PBS。scBAT应尽快处理，以便于切片和更好地保存组织形态。 - 在石蜡包埋之前，通过一系列乙醇交换使scBAT脱水，以去除组织中的水分。
- 首先，用移液管从小瓶中除去70%乙醇/ 0.85%盐水，并加入10-15mL95%脱水酒精，在室温下在导向器上摇晃小瓶1小时。重复此步骤一次。
注意：乙醇可用于代替脱水剂酒精溶液。 - 接下来，用10-15mL的100%脱水酒精代替95%脱水酒精，并继续在螺纹上摇摆1小时。重新装满新的 100% 脱水酒精并继续摇晃数小时或过夜，具体取决于小瓶中 scBAT 的数量。
- 首先，用移液管从小瓶中除去70%乙醇/ 0.85%盐水，并加入10-15mL95%脱水酒精，在室温下在导向器上摇晃小瓶1小时。重复此步骤一次。
- 要清除scBAT进行嵌入，请向小瓶中加入10mL甲苯，并继续在导杆上摇摆，直到scBAT透明，大约6-8小时。
注意：达到令人满意的清算所需的时间取决于 scBAT 的大小。建议在早上立即开始清理，以便在下午进行渗透和嵌入。 - 要将 scBAT 包埋在石蜡中，请除去甲苯并向小瓶中加入 10 mL 熔化的浸润石蜡。将小瓶置于65°C的烤箱中1小时。用新蜡重复此步骤。
注意： 在开始嵌入之前，开始在烤箱中熔化蜡颗粒过夜，以确保蜡是完全液态的。 - 用嵌入石蜡代替渗透石蜡，并将小瓶置于相同温度下1小时。重复此步骤一次。
注意：渗透阶段可以中断并在以后继续。从烤箱中取出小瓶并将其存放在室温下，直到准备好继续。 - 首先将组织放入组织包埋模具中，将熔化的包埋蜡添加到模具中，然后在立体显微镜下重新定向组织。然后，将包埋盒放在蜡的顶部，并继续将包埋蜡倒在其顶部，直到它装满并将包埋盖固定在蜡块上。将块转移到4°C冰箱过夜，让蜡变硬并收缩，然后再取出金属模具。
- 用切片机将scBAT切片至厚度为5-6μm18，每个显微镜载玻片三至四个切片，并置于~42°C的温石蜡切片浮浮浴中，以使组织切片平滑。
- 将部分转移到载玻片上，并将载玻片直立放在漂浮浴上，让水从载玻片上滴落。
- 将载玻片转移到不锈钢染色架上，然后将载玻片放在载玻片干燥台上晾干过夜。
注意：在进行进一步加工之前，石蜡载玻片可以在室温下长期储存。 - 进行 H&E 染色19.首先，将载玻片放入染色架中，然后将载玻片放入装有二甲苯的染色罐中40秒。重复此步骤一次。
注意： 如果石蜡在两个阶段后仍然可见，请等到它完全溶解后再继续。 - 要使组织再水化，请将载玻片架放入装有100%脱水酒精的染色罐中两个20秒阶段，然后在95%脱水酒精中进行15秒阶段，最后在ddH2O中冲洗15秒。
- 将载玻片置于装有苏木精溶液的染色皿中75秒以达到核染色，然后在用ddH2O染色皿中冲洗载玻片45秒。
注意： 时间可以根据所需的污渍颜色进行调整。 - 通过将载玻片浸入装有HCl-乙醇溶液的染色皿中15秒来区分染色，然后将载玻片转移到另一个ddH2O冲洗15秒。
注：HCl-乙醇溶液根据已发表的方法19制备。 - 对于细胞质染色，将载玻片置于曙红Y复染溶液中15秒。
- 通过在三个连续的 95% 脱水酒精溶液阶段中将载玻片浸泡 15 秒来脱水组织，然后进行两个连续的 100% 脱水酒精浴 - 第一个 15 秒，第二个 45 秒 - 完成脱水。
- 最后，将载玻片转移到二甲苯浴中45秒，以使组织重新适应有机溶剂。完成此步骤后，染色完成;从溶液中取出组织。
- 将安装介质涂在每张载玻片上，并将其盖在化学通风橱内。成像前晾干过夜。成像结果如 图2B所示。
3. scBAT的基因表达分析
- 组织收集（研磨）
- 解剖scBAT后，立即将组织放入微量离心管中，用无菌针头在管顶部戳一个孔，并在液氮中快速冷冻。
注意： 图3A说明了此处概述的协议的主要步骤。在将管子放入液氮之前，在管子顶部戳一个孔，可以防止管子因压力突然变化而爆裂。 - 用液氮填充塑料烧杯，然后留下杵和薄刮刀浸泡。
注意：在整个过程中，重要的是要保持所有工具和组织样品的温度尽可能低，接近液氮的温度，以防止组织解冻。解冻的脂肪组织具有很强的粘附性，使粉末化更具挑战性。仅在使用前立即从液氮浴中取出工具和样品。 - 一次取一个速冻组织样品，并将其从微量离心管倒入研钵中。
- 在研钵中加入少量液氮，然后用研杵研磨冷冻组织，直至完全粉碎。
注意：如果组织在任何时候开始变软或变粘，则说明它正在解冻;将更多的液氮倒入研钵中。 - 用薄刮刀小心地刮擦粉碎的组织并将其转移回微量离心管中。在刮擦的同时将液氮倒入研钵中，以收集剩余的组织碎片，然后用刮刀转移。重复转移步骤，直到从研钵中取出所有组织。
- 在倾倒下一个样品进行研磨之前，用轻型纸巾擦拭器和 70% 乙醇清洁砂浆。将粉末组织长期储存在-80°C冰箱中。
- 解剖scBAT后，立即将组织放入微量离心管中，用无菌针头在管顶部戳一个孔，并在液氮中快速冷冻。
- 总RNA分离
- 制备
- 用 70% 乙醇和表面去污剂清洁工作台、移液器、吸头支架和试管架，以去除 RNase。
- 运行离心机达到4°C。
- 将洗脱液加热至70°C。
- 通过将 5 μL 复溶的 DNase I 与每个样品的 75 μL DNase 稀释溶液混合来稀释 DNase I。将 DNase I 溶液放在冰上直至使用。
- 程序
- 对于每个样品，标记两个微量离心管、两个色谱柱保持管（两个无盖刻度微量离心管）和一个结合迷你柱。
- 向每个样品中加入 500 μL RNA 分离溶液，并使用沉淀杵电机超声处理 30 秒。
- 为每个样品取一个注射器，上下移液 10 次以进一步裂解组织。确保注射后看不到固体。
- 加入 250 μL 氯仿并偶尔涡旋，同时等待 5 分钟，使样品在室温下孵育。
- 在4°C下以21,000× g 离心20分钟。
- 将顶部水性部分转移到新的微量离心管中，并加入等量的70%乙醇（~500μL）。
注意：顶部水性部分应该是透明的，底部应该是红色RNA分离溶液，两层之间应该是一些不需要的固体。 - 将 500 μL 新裂解物转移到结合柱中。以18,000× g 离心60秒，然后弃去滤液。
- 对剩余的裂解物重复上一步，将所有RNA放入结合柱中。
- 向结合柱中加入700μL低严格洗涤液，离心30秒，弃去滤液。
- 向每个结合柱中加入 80 μL 稀释的 DNase I。在室温下孵育15分钟。
- 加入 700 μL 高严格洗涤液，离心 30 秒，弃去滤液。
- 加入 700 μL 低严格洗涤液，离心 60 秒，弃去滤液。
- 将结合柱移入第2个 新的无盖柱保持管中，并离心2分钟，以确保所有液体都从结合柱中除去。
- 将结合柱移至新的微量离心管中，并加入 30 μL 温热的洗脱溶液。在室温下孵育 1 分钟。
- 离心2分钟，在微量离心管底部收集洗脱的RNA。
- 使用分光光度计测量总RNA浓度。
注意：如果总RNA纯度较低，则由260/280值低于2.0或260/230值低于1.8表示，则在步骤3.2.2.12.之后，样品可以再次用低严格洗涤液洗涤，然后用80%乙醇洗涤，然后继续步骤3.2.2.13。 - 将RNA储存在-80°C冰箱中。
- 逆转录 （RT）
- 在PCR管条中，将0.5-1μg在DEPC处理的水中稀释的总RNA加入到不同的孔中，每个RNA样品总共8μL。
注意：用于逆转录的RNA量可以根据制造商的说明放大或缩小。 - 向PCR管中的每个样品中加入1μL寡核苷酸dT和1μLdNTP。确保每个样品的总体积为 10 μL。
- 将PCR管条置于热循环仪中，并将其设置为65°C5分钟，然后无限期地设置4°C。
- 在65°C下5分钟后，取出PCR管条并将管放在冰上至少2分钟。在冰上孵育后，向每个样品中加入五种试剂：4 μL 5x 第一链缓冲液、2 μL 25 mM MgCl2、2 μL 0.1 M DTT、1 μL RNase 抑制剂和 1 μL 逆转录酶。确保每个样品的总体积现在为 20 μL。
- 将PCR管条放回热循环仪中，并将程序设置为50°C50分钟，然后85°C5分钟，然后无限期地4°C。
- 程序达到4°C后，取出试纸条并加入1μL核糖核酸酶H（RNase H）。
注意：RNase H用于去除RT反应中任何剩余的RNA模板;通过此步骤，所需的RNA应该已经转化为cDNA。 - 将条带放回热循环仪中，在37°C下运行20分钟，然后无限期地在4°C下运行。
- 逆转录完成;使用分光光度计测量cDNA浓度。
- 将 cDNA 稀释至 250 ng/μL;将cDNA储存在-80°C或-20°C冰箱中。
- 在PCR管条中，将0.5-1μg在DEPC处理的水中稀释的总RNA加入到不同的孔中，每个RNA样品总共8μL。
- 定量PCR（qPCR）
- 制作一个电子表格，以组织每个引物和样品在 96 孔 qPCR 板上的位置。
注意：其中一个引物需要是参考基因，以使所有其他目标基因（如 36B4）的表达正常化。 - 为每个“引物+样品”组合制作引物预混液。向每个qPCR反应孔中加入3 μL分子生物学级水、5 μL qPCR酶预混液、0.5 μL正向引物和0.5 μL反向引物，每次反应加起来为9 μL。每个反应加入 1 μL cDNA，使每个反应孔总共 10 μL。
注意：标准是每个“引物+样品”组合有三个技术重复，因此每个预混液应为上述数量的 4 倍。 - 向每个引物预混液中加入 1 μL cDNA。如果每个预混液为 4 倍，则将每个样品 cDNA 的 4 μL 移液到它们自己标记的试管中。
- 最后，将每种反应混合物的 10 μL 移液到电子表格确定的位置的 96 孔 qPCR 板中。
- 用厚厚的粘性密封板密封板，然后在20°C下将96孔板在450× g 离心2分钟。
注意： 至关重要的是，板必须完全密封，以避免样品在热循环过程中蒸发。使用轻型纸巾擦拭器将密封件向下压在板上，尤其是边缘。 - 在实时荧光定量PCR仪器中运行板。根据制造商的说明对PCR反应进行编程：在50°C下2分钟，然后在95°C下再2分钟，最后在95°C下进行40个循环，在95°C下进行15秒，在60°C下进行30秒。 qPCR基因表达分析的结果如 图3B所示。
- 制作一个电子表格，以组织每个引物和样品在 96 孔 qPCR 板上的位置。
- 制备
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Representative Results
与位于两个肩胛骨之间的背部皮下层的 iBAT 不同，scBAT 位于颈部的中间层，在骨骼肌和唾液腺层之间延伸深处，因为它沿着颈外静脉生长（图 1A）。剖析 scBAT 并不像 iBAT 那么简单。在这里，我们提供了一个详细的程序，包括从出生后和成年小鼠中解剖完整scBAT的关键步骤（图1B，C）。使用提供的方案打开颈部后，可以在解剖显微镜下识别一层薄薄的scBAT并用镊子从连接的唾液腺和颈外静脉剥离（图1D，E）。为了评估仓库的形态，使用提供的处理程序结合先前发表的H&E染色程序19处理新鲜分离的scBAT（图2A）。如图2B所示，scBAT具有BAT库的典型组织结构，并且由健康出生后和成年小鼠中的许多小的多房脂肪细胞组成。为了评估scBAT中的基因表达水平，使用提供的程序从分离的scBAT库中提取RNA（图3A）。然后可以通过标准RT-qPCR方法评估目标基因的表达水平（图3A）。如图3B所示，参与介导scBAT功能的基因的表达水平不同，包括BAT发育的主要调节因子Pparg;Fabp4 和 Glut4，两种营养转运蛋白;Ucp1 和 Ppargc1a 是两个参与产热的基因，可以很容易地确定。为了进行比较，从分离的iBAT中提取RNA，并使用提供的程序评估上述基因的表达（图3A）。这两个库之间这些基因的表达水平相对相似。（图3B）。
图1：scBAT的解剖位置及其解剖过程。 （A） scBAT在颈部中间层的位置。（B）去除皮肤前后的颈部表层。比例尺 = 250 μm。黄色虚线勾勒出U形切口后应暴露的区域。（C） 放置在解剖显微镜下的小鼠尸体的图像，以增加解剖过程中的视觉清晰度。（D，E）从3周龄和3个月龄的小鼠中去除scBAT前后颈部中间层的代表性图像。比例尺 = 250 μm。黄色虚线勾勒出暴露的双边scBAT仓库;n = 2。缩写：scBAT = 锁骨上棕色脂肪组织;sfi = 表层;sg = 唾液腺;tr = 气管;JV = 颈外静脉;sm = 骨骼肌。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：用于 H&E 染色的 scBAT 处理。 （A） 流程图说明了 H&E 染色的 scBAT 处理的主要步骤。解剖组织后，依次固定、脱水、包埋、切片和染色。（B）3周龄和3个月龄小鼠H&E染色scBAT的代表性图像;每个发育阶段的 n = 3;比例尺 = 250 μm，用于较低放大倍率的图像;比例尺 = 50 μm，用于更高放大倍率的图像。缩写：scBAT = 锁骨上棕色脂肪组织;PFA = 多聚甲醛;H&E = 苏木精和伊红。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3：从scBAT制备用于基因表达分析的RNA。 （A） 说明scBAT基因表达的RNA分离和RT-qPCR分析阶段的流程图。由于其体积小、质地柔软，快速冷冻scBAT库并在液氮中研磨对于成功分离RNA至关重要。 （B） 标记基因的相对表达，包括 Pparg、 Fabp4、 Glut4、 Ucp1 和 Ppargc1a，在从 3 个月龄雄性小鼠中分离的 scBAT 和 iBAT，n = 5。数据以平均±SEM表示。 36B4 被用作归一化的管家基因。缩写：scBAT = 锁骨上棕色脂肪组织;RT-qPCR = 逆转录定量PCR;LN2 = 液氮。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
在该方案中，我们详细介绍了用于H&E和基因表达分析的解剖和处理scBAT的程序。由于scBAT位于颈部的中间层，并位于大静脉中，因此该库的分离需要精确的技术。具体来说，为了获得仓库的清晰视图，我们建议在颈部打开后将小鼠置于解剖显微镜下。使用一对超细尖镊子从唾液腺和周围静脉剥离 scBAT，应注意避免刺穿静脉。出血过多会使 scBAT 更难定位。为了处理用于 H&E 染色的 scBAT，我们调整了已公布的方案19 的使用，并进行了轻微的修改，包括使用 4% PFA、脱水醇和有机溶剂甲苯进行组织处理，如方案部分所示。整个过程需要 ~6 天才能完成，H&E 染色的载玻片可以在染色完成后的第二天成像。
以RNA为起始材料的RT-qPCR是脂肪组织生物学领域最常用的基因表达分析方法。由于与 iBAT 相比，scBAT 是一个相对较小的 BAT 库，因此很难获得足够的 RNA 进行基因表达。为了提高RNA产量，我们建议应用方案部分概述的顺序裂解物制备步骤，首先在冷冻时使用研杵和研钵将组织粉化。使用这种裂解物制备方法，我们成功地从一只成年小鼠身上获得了用于scBAT基因表达分析的高产量和高质量RNA样品。该裂解物制备方法也可用于使用蛋白质裂解缓冲液从scBAT中获得高质量的蛋白质裂解物，用于蛋白质印迹。
使用小鼠 iBAT，研究人员已经获得了有关 BAT 在产热和代谢中的功能的大量知识。最近在小鼠和人类中发现了一些以前未被识别的BAT库，包括scBAT，揭示了在我们完全了解BAT在小鼠和成年人类中的生理贡献之前，需要更多的研究。特别是，有必要研究阐明这些新发现的 BAT 库的起源、功能和参与产热和区域或全身代谢。
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Disclosures
作者没有需要披露的利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）的NIDDK的支持，奖励编号为R01DK116899，USDA / ARS的奖励编号为3092-51000-064-000D，以及贝勒医学院心血管研究所的试点奖。流程图是使用 BioRender 制作的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 95% Dehydrant Alcohol (Flex 95) | Epredia | 8201 | |
| 100% Dehydrant Alcohol (Flex 100) | Epredia | 8101 | |
| 96-well PCR plate | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Aurum Binding Mini Column | Bio-Rad | 7326826 | |
| Aurum High Stringency Wash | Bio-Rad | 7326803 | |
| Aurum Low Stringency Wash | Bio-Rad | 7326804 | |
| Base Molds (for embedding) | Tissue-Tek | 4122 | |
| BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2" | Becton Dickinson | 305167 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1840148 | |
| Capless Microcentrifuge Tubes 2 mL | Fisherbrand | 02-681-453 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument | Bio-Rad | 12011319 | |
| Chloroform | Thermo Scientific Chemicals | 383760010 | |
| Cytoseal 60 Low-viscosity mounting medium | Epredia | 83104 | |
| DEPC-Treated Water | Ambion | AM 9906 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| DNase Dilution Solution | Bio-Rad | 7326805 | |
| DNase I | Bio-Rad | 7326828 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427013 | |
| Elution solution | Bio-Rad | 7326801 | |
| EM 400 embedding medium paraffin | Leica Biosystems | 3801320 | |
| Eosin Y (0.5% w/v) | RICCA | 2858-16 | |
| Formula R Infiltration medium paraffin | Leica Biosystems | 3801470 | |
| Genemark Nutator Gyromixer 349 | Bio Express | S-3200-2 | |
| Gill #3 Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS332-1L | |
| HCl (for HCL-Ethanol) | Fisher Chemical | A142212 | |
| IP VI Embedding Cassettes | Leica Biosystems | 39LC-550-5-L | |
| Koptec's Pure Ethanol - 200 Proof (for 70% Ethanol) | Decon Labs | V1001 | |
| MgCl2 (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R0971 | |
| Microcentrifuge Tubes 1.7 mL | Avantor | 87003-294 | |
| Microseal 'B' Seals (adhseive seals) | Bio-Rad | MSB1001 | |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2245 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 46-000-CM | |
| Mortar Coors Tek | Thomas Scientific | 60310 | |
| NaCl (for 0.85% saline) | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop Technologies | ND-1000 UV/Vis | |
| Oligo dT | Invitrogen | 18418020 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Boekel Scientific | 14792V | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | |
| PCR Tube Strip | Avantor | 76318-802 | |
| Pestle by Coors Tek | Thomas Scientific | 60311 | |
| Pestle Pellet Motor | Kimble | 749540-0000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Precision Model 19 Vacuum Oven | Thermo Fisher Scientific | CAT# 51221162 | |
| Primer: 36B4 (forward) 10 μM 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: 36B4 (reverse) 10 μM 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (forward) 10 μM 5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM 5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM 5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM 5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (forward) 10 μM 5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (reserve) 10 μM 5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (forward) 10 μM 5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM 5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| RNA isolation solution (PureZol) | Bio-Rad | 7326880 | |
| RNase Away (surface decontaminant) | Thermo Scientific | 1437535 | |
| RNase H | NEB | M0297S | |
| Rnase inhibitor (RNase Out) | Invitrogen | 10777019 | |
| Scintillation Vial (glass) | Electron Microscopy Sciences | 72632 | |
| Slide drying bench | Electrothermal (Cole-Parmer) | MH6616 | |
| Stainless staining rack | Electron Microscopy Sciences | 70312-54 | |
| Stereo microscope (for embedding) | Olympus | SZ51 | |
| Sugical scissors | McKesson | 43-1-104 | |
| Superfine point Straight Dissecting Forceps | Avantor | 82027-402 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT) | Invitrogen | 18080044 | |
| SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mL | Terumo | 100281 | |
| SYBR Green (qPCR enzyme master mixture) | Applied Biosystems | A25778 | |
| Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars) | Electron Microscopy Sciences | SKU: 62540-01 | |
| Toluene | Fisher Chemical | T324-1 | |
| Transfer pipette | Avantor | 414004-005 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL |
References
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