Summary
ここでは、マウスの鎖骨上褐色脂肪組織の組織学的および遺伝子発現解析を解剖および実行するための実用的な手順を提供します。
Abstract
褐色脂肪組織(BAT)を介した熱産生は、代謝の制御に重要な役割を果たしており、その形態と機能は、マウスやヒトの環境刺激によって大きく影響を受けます。現在、マウスの背側上部の2つの肩甲骨の間に位置するマウス肩甲間BAT(iBAT)は、研究室がBAT機能を研究するために使用する主要なBATデポです。最近、これまで知られていなかったいくつかのBATデポがマウスで同定され、その中にはヒト鎖骨上褐色脂肪組織に類似したものも含まれていました。iBATとは異なり、マウス鎖骨上褐色脂肪組織(scBAT)は頸部の中間層に位置するため、簡単にアクセスすることはできません。
新たに同定されたマウスscBATの研究を容易にするために、出生後および成体マウスから無傷のscBATを解剖する手順を詳述したプロトコルを本明細書に提示する。scBATは他の脂肪デポに比べてサイズが小さいため、手順はscBATの処理に特化して変更され、最適化されています。これらの変更の中には、組織採取中に解剖顕微鏡を使用して、凍結scBATサンプルの精度と均質化を高め、その後のqPCR分析の効率を高めることが含まれます。これらの最適化により、マウスにおけるscBATの同定、形態学的外観、および分子特性を決定することができます。
Introduction
米国および世界中で肥満の有病率が増加していることから、肥満の病因を理解し、潜在的な治療法を特定することに大きな関心が寄せられています1,2。脂肪組織は代謝に重要な役割を果たしており、脂肪組織の調節不全は肥満の発症につながる可能性があります。一般的に、脂肪組織には白色脂肪組織と褐色脂肪組織の2種類があります。白色脂肪組織(WAT)は化学エネルギーを蓄え、内分泌因子を分泌することができますが、褐色脂肪組織(BAT)は化学エネルギーを使用して熱を発生させ、寒さの中で体温を維持することができます3,4。このユニークな能力により、BATの活性化はエネルギー消費を増加させ、インスリン感受性を改善することもできます5。
BATは、タンパク質1(UCP1)6の脱共役によって媒介される非震え熱発生を介してその機能を発揮します。マウスやヒトを含む哺乳類は、さまざまな量のBATを保有しています。BATの古典的な見解は、これらの脂肪組織は成人のヒトよりもマウスや乳児に豊富に存在するというものです。肩甲骨の間の背側上部に位置するiBATは、マウスで最も研究されているBATデポです。放射性同位元素イメージングと生検検査を適用することにより、最近の研究では、成人のヒトでいくつかのBATデポが特定されました。それらのいくつかは、頸部深部と鎖骨上領域に見られるデポを含め、マウスや他のモデル動物ではこれまで同定されていなかった7,8,9,10,11。これらのBATデポの中で、scBATは成人の人間に最も頻繁に見られるデポです。ヒトで新たに発見されたこれらのBAT貯蔵所の起源と分子的寄与をよりよく理解するためには、これらの貯蔵庫の機能的役割を追跡し、テストするための遺伝的および分子的操作を可能にするマウスの同等の貯蔵所を特定することが不可欠である。したがって、私たちらは、scBAT12,13、胸部血管周囲BAT14,15、腎周囲BAT16、および大動脈周囲BAT17など、マウスのさまざまな解剖学的位置で、これまで知られていなかったいくつかのBATデポを特定しました。マウスscBATは、解剖学的にはヒトscBATに似ており、形態学的には古典的iBATに似ており、高レベルのUCP112を発現している。
容易に解剖できるマウスiBATとは異なり、scBATはマウス頸部の中間層、唾液腺の下、外頸静脈に沿って位置しています。組織学的および分子学的分析のためのこのデポの分離は困難な場合があります。ここでは、出生後および成体マウスからscBATを解剖し、このデポを組織学および遺伝子発現解析のために処理する手順を詳細に説明します。
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Protocol
動物の処置は、ベイラー医科大学の動物管理および使用委員会によって承認されました。すべての手順は、生後3週間と3か月のC57BL / 6J雄マウスで実施されました。解剖に先立ち、すべてのマウスは、承認されたげっ歯類の二酸化炭素安楽死手順を使用して安楽死させました。このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、および機器に関連する詳細については、材料表を参照してください。
1. scBATの解剖
- マウスの死骸を作業台に置き、手術用ハサミと極細点鉗子を70%エタノールで洗浄します。
- マウスの腹頸部に70%エタノールをスプレーして毛皮を濡らし、毛皮の汚染を最小限に抑えます。
- 鎖骨に沿って約1.5cmの両側切開を行います。
- 前の切開の端から、耳に向かって縦方向に約1 cmの長さに切ります。これにより、首の周りに四角いU字型の切開が形成されます(図1A、B)。
注:scBATは首の中間層にあります。皮膚、皮下脂肪組織、唾液腺で構成される表層は、このステップ中に露出します。中間層には、scBATとともに、頸静脈と頸部の筋肉が含まれています。頸部の深部BATと動脈・頸静脈を含む頸部の深層は、骨格筋を切除することで露出します。 - マウスを解剖顕微鏡の下に置き、露出した頸部に焦点を合わせます(図1C)。
注:この追加されたステップにより、scBATのサイズが小さいことを考えると、必要な組織採取の精度が大幅に向上します。 - 鉗子で切開した皮膚部分を持ち上げて、唾液腺を完全に露出させます。
- 外科用ハサミと鉗子を使用して、唾液腺を鎖骨の周りの組織に接続している組織を切断し、互いに切断します。
- 唾液腺を持ち上げてscBATデポを露出させます。外頸静脈に沿って、おそらく唾液腺の下側に接続されているBATを探します。周囲の組織に対して際立っているオレンジがかった色で識別します。
- 標的の脂肪組織を鉗子で保持し、唾液腺からそっと剥がします。
- 唾液腺から剥離したら、首の両側のデポを完全に取り外すことができるまで、scBATを外頸静脈と首の筋肉組織から切り離し続けます。
- 解剖した各scBATサンプルを解剖顕微鏡(図1D、E)で検査し、鉗子を使用して残りの結合組織を除去します。
- 各サンプルを10 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含むガラスシンチレーションバイアルに入れ、顕微鏡下からマウスを取り出します。
2. scBATの処理とヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色 ( 図2Aに示)
- PBS(ステップ1.12)を10 mLの冷たい4%パラホルムアルデヒド(PFA)と交換し、バイアルを砕歯機に置き、4°Cで一晩揺動させてscBATを固定します。
注:灌流固定は、出生後、特に成体マウスにおいて、免疫組織化学分析のためのさらなる処理が必要な場合に適用できます。 - 翌日、滅菌トランスファーピペットでバイアルからPFA溶液を取り出し、10〜15 mLのPBSと交換します。バイアルを乳汁に置き、室温で30分間揺石します。PBSを0.85%生理食塩水に置き換え、室温でさらに30分間揺動を続けます。
注:生理食塩水は、DEPC処理水(RNaseフリー)で0.85%生理食塩水(NaCl)w / vです。PBSは、このステップおよび次のステップで生理食塩水の代わりに使用できます。 - トランスファーピペットで0.85%生理食塩水を取り除き、10 mLの70%エタノール/0.85%生理食塩水溶液をバイアルに加えます。バイアルを4°Cの冷蔵庫で一晩、またはパラフィン包埋の準備ができるまで保管してください。
注:PBSは、0.85%生理食塩水が利用できない場合に使用できます。scBATは、切片化を容易にし、組織の形態をよりよく保存するために、できるだけ早く処理する必要があります。 - パラフィン包埋の前に、一連のエタノール交換によってscBATを脱水し、組織から水分を除去します。
- まず、トランスファーピペットでバイアルから70%エタノール/0.85%生理食塩水を取り除き、10〜15 mLの95%脱水剤アルコールを加え、バイアルを室温で1時間ナテーターで揺動させます。この手順を 1 回繰り返します。
注:エタノールは、脱水アルコール溶液の代わりに使用できます。 - 次に、95%脱水アルコールを10〜15mLの100%脱水アルコールと交換し、砕泮器で1時間揺動を続けます。新しい100%脱水剤アルコールを補充し、バイアル内のscBATの量に応じて、数時間または一晩ロックし続けます。
- まず、トランスファーピペットでバイアルから70%エタノール/0.85%生理食塩水を取り除き、10〜15 mLの95%脱水剤アルコールを加え、バイアルを室温で1時間ナテーターで揺動させます。この手順を 1 回繰り返します。
- 包埋のためにscBATを除去するには、10 mLのトルエンをバイアルに加え、scBATが透明になるまで約6〜8時間、乳化剤上でロッキングを続けます。
注:満足のいくクリアを達成するために必要な時間は、scBATのサイズによって異なります。午後に浸透と埋め込みができるように、午前中にすぐに清掃を開始することをお勧めします。 - scBATをパラフィンワックスに埋め込むには、トルエンを除去し、溶融した浸潤パラフィンワックス10 mLをバイアルに加えます。バイアルを65°Cのオーブンに1時間入れます。新しいワックスでこの手順を繰り返します。
注意: ワックスが完全に液体であることを確認するために、埋め込みを開始する前に、オーブンで一晩ワックスペレットを溶かし始めてください。 - 浸潤パラフィンワックスを包埋パラフィンワックスと交換し、バイアルを同じ温度で1時間置きます。この手順を 1 回繰り返します。
注:侵入段階は中断し、後で続行できます。バイアルをオーブンから取り出し、続行する準備ができるまで室温で保管します。 - まず組織包埋型に組織を配置して包埋し、溶融した包埋ワックスを型に加え、実体顕微鏡下で組織の向きを変えます。次に、ワックスの上に包埋用カセットを置き、ワックスがいっぱいになり、包埋キャップがワックスブロックに固定されるまで、その上に包埋用ワックスを注ぎ続けます。ブロックを4°Cの冷蔵庫に一晩移し、ワックスを硬化させて収縮させてから金型を取り出します。
- scBATをミクロトームで5-6 μm18の厚さに切片し、顕微鏡スライドごとに3〜4切片を切片化し、~42°Cの温かいパラフィン切片浮遊浴に入れて、組織切片を滑らかにします。
- 切片をスライドに移し、スライドを浮遊浴槽に対して直立させて置き、スライドから水が滴り落ちるようにします。
- スライドをステンレス製の染色ラックに移し、ラックをスライド乾燥ベンチに置いて一晩乾燥させます。
注:パラフィンスライドは、さらなる処理が行われる前に室温で長期間保存することができます。 - H&E染色を行う19.まず、スライドを染色ラックに入れ、次にラックをキシレンを入れた染色ジャーに40秒間置きます。この手順を 1 回繰り返します。
注意: 2つの段階を過ぎてもパラフィンが見える場合は、パラフィンが完全に溶解するまで待ってから続行してください。 - 組織を再水和するには、スライドラックを100%脱水剤アルコールで満たされた染色ジャーに20秒間2回置き、続いて95%脱水剤アルコールで15秒間、最後にddH2Oで15秒間すすぎます。
- スライドをヘマトキシリン溶液で満たされた染色皿に75秒間入れて核染色を行い、次にスライドをddH2Oの染色皿で45秒間すすぎます。
注意: 時間は、希望の染色に応じて調整できます。 - HCl-エタノール溶液で満たされた染色皿にスライドを15秒間浸漬し、次にスライドを別のddH2Oリンスに15秒間移すことで染色を区別します。
注:HCl−エタノール溶液は、公表された方法19に従って調製される。 - 細胞質染色の場合は、スライドをEosin Y対比染色液に15秒間入れます。
- スライドを3つの連続した95%脱水剤アルコール溶液段階にそれぞれ15秒間浸し、次に2つの連続した100%脱水剤アルコール浴(1つ目は15秒間、2つ目は45秒間)に浸して脱水を終了します。
- 最後に、スライドをキシレン浴に45秒間移し、組織を有機溶媒に再順応させます。このステップの後、染色は完了です。溶液から組織を取り除きます。
- 各スライドに封入剤を塗布し、化学ドラフト内でカバースリップします。イメージングする前に一晩乾燥させます。イメージング結果を 図2Bに示す。
3. scBATの遺伝子発現解析
- ティッシュコレクション(粉砕)
- scBATを解剖した後、直ちに組織を微量遠心チューブに入れ、滅菌針でチューブの上部に穴を開け、液体窒素でスナップ凍結します。
メモ:ここで概説するプロトコルの主な手順を 図3Aに示します。液体窒素に落とす前にチューブの上部に穴を開けることで、急激な圧力変化によるチューブの破裂を防ぎます。 - プラスチック製のビーカーに液体窒素を入れ、乳棒と細いヘラを残して浸します。
注:組織が解凍するのを防ぐために、手順全体を通して、すべてのツールと組織サンプルの温度を液体窒素の温度に近いできるだけ低温に保つことが重要です。解凍された脂肪組織は非常に密着性が高く、粉末化をより困難にします。使用直前に液体窒素浴から工具やサンプルを取り出してください。 - 一度に1つの急速凍結組織サンプルを採取し、微量遠心チューブから乳鉢に注ぎます。
- 乳鉢に少量の液体窒素を加え、乳棒を使用して凍結した組織を完全に粉砕するまで粉砕します。
注意: 組織がいずれかの時点で柔らかくなったり粘着性を帯びたりし始めた場合は、解凍中です。モルタルにさらに液体窒素を注ぎます。 - 細いスパチュラを使用して、粉砕された組織を慎重にこすり落とし、微量遠心チューブに戻します。液体窒素をすり取りながらモルタルに注ぎ、残ったティッシュを集めてからヘラで移します。すべての組織がモルタルから取り除かれるまで、転写手順を繰り返します。
- 軽量ティッシュワイパーと70%エタノールでモルタルを洗浄してから、次のサンプルを捨てて粉砕します。粉末状のティッシュは-80°Cの冷凍庫で長期間保管してください。
- scBATを解剖した後、直ちに組織を微量遠心チューブに入れ、滅菌針でチューブの上部に穴を開け、液体窒素でスナップ凍結します。
- トータル RNA 単離
- 準備
- 作業台、ピペット、チップホルダー、チューブラックを70%エタノールと表面除染剤の両方で洗浄し、RNaseを除去します。
- 遠心分離機を4°Cに達するまで運転します。
- 溶出液を70°Cに温めます。
- サンプルあたり 5 μL の再構成 DNase I と 75 μL の DNase 希釈溶液を混合して、DNase I を希釈します。DNase I溶液は、使用するまで氷上に置いてください。
- プロシージャ
- 各サンプルについて、2本の微量遠心チューブ、2本のカラム保持チューブ(2本のキャップレス目盛り付き微量遠心チューブ)、および1本の結合ミニカラムを標識します。
- 各サンプルに500μLのRNA分離溶液を加え、ペレット乳棒モーターを使用して30秒間超音波処理します。
- 各サンプル用のシリンジを用意し、ピペットで10回上下させて組織をさらに溶解します。シリンジ後に固形物が見えていないことを確認してください。
- 250 μL のクロロホルムを添加し、サンプルが室温でインキュベートするのを 5 分間待ちながら、時々ボルテックスします。
- 21,000 × g で4°Cで20分間遠心分離します。
- 上部の水性部分を新しい微量遠心チューブに移し、同量の70%エタノール(~500μL)を加えます。
注:上部の水性部分は透明で、下部は赤色のRNA分離溶液で、2つの層の間には不要な固形物が含まれている必要があります。 - 500 μLの新しいライセートを結合カラムに移します。18,000 × g で60秒間遠心分離し、ろ液を廃棄します。
- 残りのライセートで前のステップを繰り返して、すべてのRNAを結合カラムに入れます。
- 700 μL の低ストリンジェンシー洗浄液を結合カラムに加え、30 秒間遠心分離し、ろ液を廃棄します。
- 希釈したDNase Iを80 μLずつ各結合カラムに添加します。室温で15分間インキュベートします。
- 700μLの高ストリンジェンシー洗浄液を加え、30秒間遠心分離し、濾液を廃棄します。
- 700 μL の低ストリンジェンシー洗浄液を加え、60 秒間遠心分離し、ろ液を廃棄します。
- 結合カラムを2番目の 新しいキャップレスカラム保持チューブに移動し、2分間遠心分離して、すべての液体が結合カラムから除去されるようにします。
- 結合カラムを新しい微量遠心チューブに移し、加温した溶出溶液を30 μL加えます。室温で1分間インキュベートします。
- 2分間遠心分離し、微量遠心チューブの底部で溶出したRNAを回収します。
- 分光光度計を使用して総RNA濃度を測定します。
注:トータルRNA純度が低い場合(2.0未満の260/280値または1.8未満の260/230値で示される)、ステップ3.2.2.12の後、サンプルを低ストリンジェンシー洗浄でもう一度洗浄した後、ステップ3.2.2.13に進む前に80%エタノールで洗浄できます。 - RNAを-80°Cの冷凍庫で保存します。
- 逆転写(RT)
- PCRチューブストリップで、DEPC処理水で希釈した0.5〜1μgのトータルRNAを、各RNAサンプルごとに合計8 μLに異なるウェルに加えます。
注:逆転写に使用されるRNAの量は、メーカーの指示に従ってスケールアップまたはスケールダウンできます。 - 1 μL のオリゴ dT と 1 μL の dNTP を PCR チューブ内の各サンプルに加えます。総容量がサンプルあたり10 μLであることを確認してください。
- PCRチューブストリップをサーモサイクラーに入れ、65°Cで5分間、続いて4°Cで無期限に設定します。
- 65°Cで5分間放置した後、PCRチューブストリップを取り出し、チューブを氷上に少なくとも2分間置きます。氷上でインキュベートした後、5 μL の 5x First-Strand バッファー、2 μL の 25 mM MgCl2、2 μL の 0.1 M DTT、1 μL の RNase 阻害剤、1 μL の逆転写酵素の 5 つの試薬を各サンプルに加えます。総容量がサンプルあたり 20 μL になっていることを確認します。
- PCRチューブストリップをサーモサイクラーに戻し、プログラムを50°Cで50分間、次に85°Cで5分間、次に4°Cに無期限に設定します。
- プログラムが4°Cに達したら、ストリップを取り出し、1 μLのリボヌクレアーゼH(RNase H)を加えます。
注:RNase Hは、RT反応で残っているRNAテンプレートを除去するために使用されます。このステップでは、目的のRNAはすでにcDNAに変換されているはずです。 - ストリップをサーモサイクラーに戻し、37°Cで20分間、その後4°Cで無期限に実行します。
- 逆転写が完了しました。分光光度計を使用してcDNA濃度を測定します。
- cDNAを250 ng/μLに希釈します。cDNAは-80°Cまたは-20°Cの冷凍庫で保存してください。
- PCRチューブストリップで、DEPC処理水で希釈した0.5〜1μgのトータルRNAを、各RNAサンプルごとに合計8 μLに異なるウェルに加えます。
- 定量PCR(qPCR)
- スプレッドシートを作成して、96ウェルqPCRプレート上のすべてのプライマーとサンプルの位置を整理します。
注:プライマーの1つは、 36B4など、他のすべての目的遺伝子の発現を標準化するための参照遺伝子である必要があります。 - 「プライマー+サンプル」の組み合わせごとにプライマーマスターミックスを作成します。各qPCR反応ウェルに、分子生物学グレードの水3 μL、qPCR酵素マスター混合物5 μL、フォワードプライマー0.5 μL、リバースプライマー0.5 μLを添加し、反応ごとに合計9 μLになります。1反応あたり1 μLのcDNAを添加し、1反応あたり合計10 μLにします。
注:標準では、「プライマー + サンプル」の組み合わせごとに 3 回のテクニカルレプリケートを行うことになっているため、各マスターミックスは上記の量の 4 倍にする必要があります。 - 各プライマーマスターミックスに各複製ごとに1 μLのcDNAを加えます。各マスターミックスが 4 倍の場合は、各サンプル cDNA 4 μL を独自の標識チューブにピペットで固定します。
- 最後に、各反応液10 μLを96ウェルqPCRプレートのスプレッドシートで決定された位置にピペットで移します。
- プレートを厚い粘着シールで密封し、96ウェルプレートを450 × g 、20°Cで2分間遠心分離します。
注:サーモサイクル中にサンプルが蒸発しないように、プレートが完全に密閉されていることが重要です。軽量のティッシュワイパーを使用して、シールをプレート、特に端に押し下げます。 - プレートをリアルタイムPCR装置で泳動させます。メーカーの指示に従ってPCR反応をプログラムします:50°Cで2分、続いて95°Cでさらに2分、最後に95°Cで15秒、60°Cで30秒の40サイクル。 qPCR遺伝子発現解析の結果を 図3Bに示します。
- スプレッドシートを作成して、96ウェルqPCRプレート上のすべてのプライマーとサンプルの位置を整理します。
- 準備
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Representative Results
背中の2つの肩甲骨の間の皮下層に位置するiBATとは異なり、scBATは頸部の中間層に位置し、骨格筋の層と唾液腺の層の間に深く伸び、外頸静脈に沿って成長します(図1A)。scBATの解剖は、iBATほど簡単ではありません。ここでは、出生後および成体マウスから無傷のscBATを解剖するための重要なステップを含む詳細な手順を提供します(図1B、C)。提供されたプロトコルを使用して頸部を開いた後、scBATの薄層を解剖顕微鏡で識別し、接続された唾液腺と一対の鉗子で外頸静脈から剥離することができます(図1D、E)。デポの形態を評価するために、新たに単離されたscBATを、以前に発表されたH&E染色手順19 (図2A)と組み合わせた提供された処理手順を使用して処理しました。 図2Bに示すように、scBATはBATデポに典型的な組織構造を持ち、健康な出生後および成体マウスにおいて多くの小さな多房脂肪細胞で構成されています。scBATの遺伝子発現レベルを評価するために、所定の手順を用いて単離されたscBATデポからRNAを抽出しました(図3A)。次に、目的の遺伝子の発現レベルを標準的なRT-qPCR法で評価できます(図3A)。 図3Bに示すように、BAT発生のマスターレギュレーターである Ppargを含むscBAT機能の媒介に関与する遺伝子の発現レベルの違い。 Fabp4 と Glut4、2つの栄養素輸送体。また、熱発生に関与する2つの遺伝子である Ucp1 と Ppargc1aは容易に決定できます。比較のために、単離されたiBATからRNAを抽出し、上記の遺伝子の発現も提供された手順を使用して評価しました(図3A)。これらの遺伝子の発現レベルは、これら2つのデポ間で比較的類似しています。(図3B)。
図1:scBATの解剖学的位置と解剖プロセス。 (A)首の中間層におけるscBATの位置。(B)皮膚を切除する前後の首の表層。スケールバー = 250 μm。黄色の点線は、U字型に切開した後に露出する領域の輪郭を描いています。(C)解剖中の視覚的明瞭さを高めるために解剖顕微鏡の下に置かれたマウスの死骸の画像。(D、E)scBATを3週間齢と3ヶ月齢のマウスから除去する前後の頸部中間層の代表的な画像。スケールバー = 250 μm。黄色の点線は、露出した二国間scBATデポの輪郭を描いています。n = 2 です。略語:scBAT =鎖骨上褐色脂肪組織;sfi = 表層;SG = 唾液腺;tr =気管;JV = 外頸静脈;SM = 骨格筋。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:H&E染色のためのscBATの処理。 (A)H&E染色のためのscBAT処理の主なステップを示すフローチャート。組織を解剖した後、順次固定、脱水、包埋、切片化、染色を行います。(B)生後3週間および3ヶ月齢のマウスのH&E染色scBATの代表的な画像。n = 3 各発達段階;スケールバー = 250 μm (低倍率画像用)。スケールバー = 50 μm (高倍率画像の場合)。略語:scBAT =鎖骨上褐色脂肪組織;PFA =パラホルムアルデヒド;H&E = ヘマトキシリンとエオシン。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:遺伝子発現解析のためのscBATからのRNAの調製。 (A)scBAT遺伝子発現のRNA単離およびRT-qPCR解析の段階を示すフローチャート。サイズが小さく、テクスチャーが柔らかいため、scBATデポを急速凍結し、液体窒素で粉砕することは、RNA単離を成功させるために不可欠です。 (B)生後3ヶ月の雄マウスから単離したscBATおよびiBATにおける 、Pparg、 Fabp4、 Glut4、 Ucp1、 およびPpargc1aを含むマーカー遺伝子の相対発現、n = 5。データは平均±SEMとして提示されています。 36B4 は、ノーマライゼーションのためのハウスキーピング遺伝子として使用されました。略語:scBAT =鎖骨上褐色脂肪組織;RT-qPCR = 逆転写定量PCR;LN2 = 液体窒素。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルでは、H&Eおよび遺伝子発現解析のためのscBATの解剖および処理手順を詳細に示します。scBATは頸部の中間層にあり、太い静脈に沿っているため、このデポの分離には正確な技術が必要です。具体的には、デポをはっきりと見るために、首を開いた後にマウスを解剖顕微鏡の下に置くことをお勧めします。一対の極細点鉗子を使用して、唾液腺と周囲の静脈からscBATを剥がし、静脈に穴を開けないように注意する必要があります。出血が多すぎると、scBATの位置を特定するのが難しくなります。H&E染色用のscBATを処理するために、プロトコルのセクションに示されているように、4% PFA、脱水剤アルコール、および有機溶媒であるトルエンの使用を含むように、公開されているプロトコル19 の使用を若干修正して適合させました。手順全体が完了するまでに~6日かかり、H&E染色されたスライドは染色完了の翌日に画像化できます。
RNAを出発物質とするRT-qPCRは、脂肪組織生物学の分野で遺伝子発現解析に最も頻繁に使用される方法です。scBATはiBATに比べて比較的小さなBATデポであるため、遺伝子発現に十分なRNAを得ることは困難です。RNAの収量を増やすには、プロトコールの項で概説されているように、凍結した状態で乳棒と乳鉢を使用して組織を粉末化することから始めて、逐次ライセート調製ステップを適用することをお勧めします。このライセート調製法を用いて、1匹の成体マウスからscBATの遺伝子発現解析用RNAサンプルを高収量かつ高品質に得ることに成功しました。このライセート調製法は、タンパク質溶解バッファーを使用してウェスタンブロッティング用のscBATから高品質のタンパク質ライセートを得るためにも適用できます。
マウスiBATを用いて、熱発生と代謝におけるBATの機能に関する実質的な知識を得ることができました。scBATを含む、これまで認識されていなかったマウスとヒトのBATデポが最近いくつか同定されたことで、マウスと成体におけるBATの生理学的寄与を完全に理解するには、さらなる研究が必要であることが明らかになりました。特に、これらの新たに発見されたBATデポの起源、機能、および熱発生および局所的または全身代謝への関与を明らかにする研究が必要です。
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Disclosures
著者には開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、NIHのNIDDKの賞番号R01DK116899、USDA/ARSの賞番号3092-51000-064-000D、およびベイラー医科大学心臓血管研究所のパイロット賞によってサポートされています。フローチャートは BioRender を使用して作成されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 95% Dehydrant Alcohol (Flex 95) | Epredia | 8201 | |
| 100% Dehydrant Alcohol (Flex 100) | Epredia | 8101 | |
| 96-well PCR plate | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Aurum Binding Mini Column | Bio-Rad | 7326826 | |
| Aurum High Stringency Wash | Bio-Rad | 7326803 | |
| Aurum Low Stringency Wash | Bio-Rad | 7326804 | |
| Base Molds (for embedding) | Tissue-Tek | 4122 | |
| BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2" | Becton Dickinson | 305167 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1840148 | |
| Capless Microcentrifuge Tubes 2 mL | Fisherbrand | 02-681-453 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument | Bio-Rad | 12011319 | |
| Chloroform | Thermo Scientific Chemicals | 383760010 | |
| Cytoseal 60 Low-viscosity mounting medium | Epredia | 83104 | |
| DEPC-Treated Water | Ambion | AM 9906 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| DNase Dilution Solution | Bio-Rad | 7326805 | |
| DNase I | Bio-Rad | 7326828 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427013 | |
| Elution solution | Bio-Rad | 7326801 | |
| EM 400 embedding medium paraffin | Leica Biosystems | 3801320 | |
| Eosin Y (0.5% w/v) | RICCA | 2858-16 | |
| Formula R Infiltration medium paraffin | Leica Biosystems | 3801470 | |
| Genemark Nutator Gyromixer 349 | Bio Express | S-3200-2 | |
| Gill #3 Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS332-1L | |
| HCl (for HCL-Ethanol) | Fisher Chemical | A142212 | |
| IP VI Embedding Cassettes | Leica Biosystems | 39LC-550-5-L | |
| Koptec's Pure Ethanol - 200 Proof (for 70% Ethanol) | Decon Labs | V1001 | |
| MgCl2 (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R0971 | |
| Microcentrifuge Tubes 1.7 mL | Avantor | 87003-294 | |
| Microseal 'B' Seals (adhseive seals) | Bio-Rad | MSB1001 | |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2245 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 46-000-CM | |
| Mortar Coors Tek | Thomas Scientific | 60310 | |
| NaCl (for 0.85% saline) | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop Technologies | ND-1000 UV/Vis | |
| Oligo dT | Invitrogen | 18418020 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Boekel Scientific | 14792V | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | |
| PCR Tube Strip | Avantor | 76318-802 | |
| Pestle by Coors Tek | Thomas Scientific | 60311 | |
| Pestle Pellet Motor | Kimble | 749540-0000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Precision Model 19 Vacuum Oven | Thermo Fisher Scientific | CAT# 51221162 | |
| Primer: 36B4 (forward) 10 μM 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: 36B4 (reverse) 10 μM 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (forward) 10 μM 5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM 5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM 5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM 5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (forward) 10 μM 5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: PPARg (reserve) 10 μM 5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (forward) 10 μM 5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM 5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
| RNA isolation solution (PureZol) | Bio-Rad | 7326880 | |
| RNase Away (surface decontaminant) | Thermo Scientific | 1437535 | |
| RNase H | NEB | M0297S | |
| Rnase inhibitor (RNase Out) | Invitrogen | 10777019 | |
| Scintillation Vial (glass) | Electron Microscopy Sciences | 72632 | |
| Slide drying bench | Electrothermal (Cole-Parmer) | MH6616 | |
| Stainless staining rack | Electron Microscopy Sciences | 70312-54 | |
| Stereo microscope (for embedding) | Olympus | SZ51 | |
| Sugical scissors | McKesson | 43-1-104 | |
| Superfine point Straight Dissecting Forceps | Avantor | 82027-402 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT) | Invitrogen | 18080044 | |
| SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mL | Terumo | 100281 | |
| SYBR Green (qPCR enzyme master mixture) | Applied Biosystems | A25778 | |
| Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars) | Electron Microscopy Sciences | SKU: 62540-01 | |
| Toluene | Fisher Chemical | T324-1 | |
| Transfer pipette | Avantor | 414004-005 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL |
References
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